Summary
Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento y cultivo de cardiomiocitos ventriculares de rata adulta (ARVC). ARVC aislada puede utilizarse para el cultivo de corto y largo plazo. El aislamiento y cultivo de ARVC pueden desempeñar un papel clave en el desarrollo de nuevos regímenes de tratamiento para enfermedades cardíacas.
Abstract
En un corazón intacto, las células adyacentes influyen en cardiomiocitos adultos. Con el método de aislamiento y cultivo de cardiomiocitos adultos, es posible una investigación precisa del comportamiento de estas células en tratamientos específicos y ambientes. Este manuscrito presenta un protocolo para acertado aislamiento y cultivo de cardiomiocitos ventriculares de rata adulta (ARVC).
La rata se sacrificaron mediante dislocación cervical bajo anestesia profunda. A continuación, se extrae el corazón y la aorta se destapa. Posteriormente, se realiza la perfusión en el sistema de perfusión de Langendorff con el agotamiento de calcio y tratamiento de la colagenasa. Luego, tejido ventricular obtiene picada, recircula y filtrado, seguido de tres pasos de centrifugación con incorporación gradual de CaCl2 hasta que se alcanza la concentración fisiológica de calcio. ARVC se platean en platos de cultivo celular. Después de actualizar el medio de cultivo celular, ARVC pueden cultivar hasta seis días sin cambiar el medio de cultivo que contiene el suero. Aislamiento de ARVC es un proceso sensible del calcio. Pequeños cambios en la concentración de calcio intracelular provocar una disminución en la calidad y viabilidad de las células aisladas.
Recién aislado ARVC son en forma de barra. En los primeros días de cultivo pierden las forma morfología y forma seudópodos-como las estructuras (separarse). Durante esta formación morfológica ARVC degradan inicialmente sus elementos contráctiles seguidas por una reforma a través de fibras de actina estrés y sarcomerogenesis de novo . Después de una semana de cultivo, la mayoría ARVC muestran un aspecto generalizado con una estriación transversal claramente perceptible. Este proceso es sensible a la concentración de calcio intracelular, como tratamiento con ionomycin atenúa separarse. Los marcadores claves en este proceso de - y re - differentiation son cadena pesada de miosina β (β-MHC), Oncostatina M (OSM) y swiprosin-1 (EFHD2). Estudios recientes han sugerido que cardiaco re y de differentiation que ocurre bajo condiciones de cultivo imita características vistos en vivo durante la remodelación cardiaca. Por lo tanto, el aislamiento y cultivo de ARVC juegan un papel clave en la comprensión de la biología de cardiomiocitos.
Introduction
Cardiomiocitos adultos en vivo funciona como un sincitio eléctrico basado en los contactos célula-célula entre miocitos. Además, están influenciadas por las adyacentes células como fibroblastos cardíacos, células endoteliales, neuronas y células inflamatorias1. Con el fin de estudiar la capacidad de cardiomiocitos para adaptar su organización intracelular alterado condiciones de carga, como se ve durante la hipertrofia cardiaca, que es un paso inicial hacia la insuficiencia cardíaca, el aislamiento y cultivo de rata adulta ventricular cardiomiocitos (ARVC) es necesario2,3,4. Históricamente, cardiomiocitos primero fueron aislados de chick embrionario corazones5,6. Unos años más tarde, el primer aislamiento de cardiomiocitos terminalmente diferenciadas fue descrito por medio del agotamiento de calcio7. Sin embargo, estos cardiomiocitos adultos no eran tolerantes de calcio y por lo tanto no se podían utilizar para ensayos funcionales. Finalmente, en 1976 un nuevo protocolo permitió a Powell y toque investigar cardiomiocitos ventriculares adultos bajo condiciones fisiológicas8. Como primer paso, aislaron cardiomiocitos adultos bajo concentraciones bajas de calcio y posteriormente aumento calcio a concentraciones fisiológicas en un procedimiento paso a paso. Hoy, mayoría de los protocolos para el aislamiento y cultivo de cardiomiocitos adultos trabaja con este protocolo de calcio y uso de colagenasa para la digestión enzimática de la célula densa contactos1.
