Summary
In diesem Protokoll wird Baculovirus von Transiente Transfektion von Baculovirus Plasmid in Sf9 Zellen produziert und verstärkt in serumfreien SUSPENSIONSKULTUR. Der Überstand wird durch Heparin Affinitätschromatographie gereinigt und weiter durch Ultrazentrifugation konzentriert. Dieses Protokoll eignet sich für die Herstellung und Reinigung des Baculovirus für Gen-Therapie Anwendung.
Abstract
Baculovirus wurde traditionell für die Produktion von rekombinanten Proteinen und Impfstoff eingesetzt worden. Allerdings ist vor kurzem Baculovirus als vielversprechende Vektor für Gen-Therapie-Anwendung entstehen. Hier entsteht Baculovirus durch Transiente Transfektion von Baculovirus Plasmid DNA (Bacmid) in einer haftfesten Kultur Sf9 Zellen. Baculovirus wird anschließend in Sf9 Zellen in serumfreien SUSPENSIONSKULTUR erweitert, bis das gewünschte Volumen erreicht ist. Es wird dann von der Kultur überstand mit Heparin Affinitätschromatographie gereinigt. Virus Überstand wird auf die Heparin-Spalte die Baculovirus Partikel im überstand aufgrund der Affinität von Heparin bindet, denn Baculovirus Glykoprotein umhüllen geladen. Die Spalte wird gewaschen, mit einem Puffer um Verunreinigungen zu entfernen und Baculovirus ist aus der Spalte mit einem hohem Salzgehalt Puffer eluiert. Das Eluat wird verdünnt, um eine isotonische Salzkonzentration und Baculovirus Partikel sind weitere Verwendung Ultrazentrifugation konzentriert. Mit dieser Methode können Baculovirus bis zu 500-fold mit einer 25 % Erholung der infektiöse Partikel konzentriert werden. Obwohl das hier beschriebene Protokoll die Herstellung und Reinigung von der Baculovirus aus Kulturen bis zu 1 L zeigt, die Methode kann in ein geschlossenes System SUSPENSIONSKULTUR, klinische Grade Vektor für Gen-Therapie-Anwendung zu produzieren Aufstockung werden.
Introduction
Baculovirus dient in erster Linie für die Produktion von rekombinanten Proteinen und Impfstoffe in Lepidopteran Spodoptera Fugiperda (Sf) 9 Insektenzellen mittels rekombinanter Autographa Californica multicapsid nuklearen Polyhedrosis Virus (AcMNPV) 1 , 2 , 3 , 4. vor kurzem, es erweist sich als eine vielversprechende Vektor für Gen-Therapie Anwendung5. Es ist bekannt, dass eine breite Host und Gewebe Tropismus, Ruhestrom und wuchernde Zellen infiziert ist apathogen und integriert nicht in die Host-Chromosom4,5,6. Darüber hinaus können Baculovirus in serumfreien SUSPENSIONSKULTUR hergestellt werden, die ist skalierbar und geschlossenes System für zukünftige klinische Produktion1Verarbeitung ermöglicht.
Die Reinheit des Baculovirus Partikel ist wichtig zur Erreichung effektiven Transduktion bei gleichzeitiger Minimierung der Zytotoxizität7,8,9. Baculovirus können durch Ultrazentrifugation oder tangential-Flow Filtration (TFF) mit geringen Auswirkungen auf seine Infektiosität konzentriert werden. Diese Verfahren nicht nur konzentrieren Viruspartikel aber auch zelltrümmer und Proteine aus Sf9 können induzieren Entzündungen oder eine Immunantwort bei Kultur, die giftige in Vitro (persönliche Beobachtung) kann in Vivo. Um dies zu vermeiden, vor allem, wenn mit Virus Aktien konzentriert, muss infektiöse Baculovirus gereinigt und von kontaminierenden Partikel getrennt werden.
Verschiedene Methoden wurden für die Reinigung und Konzentration der Baculovirus Vektoren10,11,12berichtet. Von den verfügbaren Ansätzen ermöglicht Heparin Affinitätschromatographie Einzelschritt hohem Niveau der Reinigung mit der niedrigen Konzentration der kontaminierende Proteine12. Die Methode basiert auf der Identifikation des Heparan Sulfat als Rezeptor für Baculovirus13,14. Nach dem Laden Sf9 Zelle überstand auf die Spalte und die Bindung des Baculovirus, waschbar die Spalte mit physiologischen (Isotone) Puffer ungebunden oder lose gebundenen verunreinigende Partikel zu entfernen. Da die Bindung an Heparin umkehrbar ist, können Baculovirus Partikel mit einem hohen Salz Puffer eluiert die physiologischen (Isotone) Salzkonzentration zu verhindern, dass die Inaktivierung durch osmotischen Schock12sofort verdünnt wird. Darüber hinaus kann die Produktion von Baculovirus sowie Erfassung auf und Elution von der Chromatographiesäule erfolgen über ein geschlossenes System-Prozess, der mit aktuellen gute Herstellungspraxis (cGMP) kompatibel ist.
Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll zur Herstellung, Reinigung und Konzentration von infektiösen Baculovirus mittels Affinitätschromatographie und Zentrifugieren. Kurz, wir produzieren Baculovirus durch Transfektion von Sf9 Zellen mit einem Baculovirus Plasmid DNA in adhärenten Kultur und die infektiöse Baculovirus in serumfreien SUSPENSIONSKULTUR weiter ausbauen. Wir reinigen mit Heparin Affinitätschromatographie Baculovirus und mit Ultrazentrifugation als letzten Schritt hoch den Vektor für Gen-Therapie-Anwendung konzentrieren.
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Protocol
Siehe Abbildung 1 zur Veranschaulichung einer Zusammenfassung des Protokolls.
1. Reinigung des Baculovirus Plasmid DNA
- Bakterienkultur mit Baculoviral Plasmid DNA (Bacmid)14 in 200 mL LB-Brühe mit Antibiotika zu wachsen; Kanamycin (50 µg/mL), Tetracyclin (10 µg/mL) und Gentamycin (7 µg/mL), 16 h bei 37 ° C auf einem Orbitalschüttler Einstellung bei 300 Umdrehungen pro Minute.
- Reinigen der Bacmid DNA aus der Bakterienkultur mit standard alkalische Lyse Protokoll15, und lösen sich die Bacmid in TE-Puffer.
2. Herstellung von Baculovirus
- Kultur Sf9 Zellen in einem Orbitalschüttler Inkubator bei 135 min und 28 ° C in einem Polycarbonat Erlenmeyerkolben mit serumfreien Insekt Kulturmedium1,2,3.
Hinweis: Wenn Sf9 Zellen aus gefrorenen bestand aufgetaut sind, erlauben Sie mindestens zwei Wochen für die Zellen zu erholen und geben die exponentielle Wachstumsphase. - Zählen Sie die Sf9 Zellen geerntet exponentiellen Wachstumsphase mit einer Hemocytometer nach der Färbung mit Trypan blau. 1 x 106 tragfähige Sf9 Samenzellen pro Bohrloch in einer 6-Well Gewebekultur imprägnierte Platte in 2 mL Medium. Lassen Sie die Zelle für 1 h bei 28 ° C im Brutschrank befestigen.
- Ersetzen Sie das Wachstumsmedium mit 1 mL Serum-freie unsupplemented Grace Insekt Kulturmedium.
- Transfizieren Sie die Bacmid DNA in die Sf9 Zellen mit Insekt Zelle Transfection Reagens.
- Mix 8 µL Insekt Zelle Transfection Reagens mit 100 µL Graces Insekt Medium.
- 2 µg DNA Bacmid in 100 µL unsupplemented Insekt Medium verdünnen und mischen durch aufschütteln.
- Die verdünnte DNA mit der verdünnten Insekt Zelle Transfection Reagens zu kombinieren, und vorsichtig mischen. 15 bis 30 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Fügen Sie die DNA-Lipid-Mischung tropfenweise auf die Zellen. Inkubation bei 28 ° C im Brutschrank für ca. 5 h.
- Entfernen Sie die Transfektion Mischung aus den Zellen zu und waschen Sie die Zellen mit 2 mL PBS.
- Fügen Sie 2 mL Insekt Kulturmedium und Kultur bei 28 ° C im Brutschrank ohne die Medien weiter.
