Summary
Baggrund autofluorescence biologiske prøver komplicerer ofte fluorescens-baserede Billeddannende teknikker, især i alderen postmitotic væv. Denne protokol beskriver hvordan autofluorescence fra disse prøver kan fjernes effektivt ved hjælp af en kommercielt tilgængelig lysemitterende diode lys kilde til photobleach prøven før immunfarvning.
Abstract
Immunfluorescens er en fælles metode, der bruges til at visualisere subcellulært rum og bestemme lokalisering af specifikke proteiner inden en vævsprøve. En stor hindring for erhvervelsen af høj kvalitet immunofluorescens billeder er endogene autofluorescence af væv forårsaget af ældning pigmenter såsom lipofuscin eller fælles prøve forberedelse processer såsom aldehyd fiksering. Denne protokol beskriver, hvordan baggrunden fluorescens kan være stærkt reduceret gennem photobleaching ved hjælp af hvid fosfor light emitting diode (LED) arrays inden behandling med fluorescerende sonder. Bredspektret emission af hvid fosfor lysdioder giver mulighed for blegning af fluorophores på tværs af en vifte af emission toppe. Photobleaching apparat kan være fremstillet af off-the-shelf komponenter til en meget lav pris og giver en tilgængelige alternativ til kommercielt tilgængelige kemiske quenchers. En photobleaching forbehandling af vævet efterfulgt af konventionelle immunofluorescens farvning genererer billeder gratis baggrund autofluorescence. I forhold til etableret kemiske quenchers, som reducerede sonde samt baggrund signaler, photobleaching behandling havde ingen effekt på sonden fluorescens intensitet, mens det effektivt reduceret baggrund og lipofuscin fluorescens. Selvom photobleaching kræver mere tid til forbehandling, kan højere intensitet LED arrays bruges til at reducere photobleaching tid. Denne enkle metode kan potentielt anvendes til en bred vifte af væv, især postmitotic væv, der ophobes lipofuscin som hjernen, og hjerte- eller skelet muskler.
Introduction
Fluorescens mikroskopi af antistoffer rettet mod specifikke proteiner bruges rutinemæssigt til at visualisere proteiner af interesse i cellekultur og væv. En væsentlig komplikation til erhvervelse af klare og endelige billeder i immunofluorescens er autofluorescence, som kan være forårsaget endogent i pattedyrvæv alder pigment lipofuscin og proteiner som elastin og kollagen1, 2. Andre kilder til autofluorescence kan indføres gennem prøven forberedelsestrin såsom aldehyd fiksering3. Lipofuscin granulat, sammensat primært af oxidativt modificerede proteiner og lipid nedbrydning restkoncentrationer, ophobes i lang-levende celler med øget alder2. Dette medfører vanskeligheder i imaging postmitotic væv af hjerne og hjerte eller skelet muskler, som fluorescens emission spektrum af lipofuscin er bred og variable, ofte sammenfaldende med emission bølgelængde af fælles fluorophores anvendes til mærkning4. Disse faktorer gør billeddannelse af menneskelige hjernevæv fra tilfælde af sent indsættende neurodegenerative sygdomme som frontotemporal lobar degeneration (FTLD) især udfordrende.
For at reducere autofluorescence, har vi udviklet en teknik, hvor vi bestråle afsnittene slide-monteret væv med en hvid lysemitterende (LED) diodearray ved brug af en husholdnings desk lamp5. Denne enkle teknik giver et alternativ til teknikker, der bruger kemiske quenchers såsom CuSO4 ammoniumacetat, eller kommercielt tilgængelige quenching farvestoffer som Sudan Black B og Eriochromsort sort T6. Det har også betydelige besparelser over multispektrale LED lampe photobleaching teknikker og undgår komplikationer og artefakter genereret fra digital autofluorescence fjernelse metoder såsom spektrale un-blanding7,8. Hvid fosfor lysdioder har en bred emission spektrum, høj lysstyrke og lave produktionsomkostninger, hvilket gør dem ideelle som en off-the-shelf komponent for photobleaching en række lysopfangende5,9.
