Summary
I detta protokoll, baculoviridae produceras av övergående transfection av baculoviridae plasmid i Sf9 celler och förstärks i en serumfritt suspension kultur. Supernatanten renas av heparin affinitetskromatografi och ytterligare koncentrerad genom ultracentrifugering. Detta protokoll är användbar för produktion och rening av baculoviridae för gen terapi program.
Abstract
Baculoviridae har traditionellt använts för produktion av rekombinant protein och vaccin. Mer nyligen, baculoviridae framstår dock som en lovande vektor gen terapi program. Här produceras baculoviridae av övergående transfection av baculoviridae plasmiden DNA (bacmid) i en vidhäftande kultur Sf9 celler. Baculoviridae utökas därefter Sf9 celler i ett serumfritt suspension kultur tills önskad volym erhålls. Det renas sedan från kulturen supernatanten med heparin affinitetskromatografi. Virus supernatant är lastades på kolumnen heparin som binder baculoviridae partiklar i supernatanten på grund av heparin för baculoviridae omsluta glykoprotein. Kolumnen är tvättad med en buffert för att avlägsna föroreningar och baculoviridae elueras från kolonnen med en hög-salt-buffert. Eluatet är utspätt till en isoton salt koncentration och baculoviridae partiklarna är ytterligare koncentrerad använder ultracentrifugering. Med den här metoden kan baculoviridae koncentreras upp till 500 med en 25% återvinning av infektiös partiklar. Även om protokollet beskrivs här visar produktion och rening av baculoviridae från kulturer upp till 1 L, metoden kan skalas upp i en stängd-systemet suspension kultur att producera en klinisk-grade vektor för gen terapi program.
Introduction
Baculoviridae används främst för produktion av rekombinanta proteiner och vacciner i fjärilsarts Spodoptera fugiperda (Sf) 9 insekt celler med hjälp av rekombinant Autographa californica multicapsid nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV) 1 , 2 , 3 , 4. mer nyligen, det framstår som en lovande vektor för gen terapi program5. Det är känt för att ha en bred värd och vävnad tropism, infekterar både quiescent och prolifererande celler, är icke-patogena och integrera inte i värd kromosom4,5,6. Dessutom kan baculoviridae produceras i serumfritt suspension kultur som är skalbar och möjliggör slutet system bearbetning för framtida kliniska produktion1.
Renheten i baculoviridae partiklar är viktigt för att uppnå effektiv transduktion samtidigt minimera cytotoxicitet7,8,9. Baculoviridae kan koncentreras genom ultracentrifugering eller tangentiell flow filtration (TFF) med begränsad inverkan på sin smittsamhet. Dessa förfaranden inte bara koncentrera viruspartiklar men också cellulära skräp och proteiner från Sf9 kultur, som kan vara giftiga i vitro (personlig observation) och kan framkalla inflammation eller ett immunsvar när den används i vivo. För att undvika detta, särskilt när använder mycket koncentrerad viruslagren, måste infektiös baculoviridae renas och separerade från att förorena partiklar.
Flera metoder har rapporterats för rening och koncentration av baculoviridae vektorer10,11,12. Av de tillgängliga metoderna möjliggör heparin affinitetskromatografi steg hög rening med den låga koncentrationen av kontaminerande proteiner12. Metoden bygger på identifiering av heparansulfat sulfat som receptorn för baculoviridae13,14. Efter lastning Sf9 cell supernatanten på kolumn och bindning av baculoviridae, kan kolumnen tvättas med fysiologisk (isoton) buffert att ta bort obundna eller löst bundna förorenande partiklar. Eftersom bindningen till heparin är reversibel, kan baculoviridae partiklar vara elueras med en hög salt bufferten, vilket späds omedelbart till fysiologisk (isoton) salt koncentration att förhindra inaktivering av osmotiska chock12. Dessutom kan produktion av baculoviridae, liksom fånga på och eluering från kolumnen kromatografi utföras med en stängd-system process som är kompatibel med nuvarande god tillverkningssed (cGMP).
