Summary
In dit protocol is baculovirus geproduceerd door voorbijgaande transfectie van baculovirus plasmide in Sf9 cellen en versterkt in een serumvrij schorsing cultuur. De bovendrijvende substantie is gezuiverd door de chromatografie van de affiniteit van heparine en verder geconcentreerd door ultracentrifugatie. Dit protocol is handig voor de productie en zuivering van baculovirus voor gen-therapie-toepassing.
Abstract
Baculovirus heeft van oudsher gebruikt voor de productie van recombinante eiwitten en vaccin. Echter, meer recentelijk, baculovirus ontpopt zich als een veelbelovende vector voor gen-therapie-toepassing. Hier, wordt baculovirus geproduceerd door voorbijgaande transfectie van het baculovirus plasmide DNA (bacmid) in een aanhangend cultuur van Sf9 cellen. Baculovirus wordt vervolgens uitgebreid in Sf9 cellen in een serumvrij schorsing cultuur totdat het gewenste volume is bereikt. Het wordt dan gezuiverd uit de cultuur supernatant met behulp van de chromatografie van de affiniteit van de heparine. Virus supernatant wordt geladen op de heparine-kolom die baculovirus deeltjes in de bovendrijvende substantie als gevolg van de affiniteit van heparine bindt voor baculovirus glycoproteïne omhullen. De kolom wordt gewassen met een buffer om het verwijderen van verontreinigingen en baculovirus uit de kolom met een hoge-zout-buffer wordt geëlueerd. Het eluaat is verdund tot een isotone zoutconcentratie en baculovirus deeltjes zijn verdere geconcentreerd met ultracentrifugatie. Met deze methode kan baculovirus worden geconcentreerd tot 500-fold met een 25% terugwinning van infectieuze deeltjes. Hoewel het protocol beschreven hier het productie en zuivering van de baculovirus uit culturen tot 1 L toont, de methode kan worden geschaald-up in een gesloten-systeem schorsing cultuur tot een klinische-grade vector voor gen-therapie-toepassing.
Introduction
Baculovirus wordt voornamelijk gebruikt voor de productie van recombinante eiwitten en vaccins in nachtvlinder Spodoptera fugiperda (Sf) 9 insect cellen met behulp van recombinant Autographa californica multicapsid nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV) 1 , 2 , 3 , 4. meer recentelijk het ontpopt zich als een veelbelovende vector voor gene therapie toepassing5. Het is bekend dat er een brede host en weefsel tropisme, zowel rustige en delende cellen infecteert, is niet-pathogene en niet doet integreren in de host chromosoom4,5,6. Baculovirus kan bovendien worden geproduceerd in serumvrij schorsing cultuur die is schaalbaar en gesloten systeem verwerking voor toekomstige klinische productie1voorziet.
De zuiverheid van baculovirus deeltjes is belangrijk voor het bereiken van effectieve transductie terwijl het minimaliseren van de cytotoxiciteit7,8,9. Baculovirus kunnen worden geconcentreerd door ultracentrifugatie of tangentiële stroom filtratie (TFF) met beperkte invloed op de besmettelijkheid. Deze procedures niet alleen concentreren virusdeeltjes maar ook cellulaire puin en eiwitten uit de Sf9 cultuur, die kan worden giftig in vitro (persoonlijke opmerking) en kunnen leiden tot ontsteking of een immuunrespons wanneer gebruikt in vivo. Om dit te vermijden, vooral als met behulp van zeer geconcentreerd virusvoorraden, moet besmettelijke baculovirus worden gezuiverd en gescheiden van verontreinigende deeltjes.
Verschillende methoden zijn voor de zuivering en de concentratie van baculovirus vectoren10,11,12gerapporteerd. Van de beschikbare benaderingen zorgt de chromatografie van de affiniteit van de heparine voor een-voor-stapmodus hoog niveau van zuivering met de lage concentratie van proteïnen12besmetten. De methode is gebaseerd op de identificatie van heparan sulfaat als de receptor voor baculovirus13,14. Na het laden van Sf9 cel supernatant op de kolom en de binding van baculovirus, kan de kolom worden gewassen met fysiologische (isotone) buffer om niet-afhankelijke of losjes gebonden verontreinigende deeltjes te verwijderen. Aangezien de binding aan heparine omkeerbaar is, kunnen baculovirus deeltjes met een hoog zout buffer, die onmiddellijk wordt verdund aan fysiologische (isotone) zoutconcentratie ter voorkoming van inactivatie door osmotische schok12worden geëlueerd. Bovendien, de productie van baculovirus, evenals vangen op en de elutie van de chromatografie-kolom, kan worden uitgevoerd met behulp van een gesloten-systeemproces die verenigbaar is met de huidige goede productiepraktijken (cGMP).
Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor vervaardiging, zuivering, en concentratie van besmettelijke baculovirus met behulp van de chromatografie van de affiniteit en centrifugeren. Kortom, wij produceren baculovirus door transfectie van Sf9 cellen met een baculovirus plasmide DNA in aanhangend cultuur en verdere uitbreiding van de besmettelijke baculovirus in serumvrij schorsing cultuur. We zuiveren baculovirus met behulp van de chromatografie van de affiniteit van heparine en ultracentrifugatie gebruiken als de laatste stap te sterk concentreren de vector voor gen-therapie-toepassing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Zie Figuur 1 ter een illustratie samenvatten van het protocol.
1. de zuivering van Baculovirus plasmide DNA
- Groeien bacteriecultuur met baculoviral plasmide DNA (bacmid)14 in 200 mL van de pond-Bouillon met antibiotica; kanamycine (50 µg/mL), tetracycline (10 µg/mL) en gentamycine (7 µg/mL), gedurende 16 uur bij 37 ° C op een roteerschudapparaat omgeving op 300 rpm.
- Zuiveren van de bacmid van DNA van de bacteriële cultuur met behulp van standaard alkaline lysis protocol15, en de bacmid in de buffer TE ontbinden.
2. productie van Baculovirus
- Cultuur Sf9 cellen in een roteerschudapparaat incubator bij 135 rpm en 28 ° C in een polycarbonaat conische kolf met insect serumvrij cultuurmedium1,2,3.
Opmerking: Als Sf9 cellen zijn ontdooid uit bevroren voorraad, toestaan ten minste twee weken voor de cellen te herstellen en voer de exponentiële fase van groei. - Sf9 cellen geoogst in exponentiële fase van groei met een hemocytometer na kleuring met Trypan blauw tellen. 1 x 106 Sf9 levensvatbare cellen per putje in een 6-well Weefselkweek behandeld plaat in 2 mL zuiver medium zaad. Laat de cel te voegen gedurende 1 uur bij 28 ° C in een broedstoof.
- Vervang het groeimedium met 1 mL serumvrij unsupplemented Grace insect kweekmedium.
- Transfect de bacmid van DNA in de cellen van de Sf9 met behulp van insecten cel transfectiereagens.
- Mix 8 µL insect cel transfectiereagens met 100 µL van Grace Insect medium.
- Verdun 2 µg bacmid DNA in 100 µL van unsupplemented insecten medium en meng zachtjes door vortexing.
- De verdunde DNA te combineren met de verdunde insect cel transfectiereagens, en meng voorzichtig. Incubeer gedurende 15 tot 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg het mengsel van de DNA-lipide ontkleuring op de cellen. Incubeer bij 28 ° C in een incubator voor ongeveer 5 h.
- De transfectie mengsel uit de cellen te verwijderen en de cellen met 2 mL PBS wassen.
- Voeg toe 2 mL insect kweekmedium en cultuur bij 28 ° C in een broedstoof blijven zonder het wijzigen van de media.
Opmerking: Als de bacmid een fluorescente proteïne bevat, kan haar expressie in cellen 48u na transfectie worden gedetecteerd. Baculovirus is geproduceerd door transfected cellen van de Sf9 en uitgescheiden in het kweekmedium die vervolgens de untransfected cellen infecteert. De gehele celpopulatie wordt geïnfecteerd met baculovirus in 5 dagen en toont tekenen van virale infectie, ook wel genoemd cytopathogeen effect. Deze omvatten verhoogde cel diameter, vacuolen/korrels in het cytoplasma, stopzetting van de celgroei en dode of lysed cellen aanwezig in celkweek. Echter, als de efficiëntie van de transfectie of infectie niet optimaal is, de cultuur kan niet tonen een duidelijk cytopathogeen effect. De cytopathogeen effect kan worden gevisualiseerd met een omgekeerde fase Microscoop op 200-400 X vergroting. Baculovirus geïnfecteerde cel kan worden gedetecteerd door de kleuring met anti-gp64 antistof11. - Oogst baculovirus supernatant 5 dagen na de transfectie en label als de P1 virus voorraad.
- Bewaar het supernatant, baculovirus die lichtgevoelig, in het donker met 0,5% bovien serumalbumine (BSA) in PBS. Bewaren bij 4 ° C voor de korte termijn (tot 90 dagen) of bij-80 ° C voor de lange termijn.
