Summary
في هذا البروتوكول، التي تنتجها تعداء عابرة من بلازميد باكولوفيروس داخل الخلايا Sf9 باكولوفيروس وتضخيمه في ثقافة خالية من المصل تعليق. المادة طافية تنقيته من الهيبارين التقارب اللوني ويتركز المزيد من تنبيذ فائق. هذا البروتوكول مفيد لإنتاج وتنقية باكولوفيروس لتطبيق العلاج بالجينات.
Abstract
وقد استخدمت تقليديا باكولوفيروس لإنتاج البروتين المؤتلف واللقاحات. ومع ذلك، في الآونة الأخيرة، باكولوفيروس تبرز كوسيلة واعدة لتطبيق العلاج بالجينات. هنا، هو باكولوفيروس تنتجها تعداء عابرة من بلازميد باكولوفيروس الحمض النووي (باكميد) في ثقافة ملتصقة من الخلايا Sf9. بعد ذلك يتم توسيع باكولوفيروس في الخلايا Sf9 في ثقافة خالية من المصل تعليق حتى يتم الحصول على وحدة التخزين المطلوبة. ثم أنه هو تنقيته من ثقافة طافية استخدام الهيبارين التقارب اللوني. فيروس طافية يتم تحميلها على العمود الهيبارين الذي يربط جزيئات باكولوفيروس في المادة طافية بسبب تقارب الهيبارين لتغليف باكولوفيروس بروتين سكري. العمود يتم غسلها مع مخزن مؤقت لإزالة الملوثات وهو الوتيد باكولوفيروس من العمود مع عازلة عالية-الملح. هو تضعف النذرة إلى بتركيز ملح متساوي التوتر وجسيمات باكولوفيروس زيادة تركيز استخدام تنبيذ فائق. باستخدام هذا الأسلوب، يمكن أن تتركز تصل إلى 500-fold مع انتعاش 25% من الجزيئات المعدية باكولوفيروس. على الرغم من أن البروتوكول هو موضح هنا يدل على الإنتاج وتنقية باكولوفيروس من الثقافات ما يصل إلى 1 لتر، الأسلوب يمكن أن تكون زيادة في ثقافة تعليق نظام مغلق لإنتاج ناقل السريرية الصف لتطبيق العلاج بالجينات.
Introduction
باكولوفيروس يستخدم في المقام الأول لإنتاج البروتينات المؤتلف واللقاحات في ليبيدوبتيران فوجيبيردا سبودوبتيرا (Sf) 9 خلايا الحشرات باستخدام المؤتلف كاليفورنية أوتوجرافا مولتيكابسيد بوليهيدروسيس النووية الفيروسات (أكمنبف) 1 , 2 , 3 , 4. في الآونة الأخيرة، فإنه يبرز بوصفه وسيلة واعدة ل تطبيق العلاج الجيني5. من المعروف أن لديها انتحاء المضيف والأنسجة واسعة ويصيب كل هادئة وتكاثر الخلايا، هي غير ممرضة، وعدم الاندماج في المضيف كروموسوم4،،من56. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تنتج باكولوفيروس في ثقافة خالية من المصل تعليق التي هي قابلة للتطوير، ويسمح لنظام مغلق التجهيز لإنتاج السريرية في المستقبل1.
النقاء للجسيمات باكولوفيروس أمر مهم لتحقيق توصيل فعالة مع التقليل من سيتوتوكسيسيتي7،،من89. يمكن أن تتركز باكولوفيروس تنبيذ فائق أو تدفق عرضية الترشيح (النموذجي) مع تأثير محدود على العدوى به. ومع ذلك، هذه الإجراءات ليس فقط تركيز جزيئات الفيروس ولكن أيضا الحطام الخلوية والبروتينات من Sf9 الثقافة والتي يمكن أن تكون سامة في المختبر (ملاحظة شخصية) وقد حمل التهاب أو استجابة مناعية عند استخدامها في فيفو. لتجنب هذا، خاصة عند استخدام عالية تتركز مخزونات الفيروس، يلزم باكولوفيروس المعدية تنقية وفصلها عن تلويث الجسيمات.
وأبلغ العديد من الأساليب لتنقية وتركيز باكولوفيروس ناقلات10،،من1112. النهج المتاحة، يسمح الهيبارين التقارب اللوني لمستوى عال خطوة واحدة لتنقية بتركيز منخفض من تلويث البروتينات12. الأسلوب الذي يستند إلى تحديد كبريتات heparan مستقبلات باكولوفيروس13،14. بعد تحميل المادة Sf9 خلية طافية على العمود والملزم باكولوفيروس، يمكن غسلها العمود مع المخزن المؤقت (متساوي التوتر) الفسيولوجية لإزالة الجسيمات تلويث فضفاضة منضم أو غير منضم. نظراً للربط إلى الهيبارين عكسها، يمكن التيد جسيمات باكولوفيروس مع المخزن مؤقت ملح عالية، التي تضعف فورا إلى تركيز الملح (متساوي التوتر) الفسيولوجية لمنع المنظمة من صدمة ناضح12. وعلاوة على ذلك، إنتاج باكولوفيروس، فضلا عن القبض على وشطف من العمود اللوني، يمكن أن يؤديها باستخدام عملية النظام المغلق الذي يتوافق مع ممارسات التصنيع الجيدة الحالية (المركب).