Här, ger vi ett detaljerat protokoll för tillverkning, rening, och koncentrationen av infektiös baculoviridae använder affinitetskromatografi och centrifugering. Kort, vi producerar baculoviridae av transfection Sf9 celler med en baculoviridae plasmid DNA i vidhäftande kultur och ytterligare utöka de smittsamma baculoviridae i serumfritt suspension kultur. Vi rena baculoviridae använder heparin affinitetskromatografi och använda ultracentrifugering som det sista steget mycket koncentrera vektorn för gen terapi program.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Se figur 1 för en illustration som sammanfattar protokollet.
1. rening av baculoviridae Plasmid DNA
- Växa bakteriekulturen som innehåller baculoviral plasmid DNA (bacmid)14 i 200 mL LB buljong med antibiotika; kanamycin (50 µg/mL), tetracyklin (10 µg/mL) och gentamycin (7 µg/mL), för 16 h vid 37 ° C på en roterande blandare inställning vid 300 rpm.
- Rena bacmid DNA från bakteriella kulturen använder standard alkaliska lysis protokoll15och upplösa bacmid i TE buffert.
2. produktion av baculoviridae
- Kultur Sf9 celler i en roterande blandare inkubator vid 135 rpm och 28 ° C i en polykarbonat Erlenmeyerkolv, innehållande serumfritt insekt odlingsmedium1,2,3.
Obs: Om Sf9 celler är tinade frysta lagervara, tillåta minst två veckor för cellerna att återhämta sig och ange den exponentiella fasen av tillväxt. - Räkna Sf9 cellerna skördas på exponentiell fas av tillväxt med en hemocytometer efter färgning med Trypan blå. Frö 1 x 106 livskraftiga Sf9 celler per brunn i en 6-väl vävnadsodling-behandlad plåt i 2 mL medium. Tillåta cellen att fästa för 1 h vid 28 ° C i en inkubator.
- Ersätta odlingsmedium med 1 mL serumfritt unsupplemented Graces insekt odlingsmedium.
- Transfect bacmid DNA i Sf9 celler använder insekt cell transfection reagens.
- Blanda 8 µL insekt cell transfection reagens med 100 µL av Graces insekt medium.
- Späd 2 µg av bacmid DNA i 100 µL av unsupplemented insekt medium, och blanda försiktigt genom vortexa.
- Kombinera den utspädda DNA med utspädda insekt cell transfection reagens, och blanda försiktigt. Inkubera i 15-30 min i rumstemperatur.
- Lägg till DNA-lipid blandningen droppvis på cellerna. Inkubera vid 28 ° C i en inkubator för ca 5 h.
- Ta bort transfection blandningen från cellerna och tvätta cellerna med 2 mL PBS.
- Tillsätt 2 mL av insekt odlingsmedium och fortsätta att kultur vid 28 ° C i en inkubator utan att ändra media.
Obs: Om bacmid innehåller en fluorescerande protein, kan dess uttryck upptäckas i celler 48 h efter transfection. Baculoviridae produceras av transfekterade Sf9 celler och utsöndras i odlingsmediet som därefter infekterar de untransfected cellerna. Hela cellen befolkningen blir smittad med baculoviridae i 5 dagar och visar tecken på virusinfektion, även kallad cytopatisk effekt. Dessa inkluderar ökad cell diameter, vakuoler/granulat i cytoplasman, upphörande av celltillväxt och lyserat eller döda celler är närvarande i cellkultur. Om transfection eller infektion effektivitet inte är optimal, kanske kulturen visar emellertid inte uppenbara cytopatisk effekt. Den cytopatisk effekten kan visualiseras med en inverterad fas Mikroskop på 200-400 X förstoring. Baculoviridae infekterade cellen kan upptäckas genom färgning med anti-gp64 antikropp11. - Skörda baculoviridae supernatant 5 dagar efter transfection och etikett som P1 virus beståndet.
- Lagra den baculoviridae supernatanten, som är ljuskänsligt, i mörkret med 0,5% bovint serumalbumin (BSA) i PBS. Förvaras vid 4 ° C för den kortsiktiga (upp till 90 dagar) eller vid-80 ° C på lång sikt.
- Utsäde 6 × 106 Sf9 celler i en 10-cm vävnadsodling-behandlad plåt i 10 mL av insekt odlingsmedium. Tillsätt 1 mL inledande baculoviridae supernatant (P1) till cellerna.