Para un exitoso cultivo, suero fetal de ternero (FCS) u Oncostatina M (OSM) se requiere. ARVC realizar un de - y re - differentiation con extensos cambios estructurales incluyendo sarcómero desmontaje y reforma9,10,11,12. Este proceso es acompañado por una nueva expresión de los genes de tipo fetal, como la cadena pesada de miosina β (β-MHC), como la hipertrofia y formación de seudópodos-como las estructuras, también llamado extensión de4,11, 13. Además, swiprosin-1 (EFHD2), una proteína recientemente identificada, desempeña un papel importante en el proceso de rediferenciación de ARVC cultivadas11. Como resultado, ARVC en cultura se transforman en células generalizadas, polimorfas, que espontáneamente muestran contracciones después de dos a tres semanas de cultura2,4,14.
Recientes descubrimientos han revelado que cardiaca differentiation re y de como ocurre bajo condiciones de cultivo imita características vistos en vivo durante la remodelación cardiaca10,15. Remodelación cardiaca es un proceso clave en enfermedades cardíacas16. Enfermedades cardíacas siguen siendo la principal causa de muerte en las sociedades industrializadas, una mejor comprensión de la biología de cardiomiocitos adultos es importante (que; 2015). Aislamiento y cultivo de ARVC pueden ayudar a desarrollar nuevas estrategias y medicamentos para el tratamiento de enfermedades cardíacas. Con este manuscrito, se proporciona un protocolo para el aislamiento y cultivo de ARVC. Además, se destacan algunas partes esenciales de este método en la sección de discusión.
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Protocol
la investigación se lleva a cabo conforme a la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio publicados por nosotros Instituto Nacional de salud (NIH publicación no. 85-23, revisada en 1996). En general, ratas wistar macho de 3 a 4 meses de edad y con un peso promedio de 250-350 g se utilizan para este protocolo. Un corazón de rata es suficiente para 20 platos de cultura (1 mL por plato; diámetro interior: 35 mm) con una densidad celular aproximada de 1.5 x 10 4 células/1000 mm 2.
1. preparación de medios y reactivos
- carnitina-creatina-taurina (CCT medio)
Nota: CCT medio es un medio complejo basado en medio 199 con el agregado de creatina, carnitina y taurina.- Preparar 1 L de medio 199: Añadir 3,6 g Hepes y mezcla durante 1 hora. Luego añadir 655,5 mg creatina (5 mM), 395,4 mg de carnitina (2 mM) y taurina mg 625,5 (5 mM). Carnitina y taurina cambian pH a < 7. Con el fin de inhibir el crecimiento de células contaminantes, por ejemplo, las células endoteliales o los fibroblastos, añadir 10 μm citosina β-D-arabinofuranoside al medio. Ajustar el pH con NaOH (2 mM) filtro estéril y 7.4 el medio. Almacenar el medio CCT a 4 ° C.
- Medio de Powell
- para 1 medio L Powell, disolver 6,43 g NaCl (110 mM) con 0,19 g KCl (2,5 mM), 0.16 g KH 2 PO 4 (1,2 mM), 0,3 g de MgSO 4 7 H 2 O (1,2 mM), 5,96 g Hepes (25 mM) y 1,98 g D (+ )-Glucosa monohidrato (10 mM) en Aqua estéril. Ajustar el pH con NaOH (2 M) a 7,4 y estéril el filtro del medio. Medio de Powell tienda a 4 ° C.
- Cloruro de calcio (CaCl 2)
- preparar una solución de 100 mM CaCl 2 (50 mL) y preparar alícuotas conteniendo 500 μl de CaCl 2. Congelar en alícuotas a -20 ° C.
- Preparación de medio de cultivo
- Prepare tres medios de cultivo celular: pre-galjanoplastia medio, galjanoplastia de medio y medio de lavado. Utilizar el medio CCT como base para todos los tres medios (tabla 1). Calcular medio CCT con 1 mL por placa de cultivo. Por lo tanto, preparar medio CCT 20 mL para 20 platos de cultura (diámetro interior: 35 mm).
- De la célula cultura placas: cada placa de cultivo de células de la capa (diámetro interior: 35 mm) con 1 mL pre-galjanoplastia medio. Almacenar las placas recubiertas a 37 ° C durante la noche o durante al menos 2 h antes de usar.
