Summary
I denne protokollen, er baculovirus produsert av forbigående transfection av baculovirus plasmider i Sf9 celler og forsterket i en serum-free suspensjon kultur. Nedbryting er renset ved heparin affinitet kromatografi og mer konsentrert av ultracentrifugation. Denne protokollen er nyttig for produksjon og rensing av baculovirus for gene terapi program.
Abstract
Baculovirus har tradisjonelt blitt brukt for produksjon av rekombinante proteiner og vaksine. Men nyligere fremstår baculovirus som en lovende vektor gene terapi program. Her er baculovirus produsert av forbigående transfection av baculovirus plasmider DNA (bacmid) i en tilhenger kultur av Sf9 celler. Baculovirus er senere utvidet i Sf9 celler i en serum-free suspensjon kultur til ønsket volum er oppnådd. Det er så renset fra kulturen supernatant bruker heparin affinitet kromatografi. Virus supernatant er lastet inn kolonnen heparin som binder baculovirus partikler i nedbryting på grunn av slektskap av heparin for baculovirus innhylle glykoprotein. Kolonnen er vasket med en buffer å fjerne forurensninger og baculovirus er elut fra kolonnen med en høy-salt-buffer. Eluate er utvannet til en isotonic saltkonsentrasjon og baculovirus partiklene er mer konsentrert ultracentrifugation. Bruker denne metoden, kan baculovirus være konsentrert til 500-fold med en 25% gjenvinning av smittsomme partikler. Selv om protokollen beskrevet her viser produksjon og rensing av baculovirus fra kulturer opptil 1 L, metoden kan skaleres opp i et lukket system suspensjon kultur å produsere en klinisk-grade vektor gene terapi program.
Introduction
Baculovirus brukes primært for produksjon av rekombinante proteiner og vaksiner i lepidopteran Spodoptera fugiperda (Sf) 9 insekt celler ved hjelp av rekombinant Autographa californica multicapsid kjernefysiske polyhedrosis virus (AcMNPV) 1 , 2 , 3 , 4. nå nylig, det fremstår som en lovende vektor gene terapi program5. Det er kjent for å ha en bred vert og vev tropism, infiserer både quiescent og voksende celler, er ikke-patogene og integrere ikke i det vert kromosom4,5,6. Videre kan baculovirus produseres i serum-free suspensjon kultur som er skalerbar og tillater lukket system behandling for fremtidige klinisk produksjon1.
Renheten av baculovirus partikler er viktig for å oppnå effektiv signaltransduksjon samtidig minimere cytotoksisitet7,8,9. Baculovirus kan være konsentrert ultracentrifugation eller tangentiell flyt filtrering (TFF) med begrenset innvirkning på sin infectivity. Disse prosedyrene ikke bare konsentrere viruspartikler men også mobilnettet rusk og proteiner fra Sf9 kultur, som kan være giftig i vitro (personlig observasjon) og kan forårsake betennelse eller en immunrespons når den brukes i vivo. For å unngå dette, spesielt når bruker svært konsentrert virus aksjer, trenger smittsomme baculovirus å bli renset og atskilt fra forurensende partikler.
Flere metoder har blitt rapportert for rensing og konsentrasjonen av baculovirus vektorer10,11,12. Av de tilgjengelige tilnærmingene tillater heparin affinitet kromatografi enkeltsteg høy rensing med lav konsentrasjon av forurensende proteiner12. Metoden er basert på identifisering av heparan sulfate som reseptoren for baculovirus13,14. Etter lasting Sf9 celle nedbryting på kolonnen og binding av baculovirus, kan kolonnen vaskes med fysiologiske (isotonic) buffer fjerne ubundet eller løst bundet skadelige partikler. Siden bindingen til heparin er reversibel, kan baculovirus partikler være elut med en høy salt buffer, som er utvannet umiddelbart til fysiologiske (isotonic) saltkonsentrasjon å hindre inaktivering av osmotisk sjokk12. Videre utføres produksjon av baculovirus, i tillegg til fangst og elueringsrør fra kolonnen kromatografi med en lukket system prosess som er kompatibel med gjeldende anbefalte fremgangsmåter (cGMP).
