Summary
В этом протоколе бакуловирусы производится переходных трансфекции бакуловирусы плазмида в Sf9 клетки и усиливается в культуре подвеска сыворотки бесплатно. Супернатант очищается хромотографией сродства гепарин и далее сосредоточена на ultracentrifugation. Этот протокол используется для производства и очистки бакуловирусы для генной терапии приложения.
Abstract
Бакуловирусы традиционно используется для производства рекомбинантных белков и вакцины. Однако совсем недавно, бакуловирусы становится перспективным вектор для генной терапии приложения. Здесь бакуловирусы производится переходных трансфекции бакуловирусы плазмидной ДНК (bacmid) в адэрентных культуры клеток Sf9. Бакуловирусы впоследствии расширены в Sf9 клеток в культуре сыворотки бесплатные подвески до получения нужного тома. Затем он очищается от культуры супернатанта, используя хромотографию сродства гепарина. Вирус супернатанта загружается на столбце гепарина, который связывает частицы бакуловирусы в надосадке благодаря близости гепарина для бакуловирусы окутывать гликопротеина. Столбце вымывается с буфером для удаления загрязнений и бакуловирусы этого eluted из столбца с высоким содержанием соли буфера. Элюата разводят в изотоническом концентрации соли и бакуловирусы частиц дальнейшего концентрируется с помощью ultracentrifugation. С помощью этого метода, бакуловирусы может быть сосредоточено до 500-fold с 25% восстановления инфекционных частиц. Хотя протокол, описанные здесь демонстрирует производства и очистки бакуловирусы от культур до 1 Л, метод может быть увеличен в закрытой системе подвески культуре производить клинико класса vector для генной терапии приложения.
Introduction
Бакуловирусы используется главным образом для производства рекомбинантных белков и вакцин в lepidopteran Spodoptera fugiperda (Sf) 9 насекомых клеток с помощью рекомбинантной californica Металловидка multicapsid ядерных polyhedrosis вирус (AcMNPV) 1 , 2 , 3 , 4. совсем недавно, она становится перспективным вектор для генной терапии приложения5. Это известно широкой хост и ткани тропизма, заражает покоя и пролиферирующих клеток, непатогенные и не интегрироваться в принимающей хромосомы4,5,6. Кроме того бакуловирусы могут быть произведены в сыворотки бесплатно подвеска культуры, которая является масштабируемой и позволяет для закрытой системы обработки для будущих клинических производства1.
Чистота бакуловирусы частиц имеет важное значение для достижения эффективного трансдукции при сведении к минимуму цитотоксичность7,8,9. Бакуловирусы может быть сконцентрирован на ultracentrifugation или тангенциальная фильтрация (TFF) с минимальным воздействием на его инфективности. Однако, эти процедуры не только сосредоточиться частицы вируса, но также сотовой мусора и белки от Sf9 культуры, которые могут быть токсичными в пробирке (личное наблюдение) и может вызвать воспаление или иммунного ответа при использовании в естественных условиях. Чтобы избежать этого, особенно когда с использованием высоко концентрированный запасов вируса, инфекционные бакуловирусы необходимо быть очищенной и отделены от загрязняющих частиц.
Были зарегистрированы несколько методов для очищения и концентрации бакуловирусы векторов10,,1112. Из имеющихся подходов гепарин аффинной хроматографии позволяет для единый этапа высокого уровня очистки с низкой концентрацией загрязняющих белки12. Метод основан на определении heparan сульфат как рецептора бакуловирусы13,14. После загрузки Sf9 клеток супернатант на столбец и привязка бакуловирусы, столбец можно мыть с физиологической (изотонические) буфера для удаления несвязанного или слабо связанного загрязняющих частиц. Поскольку привязки гепарина является обратимым, можно этого eluted бакуловирусы частицы с высокой соли буфер, который сразу же разбавляют в физиологические (изотонические) концентрации соли для предотвращения инактивации осмотическим шоком12. Кроме того производство бакуловирусы, а также захват на и элюции в столбце хроматографии, могут выполняться с использованием закрытой системе процесс, который совместим с текущей надлежащей производственной практики (cGMP).