- Zaad 6 × 106 Sf9 cellen in een 10-cm Weefselkweek behandeld plaat in 10 mL insect kweekmedium. 1 mL van de initiële baculovirus supernatant (P1) aan de cellen toevoegen.
- Oogst baculovirus supernatant (P2) bij 5th dag na infectie.
- Zaad 50 mL Sf9 cellen (3 x 106 cellen/mL) in schorsing cultuur in insect kweekmedium in een 250 mL polycarbonaat conische kolf en plaats de kolf in een incubator rondschudapparaat. Voeg 2 mL P2 voorraad naar de cellen en schudden bij 135 rpm met behoud van een constante temperatuur van 28 ° C.
Opmerking: Drie of vier dagen na de infectie, zal de hele Sf9-celpopulatie cytopathogeen effect, dat een indicatie van de hoge-titer baculovirus productie is tonen. - Sequentieel versterken het supernatant baculovirus totdat het gewenste volume is bereikt (P3, P4,...) door het verhogen van 10 naar 50-fold volume van celcultuur in elke latere infectie.
Opmerking: P3 is de 3rd ronde van infectie in welke 500 mL tot 1 L van de Sf9 cultuur van de cel kan worden besmet met 10 tot 20 mL P2 baculovirus supernatant; P4 is de 4th ronde van infectie in welke 5 tot 10 L van de Sf9 cultuur van de cel kan worden besmet met 100 tot 200 mL van het supernatans dat P3 baculovirus, enzovoort. Typisch, Sf9 cellen worden overgeënt op 3 × 106 cellen/mL in serumvrij insect voedingsbodems. - Centrifugeer het baculovirus supernatant bij 1.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 ° C tot cellulaire puin verwijderen en behandelen de baculovirus supernatant met 50 eenheden/mL nuclease (250 eenheden/µL van voorraad) gedurende 2 uur bij 37 ° C te verteren de genomic DNA en RNA. Filter het supernatant door een 0,45 micrometer filtratie unit.
3. voorbereiding van de chromatografie-systeem
- Voorbereiden van de chromatografie-systeem door het achtereenvolgens spoelen de monster en buffer lijnen elke met steriel water, 1 N natriumhydroxide, water, en wassen van buffer (20 mM natriumfosfaat buffer met 150 mM-natriumchloride, pH 7,0) bij een lineaire debiet van 50 mL/min.
- Bereid een heparine 50 µm kolom (10 × 10 cm, 7.9 mL van kolom volume (CV)) door het opeenvolgend uitgevoerd kolom schoonmaken buffer (5 CV steriele 20 mM natriumfosfaat buffer met 2 M keukenzout of natriumchloride, pH 7,0) en 5 CV was buffer op een lineaire debiet van 7 mL/min.
4. zuivering van Baculovirus Vector
- De chromatografie-systeem als volgt instellen:
- Gebruik van het voorbeeld perszijde voor het laden van het supernatant baculovirus laden.
- Gebruik de buffer perszijde A1 voor het laden van de buffer wassen. Bereiden van een fles met ten minste 500 mL was buffer en plaats de was buffer lijn in de fles.
- Gebruik de buffer perszijde A2 voor het laden van de elutie buffer (20 mM natriumfosfaat met 1,5 M natriumchloride, pH 8,0). Bereiden van een fles met ten minste 500 mL elutie buffer en plaats de elutie buffer lijn in de fles.
- Meerdere 50 mL conische buisjes in de collector van de breuk te verzamelen van de kolom pass-through baculovirus bezinken, het was buffer en de eluted baculovirus invoegen.
- Equilibreer de heparine-kolom met vijf 7.9 mL kolom hoeveelheid (CVs) was buffer (40 mL) bij een lineaire debiet van 7,0 mL/min.
- Laden van 250 mL baculovirus supernatant op de heparine-kolom met behulp van de pomp (monster perszijde) van de steekproef van de chromatografie-systeem op een lineaire debiet van 2,0 mL/min.
- Doorlopen 10 CVs (80 mL) van was buffer heparine kolom aan een lineaire stroomtarief van 2,0 mL/min tot de ultraviolet (UV) extinctie curve (280 nm) is teruggekeerd naar basislijn en wordt stabiel.
- Elueer de baculovirus deeltjes uit de kolom heparine 7.9 mL met 5 CVs (40 mL) van elutie buffer op een lineaire debiet van 4,0 mL/min. horloge voor een scherpe elutie piek van eiwit op het chromatogram wanneer de baculovirus deeltjes van de heparine-kolom distantiëren.