Her gir vi en detaljert protokoll for produksjon, rensing og konsentrasjonen av smittsomme baculovirus affinitet kromatografi og sentrifugering. Kort vi produserer baculovirus av hva Sf9 celler med en baculovirus plasmider DNA i tilhenger kultur og ytterligere utvide den smittsomme baculovirus i serum-free suspensjon kultur. Vi rense baculovirus bruker heparin affinitet kromatografi og bruke ultracentrifugation som det siste trinnet for å konsentrere høyt vektoren for gene terapi program.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Se figur 1 for en illustrasjon oppsummering protokoll.
1. rensing av Baculovirus plasmider DNA
- Vokse bakteriell kultur som inneholder baculoviral plasmider DNA (bacmid)14 i 200 mL LB buljong med antibiotika; kanamycin (50 µg/mL), tetracycline (10 µg/mL) og gentamycin (7 µg/mL), 16 h på 37 ° C på en orbital shaker innstillingen på 300 rpm.
- Rense bacmid DNA fra bakteriell kultur bruker standard alkaliske lysis protokollen15og oppløse bacmid TE buffer.
2. produksjon av Baculovirus
- Kultur Sf9 celler i en orbital shaker inkubator ved 135 rpm og 28 ° C i en polykarbonat Erlenmeyer kolbe som inneholder serum-free insekt kultur medium1,2,3.
Merk: Hvis Sf9 celler er tint fra frosne lager, Tillat minst to uker for cellene å gjenopprette og angi den eksponentielle fasen av vekst. - Telle Sf9 celler høstes ved eksponentiell fasen av vekst med en hemocytometer etter farging med Trypan blå. Frø 1 x 106 levedyktig Sf9 celler per brønn i en 6-og vev kultur-behandlet plate i 2 mL av medium. Tillat å feste 1t på 28 ° C i en inkubator.
- Erstatt vekstmediet med 1 mL av serum-free unsupplemented Grace insekt kultur medium.
- Transfect bacmid DNA i Sf9 cellene med insekt celle transfection reagens.
- Bland 8 µL insekt celle transfection reagens med 100 µL av Grace insekt medium.
- Fortynne 2 µg av bacmid DNA i 100 µL unsupplemented insekt medium, og bland forsiktig av vortexing.
- Kombiner utvannet DNA med fortynnet insekt celle transfection reagensen, og bland forsiktig. Inkuber i 15 til 30 min ved romtemperatur.
- Legg DNA-lipid blandingen dropwise til cellene. Ruge på 28 ° C i en inkubator for ca 5t.
- Fjerne transfection blandingen fra cellene og vask cellene med 2 mL PBS.
- Legg 2 mL insekt kultur medium og fortsette å kultur på 28 ° C i en inkubator uten å endre media.
Merk: Hvis bacmid inneholder et fluorescerende protein, kan uttrykket oppdages i celler 48 timer etter hva. Baculovirus er produsert av transfekterte Sf9 celler og skilles ut i kultur medium som senere infiserer untransfected cellene. Befolkningen hele cellen blir infisert av baculovirus i 5 dager og viser tegn på virusinfeksjon, også kalt cytopathic virkning. Disse inkluderer økt celle diameter, vacuoles/granulater i cytoplasma, opphør av cellevekst og død eller lysed celler finnes i cellekultur. Men hvis transfection eller infeksjon effektiviteten ikke er optimal, kan kultur ikke viser en åpenbar cytopathic effekt. Cytopathic effekten kan visualiseres med en invertert fase mikroskopet på 200-400 X forstørrelse. Baculovirus infisert cellen kan oppdages av flekker med anti-gp64 antistoff11. - Høste baculovirus supernatant 5 dager etter transfection og etikett som P1 virus lager.
- Lagre baculovirus supernatant, som er lysfølsom, i mørket med 0,5% bovin serum albumin (BSA) i PBS. Lagre på 4 ° C for kortsiktige (opp til 90 dager) eller på-80 ° C på lang sikt.
- Frø 6 × 106 Sf9 celler i en 10 cm vev kultur-behandlet plate i 10 mL av insekt kultur medium. Legge til 1 mL av første baculovirus supernatant (P1) i cellene.