Здесь мы предоставляем подробный протокол для производства, очистки и концентрация инфекционных бакуловирусы, используя хромотографию сродства и центрифугирования. Кратко мы производим бакуловирусы по transfection клеток Sf9 с бакуловирусы плазмидной ДНК в адэрентных культуре и далее расширять инфекционных бакуловирусы сыворотки бесплатно подвеска культуры. Мы очистить бакуловирусы используя хромотографию сродства гепарин и использовать ultracentrifugation в качестве последнего шага высоко сконцентрировать вектор для генной терапии приложения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Смотрите Рисунок 1 для иллюстрации подведение протокол.
1. Очистка бакуловирусы плазмидной ДНК
- Расти бактериальной культуры, содержащие baculoviral плазмида ДНК (bacmid)14 200 мл бульона фунтов антибиотиков; канамицин (50 мкг/мл), тетрациклином (10 мкг/мл) и гентамицина (7 мкг/мл), в течение 16 часов при 37 ° C на параметр орбитальный шейкер на 300 об/мин.
- Очистить bacmid ДНК от бактериальной культуры, с помощью стандартного щелочного литического протокол15и распустить bacmid в буфере TE.
2. производство бакуловирусы
- Культура Sf9 клетки в орбитальный шейкер инкубатор на 135 об/мин и 28 ° C в поликарбоната колбу Эрленмейера, содержащих сыворотки бесплатно Насекомое культуры средних1,2,3.
Примечание: Если Sf9 клетки талой из замороженных запасов, позволяют по крайней мере две недели для клеток для восстановления и ввести экспоненциальной фазе роста. - Подсчет ячеек Sf9, собирают в экспоненциальной фазе роста с Горяева после окрашивания с Трипановый синий. Семян 1 x 106 жизнеспособных клеток Sf9 за хорошо в культуре ткани лечение пластины 6-Ну в 2 мл среды. Разрешить ячейку для присоединения 1 h на 28 ° C в инкубаторе.
- Замените среднего роста с 1 мл сыворотки бесплатная unsupplemented Грейс насекомых питательной среды.
- Transfect bacmid ДНК в клетки Sf9, используя реагент transfection клеток насекомых.
- Смешайте 8 мкл насекомых ячейки трансфекции реагента с 100 мкл Грейс среднего насекомого.
- Развести 2 мкг bacmid ДНК в 100 мкл unsupplemented насекомых средних и смешайте нежно vortexing.
- Совместить разреженных ДНК с реактивом трансфекции разреженных насекомых клеток и осторожно перемешать. Инкубируйте 15-30 мин при комнатной температуре.
- Добавьте смесь ДНК липидов каплям на клетки. Инкубируйте на 28 ° C в инкубаторе для около 5 ч.
- Снимите смесь трансфекции из клеток и вымыть клетки с 2 мл ФСБ.
- Добавить 2 мл насекомых питательной среды и продолжать культуры на 28 ° C в инкубаторе без изменения средств массовой информации.
Примечание: Если bacmid содержит флуоресцентный белок, ее выражение может быть обнаружен в пост transfection клетки 48 ч. Бакуловирусы производится transfected клеток Sf9 и выделяется в культурной среде, которая впоследствии заражает untransfected клетки. Всю ячейку населения заражена с бакуловирусы в течение 5 дней и показывает признаки вирусной инфекции, также называется цитопатического эффекта. К ним относятся увеличение клеток диаметра, вакуоли/гранул в цитоплазме, прекращение роста клеток и мертвых или лизированных клетки присутствуют в культуре клеток. Однако если эффективность трансфекции или инфекции не является оптимальным, культура не может показать очевидные цитопатического эффекта. Цитопатического эффекта могут быть визуализированы с инвертированным микроскопом фазы при 200-400-кратном. Бакуловирусы инфицированных клеток могут быть обнаружены путем пятнать антитела анти gp6411. - Урожай бакуловирусы супернатанта 5 дней после transfection и ярлык как запас вирус1 P.
- Храните бакуловирусы супернатанта, который является светочувствительный, в темноте с 0,5% бычьим сывороточным альбумином (БСА) в PBS. Хранить при 4 ° C для краткосрочных (до 90 дней) или при температуре-80 ° C в долгосрочной перспективе.