2. Aislamiento de cardiomiocitos adultos
- sistema de preparación de Langendorff perfusión
- calor medio forro y lavado medio a 37 ° C. descongelar un tubo 500 μl de CaCl 2 y pesan de 25 mg de colagenasa.
- Ras del sistema de perfusión de Langendorff con aqua estéril, luego dejar medio Powell circulan el sistema por 5 min
- Llene el sistema de perfusión de Langendorff con 80 mL de medio de Powell sin cualquier aire burbujas y gas el medio con oxígeno del 95%.
- Preparar un tubo (50 mL) con 40 mL de medio de Powell, calentar a 37 ° C y gas con el oxígeno del 95%.
- Preparar un hilo de unos 25 cm de longitud para atar el corazón quitado a la cánula de.
- Desengrasar una cuchilla con alcohol (70% por volumen) y fijarlo a la picadora. Un disco de plástico de la abrazadera en la picadora.
- Extracción de corazón
- anestesiar una rata wistar macho con 4% a 5% isoflurano y sacrificio con la dislocación cervical. Abierto el abdomen detrás del arco costal con un corte abdominal y, con el mismo par de tijeras, corte a través del diafragma para abrir la cavidad torácica.
- Quitar el corazón, junto con el pulmón y timo, cortando por encima del timo muy craneal en la cavidad torácica. Transferir el material a una solución salina helada inmediatamente.
- Saque el pulmón y timo, el corazón con una tijera de disección (grande) y por fijación del material con pinzas para cápsula, transferir éste a una nueva solución salina.
- Aislamiento
- Eliminar exceso de tejido, como residuos de timo, la tráquea, la grasa y tejido conectivo del corazón usando fórceps cápsula y una tijera de disección (grande o pequeño). Descubrir la aorta y cortar con una tijera de disección (grande o pequeño) entre el primer y segundo lugar branchial arquitecto
- Iniciar el goteo del sistema de perfusión de Langendorff. Coloque el corazón en la cánula del sistema de perfusión de Langendorff y fijar primero con una pinza de cocodrilo y luego con el hilo preparado. Enjuague el corazón hasta que quede libre de sangre.
- Disolver 25 mg de colagenasa en el cálido medio de Powell 5-6 mL y añadir 12.5 μl CaCl 2 (30 μm).
- Cierre de circulación moviendo un embudo de cristal, que está conectado con el sistema de perfusión de Langendorff, sobre el corazón de goteo y añadir la colagenasa solucionado para el sistema de perfusión. Iniciar la perfusión de 25 min con una velocidad de caída de 1 gota por segundo.
Nota: Durante la perfusión, el corazón se hinche y conseguir un aspecto céreo. - Detener la perfusión después de 25 minutos y retirar el corazón del sistema de perfusión de Langendorff. Quitar la aorta, aurícula y tejido conectivo del corazón y abrir los ventrículos izquierdos y derecho.
- Picar el corazón dos veces en un ángulo de 90° (ancho de corte: 0,7 mm, velocidad: 0.15 cm/s). Repita este proceso manualmente con dos bisturíes para 10 s cada lado.
- Transferir 12 mL del medio de perfusión a un tubo nuevo (50 mL). Vierta la mezcla de células en este medio y digerir las células por otros cinco minutos a 37 ° C. mezcla la solución cada minuto.
- Filtrar la solución con el corazón digerido a través de una malla de nylon (200 μm) en un tubo nuevo (50 mL).
- Centrifugar la solución filtrada a 29 x g durante 3 min descartar el sobrenadante y añada 6 mL caliente Powell medio incluyendo 12,5 μl CaCl 2 (250 μm) para el sedimento celulares. Resuspender el precipitado a través de movimientos de agitación suave. Centrifugar nuevamente a 29 x g durante 2 min descartar el sobrenadante y añadir 6 mL caliente medio Powell sustituido con 25 μl de CaCl 2 (500 μm). Disolver el precipitado de células a través de suaves movimientos de agitación y añadir 12 mL caliente Powell medio incluyendo 120 μl CaCl 2 (1 mM). Centrifugar por tercera vez en 16 x g durante 1 minuto. Otra vez, eliminar el sobrenadante.
- Mezclar el sedimento celular con el galjanoplastia precalentado medio.