- Na elutie, onmiddellijk verdunnen het geëlueerd baculovirus supernatant 10-fold met 20 mM natriumfosfaat buffer in water om te voorkomen dat de inactivatie van baculovirus deeltjes uit osmotische schok tijdens latere centrifugeren.
- Opslaan van 100 µL van elk van de fracties, met inbegrip van de kolom doorstroming verzameld tijdens het laden van het supernatans dat baculovirus, het was buffer en het eluaat. Besmetten deze baculovirus breuken ten HT1080 om de reiniging proces (zie punt 6) te evalueren.
- Reinig de kolom met kolom schoonmaken was buffer en buffer. Tot slot, de kolom met 5 CV steriele 20% ethanol in water bij een lineaire debiet van 7,0 mL/min spoelen en bewaren bij 4 ° C.
- De chromatografie-systeem met water, 1 N natriumhydroxide, opnieuw met water, en 20% ethanol in water bij een lineaire debiet van 50.0 mL/min schoon en bewaar het systeem in 20% ethanol.
5. de concentratie van Baculovirus
- Vooraf steriliseren centrifuge buizen met behulp van een autoclaaf. Voeg een gelijk volume baculovirus supernatant aan elke ultracentrifuge buizen in de kap van een weefselkweek. Meten van het gewicht van de buis door een evenwicht en het gewicht van de inhoud van de ultracentrifuge buizen met steriel PBS aan te passen.
- Plaats elk van de ultracentrifuge buizen zich te verzetten tegen de SW 32 Ti-rotor emmer.
- De ultracentrifuge draaien op 80.000 × g voor 90 min bij 4 ° C.
- Open de ultracentrifuge buizen in de kap van een weefselkweek en aseptisch gecombineerd de vloeistof zonder het verwijderen van de baculovirus pellet.
- Resuspendeer de pellet van elke buis door krachtig pipetteren omhoog en omlaag met 200 µL PBS met 0,5% (w/vol) BSA.
- De geconcentreerde baculovirus overbrengen in cryovials (50 tot 100 µL per flacon) en opslaan bij-80 ° C.
6. titratie van Baculovirus
- De dag voordat de infectie, HT1080 cellen met behulp van een hemocytometer na cellen met Trypan blauw kleuring tellen. Zaad 1 x 105 HT1080 cellen per putje in een 6-well plaat in 2 mL van de Dulbecco bewerkt Eagle's Medium (DMEM) met 10% foetale runderserum (FBS). Zaad verschillende extra wells te kunnen bepalen van het exacte aantal cellen op het moment van infectie. Cultuur van de cellen in een incubator bij 37 ° C en 5% CO2.
Opmerking: HT1080 cellen worden gebruikt voor de titratie als ze een hoger niveau van heparan sulfaat in vergelijking met de andere cel lijnen16express. Aangezien HT1080 cellen zijn aanhangend, titratie is eenvoudiger en minder tijdrovend in vergelijking met het gebruik van de traditionele Sf9 gebaseerde titratie. - Op de dag van de infectie, door het aantal cellen per putje te bepalen door het tellen van cellen uit putten. De cellen infecteren door toevoeging van de verdunde oorspronkelijke baculovirus die was gereserveerd voorafgaand aan kolom zuivering en met monsters uit de kolom doorstroming, wassen en elutie breuken. Voor elk monster, bepaal de verdunnings- en volume empirisch gebaseerd op infectieuze baculovirus deeltjes en infecteren van elk putje in drievoud.
- Twee dagen na infectie, analyseren de cellen voor de uitdrukking van het gen van belang. Cellen kunnen worden geanalyseerd met behulp van een stroom cytometer als zij een fluorescente proteïne (bijvoorbeeld GFP)17 uiten.
- Berekenen van de titers (besmettelijke eenheid per mL) op basis van het aantal cellen aanwezig zijn op het moment van infectie, de verdunningsfactor, alsmede de percentages van fluorescente proteïnen in cellen met de formule: (aantal cellen tijdens de infectie × percentage van fluorescent proteïne positieve cellen × verdunningsfactor) / volume van baculovirus in mL.
Opmerking: Bijvoorbeeld, als het totale aantal cellen per putje op het moment van infectie is 1,2 × 10-5, het percentage van fluorescente proteïne is 5%, de verdunningsfactor is 100 en het volume van de verdunde baculovirus toegevoegd is 10 µL, is de titer 6 × 107 besmettelijke eenheden (IU) /mL.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het protocol gepresenteerd is in een stroomdiagram (Figuur 1). Stappen omvatten de voorbijgaande transfectie van Sf9 cellen met DNA te produceren baculovirus in aanhangend cultuur in een plaat, de latere versterking in serumvrij schorsing cultuur, nuclease behandeling en verduidelijking door centrifugeren en filtratie, bacmid en de zuivering met behulp van de chromatografie van de affiniteit van heparine gevolgd door concentratie met ultracentrifugatie.