I denne protokol, vi demonstrere opførelsen af et photobleaching apparat ved hjælp af tilgængelige komponenter og anvende photobleaching på en sag af FTLD væv indeholdende tau-positive indeslutninger (FTLD-T) ved hjælp af en antistof specifik for fosforyleres tau. Vi demonstrere effekten af photobleaching på imaging fluorescently mærket antistoffer beskæftiger to almindeligt anvendte lysopfangende: Alexa 488 og Texas rød. Effekten af photobleaching versus ubehandlet sektioner eller disse blev behandlet med en kommerciel kemiske quencher er kvantificeret og sammenlignet. Denne photobleaching forbehandling kan indarbejdes i enhver standard immunofluorescens farvnings-protokollen til at fjerne autofluorescence i en biologisk prøve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: arbejde præsenteret blev udført i overensstemmelse med anerkendte internationale standarder, herunder den internationale konference om harmonisering (ICH), Rådet for internationale organisationer af medicinske videnskaber (CIOMS) , og principperne i Helsinki-erklæringen. Brugen af menneskelige væv blev med godkendelse af University Health Network forskningsudvalg etik. De menneskelige hjerne prøver blev indsamlet som en del af den Maritime hjernen væv Bank. På tidspunktet for indsamlingen, informeret samtykke blev opnået fra alle patienter.
1. konstruktion af photobleaching apparater og løsninger
- Forbered stamopløsninger.
- Forberede 1 L 1 x stock Tris-bufferet saltvand (1 x TBS) løsning (150 mM NaCl, 50 mM Tris-Cl, pH 7,4) ved at opløse 8,77 g NaCl og 6.06 g af Tris base i 800 mL af Hedeselskabet 2 O og ph indstilles til 7.4 bruger HCl. Bring op til 1 L og autoklave. < / Li >
- forberede 10% (200 x lager) natriumazid ved at opløse 1 g af natriumazid i 10 mL af Hedeselskabet 2 O (10%, 200 x stock).
- For 1-3 standard størrelse dias, bruge en enkelt 100 mm x 100 mm gennemsigtig, firkantede petriskål dias afdeling. For et enkelt dias kammer, der tilsættes 0,25 mL 200 x natrium indeholder lager til 50 mL af 1 x TBS til at gøre en 0,05% indeholder-TBS løsning. Stack 2-3 dias kamre lodret for at behandle yderligere dias. Forberede en yderligere 50 mL indeholder-TBS løsning for hver afdeling.
- Oprette et stillads for at ophøje slide chamber(s), således at en lampe hoved kan passe nedenunder.
- For et 100 mm x 100 mm dias kammer, skåret åbninger i bunden og siderne af et 100 mm x 100 mm x 30 mm plast mad container og vend beholderen. Sikre side åbninger er stor nok til at passe en LED lyskilde og sikre den nederste åbning er stor nok, så lyset fra lyskilden når prøve salen uden hindring.
- Anvend elektrisk tape til stillads at øge greb mellem skafottet og prøve kammer/benchtop. Bruge alternative materialer til at konstruere skafottet, så længe det sikkert hæver dias kammer uden at hæmme lys fra at nå prøvens.
- Fjerne diffusorer eller uigennemsigtigt plast fra bordlampe, der kan hindre LED lys fra direkte at nå prøven (hvis muligt) og orientere LED-array opad. Placer stillads og slide chamber(s) over LED-array. Bruge en lampe med en fleksibel hals nemlig nemme manipulation.
- Konstruere en reflekterende dome dække for apparatet ved foring indersiden af en kasse stor nok til at dække dias kammer og stillads med aluminiumsfolie. Bruge en 1 mL pipette tip boks til en enkelt afdeling eller en 150 mm x 150 mm x 150 mm papkasse for flere, lodret stablet kamre.
2. Photobleaching forbehandling af væv sektioner
Bemærk: væv afsnittet forberedelse kan variere afhængigt af kilden til væv og fiksering og integrering af anvendte metoder. Her, hjernevæv (orbitofrontal gyri) fra et tilfælde af FTLD-T blev fastsat for ~ 2 dage i formalin, køre gennem en saccharose gradient, indlejret i OLT og skæres til 10 µm tykt sektioner ved hjælp af en kryostaten.