- Høste baculovirus supernatant (P2) på 5th dag etter infeksjon.
- Ætt 50 mL av Sf9 celler (3 x 106 celler/mL) i suspensjon kultur i insekt kultur medium i en 250-mL polykarbonat Erlenmeyer kolbe og sted flasken i en orbital shaker inkubator. Legg 2 mL P2 lager til cellene og riste på 135 rpm samtidig opprettholde en konstant temperatur på 28 ° C.
Merk: Tre eller fire dager etter smitte, viser hele Sf9 celle befolkningen cytopathic effekt, som er en indikasjon på høy-titer baculovirus produksjon. - Sekvensielt forsterke baculovirus supernatants til det ønskede volumet er oppnådd (P3P4,...) ved å øke 10 til 50-fold volum med cellekulturer i hver etterfølgende infeksjon.
Merk: P3 er 3rd runde av infeksjon i hvilke 500 mL til 1 L Sf9 cellekultur kan være infisert med 10 til 20 mL P2 baculovirus supernatant; P4 er de 4th runde av infeksjon i hvilke 5 til 10 L Sf9 cellekultur kan være infisert med 100 til 200 mL P3 baculovirus nedbryting og så videre. Vanligvis er Sf9 celler seeded på 3 × 106 celler/mL i serum-free insekt kultur medier. - Sentrifuge baculovirus supernatant 1000 x g i 30 min på 4 ° C fjerne mobilnettet rusk og behandle baculovirus supernatant med 50 enheter/mL nuclease (250 enheter/µL av lager) 2 h på 37 ° C å fordøye genomisk DNA og RNA. Filtrere supernatants gjennom et 0,45 μm filtrering enhet.
3. forberedelse av kromatografi
- Forberede kromatografi systemet ved sekvensielt skylling utvalg og buffer linjene hver med sterilt vann, 1 N natriumhydroksid, vann, og vask buffer (20 mM natrium fosfat buffer inneholder 150 mM natriumklorid, pH 7.0) på en lineær flow rate på 50 mL/min.
- Forberede en heparin 50 µm kolonne (10 × 10 cm, 7.9 mL av kolonnen volum (CV)) ved å kjøre fortløpende kolonnen rengjøring buffer (5 CV sterilt 20 mM natrium fosfat buffer inneholder 2 M natriumklorid, pH 7.0) og 5 CV vaskebuffer på en lineær flow rate på 7 mL/min.
4. rensing av Baculovirus vektor
- Definere kromatografi systemet som følger:
- Bruke eksempel-lasting innløp port for lasting baculovirus supernatant.
- Bruke buffer innløp port A1 for lasting av vaskebuffer. Forberede en flaske med minst 500 mL vaskebuffer og plasser bufferlinjen vask i flasken.
- Bruke buffer innløp port A2 for lasting elueringsbufferen (20 mM natrium fosfat med 1,5 M natriumklorid, pH 8.0). Forberede en flaske med minst 500 mL elueringsbufferen og plasser bufferlinjen elueringsrør i flasken.
- Sett inn flere 50 mL konisk rør i brøkdel collector å samle den kolonnen pass-through baculovirus supernatant, vaske bufferen og eluted baculovirus.
- Equilibrate heparin kolonnen med fem 7.9 mL kolonnen volumer (CVs) av vaskebuffer (40 mL) på en lineær flow rate på 7,0 mL/min.
- Last 250 mL av baculovirus supernatant på kolonnen heparin bruker eksempel pumpen (innløp eksempel port) av Ture på en lineær flow rate på 2,0 mL/min.
- Kjøre 10 CVs (80 mL) av vaskebuffer gjennom heparin kolonne på en lineær flow rate på 2,0 mL/min til ultrafiolett (UV) absorbansen kurven (280 nm) har returnert til grunnlinjen og stabiliseres.
- Elute baculovirus partikler fra kolonnen 7.9 mL heparin med 5 CVs (40 mL) av elueringsbufferen på en lineær strømningshastighet på 4.0 mL/min. Sjekk for en skarp elueringsrør topp protein på chromatogram når baculovirus partikler dissociate fra kolonnen heparin.