- Skörda baculoviridae supernatant (P2) på 5: e dagen efter infektion.
- Utsäde 50 mL Sf9 celler (3 x 106 celler/mL) i suspension kultur i insekt odlingsmedium i en 250 mL polykarbonat Erlenmeyerkolven och Placera kolven i kuvös roterande blandare. Tillsätt 2 mL P2 lager till cellerna och skaka på 135 rpm samtidigt behålla en konstant temperatur på 28 ° C.
Obs: Tre eller fyra dagar efter infektion, visar hela Sf9 cell befolkningen cytopatisk effekt, vilket är en indikation på hög-titer baculoviridae produktion. - Sekventiellt förstärka baculoviridae supernatanterna tills önskad volym erhålls (P3och P4,...) genom att öka 10 till 50-faldig volym av cellkulturen i varje efterföljande infektion.
Obs: P3 är 3rd runda av infektion i som 500 mL till 1 L av Sf9 cellkultur kan infekteras med 10 till 20 mL P2 baculoviridae supernatant; P4 är de 4th runda av infektion i som 5 till 10 L Sf9 cellkultur kan vara infekterad med 100 till 200 mL P3 baculoviridae supernatanten och så vidare. Sf9 celler är vanligtvis seedade på 3 × 106 celler/mL i serumfritt insekt kultur media. - Centrifugera i baculoviridae supernatant vid 1 000 x g i 30 minuter vid 4 ° C ta bort cellulära skräp och behandla baculoviridae supernatanten med 50 enheter/mL nuclease (250 enheter/µL av lager) för 2 h vid 37 ° C att smälta den genomiskt DNA och RNA. Filtrera supernatanterna genom ett 0,45 μm filtrering enhet.
3. beredning av kromatografisystemet
- Förbereda kromatografisystemet genom att sekventiellt skölja prov buffert raderna och varje med sterilt vatten, 1 N natriumhydroxid, vatten och tvätta buffert (20 mM natriumfosfat buffert innehållande 150 mM natriumklorid, pH 7,0) vid en linjär flödeshastighet av 50 mL/min.
- Förbereda en heparin 50 µm kolumn (10 × 10 cm, 7,9 mL kolumn volym (CV)) av körs sekventiellt kolumn rengöring buffert (5 CV steril 20 mM natriumfosfat buffert innehållande 2 M natriumklorid, pH 7,0) och 5 CV tvättbuffert linjär flödeshastighet 7 mL/min.
4. rening av baculoviridae vektor
- Ställa in kromatografisystemet enligt följande:
- Använda provet lastning inloppsport för lastning i baculoviridae supernatant.
- Använd den buffert inloppsport A1 för lastning tvättbuffert. Förbereda en flaska med minst 500 mL tvättbuffert och placera wash buffer linjen in i flaskan.
- Använd den buffert inloppsport A2 för lastning eluering bufferten (20 mM natriumfosfat med 1,5 M natriumklorid, pH 8,0). Förbereda en flaska med minst 500 mL eluering buffert och placera raden eluering buffert i flaskan.
- Infoga flera 50 mL koniska rör i bråkdel samlare att samla den kolumn pass-through baculoviridae supernatanten, tvättbufferten och de eluerade baculoviridae.
- Temperera kolumnen heparin med fem 7,9 mL kolumn volymer (CVs) av tvättbuffert (40 mL) på ett linjärt flöde 7,0 mL/min.
- Ladda 250 mL baculoviridae supernatant på kolumnen heparin med hjälp av provtagningspumpen (prov inloppsport) av kromatografisystemet linjär flödeshastighet 2,0 mL/min.
- Kör 10 CVs (80 mL) av tvättbuffert genom heparin kolumn med en linjär flödeshastighet 2,0 mL/min tills ultraviolett (UV) absorbans kurvan (280 nm) har återvänt till baslinjen och blir stabil.
- Eluera baculoviridae partiklarna från kolumnen 7,9 mL heparin med 5 CVs (40 mL) av eluering buffert på ett linjärt flöde av 4,0 mL/min. Watch för en skarp eluering topp av protein på kromatogrammet när baculoviridae partiklarna tar avstånd från kolumnen heparin.