هنا، نحن نقدم بروتوكول مفصل لتصنيع وتنقية، وتركيز باكولوفيروس المعدية باستخدام الفصل اللوني لتقارب والطرد المركزي. باختصار، نحن إنتاج باكولوفيروس من تعداء الخلايا Sf9 مع باكولوفيروس بلازميد الحمض النووي في الثقافة ملتصقة وتوسيع باكولوفيروس المعدية في ثقافة خالية من المصل تعليق. ونحن نق باكولوفيروس استخدام الهيبارين التقارب اللوني واستخدام تنبيذ فائق كخطوة أخيرة عالية التركيز متجه لتطبيق العلاج بالجينات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
انظر الشكل 1 لمثال على تلخيص البروتوكول.
1-تنقية باكولوفيروس بلازميد الحمض النووي
- تنمو ثقافة البكتيرية التي تحتوي على باكولوفيرال بلازميد الحمض النووي (باكميد)14 في 200 مل مرق LB مع المضادات الحيوية؛ كاناميسين (50 ميكروغرام/مل)، التتراسيكلين (10 ميكروغرام/مل)، ومع الجنتامايسين (7 ميكروغرام/مل)، عن ح 16 في 37 درجة مئوية في جو شاكر مداري 300 لفة في الدقيقة.
- تنقية باكميد الحمض النووي من ثقافة البكتيرية باستخدام بروتوكول قياسي تحلل القلوية15، وحل باكميد في المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات.
2-إنتاج باكولوفيروس
- الخلايا Sf9 الثقافة في حاضنة شاكر مداري في 135 دورة في الدقيقة و 28 درجة مئوية في البولي قارورة Erlenmeyer المحتوية على الحشرات خالية من المصل الثقافة المتوسطة1،،من23.
ملاحظة: إذا هي إذابة الخلايا Sf9 من الأوراق المالية المجمدة، السماح بأسبوعين على الأقل للخلايا لاسترداد ويدخل مرحلة النمو الأسى. - عد الخلايا Sf9 حصاد المرحلة الأسية للنمو مع هيموسيتوميتير بعد تلطيخ مع تريبان الأزرق. البذور 1 × 106 الخلايا Sf9 قابلة للحياة الواحدة وكذلك في لوحة المعالجة بزراعة الأنسجة 6-جيدا في 2 مل متوسطة. يسمح الخلية أن أرفق ح 1 في 28 درجة مئوية في حاضنة.
- استبدال المتوسطة النمو مع 1 مل من الحشرات الثقافة المتوسطة المصل خالية أونسوبليمينتيد غريس.
- ترانسفيكت باكميد الحمض النووي في الخلايا Sf9 باستخدام كاشف تعداء الخلايا الحشرات.
- 8 ميكس ميليلتر خلية الحشرات تعداء الكاشف مع 100 ميليلتر من متوسط حشرة غريس.
- تمييع 2 ميكروغرام من باكميد الحمض النووي إلى 100 ميليلتر من متوسط حشرة أونسوبليمينتيد، وتخلط بلطف قبل فورتيكسينج.
- الجمع بين الحمض المخفف مع الكاشف تعداء المخفف خلية الحشرات، وتخلط برفق. احتضان لمدة 15 إلى 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة خليط الحمض الدهني دروبويسي على الخلايا. تبني في 28 درجة مئوية في حاضنة لحوالي 5 ساعات.
- إزالة تعداء خليط من الخلايا وغسل الخلايا مع 2 مل من برنامج تلفزيوني.
- إضافة 2 مل من الحشرات الثقافة المتوسطة وتواصل الثقافة عند 28 درجة مئوية في حاضنة دون تغيير في وسائل الإعلام.
ملاحظة: إذا كان باكميد يحتوي على بروتين فلوري، يمكن الكشف عن التعبير عنه في الخلايا تعداء بعد 48 ساعة. باكولوفيروس تنتجها الخلايا Sf9 transfected ويفرز في المتوسط الثقافة الذي يصيب الخلايا أونترانسفيكتيد في وقت لاحق. سكان الخلية بأكملها يصاب مع باكولوفيروس في 5 أيام وتظهر علامات للعدوى الفيروسية، ودعا أيضا تأثير سيتوباثيك. وتشمل هذه الخلية زيادة القطر، فاكوليس/الحبيبات في السيتوبلازم، ووقف نمو الخلايا والخلايا ميتة أو تفكيك موجودة في خلية ثقافة. ومع ذلك، إذا كانت كفاءة تعداء أو الإصابة ليس الحل الأمثل، الثقافة قد لا تظهر تأثير سيتوباثيك واضح. يمكن تصور أثر سيتوباثيك مع مجهر مقلوب المرحلة في 200-400 X التكبير. ويمكن الكشف عن خلية باكولوفيروس المصابة تلطيخ مع الأجسام المضادة-gp6411. - حصاد باكولوفيروس طافية 5 أيام بعد تعداء والتسمية كمخزون الفيروس1 ف.