Na ontdooien, Sf9 cellen moeten ten minste twee weken om te herstellen en het aangaan van de exponentiële fase van groei. Actief groeiende Sf9 zijn cellen transfected met bacmid DNA in aanhangend cultuur. Twee dagen na de transfectie, uitdrukking van baculovirus envelop glycoproteïnen, gp64 wordt gedetecteerd en vervolgens baculovirus productie is geïnitieerd11. Aangezien baculovirus bevoegde replicatie, wordt het aantal geïnfecteerde cellen geleidelijk toeneemt als gevolg van een progressieve infectie van cellen met de zojuist geproduceerde baculovirus dat wordt uitgescheiden in het groeimedium. Baculovirus met cel supernatant zijn geoogst 5 dagen na de transfectie wanneer de gehele cel bevolking is besmet. Dit eerste virus supernatant wordt aangewezen als de passage 1 (P1) voorraad. De P1 voorraad wordt gebruikt voor de latere infectie van een nieuw geplaatste aanhangend cultuur van Sf9 cellen in een groter bord. De bevolking van de gehele cel toont tekenen van infectie in 5 dagen die heet cytopathogeen effect (Figuur 2). De bovendrijvende vloeistof uit de tweede aanhangend celcultuur wordt geoogst en is aangewezen als P2 voorraad. Baculovirus supernatant wordt verder versterkt in Sf9 opschorting cultuur door middel van voortdurende infectie van vers toegevoegde Sf9 cellen in een shaker kolf serumvrij insect cel kweekmedium. Aan het einde van elke cyclus van infectie Toon allermeest naar de cellen cytopathogeen effect met een grotere diameter van cellulaire en dode of lysed cellen, die tekenen voor de voltooiing van baculovirus infectie zijn. Baculovirus voorraad wordt opeenvolgend versterkt totdat het gewenste volume is bereikt (P3, P4,...). Het supernatant wordt door lage snelheid centrifugeren, behandeld met een nuclease te verminderen van de viscositeit, gefilterd door een membraan van 0,45 μm, alvorens wordt gebruikt in de opeenvolgende stappen voor reiniging en concentratie van de Sf9 cellen gescheiden.
Als u wilt zuiveren baculovirus, wordt supernatant van geïnfecteerde cellen van de Sf9 geladen op een kolom heparine. De heparine kolom geleidelijk verzadigd met sterk gebonden baculovirus en losjes gebonden eiwit contaminanten. De kolom heparine is gespoeld met was buffer te verwijderen verontreinigingen totdat de ultraviolet (UV) extinctie curve (280 nm) keert terug naar basislijn en wordt stabiel, met vermelding van de verwijdering van niet-afhankelijke en losjes gebonden materialen uit de kolom. Baculovirus deeltjes binden daarentegen sterk aan de heparine-kolom. Daarom wordt geen aanzienlijke hoeveelheid virus ontdekt in de kolom was buffer. Heparine-gebonden baculovirus deeltjes worden geëlueerd met 1.5 M natriumchloride op pH 8,0 en verdunde 10-fold met buffer ter verwezenlijking van de isotonicity en het voorkomen van virus geïnactiveerd. Een scherpe piek van eiwit is waargenomen tijdens de elutie die correspondeert met de baculovirus breuk (Figuur 3). De geoptimaliseerde voorwaarden voor monster laden, wassen en elutie gebruikt in deze chromatografie protocol opbrengst meer dan 50% herstel van gezuiverde infectieuze baculovirus deeltjes. Verdunde supernatant zijn verder geconcentreerd tot 500-fold met ultracentrifugatie en geformuleerd in PBS met 0,5% BSA, die resulteert in een netto 25% terugwinning11.