- Etter eluering vil umiddelbart fortynne elut baculovirus nedbryting 10-fold bruke 20 mM natrium fosfatbuffer i vann for å hindre inaktivering av baculovirus partikler fra osmotisk støt under påfølgende sentrifugering.
- Lagre 100 µL av fraksjoner, inkludert gjennomflytsenhet kolonnen samlet under lasting av baculovirus nedbryting, vaske bufferen og eluate. Infisere disse baculovirus fraksjoner å HT1080 å vurdere en renselsesprosess (se avsnitt 6).
- Rengjør kolonnen med kolonnen buffer og vaskebuffer. Til slutt, skyll kolonnen med 5 CV sterilt 20% etanol i vann på en lineær flow rate på 7,0 mL/min og lagre på 4 ° C.
- Rengjør kromatografi systemet med vann, 1 N natriumhydroksid, igjen med vann, og 20% etanol i vann på en lineær flow rate på 50.0 mL/min og lagre systemet i 20% etanol.
5. konsentrasjon av Baculovirus
- Pre sterilisere sentrifuge rør med en autoklav. Legge til en lik mengde baculovirus supernatant i hver ultracentrifuge rør i vev kultur hette. Måle tube vekten av en balanse og juster vekten av innholdet av ultracentrifuge tuber med sterilt PBS.
- Plass hver av ultracentrifuge tuber motsette bøtte med SW 32 Ti rotoren.
- Kjøre ultracentrifuge 80.000 × g i 90 minutter på 4 ° C.
- Åpne ultracentrifuge rør i vev kultur hette og tas aseptisk Sug opp væske uten å fjerne baculovirus pellets.
- Resuspend pellets hver rør av kraftig pipettering opp og ned med 200 µL PBS med 0,5% (w/vol) BSA.
- Overføre konsentrert baculovirus til cryovials (50-100 µL per medisinglass) og lagre på-80 ° C.
6. titrering av Baculovirus
- Dagen før infeksjon, Tell HT1080 celler ved hjelp av en hemocytometer etter farging celler med Trypan blå. Frø 1 x 105 HT1080 celler per brønn i en 6-vel plate i 2 mL av Dulbeccos endret Eagle's Medium (DMEM) som inneholder 10% fosterets bovin serum (FBS). Frø flere flere brønner skal kunne fastslå nøyaktig antall celler ved infeksjon. Kultur cellene i en inkubator på 37 ° C og 5% CO2.
Merk: HT1080 celler brukes for titrering som de uttrykker et høyere nivå av heparan sulfate sammenlignet med de andre celle linjer16. Siden HT1080 celler er tilhenger, titrering er enklere og mindre tidkrevende i forhold til bruk av tradisjonelle Sf9-baserte titrering. - På dagen for infeksjon, bestemme antall celler per brønn ved å telle celler fra brønner. Infisere cellene ved å legge den utvannet opprinnelige baculovirus som hadde blitt satt til side før kolonnen rensing, og med prøver fra kolonnen gjennomflytsenhet, vask og elueringsrør fraksjoner. For hver prøve, bestemme fortynning og empirisk volum på smittsomme baculovirus partikler og infisere hver brønn i tre eksemplarer.
- To dager etter smitte, analysere celler for uttrykket av genet av interesse. Cellene kan analyseres ved hjelp av en flyt cytometer hvis de uttrykker en fluorescerende protein (f.eks GFP)17.
- Beregne titers (smittsomme enhet per mL) basert på antall celler ved infeksjon, fortynningsfaktoren og prosenter fluorescerende protein i celler ved hjelp av formelen: (antall celler under infeksjon × andel av fluorescerende protein fortynningsfaktoren for positiv celler ×) / volumet av baculovirus i mL.
Merk: For eksempel hvis antall celler per brønn ved infeksjon er 1,2 × 105, prosentandelen av fluorescerende protein er 5%, fortynningsfaktoren er 100 og volumet av fortynnet baculovirus lagt er 10 µL, er titer 6 × 107 smittsomme enheter (IU) /mL.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen presentert er i et dataflytskjema (figur 1). Trinnene inkluderer det forbigående transfection av Sf9 celler med bacmid DNA til å produsere baculovirus i tilhenger kultur i en plate, etterfølgende forsterkning i serum-free suspensjon kultur, nuclease behandling og avklaring av sentrifugering og filtrering og rensing med heparin affinitet kromatografi etterfulgt av konsentrasjonen med ultracentrifugation.