- Семя 6 × 106 Sf9 клетки в культуре ткани лечение пластине 10 см в 10 мл насекомых питательной среды. Добавьте 1 mL первоначальных бакуловирусы супернатанта (1P) в клетки.
- Урожай бакуловирусы супернатанта (2P) на 5-й день после инфекции.
- Семя 50 мл Sf9 клеток (3 х 106 клеток/мл) в культуре подвеска в насекомое культуры среднего в 250 мл поликарбоната колбу Эрленмейера и место колбу в орбитальный шейкер-инкубатор. Добавить 2 мл бульона2 P к клеткам и погрозит 135 об/мин при сохранении постоянной температуре 28 ° c.
Примечание: Три или четыре дня после заражения, всю популяцию клеток Sf9 покажет цитопатического эффекта, который является свидетельством высокого титра бакуловирусы производства. - Последовательно усиливать бакуловирусы supernatants, до тех пор, пока желаемый объем получается (P3, P4,...), увеличивая 10 производится объем культуры клеток в каждом последующем инфекции.
Примечание: P3 является 3rd раунд инфекции, в котором 500 мл до 1 Л Sf9 культуры клеток могут быть заражены с 10 до 20 мл P2 бакуловирусы супернатанта; P4 является 4й раунд инфекции, в котором 5-10 Л Sf9 культуры клеток могут быть заражены с 100 до 200 мл P3 бакуловирусы супернатанта, и так далее. Как правило Sf9 клетки являются посеян на 3 × 106 клеток/мл в сыворотке бесплатно Насекомое культуры средств массовой информации. - Центрифуга бакуловирусы супернатант в 1000 x г за 30 мин при температуре 4 ° C для удаления сотовой мусора и лечения бакуловирусы супернатанта с 50 нуклеиназы единиц/мл (250 единиц/мкл акций) за 2 ч при 37 ° C переваривать геномной ДНК и РНК. Фильтр supernatants через блок фильтрации 0,45 мкм.
3. Подготовка системы хроматографии
- Подготовка системы хроматографии, последовательно промыв пример буфера линии и каждый с стерильной водой, 1 N натрия гидроксид, вода и мыть буфера (20 мм натрия фосфат буфера содержащий 150 мм натрия хлорида, рН 7,0) со скоростью линейного потока 50 мл/мин.
- Подготовить столбец гепарина 50 мкм (10 × 10 см, 7.9 мл столбца тома (CV)), последовательно выполнив столбец, очистка буфера (5 резюме стерильные 20 мм натрия фосфат буфера содержащий 2 M натрия хлорида, рН 7,0) и 5 резюме мыть буфера со скоростью линейного потока 7 мл/мин.
4. Очистка бакуловирусы вектора
- Настройка системы хроматографии следующим образом:
- Используйте образец загрузки впускное отверстие для загрузки бакуловирусы супернатант.
- Используйте буфер впускное отверстие A1 для загрузки буфера мытья. Подготовить бутылку с по крайней мере 500 мл буфера мытья и поместить строку буфера мытья в бутылку.
- Используйте буфер впускное отверстие A2 для загрузки Элюирующий буфер (20 мм фосфат натрия хлоридом натрия 1,5 М, рН 8,0). Подготовить бутылку с по крайней мере 500 мл Элюирующий буфер и место Элюирующий буфер строки в бутылку.
- Вставьте несколько 50 мл конические трубы в коллектор фракций для сбора столбца сквозной бакуловирусы супернатанта, мыть буфер и eluted бакуловирусы.
- Сбалансировать столбце гепарина с пяти томов столбец 7.9 мл (CVs) мыть буфера (40 мл) со скоростью линейного потока 7,0 мл/мин.
- Загрузите 250 мл бакуловирусы супернатанта на столбце гепарина с помощью образца насоса (забора образца) системы хроматографии со скоростью линейного потока 2.0 мл/мин.
- Запуск 10 CVs (80 мл) из буфера мытья через колонку гепарина со скоростью линейного потока 2.0 мл/мин до кривой поглощения ультрафиолетового (УФ) (280 Нм) вернулся в базовых и становится стабильным.
- Элюировать бакуловирусы частиц из столбца 7.9 мл гепарина с 5 CVs (40 мл) буфера со скоростью линейного потока 4,0 мл/мин часы для резкого элюции пик белка на Хроматограмма, когда частицы бакуловирусы отмежеваться от столбце гепарина.