Hinweis: Wenn die Bacmid ein fluoreszierendes Protein enthält, kann seinen Ausdruck in Zellen 48 h nach Transfektion erkannt werden. Baculovirus ist von transfizierten Sf9 Zellen produziert und abgesondert in das Kulturmedium, das anschließend die untransfected Zellen infiziert. Die gesamten Zellpopulation mit Baculovirus in 5 Tagen infiziert und zeigt Anzeichen einer Virusinfektion, auch genannt zytopathischen Effekt. Dazu gehören erhöhte Zelle Durchmesser, Vakuolen/Granulat im Zytoplasma, Einstellung des Zellwachstums und tot oder lysierten Zellen in Zellkultur vorhanden sind. Allerdings, wenn die Transfektion oder Infektion Effizienz nicht optimal ist, kann die Kultur keinen offensichtlichen zytopathischen Effekt zeigen. Zytopathischen Effekts kann mit einem inversen Phase Mikroskop bei 200-400 X Vergrößerung dargestellt werden. Baculovirus infizierte Zelle kann durch Färbung mit Anti-gp64 Antikörper11nachgewiesen werden. - Ernten Sie Baculovirus überstand 5 Tage nach Transfektion und Label als P1 Virus bestand.
- Speichern Sie das Baculovirus überstand, ist lichtempfindlich, in der Dunkelheit mit 0,5 % Rinderserumalbumin (BSA) in PBS. Bei 4 ° C für die kurzfristige (bis zu 90 Tagen) oder bei-80 ° C langfristig zu speichern.
- 6 × 106 Sf9 Samenzellen in einer 10 cm Gewebekultur imprägnierte Platte in 10 mL Insekt Kulturmedium. Fügen Sie 1 mL der ursprünglichen Baculovirus überstand (P1) zu den Zellen.
- Baculovirus überstand (P2) am 5ten Tag nach der Infektion zu ernten.
- Samen 50 mL Sf9 Zellen (3 x 106 Zellen/mL) in SUSPENSIONSKULTUR im Insekt Nährmedium in einem 250-mL-Polycarbonat Erlenmeyerkolben und Stelle die Flasche in einem Orbitalschüttler Inkubator. Die Zellen 2 mL P2 Lager hinzu und schütteln bei 135 u/min unter Beibehaltung einer konstanten Temperatur von 28 ° C.
Hinweis: Drei oder vier Tage nach der Infektion zeigen die gesamte Sf9 Zellpopulation zytopathischen Effekt, die ein für hohe Titer Baculovirus Produktion Indiz. - Baculovirus Überstände sequentiell zu verstärken, bis die gewünschte Lautstärke (P3, P4,...) entsteht durch die Erhöhung von 10 bis 50-fold Volumen der Zellkultur in jede nachfolgende Infektion.
Hinweis: P3 ist die 3rd Runde der Infektion in die 500 mL bis 1 L Sf9 Zellkultur mit 10 bis 20 mL P2 Baculovirus überstand infiziert werden kann; P4 ist die 4th Runde der Infektion in die 5 bis 10 L Sf9 Zellkultur mit 100 bis 200 mL P3 Baculovirus überstand usw. infiziert werden kann. In der Regel sind bei 3 × 106 Zellen/mL in serumfreien Insekt Kulturmedien Sf9 Zellen ausgesät. - Zentrifugieren Sie das Baculovirus Überstand bei 1.000 x g für 30 min bei 4 ° C zu entfernen zelltrümmer und behandeln das Baculovirus überstand mit 50 Einheiten/mL Nuklease (250 Einheiten/µL Lager) für 2 h bei 37 ° C, die genomische DNA und RNA zu verdauen. Filtern Sie die Überstände durch einen 0,45-μm-Filteranlage.
3. Vorbereitung des Systems der Chromatographie
- Bereiten Sie des Chromatographie-Systems durch nacheinander die Probe und Puffer Linien jeweils mit sterilem Wasser, 1 N Natriumhydroxid, Wasser spülen vor und waschen Sie Puffer (20 mM Natriumphosphat Puffer mit 150 mM Natrium-Chlorid, pH 7,0) mit einer linearen Durchflussrate von 50 mL/min.
- Bereiten Sie eine Heparin 50 µm Spalte (10 × 10 cm, 7,9 mL Spalte Volumen (CV)), indem sequenziell ausgeführt Spalte Reinigung Puffer (5 CV steril 20 mM Natriumphosphat Puffer mit 2 M Natrium-Chlorid, pH 7,0) und 5 CV Waschpuffer mit einer linearen Durchflussrate von 7 mL/min.
4. Reinigung des Baculovirus Vektor
- Die Chromatographie-System wie folgt einrichten:
- Anhand des Beispiels laden Einlassöffnung für laden das Baculovirus überstand.
- Verwenden Sie die Puffer Einlassstutzen A1 für das Laden der Waschpuffer. Bereiten Sie eine Flasche mit mindestens 500 mL Waschpuffer und platzieren Sie die Waschanlage Puffer in die Flasche.