- تخزين باكولوفيروس طافية، وحساسة للضوء، في الظلام مع ألبومين المصل البقري 0.5% (BSA) في برنامج تلفزيوني. تخزين عند 4 درجة مئوية لفترات قصيرة (تصل إلى 90 يوما)، أو في-80 درجة مئوية على المدى الطويل.
- بذور 6 × 106 Sf9 الخلايا الموجودة في لوحة المعالجة بزراعة الأنسجة 10 سم في 10 مل من الحشرات الثقافة المتوسطة. أضف 1 مل من الأولى باكولوفيروس طافية (ع1) إلى الخلايا.
- حصاد باكولوفيروس طافية (ف2) في 5th يوم ما بعد الإصابة.
- بذور 50 مل من الخلايا Sf9 (3 × 106 خلايا/مل) في تعليق الثقافة المتوسطة الثقافة الحشرات في البولي 250 مل قارورة Erlenmeyer ومكان قارورة في حاضنة شاكر مداري. إضافة 2 مل ف2 المخزون إلى الخلايا ويهز 135 لفة في الدقيقة مع الحفاظ على درجة حرارة ثابتة من 28 درجة مئوية.
ملاحظة: ثلاثة أو أربعة أيام بعد الإصابة، سوف تظهر جميع السكان الخلايا Sf9 تأثير سيتوباثيك، الذي يعتبر مؤشرا لإنتاج عالية-عيار باكولوفيروس. - التسلسل تضخيم supernatants باكولوفيروس حتى يتم الحصول على وحدة التخزين المطلوبة (ف3، ف4،...) بزيادة 10 إلى 50-fold حجم الخلية والثقافة في كل العدوى اللاحقة.
ملاحظة: ف3 هو 3rd جولة من العدوى يمكن أن يصاب في أي 500 مل و 1 لتر Sf9 خلية ثقافة مع 10 إلى 20 مل من ف2 باكولوفيروس طاف؛ ف4 من 4ال جولة من العدوى يمكن أن يصاب فيها ل 5 إلى 10 من Sf9 ثقافة الخلية مع 100 إلى 200 مل ف3 باكولوفيروس المادة طافية، وهلم جرا. عادة، يتم المصنف الخلايا Sf9 في6 3 × 10 خلايا/مل في وسائل الإعلام ثقافة خالية من المصل الحشرات. - الطرد المركزي باكولوفيروس طافية في 1,000 ز س لمدة 30 دقيقة عند 4 درجة مئوية إزالة الحطام الخلوية وعلاج باكولوفيروس طافية مع 50 وحدة/مل نوكلياسي (250 وحدات/ميليلتر للأوراق المالية) ح 2 في 37 درجة مئوية لهضم المجينية الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي. تصفية سوبيرناتانتس عن طريق وحدة ترشيح 0.45 ميكرومتر.
3-إعداد النظام اللوني
- تحضير النظام اللوني بالتتابع الشطف عينة والمخزن المؤقت خطوط كل مع الماء المعقم، 1 N هيدروكسيد الصوديوم، والمياه، وتغسل المخزن المؤقت (كلوريد الصوديوم 150 مم تحتوي على 20 مم فوسفات الصوديوم العازلة، ودرجة الحموضة 7.0) بمعدل تدفق خطي من 50 مل/دقيقة.
- إعداد عمود الهيبارين 50 ميكرومتر (10 × 10 سم، 7.9 مل حجم العمود (CV)) عن طريق تشغيل التسلسل العمود تنظيف المخزن المؤقت (5 السيرة الذاتية العقيمة 20 مم فوسفات الصوديوم العازلة التي تحتوي على 2 م كلوريد الصوديوم، درجة الحموضة 7.0) والسيرة الذاتية 5 يغسل العازلة بمعدل تدفق خطي 7 مل/دقيقة.
4-تنقية ناقل باكولوفيروس
- إعداد النظام اللوني كما يلي:
- استخدام نموذج تحميل مدخل الميناء لتحميل باكولوفيروس طافية.
- استخدام منفذ مدخل المخزن المؤقت A1 لتحميل المخزن المؤقت الغسيل. تحضير زجاجة مع 500 مل على الأقل من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي ووضع خط المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي في الزجاجة.
- استخدام منفذ مدخل المخزن المؤقت A2 لتحميل المخزن المؤقت شطف (20 مم فوسفات الصوديوم مع كلوريد الصوديوم 1.5 متر، والرقم الهيدروجيني 8.0). تحضير زجاجة مع 500 مل على الأقل من المخزن المؤقت شطف ومكان الخط العازل شطف إلى القمقم.
- إدراج عدة أنابيب مخروطية 50 مل في جامع الكسر جمع العمود المار باكولوفيروس طافية والمخزن المؤقت أغسل باكولوفيروس التيد.
- حجته العمود الهيبارين مع خمسة مجلدات العمود مل 7.9 (السير الذاتية) يغسل المخزن المؤقت (40 مل) بمعدل تدفق خطي 7.0 مل/دقيقة.
- تحميل 250 مل باكولوفيروس طافية على الهيبارين العمود باستخدام مضخة العينة (مدخل الميناء عينة) للنظام اللوني بمعدل تدفق خطي 2.0 مل/دقيقة.