- Retire placas previos medio placas de cultura. Transferir 1 mL de medio, incluyendo los cardiomiocitos aislados, a cada placa de cultivo de la galjanoplastia. Incubar los cardiomiocitos aislados fresca a 37 ° C por 1 h.
- Quitar el medio de placas de placas de. Añadir 1 mL de medio a cada placa de cultivo de lavado y almacenar las placas a 37 ° C hasta 6 días sin cambiar el medio.
- Para investigar la influencia de diferentes productos químicos y tratamientos en ARVC, primero actualizar chapado en medio medio de lavado y después añadiendo diferentes productos químicos.
Nota: La evaluación con microscopía de luz: con la preparación de cada célula, deben controlarse cardiomiocitos de 150 a 300 por día por microscopia ligera. Subdividir todo contado cardiomiocitos en grupos según su aspecto (por ejemplo, " en forma ", " redondo abajo ", " separarse ", y " aspecto inusual "). La categoría " separarse " incluye todos los cardiomiocitos con seudópodos como las estructuras. " Aspecto inusual " incluye todos ARVC con una superficie irregular y no detectable membrana intacta de la célula.
3. Ejemplo Experimentos
- de la fluorescencia de la inmunofluorescencia, tinción de cardiomiocitos adultos
- analizar morfológicas y estructurales las conversiones de ARVC durante el cultivo mediante microscopía láser confocal. Utilice Phalloidin-TRITC para investigar las estructuras de la F-actina en " en forma ", " redondo abajo ", y " difundir " ARVC. Realizar la coloración según el fabricante ' protocolo de s. Se da un ejemplo para la tinción de Phalloidin-TRITC en referencia Nippert et al. 11. con la tinción de fluorescencia de la inmunofluorescencia, las diferencias en el de - y re - differentiation del aparato contráctil en cardiomiocitos adultos cultivados entre tratamientos experimentales (por ejemplo, con Swiprosin-1, ionomycin) puede ser investigado.
- RT-PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR)
- realizar qRT-PCR para investigar cambios en la expresión del mRNA de genes diferentes (por ejemplo, OSM, Swiprosin-1, β-MHC) durante el cultivo de ARVC. Tamaño de muestra suficiente, utilizar platos más grandes de la cultura (diámetro interior: 60 mm) con 2 mL de volumen. ARVC de cinco platos de cultura produce una muestra. Realizar aislamiento del mRNA y la transformación del cDNA según el fabricante ' Protocolo s.
- Técnicas de inmunoblot
- realizar Western Blots para investigar cambios en la expresión de la proteína (por ejemplo, para Swiprosin-1) durante el cultivo de ARVC. Utilizar una placa de cultivo (1 mL) por ejemplo.
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Representative Results
Cardiomiocitos adultos en la cultura: La figura 1 muestra un resumen de cardiomiocitos adultos recién aislado 2 h después del último lavado. Aproximadamente el 75% de los cardiomiocitos tenía una morfología en forma de barra. El 25% restante demostrado un aspecto inusual con una morfología circular y no detectable intacto membrana de la célula (figura 1). Al final del cultivo (día 6), hasta 15% de los cardiomiocitos demostró separarse, cerca de 10% quedó en una morfología redonda sin seudópodos como las estructuras, y 75% de los cardiomiocitos presentan un aspecto inusual, con una superficie irregular y sin un detectable intacta membrana de la célula (datos no mostrados).
Figura 1: Resumen de cardiomiocitos de rata recién aislada. La fracción de cardiomiocitos recién aislados que mostraron una morfología en forma ascendió a 75% de los cardiomiocitos, en promedio. El 25% restante de las células presentan un aspecto inusual con una superficie irregular y no detectable membrana intacta de la célula. Grabación se llevó a cabo por microscopia ligera 2 h después de lavar los cardiomiocitos aislados recientemente. La microscopia ligera 2 aumentos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Con microscopía de luz, ARVC recientemente aislada apareció en forma de barra y alrededor de 100 μm de tamaño (figura 2A). Recién aislado ARVC que contraen espontáneamente no eran tolerantes de calcio. Todas las células que eran redondos y sin una membrana de la célula intacta detectable sufrieron daños y no viables (figura 2A-B). En los días siguientes, la mayoría de la barra en forma de ARVC perdido esta morfología. Las células tienen redondeadas con una membrana de la célula intacta detectable. Estos ARVC eran viables. A partir de tres días las últimas células forma seudópodos como las estructuras. Algunos de estos ARVC mantuvieron su aspecto redondeado en separarse (figura 2B). Otros convirtieron en plano, ARVC polimórfica (figura 2B).