- Verwenden Sie die Puffer Einlassstutzen A2 für Ladepuffer Elution (20 mM Natriumphosphat mit 1,5 M Natrium-Chlorid, pH 8,0). Bereiten Sie eine Flasche mit mindestens 500 mL Elution Buffer und platzieren Sie die Elution Buffer Zeile in die Flasche.
- Legen Sie mehrere 50 mL konische Röhrchen in Fraktionssammler die Spalte Pass-Through-Baculovirus überstand zu sammeln, die Waschpuffer und der eluierten Baculovirus.
- Equilibrate der Heparin-Spalte mit fünf 7,9 mL Spalte Volumen (CVs) von Waschpuffer (40 mL) mit einer linearen Durchflussrate von 7,0 mL/min.
- 250 mL Baculovirus überstand auf die Heparin-Säule mit der Probe-Pumpe (Probe Einlassstutzen) Chromatographie-Systems bei einer linearen Durchflussrate von 2,0 mL/min zu laden.
- 10 CVs (80 mL) der Waschpuffer durch Heparin-Spalte mit einer linearen Durchflussrate von 2,0 mL/min bis die ultravioletten (UV) Absorption Kurve laufen (280 nm) zu Grundlinie zurückgekehrt und wird stabil.
- Eluieren Sie Baculovirus Partikel aus der 7,9 mL Heparin Spalte mit 5 CVs (40 mL) der Elution Puffer bei einer linearen Durchflussrate von 4,0 mL/min Uhr für ein scharfes Elution Peak von Protein auf dem Chromatogramm, wenn die Baculovirus-Teilchen aus der Spalte "Heparin" distanzieren.
- Post-Elution sofort verdünnen den eluierten Baculovirus überstand 10-fach mit 20 mM-Natrium-Phosphat-Puffer im Wasser um Inaktivierung von Baculovirus Partikel aus osmotischen Schock bei der anschließende Zentrifugation zu verhindern.
- Speichern von 100 µL der einzelnen Fraktionen, einschließlich der Spalte durchströmten während des Ladens der Baculovirus überstand, der Waschpuffer und das Eluat gesammelt. Infizieren Sie diese Baculovirus-Fraktionen, HT1080 um den Reinigungsprozess (siehe Abschnitt 6) zu bewerten.
- Reinigen Sie die Spalte mit Spalte Reinigung Puffer und Waschpuffer. Zu guter Letzt spülen Sie die Spalte mit 5 CV steril 20 % Ethanol in Wasser mit einer linearen Durchflussrate von 7,0 mL/min und bei 4 ° c Lagern
- Reinigen Sie die Chromatographie-System mit Wasser, 1 N Natriumhydroxid, nochmals mit Wasser, und 20 % Ethanol in Wasser mit einer linearen Durchflussrate von 50,0 mL/min und Lagern Sie das System in 20 % Ethanol.
5. Konzentration des Baculovirus
- Pre-Sterilisieren Sie Zentrifugen-Röhrchen mit einem Autoklaven. Jede Ultrazentrifugen Rohre in einer Gewebekultur Haube ein gleiches Volumen des Baculovirus überstand hinzufügen. Messen Sie das Rohr Gewicht, indem Sie ein Gleichgewicht und stellen Sie das Gewicht des Inhalts der Ultrazentrifuge Rohre mit sterilen PBS.
- Platzieren Sie jedes der Ultrazentrifuge Rohre gegen Eimer des Rotors SW 32 Ti.
- Ausführen der Ultrazentrifuge bei 80.000 × g für 90 min bei 4 ° C.
- Öffnen Sie der Ultrazentrifuge Rohre in einer Gewebekultur Kapuze und aseptisch Aspirieren Sie die Flüssigkeit ohne das Baculovirus Pellet.
- Aufzuwirbeln Sie das Pellet jedes Rohr durch pipettieren kräftig nach oben und unten mit 200 µL PBS mit 0,5 % (w/Vol) BSA.
- Die konzentrierte Baculovirus auf Cryovials (50 bis 100 µL pro Fläschchen) übertragen und speichern bei-80 ° C.
6. die Titration des Baculovirus
- Zählen Sie am Tag vor der Infektion, HT1080 Zellen unter Verwendung eines Hemocytometer nach der Färbung Zellen mit Trypan blau. 1 x 105 HT1080 Samenzellen pro Bohrloch in einer 6-Well-Platte in 2 mL der Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS). Samen mehrere zusätzliche Brunnen, die genaue Anzahl der Zellen zum Zeitpunkt der Infektion bestimmen zu können. Kultur der Zellen in einem Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2.