Etter tining, Sf9 cellene trenger minst to uker å komme seg og inngå den eksponentielle fasen av vekst. Aktivt vokser Sf9 celler er transfekterte med bacmid DNA i tilhenger kultur. To dager etter transfection, uttrykk for baculovirus konvolutten glykoproteiner, gp64 oppdages og deretter baculovirus produksjon er initiert11. Siden baculovirus er replikering kompetente, øker antall infiserte celler gradvis på grunn av en progressiv infeksjon av celler med den nylig produsert baculovirus som utskilles i vekstmediet. Baculovirus inneholder cellen supernatants er høstet 5 dager etter transfection når befolkningen hele cellen har blitt infisert. Denne første virus supernatant er utpekt som passering 1 (P1) lager. P1 lager brukes for etterfølgende infeksjon av en nylig seeded tilhenger kultur av Sf9 celler i en større plate. Befolkningen hele cellen viser tegn på infeksjon i 5 dager som kalles cytopathic virkning (figur 2). Nedbryting fra andre tilhenger celle kulturen er høstet og som P2 stock. Baculovirus nedbryting forsterkes ytterligere i Sf9 suspensjon kultur gjennom pågående infeksjon av nylig lagt Sf9 celler i en shaker flasken serum-free insekt celle kultur medium. På slutten av hver infeksjon syklus viser de fleste av cellene cytopathic effekt med en økt mobilnettet diameter og død eller lysed celler, som er tegn for gjennomføring av baculovirus infeksjon. Baculovirus lager forsterkes sekvensielt til ønsket volum er oppnådd (P3P4,...). Nedbryting er atskilt fra de Sf9 cellene med lav hastighet sentrifugering, behandlet med en nuclease å redusere viskositet, filtrert gjennom en 0,45 μm membran, før de brukes i fremgangsmåten for rensing og konsentrasjon.
For å rense baculovirus, er nedbryting fra infiserte Sf9 celler lastet opp på en heparin-kolonne. Kolonnen heparin blir gradvis mettet med sterkt bundet baculovirus og løst bundet protein forurensninger. Kolonnen heparin skylles med vaskebuffer å fjerne forurensninger til ultrafiolett (UV) absorbansen kurven (280 nm) returnerer til grunnlinjen og stabiliseres, indikerer fjerning av løst bundet og ubundet materiale fra kolonnen. Baculovirus partikler binde derimot sterkt til kolonnen heparin. Derfor er ingen betydelig mengde virus oppdaget i kolonnen vaske bufferen. Heparin-bundet baculovirus partikler er elut med 1,5 M for natriumklorid ved pH 8.0 og utvannet 10-fold med buffer for å oppnå isotonicity og hindre virus inaktivering. En skarp topp protein er observert under elueringsrør som tilsvarer baculovirus brøken (Figur 3). Optimalisert betingelsene for eksempel lasting, vask og elueringsrør brukes i dette kromatografi protokollen avkastning mer enn 50% utvinning av renset smittsomme baculovirus partikler. Utvannet supernatants er mer konsentrert til 500-fold med ultracentrifugation og formulert i PBS med 0,5% BSA, som gir en netto 25% gjenvinning11.