- После элюции, сразу же разбавляют eluted бакуловирусы супернатанта, 10 раз с использованием 20 мм буфера фосфат натрия в воде для предотвращения инактивации бакуловирусы частиц от осмотического шока во время последующих центрифугирования.
- Магазин 100 мкл каждого из фракций, включая столбец потока через собранные во время загрузки бакуловирусы супернатанта, мыть буфер и элюата. Заразить эти бакуловирусы дроби к HT1080 для оценки процесса очистки (см. раздел 6).
- Очистите столбец с колонкой, очистка буфера и мыть буфера. Наконец промойте столбец с 5 резюме стерильные 20% этанола в воде со скоростью линейного потока 7,0 мл/мин и хранить при 4 ° C.
- Очистить систему хроматографии с водой, 1 гидроксида натрия N, снова с водой и 20% этанола в воде со скоростью линейного потока 50,0 мл/мин и храните в 20% этанола.
5. концентрация бакуловирусы
- Предварительно стерилизуют пробирок с помощью автоклава. Добавьте равное количество бакуловирусы супернатанта каждого ультрацентрифуга трубы в культуре ткани капюшоном. Измерить вес трубки, баланс и отрегулируйте вес содержимого ультрацентрифуга трубок с стерильных PBS.
- Место каждого из трубок ультрацентрифуга в противостоянии ведро SW 32 Ti ротора.
- Запустите ультрацентрифуга на 80000 g × 90 мин при 4 ° C.
- Откройте ультрацентрифуга трубы в культуре ткани капюшоном и асептически аспирационная жидкости без удаления бакуловирусы Пелле.
- Ресуспензируйте Пелле каждой трубы, энергично закупорить вверх и вниз с 200 мкл PBS, содержащий 0,5% (w/vol) BSA.
- Передача концентрированной бакуловирусы криопробирки (50-100 мкл на флакон) и хранить при температуре-80 ° C.
6. титрование бакуловирусы
- За день до инфекции, граф HT1080 ячеек с помощью Горяева после окрашивания клеток с Трипановый синий. Семена, 1 x 105 HT1080 клеток на скважину в 6-ну пластины в 2 мл Дульбекко изменение Eagle среднего (DMEM), содержащие 10% плода бычьим сывороточным (ФБС). Семя несколько дополнительных скважин, чтобы иметь возможность определить точное количество клеток во время инфекции. Культура клетки в инкубаторе при 37 ° C и 5% CO2.
Примечание: HT1080 клетки используются для титрования, как они выражают более высокий уровень heparan сульфат по сравнению с другими16клеток линии. Поскольку HT1080 клетки являются приверженцами, титрование проще и менее трудоемким по сравнению с использованием традиционных на основе Sf9 титрования. - В день инфекции Определите количество ячеек на хорошо путем подсчета клеток из скважин. Заразить клетки, добавив разреженных оригинальный бакуловирусы, которое было отменено до столбца очистки, а также с образцами из потока через колонки, мыть и элюции фракций. Для каждого образца определите разрежения и объем эмпирически основе инфекционных бакуловирусы частиц и заразить каждой скважины в трех экземплярах.
- Через два дня после инфекции, анализ клеток для экспрессии гена интереса. Клетки могут быть проанализированы с помощью проточный цитометр, если они выражают флуоресцентный белок (например GFP)17.
- Рассчитать титры (инфекционные единицу в мл) основанный на количество клеток во время инфекции, коэффициент разбавления и проценты флуоресцирующего белка в клетках, по формуле: (количество клеток во время инфекции × процент флуоресцентный белок коэффициент разрежения позитивные клетки ×) / объем бакуловирусы в мл.
Примечание: Например если общее количество клеток на хорошо во время инфекции составляет 1,2 × 105, процент флуоресцентного белка составляет 5%, коэффициент разрежения 100, и объем разреженных бакуловирусы добавил-10 мкл, титр является 6 × 107 инфекционных единиц (МЕ) / мл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Протокол представил находится в схема (рис. 1). Шаги включают переходных transfection клетки Sf9 с bacmid ДНК, чтобы произвести бакуловирусы адэрентных культуры в тарелку, последующей амплификации сыворотки бесплатно подвеска культуры, нуклеиназы лечения и уточнения путем центрифугирования и фильтрации, и очистки, используя хромотографию сродства гепарина, после чего концентрация с ultracentrifugation.