Hinweis: HT1080 Zellen sind für die Titration verwendet, da sie ein höheres Maß an Heparan Sulfat im Vergleich zu den anderen Zelle Linien16zum Ausdruck bringen. Da HT1080 Zellen anhaftend, Titration ist einfacher und weniger zeitaufwendig im Vergleich zu der traditionellen Sf9-basierte Titration. - Am Tag der Infektion bestimmen Sie die Anzahl der Zellen pro Bohrloch durch zählen von Zellen aus Brunnen. Infizieren Sie durch das Hinzufügen der verwässerte original Baculovirus beiseite vor Spalte Reinigung und mit Proben aus der Spalte durchströmten, Waschen und Elution Brüche hinterlegt hatte, die die Zellen. Bestimmen Sie für jede Probe die Verdünnung und Volumen empirisch basierend auf infektiöse Baculovirus Teilchen, und infizieren Sie jede Vertiefung in dreifacher Ausfertigung zu.
- Analysieren Sie zwei Tage nach der Infektion, die Zellen für die Expression des Gens von Interesse. Zellen können mit einem Durchflusszytometer, wenn sie einer fluoreszierenden Proteins (z. B. GFP)17 Ausdruckanalysiert werden.
- Der Titer (infektiösen Einheiten pro mL) basierend auf der Anzahl der Zellen zum Zeitpunkt der Infektion, der Verdünnungsfaktor und Prozentsätze der fluoreszierenden Proteins in den Zellen mit der Formel zu berechnen: (Anzahl der Zellen während der Infektion × Prozentsatz fluoreszierenden Proteins positive Zellen × Verdünnungsfaktor) / Volumen des Baculovirus in mL.
Hinweis: Beispielsweise ist wenn die Gesamtzahl der Zellen pro Bohrloch zum Zeitpunkt der Infektion ist 1,2 × 105, fluoreszierenden Proteins beträgt 5 %, der Verdünnungsfaktor 100, und das Volumen der verdünnten Baculovirus hinzugefügt ist 10 µL, die Titer 6 × 107 infektiösen Einheiten (IE) /mL.
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Representative Results
Das Protokoll dargestellt ist in einem Flussdiagramm (Abbildung 1). Schritte umfassen die Transiente Transfektion von Sf9 Zellen mit Bacmid DNA Baculovirus anhaftende Kultur in einer Platte, die spätere Verstärkung in serumfreien SUSPENSIONSKULTUR, Nuklease Behandlung und Klärung durch Zentrifugation und Filtration herstellen, und die Reinigung mit der Heparin-Affinitätschromatographie gefolgt von Konzentration mit Ultrazentrifugation.
Nach dem Auftauen, Sf9 Zellen brauchen mindestens zwei Wochen zu erholen und in der exponentiellen Wachstumsphase einzutreten. Aktiv wachsende Sf9 sind Zellen mit Bacmid DNA in adhärenten Kultur transfiziert. Zwei Tage nach Transfektion, Ausdruck des Baculovirus Umschlag glucoproteide gp64 erkannt und anschließend Baculovirus Produktion initiierten11. Da Baculovirus Replikation zuständigen ist, erhöht sich die Anzahl der infizierten Zellen allmählich aufgrund einer fortschreitenden Infektion von Zellen mit der neuproduzierten Baculovirus, die in das Wachstumsmedium abgesondert wird. Baculovirus mit Zelle Überstände sind geernteten 5 Tage nach Transfektion, wenn die gesamte Zellenbevölkerung infiziert hat. Dieses erste Virus überstand bezeichnet man als Durchgang 1 (P1) bestand. P ist1 für die nachfolgende Infektion einer neu gesäten Anhänger Kultur Sf9 Zellen in einer größeren Platte verwendet. Die gesamten Zellpopulation zeigt Anzeichen einer Infektion in 5 Tagen die zytopathischen Effekt (Abbildung 2) genannt wird. Der Überstand von der zweiten adhärente Zellkultur wird geerntet und wird bezeichnet als P2 Lager. Baculovirus Überstand wird in Sf9 SUSPENSIONSKULTUR durch laufende Infektion frisch hinzugefügten Sf9 Zellen in einem Shaker-Kolben mit serumfreien Insekt Zellkulturmedium verstärkt. Am Ende eines jeden Infektionszyklus zeigen die meisten Zellen zytopathischen Effekt mit einem erhöhten zellulären Durchmesser und tot oder lysierten Zellen, die Zeichen für die Fertigstellung des Baculovirus-Infektion sind. Baculovirus Lager wird sequentiell verstärkt, bis die gewünschte Lautstärke (P3, P4,...) erreicht ist. Der Überstand wird durch Lowspeed Zentrifugation, behandelt mit einer Nuklease Verringerung der Viskosität, gefiltert durch einen 0,45-μm-Membran, bevor Sie in den nachfolgenden Schritten Reinigung und Konzentration verwendet wird aus den Sf9 Zellen getrennt.