- i et 4 ºC koldt værelse, kolde fryser eller køleskab, orient lampe under skafottet og placere i prøve salen på skafottet. Hæld 50 mL indeholder-TBS løsning ind i prøve salen.
- Submerge væv sektioner monteret på standard glas objektglas ind i slide salen indeholdende indeholder-TBS ved hjælp af ren pincet. For flere dias, sikre, at diasene placeres i salen på et enkelt lag.
- Dække apparater med reflekterende kuplen, Tænd LED-lampe, og der inkuberes i 48 timer ved 4 ºC.
3. Immunfluorescens
- at plette væv til fosforyleres tau bruger DAPI kontrastfarve og Alexa 488- og Texas rød-konjugeret sekundære antistoffer, først forberede løsninger for antigen hentning, permeabilization, blokering og primære antistof bindende.
- Forberede 500 mL antigen hentning buffer (10 mM citronsyre, 2 mM ethylendiamintetra syre, 0,05% Tween 20; pH 6.2) ved at opløse 0.92 g citronsyre og 0,37 g ethylendiamintetra syre (EDTA) i 500 mL af Hedeselskabet 2 O. Juster pH-værdien til 6.2 med NaOH og tilføje 0,25 mL Tween 20.
- Forberede 500 mL 0,025% Triton X-100 i TBS løsning (TBS-Triton) ved at tilføje 0,125 mL Triton X-100 til 500 mL 1 x TBS.
- Forbered en 1% bovint serumalbumin (BSA) løsning i TBS (BSA-TBS buffer) ved at opløse 0,1 g BSA i 10 mL TBS.
- Udarbejde en blokerende løsning ved at tilføje 0,2 mL af normale ged serum til 1,8 mL 1% BSA/TBS.
- For hvert dias, forberede 150 µL af primære antistof løsning (1: 100 fortynding) af pipettering 1,5 µL anti-phospho-PHF-tau pSer202 + Thr205 (AT8) antistof til 148,5 µL 1% BSA-TBS buffer og forlade på ice.
- Til at udføre antigen hentning, dykke photobleached dias lodret i en slide samler indeholdende 25 mL antigen hentning buffer. Sikre collector med tape og/eller strygere, således at opkøber ikke falder i et vandbad. Varme samler i et vandbad ved 90 ºC i 30 min og tillade collector afkøle til stuetemperatur i 30 min før du fjerner dias. Ikke fjern dias omgående, da det vil forårsage sektioner til at udtørre.
- Overføre slides fra antigen hentning samler i en farvnings-krukke fyldt med 30 mL af TBS-Triton og vaske sektioner i 5 min på en orbitalryster med blid ryster. Gentag vask en gang med friske TBS-Triton. Vægen væk overskydende buffer med en fnugfri serviet og skitsere væv med en hydrofobe pen. Passe på ikke for at lade de dias, tørre ud.
- For hvert dias, blokere væv af pipettering 200 µL blokerende løsning på væv og placere lysbillede i en fugtig kammer. Konstruere kammeret ved at placere en slide rack inde en pipette tip kasse med en våd køkkenrulle. Inkuber ved stuetemperatur i 2 timer på en plan overflade. Sikre at den blokerende løsning fuldt ud dækker væv.
- Fjerner blokerende løsningen ved aspiration og afpipetteres 100-150 µL af primære antistof løsning på vævet. Sikre tilstrækkelig mængde antistof er til stede og at afsnittet er på en plan overflade at undgå pooling af antistof løsning til den ene side. Der inkuberes ved 4 ° c natten over i et befugtet kammer.
- Forberede sekundær antistof blandingen og DAPI nukleare kontrastfarve.
- For hvert dias, forberede 150 µL af sekundær antistof blanding (1: 100 fortyndinger) ved at tilføje 1,5 µL af ged anti-mus Alexa 488 og 1,5 µL af ged anti-mus Texas rød til 147 µL af BSA-TBS og forlade på ice.
- Forbered 0,1 µg/mL DAPI kontrastfarve ved seriel fortynding. Bland stamopløsningen grundigt og fortyndes 1 µL af stock 5 mg/mL DAPI i 999 af TBS at gøre 1 mL 5 µg/mL opløsning. For hvert dias, fortyndes 3 µL 5 µg/mL opløsning med 147 µL af TBS til en endelig koncentration på 0,1 µg/mL.