- 10 السير الذاتية (80 مل) من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي من خلال تشغيل الهيبارين العمود بمعدل تدفق خطي 2.0 مل/دقيقة حتى منحنى امتصاص الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) (280 nm) قد عاد إلى خط الأساس وتصبح مستقرة.
- الوت الجسيمات باكولوفيروس من العمود الهيبارين مل 7.9 مع السير الذاتية 5 (40 مل) من المخزن المؤقت شطف بمعدل تدفق خطي 4.0 مل/دقيقة يشاهد لذروة شطف حادة من البروتين في تشروماتوجرام عند فصل الجسيمات باكولوفيروس من العمود الهيبارين.
- بعد شطف، تضعف المادة طافية باكولوفيروس الوتيد 10 إضعاف استخدام 20 مم فوسفات الصوديوم العازلة في المياه لمنع المنظمة جسيمات باكولوفيروس من صدمة ناضح أثناء الطرد المركزي اللاحقة فورا.
- تخزين 100 ميليلتر لكل من الكسور، بما في ذلك التدفق عبر الأعمدة التي جمعت أثناء تحميل المادة طافية باكولوفيروس، المخزن المؤقت الغسيل، والنذره. تصيب هذه الكسور باكولوفيروس إلى HT1080 لتقييم عملية تنقية (انظر القسم 6).
- تنظيف العمود مع عمود تنظيف المخزن والمخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي. وأخيراً، شطف العمود مع السيرة الذاتية 5 العقيمة الإيثانول 20% في المياه بمعدل تدفق خطي 7.0 مل/دقيقة وتخزينها في 4 درجات مئوية.
- تنظيف النظام اللوني مع الماء، هيدروكسيد الصوديوم 1 ن، مرة أخرى مع الماء، والايثانول 20% في المياه بمعدل تدفق خطي 50.0 مل/دقيقة وتخزين النظام في الإيثانول 20%.
5-تركيز باكولوفيروس
- قبل تعقيم أنابيب الطرد المركزي باستخدام اﻷوتوكﻻف. إضافة وحدة تخزين متساوية من باكولوفيروس طافية على كل أنابيب أولتراسينتريفوجي في غطاء زراعة الأنسجة. قياس وزن الأنبوبة بتوازن وضبط وزن محتويات الأنابيب ultracentrifuge مع PBS العقيمة.
- ضع كل من أنابيب أولتراسينتريفوجي في معارضة دلو من الدوار "سويسري 32 منظمة الشفافية الدولية".
- تشغيل في أولتراسينتريفوجي في 80,000 × ز لمدة 90 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- فتح أنابيب أولتراسينتريفوجي في غطاء زراعة الأنسجة ونضح السائل أسيبتيكالي دون إزالة بيليه باكولوفيروس.
- ريسوسبيند بيليه من كل أنبوبة بقوة بيبيتينج صعودا وهبوطاً مع 200 ميليلتر برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.5% (w/المجلد) جيش صرب البوسنة.
- نقل باكولوفيروس تتركز على كريوفيالس (50 إلى 100 ميليلتر للقنينة الواحدة) وتخزينها في-80 درجة مئوية.
6-معايرة باكولوفيروس
- في اليوم قبل الإصابة، عد الخلايا HT1080 باستخدام هيموسيتوميتير بعد تلطيخ الخلايا مع تريبان الأزرق. البذور 1 × 105 HT1080 الخلايا الواحدة وكذلك في لوحة 6-جيدا في 2 مل من المتوسطة (دميم "تعديل النسر" دولبيكو) التي تحتوي على 10% مصل بقرى الجنين (FBS). البذور عدة آبار إضافية ليتمكن من تحديد العدد الدقيق للخلايا الحالية في وقت الإصابة. ثقافة الخلايا في حاضنة في 37 درجة مئوية و 5% CO2.
ملاحظة: وتستخدم الخلايا HT1080 للمعايرة كما يعربون عن مستوى أعلى من كبريتات heparan مقارنة بغيرها خلية خطوط16. حيث تكون الخلايا HT1080 ملتصقة، المعايرة أبسط وأقل استهلاكاً للوقت مقارنة باستخدام المعايرة التقليدية المستندة إلى Sf9. - اليوم من العدوى، تحديد عدد الخلايا كل بئر من عد الخلايا من الآبار. تصيب الخلايا عن طريق إضافة باكولوفيروس الأصلي المخفف الذي كان قد نقض قبل تنقية العمود، ومع عينات من التدفق عبر العمود والمياه والصرف الصحي، والكسور شطف. لكل عينة، تحديد تمييع وحجم تجريبي يستند إلى جسيمات باكولوفيروس المعدية، وتصيب كل بئر في ثلاث نسخ.
- يومين بعد الإصابة، تحليل الخلايا للتعبير عن الجينات للفائدة. يمكن تحليل الخلايا استخدام cytometer تدفق إذا يعربون البروتينات فلورية (مثل التجارة والنقل)17.