Figura 2: aislado cardiomiocitos de rata. (A) ARVC recientemente aislada eran por lo general en forma. (B) después de seis días en la cultura, estructuras semejantes a pseudópodos (separarse) fueron claramente perceptibles en la ARVC ahora redondeado. Algunos ARVC cambió totalmente a una morfología generalizada. ARVC con un aspecto inusual muestra una superficie irregular y no detectable membrana intacta de la célula. La microscopia ligera 10 aumentos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Recién aislado ARVC eran típicamente barra formada con una estriación transversal visible (figura 3, día 0). Se observaron cambios en la morfología de la célula durante los siguientes días en la cultura. En primer lugar, ARVC perdió todos sus elementos contráctiles (figura 3, días 1 y 2). Esto fue seguido por una reforma, que sarcomerogenesis de novo . La reforma fue precedida por la formación de seudópodos estructuras (extensión, figura 3, días 3 y 6). Sarcomerogenesis de novo comenzó con la aparición de las fibras de estrés de actina (figura 3, día 3). Además, haces de actina apareció en la región perinuclear y formado recién montado sarcómeros (figura 3, días 4 y 5). Este último creció a lo largo de las fibras de actina preformado tensión en la periferia (figura 3, el día 6). Al final del período de cultivo (día 6a), se observó una típica estriación cruzada de sarcómeros recién montados en la extensión ARVC.
Figura 3: tinción de fluorescencia. La de - y re - differentiation de ARVC en cultura con 20% FCS se muestra. Recién aislado ARVC con su forma típica barra (día 0) se convirtió en ronda por degradantes sarcómeros durante los primeros días de la cultura (día 1). Perdieron todos sus contráctiles elementos (día 2) seguidas por la formación de seudópodos-como las estructuras (que se separa; Días 3-5) y la posterior reforma de sus elementos contráctiles que indica sarcomerogenesis de novo (día 6). Al sexto día en la cultura, estriación transversal era claramente perceptible otra vez (día 6a). Tinción con Phalloidin-TRITC según protocolo del fabricante; "flechas": seudópodos-como las estructuras (ejemplo); *: haces de actina en la región perinuclear (ejemplar se muestra). Piezas de esta figura se publican en11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 muestra la cinética del proceso que se separa durante el cultivo. La fracción de ARVC con seudópodos como las estructuras en cada momento del examen se administra en % (figura 4). Iniciado por tres días y aumentó constantemente durante el tiempo de cultivo. 14.7 ± 1,39% de ARVC contado todos demostró seudópodos estructuras después de seis días en cultivo.
Figura 4: aumento cinético en cardiomiocitos con seudópodos como las estructuras de propagación normalizada a todos los cardiomiocitos contados (el separarse en %) durante seis días de tiempo de cultivo (n = 33 preparaciones celulares). Los datos se presentan como medios ± SEM. Esta figura se publica en11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Efecto de ionomycin en separarse de ARVC: El aislamiento y cultivo de ARVC es un calcio sensible proceso1,8. Tratamiento de ARVC con ionomycin (1 μm), que aumenta la concentración de calcio intracelular, causó una disminución significativa (p ≤0. 01) en la formación de seudópodos-como las estructuras en comparación con controles (figura 5). Cuando se compara directamente, 17.19% ± 2,45% de ARVC contado todos demostró separarse bajo condiciones de control pero solamente 9,87% ± 2.77% de ARVC contado todos forman seudópodos estructuras en presencia ionomycin (día 6 de cultivo). Así, ionomycin reducida difusión de 42.58%.
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Figura 5: propagación cinética bajo tratamiento con ionomycin. Tratamiento con ionomycin (1 μm) en el día 0 provocó una reducción altamente significativa en separarse de la célula en comparación con el control. Los datos se presentan como medios ± SEM; n = 4 preparaciones celulares; Prueba U de Mann-Whitney; * p ≤0. 05; ** p ≤0. 01 haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Además, ionomycin aumentó el porcentaje de ARVC con un aspecto inusual en comparación con las condiciones de control (figura 6). En el día seis, 71.11% ± 4,65% del total contaron ARVC tratado con ionomycin mostró un aspecto inusual. Sin embargo, bajo condiciones de control, sólo 51.35% ± 3,55% de la ARVC se clasificaron en este grupo.