Forsigtig: DAPI er en kendt mutagen og skal håndteres med omhu.
- Fjerne den primære antistof ved aspiration. Dykke dias i et glas farvning krukke indeholdende 30 mL af TBS-Triton og vask for 5 min med blide blanding på en orbitalryster. Gentag trinnet vask med friske TBS-Triton. Vægen væk overskydende TBS-Triton og afpipetteres 100 til 150 µL af sekundær antistof blanding til hver dias.
- Sikre væv er fuldt dækket af antistof blanding. Der inkuberes i 2 timer ved stuetemperatur i befugtet salen i mørke.
- Fjerne sekundær antistof blanding af aspiration og overføre diasset i et glas farvning krukke indeholdende 30 mL af TBS (ingen Triton). Vask for 5 min med blide blanding på en orbitalryster. Gentag trinnet vask med friske TBS. anvende 100 til 150 µL af 0,1 µg/mL DAPI kontrastfarve på hvert dias og inkuberes i 10 min. ved stuetemperatur i mørke.
- Overføre dias til et glas farvning krukke indeholdende TBS og vask 3 gange med blide blanding for 5 min hver, ved hjælp af friske TBS for hver vask. Vægen væk overskydende buffer.
- Anvende 3 dråber vandig montering medium til væv. Brug af pincet, Sænk forsigtigt et rent glas coverslip på væv, begyndende med en kant og langsomt sænke den andre kant for at undgå fangst af luftbobler. Passe på ikke for at løsne coverslip, hvis imaging straks. Ellers tillader montering medium tørre inden opbevaring ved 4 ° c i mørke.
4. Fluorescens mikroskopi
- tur på fluorescens lampe, mikroskop og computeren og tillader lampe til varm op i 15 min. sted farvede vævet dias i fluorescens mikroskop fase. Brug lysfelt billedet til at lokalisere væv ved 10 x forstørrelse.
- Påfør en dråbe af Hedeselskabet 2 O coverslip overflade og bruge en 20 x vand fordybelse mål linse (NA = 1,0). Vælg den 4-line gennemsnitlige flyet scan indstilling. Indstille pinhole størrelse til 1 luftige enhed, der giver et optisk udsnit af ~ 3 mikrometer. Vælg laser excitations- og bølgelængder for hver fluorophore i separate spor for bedste signal.
Bemærk: Alexa 488: λ ex = 488 nm (argon laser) λ em = 493-570 nm; Texas rød: λ ex = 561 nm (DPSS 561 nm laser), λ em = 601-635 nm; DAPI: λ ex = 405 nm (Diode 405 laser), λ em = 410-507 nm.- Regulere laser magten og få indstillinger for at optimere signalet intensiteten for hvert spor. Indsamle det sammensatte billede og gemme. Brug de samme laser indstillinger til at sammenligne fluorescens intensiteter i et andet dias.
- Visualisering af fluorescens intensitet i hver kanal, skal du installere RGB-profil værktøjer makro for ImageJ 10. Gem makroen fra websiden som en tekstfil (https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt). Vælg menuen ImageJ Plugins - > makroer - > installere; Vælg tekstfil for at installere værktøjet RGB-profiler.
- Åbne Konfokal billedfilen i ImageJ og konvertere de sammensatte billeder fra de 3 stakke til RGB ved at udføre følgende: Image - > farve - > kanal værktøj. Vælg " sammensatte " fra dropdown menuen og tjek alle tre kanaler. Vælg derefter billede - > Type - > RGB farve.