Figur 1 . Skjematisk diagram for produksjon og rensing av baculovirus. Sf9 celler er sådd i celle kultur-behandlet plate transfekterte med bacmid DNA. Baculovirus nedbryting er høstet og brukes å infisere nye Sf9 celler i tilhenger kultur. Infiserte celler, deretter overføres i serum-free suspensjon kultur. Baculovirus nedbryting er behandlet med en nuclease, sentrifugeres og filtreres. Baculovirus er renset ved heparin affinitet kolonnen Ture, fortynnet i bufferen og konsentrert tas aseptisk ved ultracentrifugation. Endelig lagres baculovirus supernatant på-80 ° C. (Tallet er tilpasset fra Nasimuzzaman et al., 2016, Mol Ther metoder Clin Dev. 2016; 3: 16071 med tillatelse.) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Cytopathic effekter av baculovirus infisert Sf9 celler. Baculovirus nedbryting ble brukt for å infisere Sf9 cellene i en vev-kultur behandlet plate. Fem dager etter smitte, var celler visualisert med en invertert fase mikroskop. A) Uninfected Sf9 celler som en kontroll. B) Baculovirus infisert Sf9 celler viser cytopathic virkning. Celler vises på 200 X forstørrelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . Antall smittsomme baculovirus i gjennomflytsenhet under heparin affinitet kromatografi. Baculovirus titers ble anslått av infeksjon av HT1080 celler. Prøvene testet var inkludert kolonnen gjennomgang, vask og eluate. Prøvene ble utvannet etter behov. Linjen (mørk diamanter) viser de totale smittsomme enhetene (IU) av baculovirus i hver fraksjon. Brøkdel størrelsen på kolonnen gjennomflytsenhet utvalg og vaskebuffer var 40 mL i hver retning, og eluate var 10 mL i hver retning. (Tallet er tilpasset fra Nasimuzzaman et al., 2016, Mol Ther metoder Clin Dev. 2016; 3: 16071 med tillatelse.) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen presenteres her beskriver produksjonen av baculovirus i Sf9 celler i suspensjon kultur og rensing av baculovirus bruker en heparin affinitet kromatografi. Parameterne som brukes i denne protokollen maksimere avkastningen og minimere inaktivering av smittsomme baculovirus. Protokollen her viser en betydelig forbedret utvinning av baculovirus partikler i forhold til inngang oppnådd ved andre9.
På grunn av bred vert området og vev tropism, ble flere studier gjennomført i sentralnervesystemet, lever, øyne, eggstokk, prostata og testikkel med baculovirus-mediert gen levering5,6,7,8 . Baculovirus vektorer som inneholder terapeutiske gener, som selvmord gener, tumor suppressor gener og gener koding svulst-spesifikke antigener er vellykket gjennomført i preklinisk modeller dyr18,19. Selv om baculovirus kan transduce menneskelige celler, det kan bare overføres i insekt celler, og derfor utgjør ikke en risiko til menneskelig mottakere.
Baculovirus er produsert i insekt celler av forbigående transfection av bacmid DNA. Kvaliteten på bacmid er avgjørende for produksjonen av høy-titer baculovirus. Vanligvis utfører ferskt tilberedte bacmid bedre enn de er lagret i kjøleskapet for lengre tid. Aktivt vokser Sf9 celler er transfekterte effektivt som produserer høy-titer baculovirus. I fasen for forsterkning er det viktig å optimalisere celle konsentrasjonen i suspensjon kultur og volumet av baculovirus supernatant brukt for infeksjon. Hvis forholdet mellom baculovirus partikler til cellene ikke er optimal, kan avkastningen av baculovirus være lavere enn forventet (personlig observasjon, MN).
Mens lasting baculovirus supernatant på kolonnen heparin, er det viktig å sjekke gjennomflytsenhet for viruspartikler som kan være forbi gjennom kolonnen. Hvis det skjer, en lavere kolonne kjøre fart kan være nødvendig eller mindre volum nedbryting skal lastes inn i kolonnen. De fleste av forurensninger til stede i de baculovirus supernatants er vasket under vask trinnet av kromatografi kjøringen. Vi vurdert renheten på baculovirus av sølv farging av natrium dodecyl sulfate (SDS)-polyakrylamid gel geleelektroforese (side) gel og elektron mikroskopiske studie fant at våre renset baculoviruses er god kvalitet12.
Vi har nøye optimalisert bindende betingelser og fant at POROS heparin mediet er overlegen andre heparin medier (f.eks. HiTrap eller Capto heparin) evne til å fange baculovirus partikler (personlig observasjon). Evnen av heparin binde baculovirus høyere eksempel hastighet og kapasitet er viktig å minimere nedstrøms behandlingstid for store produksjonsprosessen. Foruten baculovirus binder heparin medium også andre forurensende proteiner som har en affinitet for heparin. De fleste av lav molekylvekt forurensning kan fjernes ved å inkludere en tangentiell flyt filtrering (TFF) trinn nedstrøms av heparin kromatografi kjøre. TFF brukes også som et alternativ til sentrifugering for å konsentrere produktet20.