Figura 6: ARVC con un aspecto insalubre. Tratamiento con ionomycin (1 μm) en el día 0 causó un aumento significativo en el número de ARVC, que demostró un aspecto inusual. En día 6, la diferencia entre control y ARVC tratados con ionomycin fue significativa. Los datos se presentan como medios ± SEM; n = 4 preparaciones celulares; Prueba U de Mann-Whitney; * p ≤0. 05 haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
En el día 3 de cultivo, bajo tratamiento con ionomycin, qRT-PCR reveló una disminución en la expresión del ARNm de β-MHC (p ≤0. 01) y OSM, que desempeñan un papel específico en la diferenciación de ARVC (Figura 7A y C). Swiprosin-1, un marcador de la diferenciación de ARVC fue significativamente o, también (figura 7B).
Figura 7: De - y re - differentiation de ARVC cultivada bajo tratamiento con ionomycin
(1 μm) en el día 0 causada una disminución del mRNA expresión de Oncostatina M (OSM) y β-MHC, que desempeñan un papel clave en la la diferenciación de cardiomiocitos adultos. Además, la expresión del mRNA de Swiprosin-1, un jugador clave en la nueva diferenciación de cardiomiocitos adultos, también fue disminuida por el ionomycin tratamiento. El día 3 de cultivo; Los datos se presentan como medios ± SEM; n = 30 placas de cultivo de células por grupo; Prueba U de Mann-Whitney; * p ≤0. 05; ** p ≤0. 01 haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Medio de la pre-galjanoplastia |
| medio CCT 20 mL |
| 2% vol. penicilina/estreptomicina (400 μL) |
| 4% vol. FCS (800 μL) |
| Medio de placas |
| medio CCT 20 mL |
| 2% vol. penicilina/estreptomicina (400 μL) |
| Medio de lavado |
| medio CCT 20 mL |
| 2% vol. penicilina/estreptomicina (400 μL) |
| Nota: 4% Vol. FCS en medio de la pre-galjanoplastia puede ser sustituido por laminina Vol.-% 1 (0,5 μg/cm2). Además, para el cultivo de cardiomiocitos por varios días Añadir 20 Vol.-% FCS al medio de lavado. Almacenar medio forro y lavado medio por 4-8 ° C hasta usar. |
Tabla 1: medios de cultivo utilizados para el aislamiento de cardiomiocitos
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Discussion
El comportamiento de los cardiomiocitos adultos en vivo está influenciado por muchas interacciones con otras células (p. ej., neuronas, células endoteliales, fibroblastos, células inflamatorias) y el sincicio eléctrico que forman1. Por lo tanto, estudiando la adaptación de la tensión de cardiomiocitos adultos exclusivamente requiere el aislamiento y cultivo de ARVC. Los principales efectos de aislar y cultivar ARVC son: 1) desconexión de la matriz extracelular y célula-célula contactos; 2) desconexión de estímulos contráctiles; 3) obligándolos a adaptarse de un tejido tridimensional entorno bidimensional. En estas condiciones, ARVC iniciar differentiation de y re como se describe anteriormente y realizar adaptaciones múltiples, que también se ven durante cardiacos remodelación en vivo (desensibilización de receptores β-adrenérgicos, rearmado de sarcómeros, etc.) 4. por lo tanto, el aislamiento de cardiomiocitos adultos representa un método válido para investigar estas células y su respuesta a diferentes tratamientos. Estas ideas se pueden utilizar luego para experimentos en vivo , que le ayudan a evitar experimentos innecesarios y reduciendo el número de animales de prueba. Ciertamente, algunas conclusiones vistos en vitro no ocurrirá en vivo (p. ej., la formación de seudópodos como las estructuras). Los célula-célula-contactos existentes dentro el sincicio eléctrico obstaculizará crecimiento excesivo bajo condiciones fisiológicas17. Sin embargo, ARVC aislada y cultivada puede utilizarse para investigar el comportamiento de los cardiomiocitos adultos. Además, los primeros ensayos de nuevas estrategias de tratamiento contra enfermedades cardíacas en los seres humanos pueden realizarse con ARVC.