После оттаивания, Sf9 клетки нужно по крайней мере две недели, чтобы восстановить и вступления в экспоненциальной фазе роста. Активно развивается Sf9 клетки являются transfected с bacmid ДНК в адэрентных культуры. Через два дня после трансфекции, выражение бакуловирусы конверт гликопротеинов, обнаруживается gp64 и впоследствии бакуловирусы производство является инициатором11. Так как бакуловирусы репликации компетентным, количество инфицированных клеток постепенно увеличивается из-за прогрессивного инфекции клеток с недавно произведенных бакуловирусы, которая выделяется в среднего роста. Бакуловирусы, содержащие supernatants клетки при заготовленной 5 дней после трансфекции заразиться населения всей ячейки. Этот первоначальный вирус супернатанта обозначается как проход 1 фондовой (Р1). Запас1 P используется для последующего заражения недавно в сеяный адэрентных культуры клеток Sf9 в больших пластине. Население всей ячейки показывает знак инфекции в течение 5 дней, которые называют цитопатического эффекта (рис. 2). Супернатант от второй адэрентных клеток культуры собирают и обозначается как запас2 P. Супернатант бакуловирусы далее усиливается в Sf9 подвеска культуры через текущие инфекции свежезаваренным добавлен Sf9 клеток в шейкер колба с сыворотка бесплатно Насекомое клеток питательной среды. В конце каждого цикла инфекции большинство клеток показывают цитопатического эффекта с увеличенного диаметра сотовой и мертвых или лизированных клетки, которые являются знаки для завершения бакуловирусы инфекции. Бакуловирусы фондовой последовательно усиливается до тех пор, пока желаемый объем получается (P3, P4,...). Супернатант отделен от Sf9 клетки центрифугированием низкой скорости, получавших нуклеиназы для уменьшения вязкости, фильтруют через мембрану 0,45 мкм, прежде чем использовать в последующих шагах очищения и концентрации.
Чтобы очистить бакуловирусы, супернатанта от инфицированных клеток Sf9 загружается на столбец гепарина. Гепарин столбец постепенно насыщается с сильно привязанных бакуловирусы и слабо связанных белковых загрязнений. Столбце гепарина промыть мыть буфер для удаления загрязнений до кривой поглощения ультрафиолетового (УФ) (280 Нм) возвращается к базовой и становится стабильным, указывающее удаление несвязанных и слабо связанных материалов из столбца. С другой стороны бакуловирусы частиц сильно привязать к столбцу гепарина. Поэтому не значительное количество вирус обнаружен в буфере столбец мыть. Гепарин прыгните бакуловирусы частицы являются этого eluted с 1,5 М хлорида натрия при pH 8.0 и разбавленной 10 раз с буфером для достижения isotonicity и предотвращения вирусной инактивации. Острый пик белка наблюдается во время элюции, который соответствует доле бакуловирусы (рис. 3). Оптимизированные условия для загрузки образца, Стиральная и элюции в хроматографии протокол доходность, более чем на 50% восстановления очищенный бакуловирусы инфекционных частиц. Разреженных supernatants далее сосредоточены до 500-fold с ultracentrifugation и сформулированы в PBS, содержащих 0,5% BSA, который дает чистый восстановления 25%11.