- Efter eluering, omedelbart späder eluerade baculoviridae supernatanten 10-faldig med 20 mM natriumfosfat buffert i vatten för att förhindra inaktivering av baculoviridae partiklar från osmotiska chock under efterföljande centrifugering.
- Lagra 100 µL av varje av fraktioner, inklusive den kolumn genomströmning som samlats in under lastning av baculoviridae supernatanten, tvättbufferten och eluatet. Infektera dessa baculoviridae bråktal i HT1080 att utvärdera reningsprocessen (anges i avsnitt 6).
- Ren kolumnen med kolumn rengöring buffert och tvättbuffert. Slutligen, Skölj kolonnen med 5 CV steril 20% etanol i vatten med en linjär flödeshastighet 7,0 mL/min och förvaras vid 4 ° C.
- Rengöra kromatografisystemet med vatten, 1 N natriumhydroxid, igen med vatten, och 20% etanol i vatten med en linjär flödeshastighet 50,0 mL/min och lagra systemet i 20% etanol.
5. koncentrationen av baculoviridae
- Pre sterilisera centrifugrör med hjälp av en autoklav. Tillsätt en motsvarande volym av baculoviridae supernatanten till varje ultracentrifugen rör i vävnadsodling huva. Mäta tube vikten av en balans och justera vikten på innehållet i ultracentrifugen rören med steril fosfatbuffrad Koksaltlösning.
- Placera varje ultracentrifugen rören i motsatta hink med SW 32 Ti rotorn.
- Kör ultracentrifugen på 80 000 × g under 90 minuter vid 4 ° C.
- Öppna ultracentrifugen rören i vävnadsodling huva och aseptiskt aspirera vätska utan att ta bort baculoviridae pelleten.
- Återsuspendera pelleten i varje rör genom pipettering kraftigt upp och ner med 200 µL PBS med 0,5% (w/vol) BSA.
- Överföra den koncentrerade baculoviridae till cryovials (50 till 100 µL per injektionsflaska) och lagra vid-80 ° C.
6. titrering av baculoviridae
- Dagen före infektion, räkna HT1080 celler med hjälp av en hemocytometer efter färgning celler med Trypan blå. Frö 1 x 105 HT1080 celler per brunn i en 6-well platta i 2 mL av Dulbeccos modifierade örnens Medium (DMEM) innehållande 10% fetalt bovint serum (FBS). Utsäde flera ytterligare brunnar för att kunna fastställa det exakta antalet celler som finns vid tidpunkten för infektion. Odla cellerna i en inkubator på 37 ° C och 5% CO2.
Obs: HT1080 celler används för titrering som de uttrycker en högre nivå av heparansulfat sulfate jämfört med de andra cell linjer16. Eftersom HT1080 celler är vidhäftande, titrering är enklare och mindre tidskrävande jämfört med traditionella Sf9-baserade titreringen. - På dagen för infektion, bestämma antalet celler per väl genom att räkna celler från brunnar. Infektera cellerna genom att lägga till den utspädda ursprungliga baculoviridae som hade avsatts före kolumn rening och med prover från kolumn genomflöde, tvätta och eluering fraktioner. För varje prov, fastställa utspädning och volym empiriskt baserat på infektiös baculoviridae partiklar och infektera varje brunn i tre exemplar.
- Två dagar efter infektion, analysera cellerna för uttrycket av genen av intresse. Celler kan analyseras med hjälp en flödescytometer om de uttrycker en fluorescerande protein (t.ex. god Jordbrukarsed)17.
- Beräkna de titrar (infektiös enhet per mL) baserat på antalet celler som är närvarande vid tidpunkten för infektion, utspädningsfaktorn och procentsatser av fluorescerande protein i cellerna med hjälp av formeln: (antal celler under infektion × andelen fluorescerande protein positiva celler × utspädningsfaktor) / volym av baculoviridae i mL.
Obs: Till exempel om totala antalet celler per brunn vid tidpunkten för infektion är 1,2 × 105, andelen av fluorescerande protein är 5%, utspädningsfaktorn är 100 och volymen av utspädda baculoviridae lagt till är 10 µL, är titern 6 × 107 infektiösa enheter (IE) /mL.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det protokoll som presenteras är i ett flödesschema (figur 1). Stegen omfattar den övergående transfection Sf9 celler med bacmid DNA för att producera baculoviridae i vidhäftande kultur i en tallrik, den efterföljande amplifieringen i serumfritt suspension kultur, nukleotid och förtydligande av centrifugering och filtrering, och rening med hjälp av heparin affinitetskromatografi följt av koncentration med ultracentrifugering.