- Vælg RGB-profil værktøjer ikonet og trække en linje på tværs af afsnittet i billedet for at blive profileret. Gemme dataene i intensitet som et regneark til plotning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Photobleaching forbehandling trin kan føjes til en standard immunofluorescens protokollen umiddelbart før antigen hentning og immunfarvning (figur 1A). Montering af photobleaching apparater kan også udføres ved hjælp af forskellige, billig, off-the-shelf komponenter (figur 1B). Emission spektrum af hvid fosfor lysdioder dækker en bred vifte af bølgelængder, hvilket gør dem egnet til bred vifte photobleaching, enig med tidligere rapporter (figur 1 c)5,11. Efter 48 h photobleaching, blev intensiteten af autofluorescent pletter, der ligner lipofuscin samt generel baggrund fluorescens reduceret betydeligt i begge emission bølgelængder i en unstained del af FTLD-T (figur 1 d). Til viste effekten af photobleaching, plettet vi for hyperphosphorylated tau at visualisere patologiske tau optagelser i et tilfælde af FTLD-T ved hjælp af to forskellige sekundære antistoffer. Den adskilte form af tau indeslutninger og brug af to lysopfangende til mærkning også tillader os at trygt skelne autofluorescent funktioner fra de tilsigtede mål hen til efterprøve teknikken.
I de sammensatte billeder ved lavere forstørrelse, morfologi af tau-positive indeslutninger, farves gul fra kombinationen af Alexa 488 og Texas rød kanaler, består af ring-formede samlinger af korte celle processer, der er benævnt» astrocytic plaques' (figur 2a-c). Denne morfologi er karakteristisk for corticobasal degeneration (CBD)12,13, som er enig med rapporten patologi af denne sag. I den ubehandlede prøve, mange strukturer er til stede i det sammensatte billede, der ikke ligner tau indeslutninger, og viste fluorescens primært i den røde kanal, hvilket tyder på, at det er autofluorescence i stedet for planlagte antistoffarvning. En mærkbar baggrund Fluorescens er også synligt i denne kanal hele synsfelt (figur 2a). Disse autofluorescent funktioner er fjernet og det overordnede billede vises meget renere, når prøver blev behandlet med photobleaching (PB) og den kemiske quencher (figur 2b-c).
Vi derefter kvantificeret fluorescens forskelle i disse prøver ved profilering et mindre område i hver prøve. En enkelt astrocytic plaque er præsenteret i hver behandling betingelse for sammenligning (figur 2d-r). I eksemplet ubehandlet baggrund Fluorescens er til stede i alle tre kanaler, men sekundær antistof fluorescens for både Alexa 488 og Texas rød antistoffer var relativt høj (Fig 2h). Dog havde autofluorescent strukturer i ubehandlet prøven fluorescens intensiteter i Texas rød kanal sammenlignes med Texas rød sekundær antistof, der farves til tau (figur 2 h). Hvis target proteinet ikke havde en tydelig og forudsigelig morfologi såsom tau i vores tilfælde, autofluorescence i vævet, ville have givet billedet uninterpretable.
Derimod når photobleaching forbehandling blev anvendt før immunfarvning, baggrund fluorescens i Alexa 488 og Texas rød kanaler blev reduceret betydeligt i forhold til den ubehandlede prøve, og fluorescens af immunostained tau forblev upåvirket (figur 2i-m). Den kommercielle kemiske quencher bratkølet autofluorescence i Alexa 488 kanal lige så effektivt som photobleaching. Det også undertrykt DAPI baggrund fluorescens, der ikke var påvirket af 48 h photobleaching behandling (figur 2 m). Men den kemiske quencher også reduceret intensiteten af Texas rød sekundære og DAPI signaler, hvilket tyder på en vis grad af kontraproduktivt quenching (figur 2n-r).