Figuur 1 . Schema voor de productie en zuivering van baculovirus. Sf9 cellen worden overgeënt in cel cultuur behandeld plaat met bacmid DNA transfected. Baculovirus supernatans is geoogst en gebruikt voor het infecteren van de nieuwe Sf9 cellen in aanhangend cultuur. Geïnfecteerde cellen worden vervolgens doorgegeven in serumvrij schorsing cultuur. Baculovirus supernatans is behandeld met een nuclease gecentrifugeerd en gefilterd. Baculovirus is gezuiverd door kolom chromatografie van de affiniteit van de heparine, verdund in buffer en geconcentreerd aseptisch door ultracentrifugatie. Ten slotte wordt baculovirus supernatant opgeslagen bij-80 ° C. (De figuur is aangepast van Nasimuzzaman et al., 2016, Mol Ther methoden Clin Dev. 2016; 3: 16071 met toestemming.) Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . Cytopathogeen effect van baculovirus besmet Sf9 cellen. Baculovirus supernatant werd gebruikt voor het infecteren van de Sf9 cellen in een bord Weefselkweek behandeld. Vijf dagen na de besmetting, werden cellen gevisualiseerd met een omgekeerde fase Microscoop. A) Sf9 niet-geïnfecteerde cellen als een besturingselement. B) Baculovirus besmet Sf9 cellen tonen cytopathogeen effect. Cellen zijn vertoond op 200 X vergroting. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . Het aantal infectieuze baculovirus in doorstroomtest tijdens de chromatografie van de affiniteit van de heparine. Baculovirus titers werden geraamd door infectie van HT1080 cellen. Geteste monsters waren met inbegrip van de kolom run-through, wassen en eluaat. Monsters werden verdund zo nodig. De lijn (donkere ruiten) geeft de totale besmettelijke eenheden (IU) van baculovirus in elke fractie. De grootte van de breuk van kolom doorstroomtest monster en was buffer 40 mL in elke buis, en eluaat was 10 mL in elke buis. (De figuur is aangepast van Nasimuzzaman et al., 2016, Mol Ther methoden Clin Dev. 2016; 3: 16071 met toestemming.) Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het hier gepresenteerde protocol beschrijft de productie van baculovirus in Sf9 cellen in schorsing cultuur en zuivering van baculovirus met behulp van een chromatografie van de affiniteit van heparine. De parameters die worden gebruikt in dit protocol de opbrengst te maximaliseren en minimaliseren de inactivering van besmettelijke baculovirus. Het protocol hier toont dat een aanzienlijk verbeterde herstel van baculovirus deeltjes ten opzichte van terugvorderingen bereikt door anderen9.
Als gevolg van brede gastheer-range en weefsel tropisme, werden verschillende studies uitgevoerd in het centraal zenuwstelsel, lever, ogen, eierstok, prostaat en testis met gene baculovirus-gemedieerde levering5,6,7,8 . Baculovirus vectoren met therapeutische genen, zoals zelfmoord genen, tumor suppressor genen en genen coderen tumor-specifieke antigenen succesvol in preklinische verlopen zijn diermodellen18,19. Hoewel baculovirus kan transduce menselijke cellen, het kan alleen worden doorgegeven in insect cellen en, dientengevolge, doet niet vormen een risico voor de menselijke ontvangers.
Baculovirus wordt geproduceerd in insect cellen door voorbijgaande transfectie van bacmid DNA. De kwaliteit van bacmid is essentieel voor de productie van hoge-titer baculovirus. Typisch, vers bereide bacmid presteert beter dan die zijn opgeslagen in de ijskast voor lange periode van tijd. Actief groeiende Sf9 zijn cellen transfected efficiënt die hoge-titer baculovirus produceren. Tijdens de fase van de versterking, het is belangrijk om het optimaliseren van de concentratie van de cel in de cultuur van de schorsing en de hoeveelheid baculovirus supernatant gebruikt voor infectie. Als de verhouding van baculovirus deeltjes naar cellen niet optimaal is, kan het rendement van baculovirus lager zijn dan de verwachte (persoonlijke observatie, MN).
Tijdens het laden van het supernatant op de kolom heparine baculovirus, is het belangrijk om te controleren de doorstroming voor virusdeeltjes die door de kolom kan worden doorgeven. Als dit het geval is, een lagere kolom uitvoeren snelheid kan het nodig zijn of kleiner volume van het supernatans dat moet worden geladen op de kolom. Allermeest naar de in het supernatant baculovirus aanwezige contaminanten worden afgewassen tijdens de stap van het wassen van de chromatografie-run. Wij de zuiverheid van baculovirus geëvalueerd door zilveren kleuring van het natrium dodecyl sulfaat (SDS)-polyacrylamide-gel elektroforese (pagina) gel en elektron microscopisch bestuderen en gevonden dat onze gezuiverde baculoviruses goede kwaliteit12 zijn.