Рисунок 1 . Схема производства и очистки бакуловирусы. Sf9 клетки являются семенами в ячейку культуры лечение пластины transfected с bacmid ДНК. Супернатант бакуловирусы собирают и используется для новых Sf9 клетки в культуре сторонником. Впоследствии зараженные клетки распространяются в сыворотки бесплатно подвеска культуры. Супернатант бакуловирусы трактуется с нуклеиназы, центрифугируют и фильтруют. Бакуловирусы очищается хромотографией сродства столбец гепарина, разбавленных в буфер и асептически сосредоточены на ultracentrifugation. Наконец бакуловирусы супернатанта хранится при температуре-80 ° C. (Этот показатель был адаптирован от Nasimuzzaman et al., 2016, мол там методы Clin дев 2016; 3: 16071 с разрешения.) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 . Цитопатического воздействия бакуловирусы инфицированных клеток Sf9. Супернатант бакуловирусы был использован для заражения Sf9 клетки в пластине лечение культуры ткани. Через пять дней после инфицирования, клетки были визуализированы с инвертированным микроскопом фазы. A) неинфицированных Sf9 клетки как элемент управления. B) бакуловирусы инфицированных клеток Sf9, показаны цитопатического эффекта. Ячейки отображаются на 200 крат. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 . Количество инфекционных бакуловирусы в проточных во время гепарина аффинной хроматографии. Титры бакуловирусы были оценены инфекции HT1080 клеток. Исследованных образцов включая столбца прогон, вымыть и элюата. Образцы разводили при необходимости. Линия (темные алмазы) показывает всего инфекционные единиц (МЕ) бакуловирусы в каждой фракции. Размер фракции столбец потока через образец и мыть буфера были 40 мл в пробирки, и элюата было 10 мл в каждую пробирку. (Этот показатель был адаптирован от Nasimuzzaman et al., 2016, мол там методы Clin дев 2016; 3: 16071 с разрешения.) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол, представленные здесь описывает производства бакуловирусы в Sf9 клеток в культуре подвеска и очистки бакуловирусы используя хромотографию сродства гепарина. Параметры, используемые в настоящем Протоколе максимальной урожайности и свести к минимуму инактивации инфекционных бакуловирусы. Протокол, представленная здесь показывает, что значительно улучшить восстановление бакуловирусы частиц по сравнению с восстановление достигнуто другими9.
Благодаря широкой принимающей диапазон и тканей тропизма несколько исследований были проведены в центральной нервной системы, печени, глаз, яичников, предстательной железы и яичек с бакуловирусы опосредованной гена доставки5,6,7,8 . Бакуловирусы векторов, содержащие терапевтических генов, как самоубийства генов, генов супрессоров опухолей и гены, которые кодирования опухоль – специфичные антигены успешно были проведены в доклинических животных моделей18,19. Хотя бакуловирусы может передают клетки человека, она может распространяться только в клетках насекомых и, в результате, не создают угрозу для человека получателей.
Бакуловирусы производится переходных transfection bacmid ДНК в клетках насекомых. Качество bacmid имеет решающее значение для производства бакуловирусы высокого титра. Как правило свежеприготовленный bacmid выполняет лучше, чем те, хранятся в холодильнике для длительного периода времени. Активно развивается Sf9 клетки являются transfected эффективно производящих бакуловирусы высокого титра. На этапе амплификации важно оптимизировать концентрации клеток в культуре подвеска и объем бакуловирусы супернатанта используется для инфекции. Если соотношение бакуловирусы частиц клеток не является оптимальным, доходность бакуловирусы может быть ниже ожидаемой (личные наблюдения, MN).
При загрузке бакуловирусы супернатанта на столбце гепарина, важно проверить поток через вирусные частицы, которые могут проходить через колонку. Если это происходит, столбец ниже скорости бега может быть необходимым или меньший объем супернатант должны быть загружены на столбец. Большую часть загрязнений, присутствующих в supernatants бакуловирусы смываются во время стирки шага хроматографии выполнения. Мы оценку чистоты бакуловирусы Серебряные пятная додецилового сульфата натрия (SDS)-гель гель полиакриламида электрофореза (страница) и электронно-микроскопические исследования и обнаружили, что наши очищенный baculoviruses хорошего качества12.
Мы тщательно оптимизированные условия привязки и обнаружили, что средний гепарина Порос превосходит другие СМИ гепарина (например. HiTrap или Capto гепарина) в его способность захватить бакуловирусы частиц (личную наблюдения). Способность гепарина для привязки бакуловирусы выше скорость выборки и потенциала имеет важное значение для сведения к минимуму течению времени обработки для крупномасштабного производства. Помимо бакуловирусы гепарин среднего также связывает другие загрязняющие белков, которые имеют сродство для гепарина. Наиболее низкий молекулярный вес загрязнения могут быть устранены путем включая тангенциальном потоке фильтрации (TFF) шаг вниз по течению гепарина хроматографии запуска. TFF также используется в качестве альтернативы центрифугирования сконцентрировать продукта20.