Efter upptining, Sf9 celler behöver minst två veckor att återhämta sig och kommer in i den exponentiella fasen av tillväxt. Aktivt växande Sf9 är celler transfekterade med bacmid DNA i vidhäftande kultur. Två dagar efter transfection, uttryck för baculoviridae kuvertet glykoproteiner, gp64 upptäcks och därefter baculoviridae produktion är initierade11. Eftersom baculoviridae är replikering behöriga, ökar antalet infekterade celler gradvis på grund av en progressiv infektion av celler med den nyproducerade baculoviridae som utsöndras i odlingsmedium. Baculoviridae som innehåller cell supernatanterna är skördade 5 dagar efter transfection när hela cellen befolkningen har blivit smittade. Detta inledande virus supernatant betecknas som passage 1 (P1) lager. P1 beståndet används för efterföljande infektion av en nyligen seedade vidhäftande kultur av Sf9 celler i en större tallrik. Hela cellen befolkningen visar tecken på infektion i 5 dagar som kallas cytopatisk effekt (figur 2). Supernatanten från den andra fastsittande cellkulturen skördas och betecknas som P2 lager. Baculoviridae supernatanten förstärks ytterligare i Sf9 suspension kultur genom pågående infektion av nyligen tillagda Sf9 celler i en shaker kolv med serumfritt insekt cellodlingsmedium. I slutet av varje infektion cykel visar de flesta av cellerna cytopatisk effekt med ökad cellulär diameter och lyserat eller döda celler, som är tecken för slutförandet av baculoviridae infektion. Baculoviridae lager förstärks sekventiellt tills önskad volym erhålls (P3och P4,...). Supernatanten avgränsas från Sf9 cellerna med låg hastighet centrifugering, behandlade med en nuclease att minska viskositeten, filtreras genom ett 0,45 μm membran, innan de används i efterföljande rening och koncentration steg.
För att rena baculoviridae, är supernatanten från infekterade Sf9 celler laddad på ett heparin-kolumn. Kolumnen heparin blir gradvis mättad med starkt bundna baculoviridae och löst bunden protein föroreningar. Kolumnen heparin sköljs med tvättbuffert att avlägsna föroreningar till ultraviolett (UV) absorbans kurvan (280 nm) återgår till ursprungsnivån och blir stabil, vilket indikerar avlägsnande av obundna och löst bundna material från kolumnen. Baculoviridae partiklarna binder å andra sidan starkt till kolumnen heparin. Därför upptäcks ingen betydande mängd virus i kolumnen tvättbuffert. Heparin-bundna baculoviridae partiklar elueras med 1,5 M av natriumklorid vid pH 8,0 och utspädda 10-faldig med buffert att uppnå isotonicity och förhindra virus inaktivering. En skarp topp av protein observeras under eluering vilket motsvarar den baculoviridae fraktionen (figur 3). Optimerad villkoren för prov lastning, tvätt och eluering används i denna kromatografi protokoll avkastningen mer än 50% återhämtning av renade smittsamma baculoviridae partiklar. Utspädda supernatanterna ytterligare koncentreras upp till 500 med ultracentrifugering och formulerat i PBS med 0,5% BSA, som ger ett netto 25% återvinning11.