Figur 1 : Anvendelse af photobleaching forbehandling i en standard immunofluorescens arbejdsproces. A) forenklet skematisk af standard immunofluorescens protokollen fra væv erhvervelse til billedbehandling. Anvendelse af primære og sekundære fluorescerende antistoffer er repræsenteret af tegnefilm. En repræsentativ mikroskop billede er produceret. Skalalinjen = 100 µm. B) et repræsentativt photobleaching apparater konstrueret ved hjælp af off-the-shelf komponenter (reflekterende låget ikke er vist). C) Emission spektrum af hvide LED-array. En smal emission peak ved 450 nm og en bred peak på 550 nm overholdes. D) effekt af photobleaching på endogene baggrund fluorescens af FTLD-T væv på Alexa 488 (493-570 nm) og Texas rød (601-635 nm) emission bølgelængder. Autofluorescent pletter der ligner lipofuscin reduceres synligt efter 48 h photobleaching. Skalalinjen = 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2:effekt af autofluorescence fjernelse på billedkvaliteten af et tilfælde af FTLD-T væv med anti-fosforyleret tau immunfarvning. a-c) lav forstørrelse, sammensatte immunofluorescens billeder af repræsentative felter synspunkt i ubehandlet (a), photobleached for 48 h (b) og kemisk quencher behandlet (c) prøver. Farver repræsenterer fluorescens i de følgende kanaler via excitation af deres respektive lyskilder: Alexa 488 (grøn): λex = 488 nm (argon laser) λem = 493-570 nm; Texas rød (red): λex = 561 nm (DPSS 561 nm laser), λem = 601-635 nm; DAPI (blå): λex = 405 nm (Diode 405 laser), λem = 410-507 nm. Skalalinjen = 100 µm. d-f) højere forstørrelse billeder af de stiplede områder i ubehandlet (d-g), photobleached (i-l) og kemiske quencher behandlet (n-q) prøver, med separat fluorescens kanaler, fusioneret billede, og kvantificeres fluorescens signal profiler. Stiplede linjer i de flettede kanaler (g, l, q) repræsenterer linjen som signal profiler (h, m, r) blev genereret. Skalalinjen = 50 µm. Autofluorescent partikler (af),immunolabeled tau fluorescens (tau) og nucleus signal (NUK) er angivet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Photobleaching forbehandling af væv, der er beskrevet i dette håndskrift giver mulighed for effektiv fjernelse af autofluorescence ved hjælp af off-the-shelf komponenter. Protokollen beskriver immunofluorescens billeddannelse af fosforyleres tau aggregater i formalin-fast menneskelige hjernevæv ved hjælp af sekundære antistoffer konjugeret til Alexa 488 og Texas rød, med DAPI som en nuklear kontrastfarve. For at anvende metoden til andre væv, anbefaler vi udfører en 48 h photobleaching forbehandling til prøven som udgangspunkt. Efter photobleaching, udføre den standard immunofluorescens farvning protokol for funktioner af interesse ved hjælp af antistof fortyndinger efter fabrikantens anvisninger. Hvis baggrunden Fluorescens er stadig til stede, skal photobleaching varighed og/eller antistof farvning trin ændres. Varigheden af photobleaching varierer afhængigt af lampen valgt til at konstruere apparatet og niveauet af autofluorescence i prøven. Den optimale blegning tid for hver unik lampe apparater skal bestemmes. Dette kan gøres ved at photobleaching en unstained, coverslipped væv afsnit monteret i TBS-indeholder og måle den endogene fluorescens af diaset med 12-timers intervaller ved hjælp af et fluorescens mikroskop. I tidligere betænkninger, vi overvåges lipofuscin photobleaching af partikel analyse og kurve montering til eksponentiel henfald funktioner5, men for enkelhed, visuel observation af sektioner med jævne mellemrum kan være lige så effektiv til at bedømme den varighed på som de fleste af fluorescens bliver slukket. I vores tilfælde i alderen hjernevæv indeholder høje mængder af lipofuscin pigmenter, var 48 h inkubation med en 800 lux lampe tilstrækkelig. Hvis de specifikke signalet forbliver svag i forhold til baggrunden efter photobleaching, kan du overveje at øge koncentrationen af primære og sekundære antistoffer i farvning. Det er også vigtigt at udføre en sekundær antistof-kun kontrol for at sikre baggrunden signal ikke er forårsaget af ikke-specifik sekundær antistof bindende. Vær omhyggelig med at vælge antistoffer, der ikke krydsreagere, især når farvning for flere mål. Derudover sikre, at de specifikke signaler ikke uforvarende slukkes under farvning processen. For eksempel, er Nissl pletten (for farvning neuroner) slukket af BSA. I dette tilfælde skal BSA komponent af den blokering løsning erstattes med alternativer såsom fisk hud gelatine5.