Baculovirus zu reinigen, ist eine Heparin-Spalte überstand von infizierten Sf9 Zellen verladen. Die Heparin-Spalte wird allmählich mit stark gebundenen Baculovirus und lose gebundenen Proteins Schadstoffen gesättigt. Die Heparin-Spalte wird mit Waschpuffer um Verunreinigungen zu entfernen, bis die ultravioletten (UV) Absorption Kurve gespült (280 nm) kehrt zur Grundlinie zurück und wird stabil, die Entfernung von lose gebundenen und ungebundenen Materialien aus der Spalte angibt. Baculovirus Partikel binden auf der anderen Seite stark an die Heparin-Spalte. Aus diesem Grund ist keine signifikante Menge des Virus in die Spalte Waschpuffer erkannt. Heparin-gebundenen Baculovirus Partikel sind mit 1,5 M von Natrium-Chlorid bei pH 8,0 und 10-fach verdünnt mit Puffer zu erreichen Isotonicity und verhindert Virus-Inaktivierung eluiert. Eine scharfe Spitze des Proteins wird während der Elution beobachtet das Baculovirus Bruchteil (Abbildung 3) entspricht. Die optimierte Bedingungen für probenbeladung, Wasch- und Elution in diesem Chromatographie Protokoll Ausbeute mehr als 50 % Erholung der gereinigten infektiöse Baculovirus Partikel verwendet. Verdünnte Überstände sind weitere bis zu 500-fold mit Ultrazentrifugation konzentriert und formuliert in PBS mit 0,5 % BSA, was einen Netto 25 % Erholung11ergibt.
Abbildung 1 . Schematische Darstellung für die Herstellung und Reinigung des Baculovirus. Sf9 Zellen sind in Kultur behandelt Zellplatte mit Bacmid DNA transfiziert ausgesät. Baculovirus Überstand wird geerntet und verwendet, um neue Sf9 Zellen anhaftende Kultur zu infizieren. Infizierte Zellen werden anschließend in serumfreien SUSPENSIONSKULTUR propagiert. Baculovirus überstand ist mit einer Nuklease behandelt, zentrifugiert und gefiltert. Baculovirus ist durch Heparin Spalte Affinitätschromatographie gereinigt, in Puffer verdünnt und aseptisch durch Ultrazentrifugation konzentriert. Zu guter Letzt Baculovirus Überstand bei-80 ° c gelagert (Die Abbildung wurde angepasst von Nasimuzzaman Et Al., 2016, Mol Ther Methoden Clin Entw. 2016; 3: 16071 mit freundlicher Genehmigung.) Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 . Zytopathischen Effekte des Baculovirus Sf9 Zellen infiziert. Baculovirus überstand wurde verwendet für Sf9 Zellen in einer Gewebekultur behandelt-Platte zu infizieren. Fünf Tage nach der Infektion, wurden Zellen mit einem inversen Mikroskop Phase visualisiert. A) nicht infizierten Sf9 Zellen als Kontrolle. B) Baculovirus infizierten Sf9 Zellen zytopathischen Effekt zeigen. Zellen werden bei 200 X Vergrößerung angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 . Die Anzahl der infektiösen Baculovirus im Durchflussverfahren während Heparin Affinitätschromatographie. Baculovirus Titer wurden durch Infektion der Zellen HT1080 geschätzt. Untersuchten Proben waren die Spalte Durchlauf, Waschen und Eluat einschließlich. Proben wurden verdünnt, je nach Bedarf. Die Linie (dunklen Diamanten) zeigt die totale infektiöse Einheiten (IE) Baculovirus in jeder Bruchteil. Die Bruchteil Größe der Spalte durchströmten Probe und Waschpuffer wurden 40 mL in jedem Röhrchen und Eluat war 10 mL in jedem Röhrchen. (Die Abbildung wurde angepasst von Nasimuzzaman Et Al., 2016, Mol Ther Methoden Clin Entw. 2016; 3: 16071 mit freundlicher Genehmigung.) Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Die hier vorgestellten Protokoll beschreibt die Herstellung von Baculovirus in Sf9 Zellen in SUSPENSIONSKULTUR und Reinigung des Baculovirus mit einem Heparin-Affinitätschromatographie. Die Parameter, die in diesem Protokoll verwendeten den Ertrag maximieren und minimieren die Inaktivierung von infektiösen Baculovirus. Das Protokoll zur Verfügung gestellt hier zeigt, dass eine deutlich verbesserte Regeneration Baculovirus Teilchen im Vergleich zu Rückforderungen von anderen9erreicht.