Этот протокол может использоваться для очистки других вирусов и белков, которые имеют склонность для гепарина. Однако может потребоваться внесение изменений в состав мыть и Элюирующий буфер и скорость потока.
Производство рекомбинантных белков работает хорошо использовать неочищенную бакуловирусы supernatants непосредственно. Таким образом сырой бакуловирусы может использоваться для производства рекомбинантного белка. Однако если baculoviruses используются в качестве вектора в естественных условиях переноса генов, или как вакцина, дополнительной очистки например хроматография, гель фильтрации и/или ultracentrifugation необходимы шаги для получения чистой и концентрированные бакуловирусы частицы и свести к минимуму продюсер клеток и культуры носителей, полученных примесей избежать токсичности, воспаления и иммунного ответа.
В заключение мы описали простой протокол для производства и очистки бакуловирусы, который может быть увеличен для производство рекомбинантных белков, вакцин и векторов генной терапии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют никакого конфликта интересов.
Acknowledgments
Эта работа частично поддерживается первоначальное финансирование от Цинциннати детей исследовательский фонд (УК РФ) м.н. и инновационные Core Грант (ГСИ) поддерживается Национальным центром для продвижения трансляционная наук национальных институтов здравоохранения под Номер УЛ1 TR001425 премии. Содержание является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения национальных институтов здоровья.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Akta Avant 150 | GE Healthcare | 28976337 | Chromatography system |
| POROS Heparin 50 µm Column | ThermoFisher Scientific | 4333414 | Heparin column |
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | Non-catalog item | Concentrates virus at high-speed |
| Polyallomer Ultracentrifuge tube | Beckman-Coulter | 326823 | Concentrates virus at high-speed |
| MaxQ 8000 orbital shaker incubator | ThermoFisher Scientific | Non-catalog item | Shaker for suspension culture |
| 250 mL Erlenmeyer flasks | ThermoFisher Scientific | 238071 | Flask for suspension culture |
| 1 L Erlenmeyer flasks | ThermoFisher Scientific | 238072 | Flask for suspension culture |
| Microscope (Olympus CKX41) | Olympus | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | For clarification of Baculovirus supernatant |
| 50 ml Conical tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | For collection of Baculovirus supernatant |
| 6-well plate | ThermoFisher Scientific | 07-200-80 | Tissue culture treated plate |
| 10-cm plate | ThermoFisher Scientific | 08-772E | Tissue culture treated plate |
| Stericup-HV, 0.45 µm, PVDF | EMD-Millipore | SCHVU05RE | Filtration unit |
| Kanamycin | ThermoFisher Scientific | 15160-054 | |
| Tetracycline | Sigma-Aldrich | T7660 | |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15750-060 | |
| Bac-to-Bac Vector Kit | ThermoFisher Scientific | 10360-014 | Baculovirus expression system |
| DH10B-T1R Competent cell | ThermoFisher Scientific | 12331-013 | Competent cell for bacmid |
| TE buffer | In-house | Non-catalog item | 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0. |
| Plasmid Maxiprep kit | ThermoFisher Scientific | K2100-06 | For bacmid purification |
| Sf9 Cells | ThermoFisher Scientific | 11496-015 | Insect cells |
| Grace’s Insect Cell Culture Medium | ThermoFisher Scientific | 11605-094 | Transfection medium |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 20012227 | Washing cells, diluting samples |
| HyClone SFX-Insect cell media | GE Healthcare | SH30278.02 | Serum-free insect cell growth medium |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Enzyme to degrade DNA and RNA |
| Baculovirus plasmid (bacmid) DNA | In-house | Non-catalog item | Bacmid for Baculovirus Production |
| Cellfectin II | ThermoFisher Scientific | 10362 | Transfection reagent for insect cells |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4737 | Stabilizes Baculovirus |
| Cryovial | Thomas Scientific | 1222C24 | For storage of Baculovirus |
| HT1080 cell line | ATCC | CCL-121 | Fibroblast cell line |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Growth media for cell lines |
| Wash buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 150 mmol/l sodium chloride |
| Elution buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 1.5 mol/l sodium chloride |
| Column cleaning buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 2.0 mol/l sodium chloride |
| Sterile water | In-house | Non-catalog item | For Akta Avant cleaning |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.09137 | For Akta Avant cleaning |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7073 | For Akta Avant cleaning |
References
- Ikonomou, L., Schneider, Y. J., Agathos, S. N. Insect cell culture for industrial production of recombinant proteins. Appl Microbiol Biotechnol. 62 (1), 1-20 (2003).