- حساب التتر (وحدة المعدية كل مل) استناداً إلى العدد الخلايا حاضرا وقت الإصابة، وعامل التخفيف، والنسب المئوية للبروتين الفلورسنت في الخلايا باستخدام الصيغة: (عدد الخلايا أثناء الإصابة × نسبة بروتين فلوري عامل إضعاف × الخلايا إيجابية)/حجم باكولوفيروس في مل.
ملاحظة: على سبيل المثال، إذا كان إجمالي عدد الخلايا في البئر في وقت الإصابة هو 1.2 × 105والنسبة المئوية للبروتين الفلورسنت هو 5%، عامل إضعاف وهو 100 وهو حجم باكولوفيروس المخفف إضافة 10 ميليلتر، عيار7 × 10 6 وحدات المعدية (وحدة دولية) /mL.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
البروتوكول قدم في رسم تخطيطي تدفق (الشكل 1). وتشمل الخطوات عابر تعداء الخلايا Sf9 مع باكميد الحمض النووي لإنتاج باكولوفيروس في الثقافة ملتصقة في صفيحة، التضخيم اللاحقة في الثقافة تعليق خالية من المصل، العلاج نوكلاس والتوضيح بالطرد المركزي والترشيح، والتنقية استخدام كروماتوغرافيا تقارب الهيبارين متبوعاً بتركيز مع تنبيذ فائق.
بعد ذوبان الجليد، Sf9 الخلايا بحاجة إلى أسبوعين على الأقل للتعافي والدخول في مرحلة النمو الأسى. تزايد نشاط Sf9 هي transfected الخلايا مع باكميد الحمض النووي في الثقافة ملتصقة. Gp64 يتم الكشف عن يومين بعد تعداء، التعبير عن glycoproteins مغلف باكولوفيروس، وفي وقت لاحق، هو إنتاج باكولوفيروس شرع11. ولما باكولوفيروس النسخ المتماثل المختصة، يزيد عدد الخلايا المصابة تدريجيا نتيجة لعدوى تدريجي للخلايا مع باكولوفيروس المنتجة حديثا أن يفرز إلى المتوسطة النمو. باكولوفيروس الذي يحتوي على الخلية سوبيرناتانتس المقطوع 5 أيام بعد تعداء عندما يصاب سكان الخلية بأكملها. يعين هذا الفيروس الأولى طاف مرور 1 (ع1) المخزون. يستخدم المخزون1 ف للعدوى اللاحقة لثقافة ملتصقة المصنف حديثا من الخلايا Sf9 في لوحة أكبر. يظهر السكان الخلية بأكملها علامة على الإصابة في 5 أيام وهو ما يسمى تأثير سيتوباثيك (الشكل 2). المادة طافية من ثقافة ملتصقة الخلية الثانية هو المقطوع، واعتبرت بمثابة مخزون2 ف. كذلك يتم تضخيمه باكولوفيروس المادة طافية في Sf9 تعليق الثقافة عن طريق العدوى الجارية من الخلايا Sf9 المضافة حديثا في قارورة شاكر مع الخلية خالية من المصل الحشرات الثقافة المتوسطة. في نهاية كل دورة العدوى، تظهر معظم الخلايا تأثير سيتوباثيك زيادة قطر خلوية وخلايا ميتة أو تفكيك، التي علامات لانتهاء إصابة باكولوفيروس. يتم تضخيمه الأسهم باكولوفيروس تسلسلياً حتى يتم الحصول على وحدة التخزين المطلوبة (ف3، ف4،...). يتم فصل المادة طافية من الخلايا Sf9 بالطرد المركزي ذات سرعة منخفضة، تعامل مع نوكلياسي لتقليل اللزوجة، التي تمت تصفيتها من خلال غشاء 0.45 ميكرومتر، قبل استخدامها في تنقية وتركيز الخطوات اللاحقة.
لتنقية باكولوفيروس، يتم تحميل المادة طافية من الخلايا Sf9 المصابة على عمود الهيبارين. يصبح مشبعة العمود الهيبارين تدريجيا مع باكولوفيروس بقوة ملزمة والملوثات فضفاضة ملزمة البروتين. هو تشطف العمود الهيبارين مع المخزن المؤقت للغسيل إزالة الملوثات حتى منحنى امتصاص الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) (280 nm) ترجع إلى خط الأساس ويصبح مستقرا، مشيراً إلى إزالة المواد المنضمة وغير المنضمة فضفاضة من العمود. من ناحية أخرى ربط الجسيمات باكولوفيروس بشدة إلى العمود الهيبارين. ولذلك، يتم الكشف عن لا كمية كبيرة من الفيروسات في المخزن المؤقت لعمود المياه والصرف الصحي. هي التيد جسيمات باكولوفيروس الهيبارين زمنياً مع 1.5 متر من كلوريد الصوديوم على درجة الحموضة 8.0 والمخفف 10 إضعاف مع المخزن المؤقت لتحقيق isotonicity ومنع الفيروسات المنظمة. ويلاحظ ذروة حادة من البروتين خلال شطف الذي يتوافق مع الكسر باكولوفيروس (الشكل 3). الظروف الأمثل لتحميل عينة والغسيل وشطف المستخدمة في هذا الفصل اللوني لبروتوكول الغلة أكثر من 50 ٪ الانتعاش الجسيمات باكولوفيروس المعدية المنقي. سوبيرناتانتس المخفف مزيدا من تركيز يصل إلى 500-fold مع تنبيذ فائق وصياغتها في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.5% جيش صرب البوسنة، التي تؤدي استرداد 25% صافي11.