Denne protokollen kan brukes for rensing av andre virus og proteiner som har en affinitet for heparin. Imidlertid kan endringer vask og elueringsrør buffer sammensetningen og infusjonshastigheten være nødvendig.
Rekombinant protein produksjon fungerer godt med urenset baculovirus supernatants direkte. Grov baculovirus kan derfor brukes for rekombinante proteiner produksjon. Men hvis baculoviruses brukes som en vektor i vivo genoverføring, eller som en vaksine, er ekstra rensing trinn som Ture, gel filtrering og/eller ultracentrifugation nødvendig for å oppnå ren og konsentrert baculovirus partikler og minimere produsent celle - og kultur medier-avledet urenheter å unngå toksisitet, betennelse og en immunrespons.
I konklusjonen, har vi beskrevet en enkel protokoll for produksjon og rensing av baculovirus som kan skaleres opp for produksjon rekombinante proteiner, vaksiner og gene terapi vektorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklære noen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbeidet støttes delvis av oppstart finansiering fra Cincinnati Children's Research Foundation (CCRF) M.N. og nyskapende Core Grant (ICG) støttes av National Center for fremme translasjonsforskning Sciences i National Institutes of Health under Prisen nummer UL1 TR001425. Innholdet er ansvar forfattere og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synet til National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Akta Avant 150 | GE Healthcare | 28976337 | Chromatography system |
| POROS Heparin 50 µm Column | ThermoFisher Scientific | 4333414 | Heparin column |
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | Non-catalog item | Concentrates virus at high-speed |
| Polyallomer Ultracentrifuge tube | Beckman-Coulter | 326823 | Concentrates virus at high-speed |
| MaxQ 8000 orbital shaker incubator | ThermoFisher Scientific | Non-catalog item | Shaker for suspension culture |
| 250 mL Erlenmeyer flasks | ThermoFisher Scientific | 238071 | Flask for suspension culture |
| 1 L Erlenmeyer flasks | ThermoFisher Scientific | 238072 | Flask for suspension culture |
| Microscope (Olympus CKX41) | Olympus | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | For clarification of Baculovirus supernatant |
| 50 ml Conical tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | For collection of Baculovirus supernatant |
| 6-well plate | ThermoFisher Scientific | 07-200-80 | Tissue culture treated plate |
| 10-cm plate | ThermoFisher Scientific | 08-772E | Tissue culture treated plate |
| Stericup-HV, 0.45 µm, PVDF | EMD-Millipore | SCHVU05RE | Filtration unit |
| Kanamycin | ThermoFisher Scientific | 15160-054 | |
| Tetracycline | Sigma-Aldrich | T7660 | |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15750-060 | |
| Bac-to-Bac Vector Kit | ThermoFisher Scientific | 10360-014 | Baculovirus expression system |
| DH10B-T1R Competent cell | ThermoFisher Scientific | 12331-013 | Competent cell for bacmid |
| TE buffer | In-house | Non-catalog item | 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0. |
| Plasmid Maxiprep kit | ThermoFisher Scientific | K2100-06 | For bacmid purification |
| Sf9 Cells | ThermoFisher Scientific | 11496-015 | Insect cells |
| Grace’s Insect Cell Culture Medium | ThermoFisher Scientific | 11605-094 | Transfection medium |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 20012227 | Washing cells, diluting samples |
| HyClone SFX-Insect cell media | GE Healthcare | SH30278.02 | Serum-free insect cell growth medium |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Enzyme to degrade DNA and RNA |
| Baculovirus plasmid (bacmid) DNA | In-house | Non-catalog item | Bacmid for Baculovirus Production |
| Cellfectin II | ThermoFisher Scientific | 10362 | Transfection reagent for insect cells |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4737 | Stabilizes Baculovirus |
| Cryovial | Thomas Scientific | 1222C24 | For storage of Baculovirus |
| HT1080 cell line | ATCC | CCL-121 | Fibroblast cell line |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Growth media for cell lines |
| Wash buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 150 mmol/l sodium chloride |
| Elution buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 1.5 mol/l sodium chloride |
| Column cleaning buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 2.0 mol/l sodium chloride |
| Sterile water | In-house | Non-catalog item | For Akta Avant cleaning |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.09137 | For Akta Avant cleaning |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7073 | For Akta Avant cleaning |
References
- Ikonomou, L., Schneider, Y. J., Agathos, S. N. Insect cell culture for industrial production of recombinant proteins. Appl Microbiol Biotechnol. 62 (1), 1-20 (2003).