El método descrito para el aislamiento y cultivo de cardiomiocitos adultos contiene algunos puntos críticos. Para obtener resultados exitosos, los siguientes elementos tienen que ser considerados.
1. tolerancia de calcio: históricamente, la tolerancia de calcio de cardiomiocitos adultos fue uno de los factores más críticos para un acertado aislamiento y cultivo de cardiomiocitos adultos1,7, 8. en la actualidad, se establecen protocolos para cultivo bajo calcio fisiológico condiciones1,3. Este manuscrito muestra la influencia de una concentración de calcio intracelular cambios en la calidad de ARVC aislada. Ionomycin, que aumenta las concentraciones de calcio intracelular, causó una disminución significativa en la difusión y un aumento significativo del número de cardiomiocitos con un aspecto inusual. Además, causó una downregulation de los marcadores claves de cardiaca de - y re - differentiation: β-MHC, OSM y Swiprosin-1. Por lo tanto, variando la concentración de calcio intracelular durante el cultivo dificulta la capacidad de adaptarse a nuevos entornos de ARVC. Aunque algunos ARVC pudieron difundir y adaptar (9,87% ± 2.77% de ARVC contado todo; Figura 5), una investigación precisa de ARVC bajo estas condiciones no es posible. En consecuencia, para una precisa aislamiento y cultivo de ARVC pueden usarse un protocolo establecido de calcio. Además, se debe asegurar que ninguno de los tratamientos investigados interfieren con la hemostasis de calcio de ARVC.
2. colagenasa: se dispone de diferentes lotes de colagenasa. Cada lote muestra diferencias en la calidad y efectividad de1. Por lo tanto, los autores recomiendan pedidos y muestras de diferentes lotes. Además, el tiempo de digestión y de la cantidad de colagenasa de cada nuevo lote utilizado necesita evaluarse por separado. En consecuencia, la concentración y el tiempo de digestión en el protocolo descrito pueden diferir a otros protocolos.
3. tiempo hasta que la perfusión del corazón: para asegurar una alta calidad de ARVC, el tiempo entre extracción el corazón desde el cuerpo y el inicio de la perfusión con el sistema de Langendorff debe ser tan corto como sea posible. Un tiempo prolongado causa daño al corazón y resulta en un mayor número de ARVC no viables.
Además, para calentar la solución de perfusión durante la perfusión y la digestión para 5 minutos después de cortar el tejido es esencial para la obtención de un buen resultado. Para evitar el daño innecesario de los tejidos biológicos, se deben manipularse con cuidado en los puntos de todos los tiempos. Además, debe señalarse que el tratamiento con OSM o concentraciones más bajas del FCS también permiten ARVC differentiate de y re4,10,18,19. Sin embargo, sin estos tratamientos nutritivos, ARVC degenerada dentro de unos días2.
En conclusión, el aislamiento y cultivo de ARVC es un método sensible que ofrece una variedad de posibilidades para investigar el comportamiento de los cardiomiocitos adultos exclusivamente.
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Disclosures
Los resultados mostrados son parte de la tesis doctoral de Franziska Nippert.
Acknowledgments
Los autores gracias Nadine Woitasky y Peter Volk para asistencia técnica. Además, los autores agradecen a la Sra. Claudia Lorenz (médico escritor, ACCEDIS) por su ayuda en la preparación del manuscrito. Este manuscrito fue apoyado financieramente por DFG (Schlu 324/7-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Langendorff perfusion system | inhouse construction | double-walled with a water based heating system |
|
| Tissue chopper Mc Ilwain | Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd. | ||
| Aortic Cannula, OD 1,8 mm | inhouse construction | ||
| Abdominal shears | Aeskulap | BC772R | |
| Capsule forceps | Eickemeyer | 171307 | |
| Dissecting scissor large | Aeskulap | BC562R | |
| Dissecting scissor small | Aeskulap | BC163R | |
| Mash with Polyamid | Neolab | 4-1413 | mash size 200 μm |
| plastic disc | Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd. | ||
| Collagenase Typ II | Worthington | LS004177 |
References
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