الشكل 1 . الرسم التخطيطي لإنتاج وتنقية باكولوفيروس. هي المصنف الخلايا Sf9 في لوحة المعالجة بثقافة الخلية transfected مع باكميد الحمض النووي. باكولوفيروس المادة طافية حصادها واستخدامها لتصيب الخلايا Sf9 الجديدة في الثقافة ملتصقة. بعد ذلك يتم نشر الخلايا المصابة في ثقافة خالية من المصل تعليق. تعامل مع نوكلاس باكولوفيروس المادة طافية، تثفيل، وتصفيتها. باكولوفيروس تنقيته من الهيبارين تقارب العمود اللوني، تضعف في المخزن المؤقت، وتتركز أسيبتيكالي واسطة تنبيذ فائق. وأخيراً، يتم تخزين باكولوفيروس طافية في-80 درجة مئوية. (هذا الرقم قد تم تكييفه من ناسيموزامان et al.، 2016، مول هناك أساليب نوتر تطوير عام 2016؛ 3:16071 مع الإذن.) الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 . آثار سيتوباثيك من باكولوفيروس إصابة الخلايا Sf9. واستخدمت المادة طافية باكولوفيروس لإصابة الخلايا Sf9 في صفيحة زراعة أنسجة تعامل. خمسة أيام بعد الإصابة، تم تصور الخلايا مع مجهر مقلوب المرحلة. A) الخلايا Sf9 مصابة كعنصر تحكم. ب) باكولوفيروس إصابة الخلايا Sf9 يظهر تأثير سيتوباثيك. يتم عرض الخلايا في 200 X التكبير. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 . عدد باكولوفيروس المعدية في التدفق عبر خلال الفصل اللوني لتقارب الهيبارين. وقدرت التتر باكولوفيروس عدوى خلايا HT1080. كانت منها عينات اختبار رونثروغ العمود والمياه والصرف الصحي، والنذره. وقد تضعف العينات حسب الحاجة. يظهر السطر (الظلام الماس) مجموع الوحدات المعدية (وحدة دولية) من باكولوفيروس في كل جزء. حجم كسر العمود التدفق من خلال عينة ويغسل المخزن المؤقت 40 مل في كل أنبوبة، والنذره 10 مل في كل أنبوبة. (هذا الرقم قد تم تكييفه من ناسيموزامان et al.، 2016، مول هناك أساليب نوتر تطوير عام 2016؛ 3:16071 مع الإذن.) الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويصف البروتوكول المعروضة هنا إنتاج باكولوفيروس في الخلايا Sf9 في ثقافة الوقف، وتنقية باكولوفيروس الهيبارين تقارب لوني باستخدام. المعلمات المستخدمة في هذا البروتوكول تعظيم العائد وتقليل المنظمة باكولوفيروس المعدية. يظهر هنا وينص البروتوكول تحقيق انتعاش تحسنت بشكل ملحوظ للجسيمات باكولوفيروس مقارنة بالمبالغ المستردة بالآخرين9.
سبب انتحاء المضيف واسعة النطاق، والأنسجة، وأجريت دراسات عدة في الجهاز العصبي المركزي، والكبد والعين، والمبيض، والبروستاتا، والخصية مع باكولوفيروس بوساطة الجينات تسليم5،،من67،8 . باكولوفيروس الناقلة التي تحتوي على الجينات العلاجية، مثل الجينات الانتحارية وورم المكثف الجينات والجينات الترميز الخاصة بالورم المستضدات قد أجريت بنجاح في السريري نماذج الحيوان18،19. على الرغم من أن يمكن ترانسدوسي باكولوفيروس الخلايا البشرية، فيمكن نشرة فقط في خلايا الحشرات ونتيجة لذلك لا تشكل خطرا على البشرية المستلمين.
وتنتج باكولوفيروس في خلايا الحشرات تعداء عابرة من باكميد الحمض النووي. نوعية باكميد أمر بالغ الأهمية لإنتاج عالية-عيار باكولوفيروس. عادة، يقوم باكميد الطازجة أفضل من تلك التي يتم تخزينها في الثلاجة لفترة طويلة من الزمن. تزايد نشاط Sf9 الخلايا هي transfected كفاءة التي تنتج باكولوفيروس عيار عالية. أثناء مرحلة التضخيم، من المهم تحسين تركيز الخلية في ثقافة الوقف وحجم باكولوفيروس طافية المستخدمة للعدوى. إذا لم تكن نسبة الجزيئات باكولوفيروس للخلايا الأمثل، قد يكون عائد باكولوفيروس أقل من المتوقع (شخصية ملاحظة، مينيسوتا).