Figur 1 . Schematiskt diagram för produktion och rening av baculoviridae. Sf9 celler är seedade i cell kultur-behandlade plattan transfekterade med bacmid DNA. Baculoviridae supernatanten skördas och används att infektera nya Sf9 celler i vidhäftande kultur. Infekterade celler sprids därefter i serumfritt suspension kultur. Baculoviridae supernatanten är behandlade med en nuclease, centrifugeras och filtreras. Baculoviridae renas av heparin affinitet kolonnkromatografi, utspädd i buffert, och koncentrerad aseptiskt genom ultracentrifugering. Slutligen lagras baculoviridae supernatanten vid-80 ° C. (Figuren har anpassats från Nasimuzzaman et al., 2016, Mol Ther metoder Clin Dev. 2016; 3: 16071 med tillstånd.) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Cytopatisk effekterna av baculoviridae infekterade Sf9 celler. Baculoviridae supernatanten användes för infekterar Sf9 cellerna i en vävnad-kultur behandlas plattan. Fem dagar efter infektion, var celler visualiserat med en inverterad fas Mikroskop. A) oinfekterade Sf9 celler som en kontroll. B) baculoviridae infekterade Sf9 celler visar cytopatisk effekt. Celler visas på 200 X förstoring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Antalet smittsamma baculoviridae i genomflöde under heparin affinitetskromatografi. Baculoviridae titrar uppskattades av infektion i HT1080 celler. Prov inklusive kolumn genomgång, tvätta och eluatet. Prover späddes som behövs. Linjen (mörka diamanter) visar de totala infektiösa enheterna (IE) av baculoviridae i respektive fraktion. Fraktion storlek kolumnen genomflöde prov och tvättbuffert var 40 mL i varje rör och eluatet var 10 mL i varje rör. (Figuren har anpassats från Nasimuzzaman et al., 2016, Mol Ther metoder Clin Dev. 2016; 3: 16071 med tillstånd.) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det protokoll som presenteras här beskrivs produktionen av baculoviridae Sf9 celler i suspension kultur och rening av baculoviridae använder en heparin affinitetskromatografi. De parametrar som används i detta protokoll maximera avkastningen och minimera inaktivering av infektiös baculoviridae. Protokollet anges här visar en betydligt förbättrad återhämtning av baculoviridae partiklar jämfört med återvinningar uppnåtts av andra9.
På grund av bred värd utbud och vävnad tropism utfördes flera studier i centrala nervsystemet, lever, ögon, äggstockar, prostata och testiklar med baculoviridae-medierad gen leverans5,6,7,8 . Baculoviridae vektorer som innehåller terapeutiska gener, såsom självmord gener, tumörsuppressorgener och gener kodning tumör-specifika antigener har framgångsrikt utförts i prekliniska modeller djur18,19. Även om baculoviridae kan transduce mänskliga celler, det kan endast förökas i insekt celler, och som ett resultat, utgör inte en risk för människors mottagare.
Baculoviridae produceras i insekt celler av övergående transfection av bacmid DNA. Kvaliteten på bacmid är kritisk för produktion av hög-titer baculoviridae. Typiskt, nylagade bacmid presterar bättre än de lagras i kylskåp under lång tid. Aktivt växande Sf9 är celler transfekterade effektivt som producerar hög-titer baculoviridae. Under förstärkning-fasen är det viktigt att optimera cellkoncentrationen i suspension kultur och volymen av baculoviridae supernatant används för infektion. Om förhållandet mellan baculoviridae partiklar till celler inte är optimal, vara avkastningen av baculoviridae lägre än den förväntade (personlig observationen, MN).
Fördriva tiden lastande baculoviridae supernatant på kolumnen heparin, är det viktigt att kontrollera genomströmmande för viruspartiklar som får passera genom kolonnen. Om det inträffar en lägre kolumn kör hastighet kan vara nödvändigt eller mindre volym av supernatanten ska läsas på kolumnen. De flesta av föroreningarna som förekommer i baculoviridae supernatanterna tvättas under tvätt steg av kromatografi körningen. Vi utvärderade baculoviridae renhet av silverfärgning av sodium dodecyl sulfate (SDS)-Polyakrylamidgelen elektrofores (sidan) gel och elektron mikroskopisk studera och fann att vårt renade baculoviruses är god kvalitet12.
Vi har noggrant optimerad bindande villkoren och fann att POROS heparin mediet är överlägsen andra heparin media (t.ex. HiTrap eller Capto heparin) i dess förmåga att fånga baculoviridae partiklar (personlig observation). Heparin förmåga att binda baculoviridae på högre prov hastighet och kapacitet är viktigt att minimera nedströms handläggningstiden för storskaliga tillverkningsprocessen. Förutom baculoviridae binder heparin medium också andra kontaminerande proteiner som har en affinitet för heparin. De flesta av lågmolekylära föroreningen kan elimineras genom att inkludera en tangentiell flow filtrering (TFF) steg nedströms av heparin kromatografi kör. TFF används också som ett alternativ till centrifugering för att koncentrera den produkt20.