Anvendelsen af hvid fosfor lysdioder til photobleaching har visse begrænsninger på grund af dens emission spektrum fra 420 nm til 650 nm. Således er ingen væsentlig photobleaching i UV bølgelængder muligt. Også, på grund af den brede emission spektrum, photobleaching lysopfangende af bestemte bølgelængder kræver ændringer som overliggende farvefilter ark ovenfor LED arrays til at bortfiltrere uønskede emission bølgelængder. Derudover kan photobleaching af væv kræve længere sagsbehandlingstider end andre metoder. I dette tilfælde på grund af alder af hjernevæv (fra en 89-årig person) og lang aldehyd fiksering periode på mere end 2 dage var en 48 h photobleaching varighed påkrævet. Selvom ingen aktiv behandlingstid er påkrævet, skal man tage hensyn photobleaching tid og planlægge farvning sessionen i overensstemmelse hermed. LED lamper af højere lysstyrke eller brug af flere lamper kan markant reducere tid, photobleaching af den simple stigning i photon flux.
I forhold til eksisterende metoder, tilbyder vores teknik flere betydelige fordele. I modsætning til photobleaching ved hjælp af scanning lasere i Fluorescens mikroskopi, observeret vi nogen tegn på foto-induceret skade vores prøver ved hjælp af LED photobleaching. En anden stor fordel af vores apparater er en væsentlig reduktion i omkostninger over andre teknikker. Samling af vores apparater koster ca $10 USD, og samling af apparatet er fleksibel nok sådan, at alle laboratorier kan vedtage deres egen version af photobleacher. I sammenligning, andre metoder, mutispectral førte matrixer med brugerdefineret dias indehavere og køling kamre kræver op til $1000 USD at konstruere8. Derudover er kommercielle kemiske quenchers forbrugsgoder, der koster $120 USD for 100 dias og indføre potentielt uønskede stoffer i prøven. Den kemiske quencher anvendes til sammenligning i den nuværende undersøgelse sandsynligvis indeholder lipid-bindende Sudan sort farvestof, som kan forstyrre immunfarvning af lipoproteiner.
Samlet set de mest kritiske trin i photobleaching forbehandling og immunfarvning af modellen indebærer håndtering af afsnittet under immunfarvning. Det er vigtigt, at når først afsnittet er rehydreret under photobleaching, ikke er det tilladt at tørre ud i nogen af de efterfølgende trin. Tørring af diaset vil medføre ujævn fordeling af antistoffer og oprette uninterpretable artefakter. For at undgå tab af tid og potentielt værdifulde prøver, skal pleje tages flere skridt i protokollen. Efter hentning af antigen, tillade væv til at afkøle inden flytningen til TBS-Triton permeabilization løsning. Selv kortvarig eksponering for luft når prøven er opvarmet til høje temperaturer vil forårsage øjeblikkelige udtørring af væv. Også sikre, at antistof, blokering eller kontrastfarve løsninger fuldt ud dække væv under anvendelsen. Dette kan opnås ved at sikre at vævet er fuldt skitseret af hydrofobe pennen til at undgå løsning afstrømning og at alle løsninger anvendes i en fugtig kammer på en plan overflade. Dette er især vigtigt i løbet af natten inkubationer (primære antistof bindende).
Vellykket anvendelse af photobleaching ved hjælp af hvid fosfor lysdioder før farvning kan lette anvendelsen af immunofluorescens metoder til arkiverede væv. Det er en alsidig og billig behandling, som vi forventer at være åbne over for en bred vifte af enheder i fremtiden. Selv om vi har kun anvendt denne metode til menneskelige hjernevæv, denne teknik kan integreres nemt i enhver farvning protokol i hvilke autofluorescence der forhindrer ønskelig resultater, specielt i postmitotic væv såsom hjerte eller skelet muskler hvor lipofucin er mere tilbøjelige til at akkumulere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet i hele eller en del af den canadiske konsortium af Neurodegeneration og aldring (CCNA), det canadiske Institut for sundhed Research (CIHR), ALS Society of Canada (ALS Canada) og Alzheimers samfund i Canada (ASC). Forfatterne vil gerne takke Sultan Darvesh og Andrew Reid fra Maritime hjernen væv banken til at yde FTLD hjernen væv, Milano Ganguly fra programmet Spatio-temporale målretning og forstærkning af stråling svar (STTARR) og dens tilknyttede finansiering agenturer for væv indlejring og skæring tjenester, og den avancerede Optisk mikroskopi facilitet (AOMF) for at give mikroskopi instrumenter. Kevin Hadley er takkede for kritisk gennemgang af håndskriftet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Sodium Choloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Hydrochloric Acid | Caledon Laboratory Chemicals | 1506656 | |