We hebben zorgvuldig geoptimaliseerd de bindende voorwaarden en vond dat het medium van de heparine POROS superieur aan andere heparine media (BV is. HiTrap of Capto heparine) in zijn vermogen voor inneming baculovirus deeltjes (persoonlijke opmerking). Het vermogen van heparine te binden baculovirus op hogere sample snelheid en capaciteit is belangrijk om downstream processing tijd voor de grootschalige productieproces te minimaliseren. Naast baculovirus bindt heparine medium ook andere contaminerende proteïnen die een affiniteit voor heparine hebben. Allermeest naar de laagmoleculaire besmetting kan worden voorkomen door met inbegrip van een tangentiële stroom filtratie (TFF) stap stroomafwaarts van de chromatografie van de heparine uitgevoerd. TFF wordt het ook gebruikt als alternatief voor centrifugeren te concentreren van de product-20.
Dit protocol kan worden gebruikt voor het zuiveren van andere virussen en proteïnen die een affiniteit voor heparine hebben. Niettemin, wijzigingen in de samenstelling van wassen en elutie buffer en het debiet kunnen worden verlangd.
Productie van recombinante eiwitten werkt ook direct het gebruiken van ongezuiverde baculovirus supernatant. Daarom, ruwe baculovirus kan worden gebruikt voor de productie van recombinante eiwitten. Als baculoviruses worden gebruikt als een vector voor in vivo gentransfer, of als een vaccin, zijn extra zuivering stappen zoals chromatografie, filtratie van gel en/of ultracentrifugatie echter nodig om de zuivere en geconcentreerde baculovirus deeltjes en producent cel - en cultuurmedia-afgeleide onzuiverheden om te voorkomen dat toxiciteit, ontsteking en een immuunrespons te minimaliseren.
Kortom, hebben wij beschreven een eenvoudig protocol voor de productie en zuivering van baculovirus die kunnen worden geschaald-up voor de productie van recombinante eiwitten, vaccins en gene therapie vectoren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflict.
Acknowledgments
Dit werk wordt gedeeltelijk ondersteund door de Start-Up financiering uit Cincinnati Children's Research Foundation (CCRF) voor M.N. en innovatieve Core Grant (ICG) ondersteund door het National Center for Advancing translationeel Wetenschappen van de National Institutes of Health onder Award nummer UL1 TR001425. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van de National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Akta Avant 150 | GE Healthcare | 28976337 | Chromatography system |
| POROS Heparin 50 µm Column | ThermoFisher Scientific | 4333414 | Heparin column |
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | Non-catalog item | Concentrates virus at high-speed |
| Polyallomer Ultracentrifuge tube | Beckman-Coulter | 326823 | Concentrates virus at high-speed |
| MaxQ 8000 orbital shaker incubator | ThermoFisher Scientific | Non-catalog item | Shaker for suspension culture |
| 250 mL Erlenmeyer flasks | ThermoFisher Scientific | 238071 | Flask for suspension culture |
| 1 L Erlenmeyer flasks | ThermoFisher Scientific | 238072 | Flask for suspension culture |
| Microscope (Olympus CKX41) | Olympus | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | For clarification of Baculovirus supernatant |
| 50 ml Conical tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | For collection of Baculovirus supernatant |
| 6-well plate | ThermoFisher Scientific | 07-200-80 | Tissue culture treated plate |
| 10-cm plate | ThermoFisher Scientific | 08-772E | Tissue culture treated plate |
| Stericup-HV, 0.45 µm, PVDF | EMD-Millipore | SCHVU05RE | Filtration unit |
| Kanamycin | ThermoFisher Scientific | 15160-054 | |
| Tetracycline | Sigma-Aldrich | T7660 | |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15750-060 | |
| Bac-to-Bac Vector Kit | ThermoFisher Scientific | 10360-014 | Baculovirus expression system |
| DH10B-T1R Competent cell | ThermoFisher Scientific | 12331-013 | Competent cell for bacmid |
| TE buffer | In-house | Non-catalog item | 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0. |
| Plasmid Maxiprep kit | ThermoFisher Scientific | K2100-06 | For bacmid purification |
| Sf9 Cells | ThermoFisher Scientific | 11496-015 | Insect cells |
| Grace’s Insect Cell Culture Medium | ThermoFisher Scientific | 11605-094 | Transfection medium |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 20012227 | Washing cells, diluting samples |
| HyClone SFX-Insect cell media | GE Healthcare | SH30278.02 | Serum-free insect cell growth medium |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Enzyme to degrade DNA and RNA |
| Baculovirus plasmid (bacmid) DNA | In-house | Non-catalog item | Bacmid for Baculovirus Production |
| Cellfectin II | ThermoFisher Scientific | 10362 | Transfection reagent for insect cells |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4737 | Stabilizes Baculovirus |
| Cryovial | Thomas Scientific | 1222C24 | For storage of Baculovirus |
| HT1080 cell line | ATCC | CCL-121 | Fibroblast cell line |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Growth media for cell lines |
| Wash buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 150 mmol/l sodium chloride |
| Elution buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 1.5 mol/l sodium chloride |
| Column cleaning buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 2.0 mol/l sodium chloride |
| Sterile water | In-house | Non-catalog item | For Akta Avant cleaning |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.09137 | For Akta Avant cleaning |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7073 | For Akta Avant cleaning |
References
- Ikonomou, L., Schneider, Y. J., Agathos, S. N. Insect cell culture for industrial production of recombinant proteins. Appl Microbiol Biotechnol. 62 (1), 1-20 (2003).