Detta protokoll kan användas för rening av andra virus och proteiner som har en affinitet för heparin. Dock krävas ändringar wash och eluering buffert sammansättning och flödet.
Rekombinant proteinproduktion fungerar väl med orenat baculoviridae supernatanterna direkt. Råolja baculoviridae kan därför användas för produktion av rekombinanta proteiner. Om baculoviruses används som en vektor för i vivo genöverföring, eller som ett vaccin, är ytterligare reningssteg såsom kromatografi, gelfiltrering eller ultracentrifugering dock nödvändigt att få ren och koncentrerad baculoviridae partiklar och minimera producent cell - och kultur media-härledda orenheter för att undvika toxicitet, inflammation och ett immunsvar.
Sammanfattningsvis har vi beskrivit ett enkelt protokoll för produktion och rening av baculoviridae som kan skalas upp för tillverkning rekombinanta proteiner, vacciner och gene therapy vektorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar någon intressekonflikt.
Acknowledgments
Detta arbete stöds delvis av den startfinansiering från Cincinnati Children's Research Foundation (CCRF) att M.N. och innovativa Core Grant (ICG) stöds av National Center för framflyttning translationell vetenskaper av National Institutes of Health under Award nummer UL1 TR001425. Innehållet ansvarar enbart för författarna och representerar inte nödvändigtvis officiella ståndpunkter av National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Akta Avant 150 | GE Healthcare | 28976337 | Chromatography system |
| POROS Heparin 50 µm Column | ThermoFisher Scientific | 4333414 | Heparin column |
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | Non-catalog item | Concentrates virus at high-speed |
| Polyallomer Ultracentrifuge tube | Beckman-Coulter | 326823 | Concentrates virus at high-speed |
| MaxQ 8000 orbital shaker incubator | ThermoFisher Scientific | Non-catalog item | Shaker for suspension culture |
| 250 mL Erlenmeyer flasks | ThermoFisher Scientific | 238071 | Flask for suspension culture |
| 1 L Erlenmeyer flasks | ThermoFisher Scientific | 238072 | Flask for suspension culture |
| Microscope (Olympus CKX41) | Olympus | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | For clarification of Baculovirus supernatant |
| 50 ml Conical tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | For collection of Baculovirus supernatant |
| 6-well plate | ThermoFisher Scientific | 07-200-80 | Tissue culture treated plate |
| 10-cm plate | ThermoFisher Scientific | 08-772E | Tissue culture treated plate |
| Stericup-HV, 0.45 µm, PVDF | EMD-Millipore | SCHVU05RE | Filtration unit |
| Kanamycin | ThermoFisher Scientific | 15160-054 | |
| Tetracycline | Sigma-Aldrich | T7660 | |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15750-060 | |
| Bac-to-Bac Vector Kit | ThermoFisher Scientific | 10360-014 | Baculovirus expression system |
| DH10B-T1R Competent cell | ThermoFisher Scientific | 12331-013 | Competent cell for bacmid |
| TE buffer | In-house | Non-catalog item | 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0. |
| Plasmid Maxiprep kit | ThermoFisher Scientific | K2100-06 | For bacmid purification |
| Sf9 Cells | ThermoFisher Scientific | 11496-015 | Insect cells |
| Grace’s Insect Cell Culture Medium | ThermoFisher Scientific | 11605-094 | Transfection medium |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 20012227 | Washing cells, diluting samples |
| HyClone SFX-Insect cell media | GE Healthcare | SH30278.02 | Serum-free insect cell growth medium |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Enzyme to degrade DNA and RNA |
| Baculovirus plasmid (bacmid) DNA | In-house | Non-catalog item | Bacmid for Baculovirus Production |
| Cellfectin II | ThermoFisher Scientific | 10362 | Transfection reagent for insect cells |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4737 | Stabilizes Baculovirus |
| Cryovial | Thomas Scientific | 1222C24 | For storage of Baculovirus |
| HT1080 cell line | ATCC | CCL-121 | Fibroblast cell line |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Growth media for cell lines |
| Wash buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 150 mmol/l sodium chloride |
| Elution buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 1.5 mol/l sodium chloride |
| Column cleaning buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 2.0 mol/l sodium chloride |
| Sterile water | In-house | Non-catalog item | For Akta Avant cleaning |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.09137 | For Akta Avant cleaning |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7073 | For Akta Avant cleaning |
References
- Ikonomou, L., Schneider, Y. J., Agathos, S. N. Insect cell culture for industrial production of recombinant proteins. Appl Microbiol Biotechnol. 62 (1), 1-20 (2003).