| Sodium Azide | BioShop Canada | SAZ001 | |
| 100 mm x 100 mm x 20 mm Pitri dish | Sarstedt | 82.9923.422 | All components of photobleacher can be substituted based on availability |
| 6 W LED Dimmable Desk Lamp | DBPower | DS501 | All components of photobleacher can be substituted based on availability |
| Citric Acid | Sigma-Aldrich | C-2404 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | BioShop Canada | EDT001 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P-7949 | |
| Sodium Hydroxide | BioShop Canada | SHY700.1 | |
| Water bath | Haake Fisons | K15 | |
| Slide collector | FisherScientific | 12-587-17B | |
| Staining Jar | FisherScientific | E94 | |
| Orbital Shaker | Bellco Glass | 7744-08115 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T7878 | |
| Bovine Serum Albumin | FisherScientific | BP1600-1 | |
| Normal Goat Serum | Aurion | 905.002 | |
| Hydrophobic pen | Sigma-Aldrich | Z672548-1EA | |
| Phospho-Tau (Ser202, Thr205) Monoclonal Antibody (AT8) | ThermoFisher | MN1020 | |
| Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Texas Red-X | ThermoFisher | T862 | |
| Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-11029 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Mounting medium | ThermoScientific | 28-600-42 | |
| Glass soverslip | |||
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM710 | |
| Imaging software ZEN 2012 Black Edition 11.0 | Zeiss | LSM710 | Software accompanies the Confocal Microscope |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| RGB Profile Tools macro | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt | |
| Commercial chemical quencher | Biotum | 23007 |
References
- Banerjee, B., Miedema, B. E., Chandrasekhar, H. R. Role of basement membrane collagen and elastin in the autofluorescence spectra of the colon. J Investig Med. 47 (6), 326-332 (1999).
- Terman, A., Brunk, U. T. Lipofuscin . Int J Biochem Cell Biol. 36 (8), 1400-1404 (2004).
- Del Castillo, P., Llorente, A. R., Stockert, J. C. Influence of fixation, exciting light and section thickness on the primary fluorescence of samples for microfluorometric analysis. Basic Appl Histochem. 33 (3), 251-257 (1989).
- Ottis, P., Koppe, K., et al. Human and rat brain lipofuscin proteome. Proteomics. 12 (15-16), 2445-2454 (2012).
- Sun, Y., Chakrabartty, A. Cost-effective elimination of lipofuscin fluorescence from formalin-fixed brain tissue by white phosphor light emitting diode array. Biochem Cell Biol. 94 (6), 545-550 (2016).
- Davis, A. S., Richter, A., et al. Characterizing and Diminishing Autofluorescence in Formalin-fixed Paraffin-embedded Human Respiratory Tissue. J Histochem Cytochem. 62 (6), 405-423 (2014).
- Zimmermann, T., Rietdorf, J., Pepperkok, R. Spectral imaging and its applications in live cell microscopy. FEBS Lett. 546 (1), 87-92 (2003).
- Duong, H., Han, M. A multispectral LED array for the reduction of background autofluorescence in brain tissue. J Neurosci Methods. 220 (1), 46-54 (2013).
- Albeanu, D. F., Soucy, E., Sato, T. F., Meister, M., Murthy, V. N. LED arrays as cost effective and efficient light sources for widefield microscopy. PLoS One. 3 (5), 1-7 (2008).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Robertson, J. B., Zhang, Y., Johnson, C. H. Light-emitting diode flashlights as effective and inexpensive light sources for fluorescence microscopy. J Microsc. 236 (1), 1-4 (2009).
- Mackenzie, I. R. A., Neumann, M. Molecular neuropathology of frontotemporal dementia: insights into disease mechanisms from postmortem studies. J Neurochem. 138 (S1), 54-70 (2016).
- Kouri, N., Whitwell, J. L., Josephs, K. A., Rademakers, R., Dickson, D. W. Corticobasal degeneration: a pathologically distinct 4R tauopathy. Nat Rev Neurol. 7 (5), 263-272 (2011).