- Contreras-Gomez, A., Sanchez-Miron, A., Garcia-Camacho, F., Molina-Grima, E., Chisti, Y. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnol Prog. 30 (1), 1-18 (2014).
- Cox, M. M. Recombinant protein vaccines produced in insect cells. Vaccine. 30 (10), 1759-1766 (2012).
- Boyce, F. M., Bucher, N. L. Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (6), 2348-2352 (1996).
- Airenne, K. J., et al. Baculovirus: an insect-derived vector for diverse gene transfer applications. Mol Ther. 21 (4), 739-749 (2013).
- Sung, L. Y., et al. Efficient gene delivery into cell lines and stem cells using baculovirus. Nat Protoc. 9 (8), 1882-1899 (2014).
- Zeng, J., Du, J., Lin, J., Bak, X. Y., Wu, C., Wang, S. High-efficiency transient transduction of human embryonic stem cell-derived neurons with baculoviral vectors. Mol Ther. 17 (9), 1585-1593 (2009).
- Zeng, J., Du, J., Zhao, Y., Palanisamy, N., Wang, S. Baculoviral vector-mediated transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells. Stem Cells. 25 (4), 1055-1061 (2007).
- Wu, C., Soh, K. Y., Wang, S. Ion-exchange membrane chromatography method for rapid and efficient purification of recombinant baculovirus and baculovirus gp64 protein. Hum Gene Ther. 18 (7), 665-672 (2007).
- Grein, T. A., Michalsky, R., Vega Lopez, M., Czermak, P. Purification of a recombinant baculovirus of Autographa californica M nucleopolyhedrovirus by ion exchange membrane chromatography. J Virol Methods. 183 (2), 117-124 (2012).
- Nasimuzzaman, M., Lynn, D., van der Loo, J. C., Malik, P. Purification of baculovirus vectors using heparin affinity chromatography. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16071 (2016).
- Makkonen, K. E., Turkki, P., Laakkonen, J. P., Yla-Herttuala, S., Marjomaki, V., Airenne, K. J. 6-o- and N-sulfated syndecan-1 promotes baculovirus binding and entry into Mammalian cells. J Virol. 87 (20), 11148-11159 (2013).
- Nasimuzzaman, M. Heparan sulfate in baculovirus binding and entry of mammalian cells. J Virol. 88 (8), 4607-4608 (2014).
- Urabe, M., et al. Scalable generation of high-titer recombinant adeno-associated virus type 5 in insect cells. J Virol. 80 (4), 1874-1885 (2006).
- Feliciello, I., Chinali, G. A modified alkaline lysis method for the preparation of highly purified plasmid DNA from Escherichia coli. Anal Biochem. 212 (2), 394-401 (1993).
- Nasimuzzaman, M., Persons, D. A. Cell Membrane-associated heparan sulfate is a receptor for prototype foamy virus in human, monkey, and rodent cells. Mol Ther. 20 (6), 1158-1166 (2012).
- Earl, P. L., Americo, J. L., Moss, B. Development and use of a vaccinia virus neutralization assay based on flow cytometric detection of green fluorescent protein. J Virol. 77 (19), 10684-10688 (2003).
- Kim, Y. K., et al. Suppression of tumor growth in xenograft model mice by programmed cell death 4 gene delivery using folate-PEG-baculovirus. Cancer Gene Ther. 17 (11), 751-760 (2010).
- Stanbridge, L. J., Dussupt, V., Maitland, N. J. Baculoviruses as vectors for gene therapy against human prostate cancer. J Biomed Biotechnol. 2003 (2), 79-91 (2003).
- Nasimuzzaman, M., et al. Production and purification of high-titer foamy virus vector for the treatment of leukocyte adhesion deficiency. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16004 (2015).