أثناء تحميل باكولوفيروس طافية على العمود الهيبارين، من المهم أن تحقق من خلال التدفق لجزيئات الفيروس التي قد تمر عبر العمود. إذا حدث ذلك، عمود أقل سرعة بتشغيل قد تكون ضرورية أو ينبغي تحميله حجم أصغر من المادة طافية على العمود. يتم غسله معظم الملوثات الموجودة في سوبيرناتانتس باكولوفيروس خلال الخطوة الغسيل تشغيل اللوني. نحن تقييم نقاء باكولوفيروس تلطيخ الفضي من دوديسيل كبريتات الصوديوم (SDS)-polyacrylamide هلام هلام التفريد (صفحة)، والالكترون المجهرية دراسة ووجدت أن لدينا باكولوفيروسيس المنقي12من نوعية جيدة.
لدينا بعناية الأمثل الشروط الملزمة ووجدت أن المتوسط الهيبارين بوروس متفوقة على وسائل الإعلام الأخرى الهيبارين (على سبيل المثال. الهيبارين هيتراب أو كاتو) في قدرته على التقاط جزيئات باكولوفيروس (ملاحظة شخصية). قدرة الهيبارين على ربط باكولوفيروس أعلى سرعة عينة وقدرة المهم لتقليل وقت المعالجة النهائية لعملية التصنيع على نطاق واسع. وإلى جانب باكولوفيروس، يربط المتوسطة الهيبارين أيضا البروتينات تلويث الأخرى التي لها صلة الهيبارين. يمكن القضاء على معظم التلوث منخفضة الوزن الجزيئي بخطوة ترشيح (النموذجي) تدفق عرضية المصب للفصل اللوني الهيبارين تشغيل. TFF يستخدم أيضا كبديل للطرد المركزي لتركيز المنتج20.
يمكن استخدام هذا البروتوكول لتنقية الفيروسات الأخرى والبروتينات التي لها صلة الهيبارين. ومع ذلك، قد يلزم إدخال تعديلات على تكوين المخزن المؤقت لغسل وشطف ومعدل التدفق.
إنتاج البروتين المؤتلف يعمل جيدا باستخدام سوبيرناتانتس باكولوفيروس أونبوريفيد مباشرة. ولذلك، يمكن استخدام باكولوفيروس الخام لإنتاج البروتين المؤتلف. ومع ذلك، إذا استخدمت باكولوفيروسيس كناقل لنقل الجينات في فيفو ، أو كلقاح، خطوات تنقية إضافية مثل اللوني وهلام الترشيح و/أو تنبيذ فائق اللازمة للحصول على باكولوفيروس نقية ومركزة الجسيمات وتقليل الشوائب المستمدة من الخلية ووسائط الثقافة المنتجة لتجنب التسمم والتهاب واستجابة مناعية.
وفي الختام، لقد قمنا بوصف بروتوكول بسيط لإنتاج وتنقية من باكولوفيروس التي يمكن أن تكون زيادة لتصنيع البروتينات المؤتلف، واللقاحات، وناقلات العلاج بالجينات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن لا تضارب في المصالح.
Acknowledgments
هذا العمل هو تدعمها جزئيا من مؤسسة البحوث (الرشيد سينسيناتي للأطفال) التمويل الأولى لرائد ومنحة أساسية مبتكرة (ICG) يدعمه المركز الوطني "النهوض بالعلوم متعدية الجنسيات" من "معاهد الصحة الوطنية في" إطار جائزة رقم UL1 TR001425. المحتوى هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية "المعاهد الوطنية للصحة".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Akta Avant 150 | GE Healthcare | 28976337 | Chromatography system |
| POROS Heparin 50 µm Column | ThermoFisher Scientific | 4333414 | Heparin column |
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | Non-catalog item | Concentrates virus at high-speed |
| Polyallomer Ultracentrifuge tube | Beckman-Coulter | 326823 | Concentrates virus at high-speed |
| MaxQ 8000 orbital shaker incubator | ThermoFisher Scientific | Non-catalog item | Shaker for suspension culture |
| 250 mL Erlenmeyer flasks | ThermoFisher Scientific | 238071 | Flask for suspension culture |
| 1 L Erlenmeyer flasks | ThermoFisher Scientific | 238072 | Flask for suspension culture |
| Microscope (Olympus CKX41) | Olympus | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | For clarification of Baculovirus supernatant |
| 50 ml Conical tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | For collection of Baculovirus supernatant |
| 6-well plate | ThermoFisher Scientific | 07-200-80 | Tissue culture treated plate |
| 10-cm plate | ThermoFisher Scientific | 08-772E | Tissue culture treated plate |
| Stericup-HV, 0.45 µm, PVDF | EMD-Millipore | SCHVU05RE | Filtration unit |
| Kanamycin | ThermoFisher Scientific | 15160-054 | |
| Tetracycline | Sigma-Aldrich | T7660 | |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15750-060 | |
| Bac-to-Bac Vector Kit | ThermoFisher Scientific | 10360-014 | Baculovirus expression system |
| DH10B-T1R Competent cell | ThermoFisher Scientific | 12331-013 | Competent cell for bacmid |
| TE buffer | In-house | Non-catalog item | 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0. |
| Plasmid Maxiprep kit | ThermoFisher Scientific | K2100-06 | For bacmid purification |
| Sf9 Cells | ThermoFisher Scientific | 11496-015 | Insect cells |
| Grace’s Insect Cell Culture Medium | ThermoFisher Scientific | 11605-094 | Transfection medium |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 20012227 | Washing cells, diluting samples |
| HyClone SFX-Insect cell media | GE Healthcare | SH30278.02 | Serum-free insect cell growth medium |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Enzyme to degrade DNA and RNA |
| Baculovirus plasmid (bacmid) DNA | In-house | Non-catalog item | Bacmid for Baculovirus Production |
| Cellfectin II | ThermoFisher Scientific | 10362 | Transfection reagent for insect cells |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4737 | Stabilizes Baculovirus |
| Cryovial | Thomas Scientific | 1222C24 | For storage of Baculovirus |
| HT1080 cell line | ATCC | CCL-121 | Fibroblast cell line |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Growth media for cell lines |
| Wash buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 150 mmol/l sodium chloride |
| Elution buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 1.5 mol/l sodium chloride |
| Column cleaning buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 2.0 mol/l sodium chloride |
| Sterile water | In-house | Non-catalog item | For Akta Avant cleaning |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.09137 | For Akta Avant cleaning |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7073 | For Akta Avant cleaning |
References
- Ikonomou, L., Schneider, Y. J., Agathos, S. N. Insect cell culture for industrial production of recombinant proteins. Appl Microbiol Biotechnol. 62 (1), 1-20 (2003).