Aufgrund der breiten Host Range und Gewebe Tropismus wurden mehrere Studien im Zentralnervensystem, Leber, Auge, Eierstock, Prostata und Hoden mit Baculovirus-vermittelten gen Lieferung5,6,7,8 . Baculovirus Vektoren mit therapeutischen Gene, wie Selbstmord Gene, Tumor-Suppressor-Gene und Gene, die Codierung tumorspezifischen Antigene in präklinischen erfolgreich durchgeführt wurden Modelle Tier18,19. Obwohl Baculovirus menschliche Zellen transduzieren können, können nur in Insektenzellen propagiert und, infolgedessen stellt kein Risiko an menschlichen Empfänger.
Baculovirus entsteht durch Transiente Transfektion von Bacmid DNA in Insektenzellen. Die Qualität des Bacmid ist entscheidend für die Produktion von hoch-Titer Baculovirus. In der Regel führt frisch zubereitete Bacmid besser als diejenigen für längere Zeit im Kühlschrank aufbewahrt werden. Aktiv wachsende Sf9 sind Zellen effizient transfiziert erzeugen hohe Titer Baculovirus. Während der Phase der Amplifikation es ist wichtig, die Zellkonzentration in die SUSPENSIONSKULTUR zu optimieren und das Volumen des Baculovirus überstand zur Infektion. Wenn das Verhältnis von Baculovirus Partikel Zellen nicht optimal ist, kann die Ausbeute an Baculovirus niedriger als die erwartete (persönliche Beobachtung, MN) sein.
Beim Laden der Baculovirus überstand auf die Heparin-Säule, ist es wichtig, der Durchfluss für Viruspartikel zu überprüfen, die durch die Säule übergeben werden kann. In diesem Fall eine untere Spalte Laufgeschwindigkeit kann erforderlich sein oder kleineres Volumen überstand sollte auf die Spalte geladen werden. Der Großteil der Verunreinigungen in das Baculovirus Überstände werden während der Waschschritt der Chromatographie-Ausführung abgewaschen. Wir bewerten die Reinheit des Baculovirus durch silberne Färbung von Natrium-Dodecyl-Sulfat (SDS)-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (PAGE) Gel und Elektron mikroskopische studieren und festgestellt, dass unsere gereinigten Baculoviren guter Qualität12.
Wir haben sorgfältig optimiert die verbindliche Auflagen und festgestellt, dass POROS Heparin Medium besser als andere Heparin-Medien (zB. HiTrap oder Capto Heparin) in seiner Fähigkeit, Baculovirus Partikel (persönliche Beobachtung) zu erfassen. Die Fähigkeit des Heparins Baculovirus bei höheren Probe Geschwindigkeit und Kapazität binden ist wichtig, nachgeschaltete Bearbeitungszeit für die Großserienfertigung Prozess zu minimieren. Neben Baculovirus bindet Heparin Medium auch andere kontaminierende Proteine, die eine für Heparin Affinität. Die meisten der niedermolekularen Kontamination können durch die Einbeziehung einer tangentialen Fluss (TFF) Filtrationsschritt stromabwärts von der Heparin-Chromatographie laufen beseitigt werden. TFF dient auch als Alternative zur Zentrifugation Produkt20konzentrieren.
Dieses Protokoll kann zur Reinigung von anderen Viren und Proteine, die eine für Heparin Affinität verwendet werden. Änderungen der Wasch- und Elution Puffer-Zusammensetzung und die Durchflussmenge sein erforderlich.