- Contreras-Gomez, A., Sanchez-Miron, A., Garcia-Camacho, F., Molina-Grima, E., Chisti, Y. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnol Prog. 30 (1), 1-18 (2014).
- Cox, M. M. Recombinant protein vaccines produced in insect cells. Vaccine. 30 (10), 1759-1766 (2012).
- Boyce, F. M., Bucher, N. L. Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (6), 2348-2352 (1996).
- Airenne, K. J., et al. Baculovirus: an insect-derived vector for diverse gene transfer applications. Mol Ther. 21 (4), 739-749 (2013).
- Sung, L. Y., et al. Efficient gene delivery into cell lines and stem cells using baculovirus. Nat Protoc. 9 (8), 1882-1899 (2014).
- Zeng, J., Du, J., Lin, J., Bak, X. Y., Wu, C., Wang, S. High-efficiency transient transduction of human embryonic stem cell-derived neurons with baculoviral vectors. Mol Ther. 17 (9), 1585-1593 (2009).
- Zeng, J., Du, J., Zhao, Y., Palanisamy, N., Wang, S. Baculoviral vector-mediated transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells. Stem Cells. 25 (4), 1055-1061 (2007).
- Wu, C., Soh, K. Y., Wang, S. Ion-exchange membrane chromatography method for rapid and efficient purification of recombinant baculovirus and baculovirus gp64 protein. Hum Gene Ther. 18 (7), 665-672 (2007).
- Grein, T. A., Michalsky, R., Vega Lopez, M., Czermak, P. Purification of a recombinant baculovirus of Autographa californica M nucleopolyhedrovirus by ion exchange membrane chromatography. J Virol Methods. 183 (2), 117-124 (2012).
- Nasimuzzaman, M., Lynn, D., van der Loo, J. C., Malik, P. Purification of baculovirus vectors using heparin affinity chromatography. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16071 (2016).
- Makkonen, K. E., Turkki, P., Laakkonen, J. P., Yla-Herttuala, S., Marjomaki, V., Airenne, K. J. 6-o- and N-sulfated syndecan-1 promotes baculovirus binding and entry into Mammalian cells. J Virol. 87 (20), 11148-11159 (2013).
- Nasimuzzaman, M. Heparan sulfate in baculovirus binding and entry of mammalian cells. J Virol. 88 (8), 4607-4608 (2014).
- Urabe, M., et al. Scalable generation of high-titer recombinant adeno-associated virus type 5 in insect cells. J Virol. 80 (4), 1874-1885 (2006).
- Feliciello, I., Chinali, G. A modified alkaline lysis method for the preparation of highly purified plasmid DNA from Escherichia coli. Anal Biochem. 212 (2), 394-401 (1993).
- Nasimuzzaman, M., Persons, D. A. Cell Membrane-associated heparan sulfate is a receptor for prototype foamy virus in human, monkey, and rodent cells. Mol Ther. 20 (6), 1158-1166 (2012).
- Earl, P. L., Americo, J. L., Moss, B. Development and use of a vaccinia virus neutralization assay based on flow cytometric detection of green fluorescent protein. J Virol. 77 (19), 10684-10688 (2003).
- Kim, Y. K., et al. Suppression of tumor growth in xenograft model mice by programmed cell death 4 gene delivery using folate-PEG-baculovirus. Cancer Gene Ther. 17 (11), 751-760 (2010).
- Stanbridge, L. J., Dussupt, V., Maitland, N. J. Baculoviruses as vectors for gene therapy against human prostate cancer. J Biomed Biotechnol. 2003 (2), 79-91 (2003).
- Nasimuzzaman, M., et al. Production and purification of high-titer foamy virus vector for the treatment of leukocyte adhesion deficiency. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16004 (2015).