- Contreras-Gomez, A., Sanchez-Miron, A., Garcia-Camacho, F., Molina-Grima, E., Chisti, Y. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnol Prog. 30 (1), 1-18 (2014).
- Cox, M. M. Recombinant protein vaccines produced in insect cells. Vaccine. 30 (10), 1759-1766 (2012).
- Boyce, F. M., Bucher, N. L. Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (6), 2348-2352 (1996).
- Airenne, K. J., et al. Baculovirus: an insect-derived vector for diverse gene transfer applications. Mol Ther. 21 (4), 739-749 (2013).
- Sung, L. Y., et al. Efficient gene delivery into cell lines and stem cells using baculovirus. Nat Protoc. 9 (8), 1882-1899 (2014).
- Zeng, J., Du, J., Lin, J., Bak, X. Y., Wu, C., Wang, S. High-efficiency transient transduction of human embryonic stem cell-derived neurons with baculoviral vectors. Mol Ther. 17 (9), 1585-1593 (2009).
- Zeng, J., Du, J., Zhao, Y., Palanisamy, N., Wang, S. Baculoviral vector-mediated transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells. Stem Cells. 25 (4), 1055-1061 (2007).
- Wu, C., Soh, K. Y., Wang, S. Ion-exchange membrane chromatography method for rapid and efficient purification of recombinant baculovirus and baculovirus gp64 protein. Hum Gene Ther. 18 (7), 665-672 (2007).
- Grein, T. A., Michalsky, R., Vega Lopez, M., Czermak, P. Purification of a recombinant baculovirus of Autographa californica M nucleopolyhedrovirus by ion exchange membrane chromatography. J Virol Methods. 183 (2), 117-124 (2012).
- Nasimuzzaman, M., Lynn, D., van der Loo, J. C., Malik, P. Purification of baculovirus vectors using heparin affinity chromatography. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16071 (2016).
- Makkonen, K. E., Turkki, P., Laakkonen, J. P., Yla-Herttuala, S., Marjomaki, V., Airenne, K. J. 6-o- and N-sulfated syndecan-1 promotes baculovirus binding and entry into Mammalian cells. J Virol. 87 (20), 11148-11159 (2013).
- Nasimuzzaman, M. Heparan sulfate in baculovirus binding and entry of mammalian cells. J Virol. 88 (8), 4607-4608 (2014).
- Urabe, M., et al. Scalable generation of high-titer recombinant adeno-associated virus type 5 in insect cells. J Virol. 80 (4), 1874-1885 (2006).
- Feliciello, I., Chinali, G. A modified alkaline lysis method for the preparation of highly purified plasmid DNA from Escherichia coli. Anal Biochem. 212 (2), 394-401 (1993).
- Nasimuzzaman, M., Persons, D. A. Cell Membrane-associated heparan sulfate is a receptor for prototype foamy virus in human, monkey, and rodent cells. Mol Ther. 20 (6), 1158-1166 (2012).
- Earl, P. L., Americo, J. L., Moss, B. Development and use of a vaccinia virus neutralization assay based on flow cytometric detection of green fluorescent protein. J Virol. 77 (19), 10684-10688 (2003).
- Kim, Y. K., et al. Suppression of tumor growth in xenograft model mice by programmed cell death 4 gene delivery using folate-PEG-baculovirus. Cancer Gene Ther. 17 (11), 751-760 (2010).
- Stanbridge, L. J., Dussupt, V., Maitland, N. J. Baculoviruses as vectors for gene therapy against human prostate cancer. J Biomed Biotechnol. 2003 (2), 79-91 (2003).
- Nasimuzzaman, M., et al. Production and purification of high-titer foamy virus vector for the treatment of leukocyte adhesion deficiency. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16004 (2015).
