Summary
Αvβ3 integrin er en type vedheft protein som er svært uttrykt på aktivert endotelceller gjennomgår angiogenese. Dermed er vurderer integriteten til integrin av stor interesse i onkologi. Her introduserer vi en metode for å forberede 68Ga-merket radiopeptides og metode for å vurdere effektiviteten biologiske.
Abstract
Αvβ3 integrin er et heterodimeric vedheft molekyl svulst celle migrasjon og angiogenese. Integrin er overexpressed i angiogenic svulst endotelceller, der det vanligvis har en lav konsentrasjon. Dette bestemte uttrykket αvβ3 gjør det en gyldig biomarkør for antiangiogenic og tenkelig narkotika. Som en funksjonell tenkelig modalitet gir fantes et positron utslipp tomografi (PET) informasjon om biokjemiske og fysiologiske endringer i vivo, på grunn av sin unike høy følsomhet på nanomolar skala. Derfor har radiometal-baserte PET radiopharmaceuticals fått stor oppmerksomhet for den ikke-invasiv kvantifiseringen av svulst angiogenese. Dette dokumentet gir en systemisk protokoll for å forberede en ny radiometal-merket peptid evalueringen av angiogenese. Denne protokollen inneholder informasjon om radiochemical pålitelighet, lipofile stoffer, celle opptak, serum stabilitet og farmakokinetiske egenskapene. De 68Ga-RGD-peptid er en av de representant PET ligander mot αvβ3 integrin. Her introduserer vi en protokoll for å forberede en 68Ga-RGD-peptid og evaluering av biologisk effekt.
Introduction
Angiogenese er en biologisk prosess som er preget av utviklingen av nye blodkar. Blant mange angiogenetic faktorer, αvβ3 integrin er forbundet med invasiveness, fordi integrin er svært uttrykt i angiogenic svulst fartøy, men er fraværende i normalt vev1.
Radiolabeled reseptor-bindende peptider med arginine glysin aspartate (RGD) domene, som har høy affinitet mot αvβ3 integrin reseptorer, anses lovende angiogenese imaging agenter2,3 , 4 , 5 , 6 , 7. flere radiopharmaceuticals er opprettet for PET og biologiske egenskapene har validert i ulike dyremodeller8,9,10,11. I en radionuklide har 68Ga flere fordeler sammenlignet med andre radioisotopes. Først, den har en høy tilgjengelighet for brukere og er økonomisk fordelaktig fordi en cyclotron ikke er nødvendig. Dernest produsere 68Ga-baserte radiopharmaceuticals høy romlig oppløsning sammenlignet med enkelt-fotonet utslipp beregnet tomografi (SPECT), slik at mer nøyaktig kvantifisering. Endelig kan 67.71 minutter halveringstiden av 68Ga være tilstrekkelig for utarbeidelse av små peptider eller proteiner.
For å produsere et stabilt kompleks med 68Ga, har mange chelater blitt utviklet. Representant chelater er 1,4,8,11-tetraazacyclotetradecanetetraacetic acid (TETA), 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic syre (DOTA), 1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic syre (NOTA), diethylenetriaminepentaacetic syre (DTPA), og N, N'-di(2-hydroxybenzyl) ethylenediamine-N, N'-diacetic syre (HBED). NOTA har blitt rapportert å danne et svært stabile kompleks med 68Ga (Logg stabilitet konstant 30.98)12,13,14.
Formålet med denne studien er å gi en kortfattet protokoll for utviklingen av en ny radiopeptide (figur 1). Som et eksempel forbereder vi 68Ga-merket RGD-peptider og nåværende metoder for biologisk vurdering av disse analoger i en xenograft modell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med retningslinjene og bruk av forskning dyr under protokoller godkjent av Korea Institute av radiologisk og Medical Sciences dyr studier komité. Alle reagenser og løsemidler ble kjøpt og brukt uten ytterligere rensing. NOTA-RGD-peptider ble utarbeidet etter litteratur metoder15.
FORSIKTIG: 68Ga avgir både fantes et positron og gammastråling. Alle eksperimenter, inkludert direkte eller indirekte kontakt med radioaktive, må utføres av opplært og tillatt personell. Ved håndtering av radioaktivt materiale, bør egnet verneutstyr, skjerming, stråling dosimeter merke og ringer og en undersøkelse meter brukes.