- Contreras-Gomez, A., Sanchez-Miron, A., Garcia-Camacho, F., Molina-Grima, E., Chisti, Y. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnol Prog. 30 (1), 1-18 (2014).
- Cox, M. M. Recombinant protein vaccines produced in insect cells. Vaccine. 30 (10), 1759-1766 (2012).
- Boyce, F. M., Bucher, N. L. Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (6), 2348-2352 (1996).
- Airenne, K. J., et al. Baculovirus: an insect-derived vector for diverse gene transfer applications. Mol Ther. 21 (4), 739-749 (2013).
- Sung, L. Y., et al. Efficient gene delivery into cell lines and stem cells using baculovirus. Nat Protoc. 9 (8), 1882-1899 (2014).
- Zeng, J., Du, J., Lin, J., Bak, X. Y., Wu, C., Wang, S. High-efficiency transient transduction of human embryonic stem cell-derived neurons with baculoviral vectors. Mol Ther. 17 (9), 1585-1593 (2009).
- Zeng, J., Du, J., Zhao, Y., Palanisamy, N., Wang, S. Baculoviral vector-mediated transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells. Stem Cells. 25 (4), 1055-1061 (2007).
- Wu, C., Soh, K. Y., Wang, S. Ion-exchange membrane chromatography method for rapid and efficient purification of recombinant baculovirus and baculovirus gp64 protein. Hum Gene Ther. 18 (7), 665-672 (2007).
- Grein, T. A., Michalsky, R., Vega Lopez, M., Czermak, P. Purification of a recombinant baculovirus of Autographa californica M nucleopolyhedrovirus by ion exchange membrane chromatography. J Virol Methods. 183 (2), 117-124 (2012).
- Nasimuzzaman, M., Lynn, D., van der Loo, J. C., Malik, P. Purification of baculovirus vectors using heparin affinity chromatography. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16071 (2016).
- Makkonen, K. E., Turkki, P., Laakkonen, J. P., Yla-Herttuala, S., Marjomaki, V., Airenne, K. J. 6-o- and N-sulfated syndecan-1 promotes baculovirus binding and entry into Mammalian cells. J Virol. 87 (20), 11148-11159 (2013).
- Nasimuzzaman, M. Heparan sulfate in baculovirus binding and entry of mammalian cells. J Virol. 88 (8), 4607-4608 (2014).
- Urabe, M., et al. Scalable generation of high-titer recombinant adeno-associated virus type 5 in insect cells. J Virol. 80 (4), 1874-1885 (2006).
- Feliciello, I., Chinali, G. A modified alkaline lysis method for the preparation of highly purified plasmid DNA from Escherichia coli. Anal Biochem. 212 (2), 394-401 (1993).
- Nasimuzzaman, M., Persons, D. A. Cell Membrane-associated heparan sulfate is a receptor for prototype foamy virus in human, monkey, and rodent cells. Mol Ther. 20 (6), 1158-1166 (2012).
- Earl, P. L., Americo, J. L., Moss, B. Development and use of a vaccinia virus neutralization assay based on flow cytometric detection of green fluorescent protein. J Virol. 77 (19), 10684-10688 (2003).
- Kim, Y. K., et al. Suppression of tumor growth in xenograft model mice by programmed cell death 4 gene delivery using folate-PEG-baculovirus. Cancer Gene Ther. 17 (11), 751-760 (2010).
- Stanbridge, L. J., Dussupt, V., Maitland, N. J. Baculoviruses as vectors for gene therapy against human prostate cancer. J Biomed Biotechnol. 2003 (2), 79-91 (2003).
- Nasimuzzaman, M., et al. Production and purification of high-titer foamy virus vector for the treatment of leukocyte adhesion deficiency. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16004 (2015).