Rekombinantes Proteinproduktion arbeitet nun mit ungereinigten Baculovirus Überstände direkt. Daher können grobe Baculovirus für rekombinante Protein-Produktion verwendet werden. Allerdings, wenn Baculoviren als Vektor für in Vivo Gentransfer oder als Impfstoff verwendet werden, sind zusätzliche Reinigungsschritte wie Chromatographie, Gel Filtration und/oder Ultrazentrifugation notwendig, rein und konzentriert Baculovirus zu erhalten Partikel und Produzent Zelle und Kulturmedien abgeleitet Verunreinigungen zur Vermeidung von Toxizität, Entzündungen und eine Immunantwort zu minimieren.
Zusammenfassend haben wir ein einfaches Protokoll für die Herstellung und Reinigung des Baculovirus, die für die Herstellung rekombinanter Proteine, Impfungen und Gen-Therapie-Vektoren Aufstockung können werden beschrieben.
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Disclosures
Die Autoren erklären keinen Interessenskonflikt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wird teilweise unterstützt durch die Anschubfinanzierung von Cincinnati Children Research Foundation (CCRF) M.N und Innovative Core Grant (ICG) unterstützt durch die nationale Mitte für voran Translational Wissenschaft von den National Institutes of Health unter Award Nr. UL1 TR001425. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Akta Avant 150 | GE Healthcare | 28976337 | Chromatography system |
| POROS Heparin 50 µm Column | ThermoFisher Scientific | 4333414 | Heparin column |
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | Non-catalog item | Concentrates virus at high-speed |
| Polyallomer Ultracentrifuge tube | Beckman-Coulter | 326823 | Concentrates virus at high-speed |
| MaxQ 8000 orbital shaker incubator | ThermoFisher Scientific | Non-catalog item | Shaker for suspension culture |
| 250 mL Erlenmeyer flasks | ThermoFisher Scientific | 238071 | Flask for suspension culture |
| 1 L Erlenmeyer flasks | ThermoFisher Scientific | 238072 | Flask for suspension culture |
| Microscope (Olympus CKX41) | Olympus | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | For clarification of Baculovirus supernatant |
| 50 ml Conical tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | For collection of Baculovirus supernatant |
| 6-well plate | ThermoFisher Scientific | 07-200-80 | Tissue culture treated plate |
| 10-cm plate | ThermoFisher Scientific | 08-772E | Tissue culture treated plate |
| Stericup-HV, 0.45 µm, PVDF | EMD-Millipore | SCHVU05RE | Filtration unit |
| Kanamycin | ThermoFisher Scientific | 15160-054 | |
| Tetracycline | Sigma-Aldrich | T7660 | |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15750-060 | |
| Bac-to-Bac Vector Kit | ThermoFisher Scientific | 10360-014 | Baculovirus expression system |
| DH10B-T1R Competent cell | ThermoFisher Scientific | 12331-013 | Competent cell for bacmid |
| TE buffer | In-house | Non-catalog item | 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0. |
| Plasmid Maxiprep kit | ThermoFisher Scientific | K2100-06 | For bacmid purification |
| Sf9 Cells | ThermoFisher Scientific | 11496-015 | Insect cells |
| Grace’s Insect Cell Culture Medium | ThermoFisher Scientific | 11605-094 | Transfection medium |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 20012227 | Washing cells, diluting samples |
| HyClone SFX-Insect cell media | GE Healthcare | SH30278.02 | Serum-free insect cell growth medium |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Enzyme to degrade DNA and RNA |
| Baculovirus plasmid (bacmid) DNA | In-house | Non-catalog item | Bacmid for Baculovirus Production |
| Cellfectin II | ThermoFisher Scientific | 10362 | Transfection reagent for insect cells |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4737 | Stabilizes Baculovirus |
| Cryovial | Thomas Scientific | 1222C24 | For storage of Baculovirus |
| HT1080 cell line | ATCC | CCL-121 | Fibroblast cell line |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Growth media for cell lines |
| Wash buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 150 mmol/l sodium chloride |
| Elution buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 1.5 mol/l sodium chloride |
| Column cleaning buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 2.0 mol/l sodium chloride |
| Sterile water | In-house | Non-catalog item | For Akta Avant cleaning |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.09137 | For Akta Avant cleaning |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7073 | For Akta Avant cleaning |
References
- Ikonomou, L., Schneider, Y. J., Agathos, S. N. Insect cell culture for industrial production of recombinant proteins. Appl Microbiol Biotechnol. 62 (1), 1-20 (2003).
- Contreras-Gomez, A., Sanchez-Miron, A., Garcia-Camacho, F., Molina-Grima, E., Chisti, Y. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnol Prog. 30 (1), 1-18 (2014).
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