- Contreras-Gomez, A., Sanchez-Miron, A., Garcia-Camacho, F., Molina-Grima, E., Chisti, Y. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnol Prog. 30 (1), 1-18 (2014).
- Cox, M. M. Recombinant protein vaccines produced in insect cells. Vaccine. 30 (10), 1759-1766 (2012).
- Boyce, F. M., Bucher, N. L. Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (6), 2348-2352 (1996).
- Airenne, K. J., et al. Baculovirus: an insect-derived vector for diverse gene transfer applications. Mol Ther. 21 (4), 739-749 (2013).
- Sung, L. Y., et al. Efficient gene delivery into cell lines and stem cells using baculovirus. Nat Protoc. 9 (8), 1882-1899 (2014).
- Zeng, J., Du, J., Lin, J., Bak, X. Y., Wu, C., Wang, S. High-efficiency transient transduction of human embryonic stem cell-derived neurons with baculoviral vectors. Mol Ther. 17 (9), 1585-1593 (2009).
- Zeng, J., Du, J., Zhao, Y., Palanisamy, N., Wang, S. Baculoviral vector-mediated transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells. Stem Cells. 25 (4), 1055-1061 (2007).
- Wu, C., Soh, K. Y., Wang, S. Ion-exchange membrane chromatography method for rapid and efficient purification of recombinant baculovirus and baculovirus gp64 protein. Hum Gene Ther. 18 (7), 665-672 (2007).
- Grein, T. A., Michalsky, R., Vega Lopez, M., Czermak, P. Purification of a recombinant baculovirus of Autographa californica M nucleopolyhedrovirus by ion exchange membrane chromatography. J Virol Methods. 183 (2), 117-124 (2012).
- Nasimuzzaman, M., Lynn, D., van der Loo, J. C., Malik, P. Purification of baculovirus vectors using heparin affinity chromatography. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16071 (2016).
- Makkonen, K. E., Turkki, P., Laakkonen, J. P., Yla-Herttuala, S., Marjomaki, V., Airenne, K. J. 6-o- and N-sulfated syndecan-1 promotes baculovirus binding and entry into Mammalian cells. J Virol. 87 (20), 11148-11159 (2013).
- Nasimuzzaman, M. Heparan sulfate in baculovirus binding and entry of mammalian cells. J Virol. 88 (8), 4607-4608 (2014).
- Urabe, M., et al. Scalable generation of high-titer recombinant adeno-associated virus type 5 in insect cells. J Virol. 80 (4), 1874-1885 (2006).
- Feliciello, I., Chinali, G. A modified alkaline lysis method for the preparation of highly purified plasmid DNA from Escherichia coli. Anal Biochem. 212 (2), 394-401 (1993).
- Nasimuzzaman, M., Persons, D. A. Cell Membrane-associated heparan sulfate is a receptor for prototype foamy virus in human, monkey, and rodent cells. Mol Ther. 20 (6), 1158-1166 (2012).
- Earl, P. L., Americo, J. L., Moss, B. Development and use of a vaccinia virus neutralization assay based on flow cytometric detection of green fluorescent protein. J Virol. 77 (19), 10684-10688 (2003).
- Kim, Y. K., et al. Suppression of tumor growth in xenograft model mice by programmed cell death 4 gene delivery using folate-PEG-baculovirus. Cancer Gene Ther. 17 (11), 751-760 (2010).
- Stanbridge, L. J., Dussupt, V., Maitland, N. J. Baculoviruses as vectors for gene therapy against human prostate cancer. J Biomed Biotechnol. 2003 (2), 79-91 (2003).
- Nasimuzzaman, M., et al. Production and purification of high-titer foamy virus vector for the treatment of leukocyte adhesion deficiency. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16004 (2015).