1. radiolabeling RGD-peptider med 68GaCl3
Merk: 68Ga (t1/2 = 68 min, β+ = 89% og EF = 11%) ble Hentet fra 68Ga /68Ge generator.
- Elute av 68GaCl3 fra generator med 4 mL av 0,05 M HCl.
- Tømme med nitrogen gass ved 80 ° C i 30 min tørke 68GaCl3 (333 kBq, 1 mL) i en 5 mL reaksjon hetteglass.
- Legge til en løsning av RGD-peptid (100 µg) i 1 M natrium acetate (100 µL, pH 5-6) til reaksjon ampullen inneholder 68GaCl3 fra trinn 1.2.
- Varme reaksjonsblandingen ved 80 ° C i 5 minutter. Deretter avkjøles den ned til romtemperatur.
- Rense råolje produktet med høy ytelse flytende kromatografi (HPLC). Bruke følgende: en C-18 kolonne, en strømningshastighet på 0,5 mL/min, en gradient skråning på acetonitrile av 1.17%/min (5% - 40% i 30 min), og elueringsrør komponenter: A = 0,1% trifluoroacetic syre (TFA) i acetonitrile, B = 0,1% TFA i vann.
Merk: HPLC er utstyrt med en photodiode matrise detektor og en radioaktivitet detektor. De 68Ga-RGD-peptid ble samlet inn samtidig oppbevaring 12.5 min (figur 2). - Rense den resulterende 68Ga-RGD-peptid med en solid fase utvinning system.
- Passerer løsningen gjennom en C18 omvendt-fase patron og vask med 2 mL saltoppløsning.
- Elute 68Ga-RGD-peptid med 0,7 mL 95% etanol. Fjern løsemiddelet på 80 ° C nitrogen gass for 20 min og gjeninnføre med fosfat-bufret saltvann (PBS) før bruk.
- Filtrere radiolabeled produktet gjennom filtere 0.22 µm sterile og formulere i 1 mL av sterilt saltvann.
- Sjekk radiochemical avkastningen av radio-tynn-lag kromatografi (TLC).
- Sted 1 µL på en umiddelbar tynt lag kromatografi plate (ITLC, 10 cm i lengde). Utvikle platen i et kammer som inneholder eluent (vandig 0.1 M sitronsyre, pH 5.0) til 9 cm fra stedet.
Merk: Oppbevaring faktor for 68Ga-RGD-peptid er 0 og oppbevaring faktor for Ureagert 68Ga3 + er 1.
- Sted 1 µL på en umiddelbar tynt lag kromatografi plate (ITLC, 10 cm i lengde). Utvikle platen i et kammer som inneholder eluent (vandig 0.1 M sitronsyre, pH 5.0) til 9 cm fra stedet.
- Beregne den siste aktiviteten på forholdet mellom radioaktivitet tilsvarer ikke-radioaktiviteten som MBq/nmol.
Merk: Etter injeksjon av 100 µL av de formulerte 68Ga-RGD-peptid til HPLC, mengden ikke radioaktiv komponenten ble beregnet fra standard kalibreringskurven ved hjelp av nonradioactive Ga-RGD-peptid.
2. i Vitro mobilnettet opptak
Merk: Uppsala 87 ondartede Glioma (U87MG) menneskelige glioblastom celler ble dyrket i Dulbeccos endret Eagle's media (DMEM), supplert med 10% fosterets bovin serum og 1% penicillin-streptomycin. Cellene ble dyrket i 150 mm retter på 37 ° C i et fuktet 5% CO2. Celler er høstet eller delt trypsinization: 0,25% (w/v) trypsin og 0.02% (w/v) ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) i PBS ved 37 ° C i 3-5 minutter.
- Frø U87MG celler i 6-vel platene på en tetthet 1 x 106 celler/vel.
- Inkuber cellene med 68Ga-RGD-peptid (111 kBq) ved 37 ° C i 30, 60, 90 og 120 min. forberede prøver tre eksemplarer.
- Vask cellene 2 x med 2 mL PBS og høsting av trypsinization. Bruke 0,25% (w/v) trypsin og 0.02% (w/v) ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) i PBS på 37 ° C for 3-5 minutter.
- Samle celle suspensjon (500 µL) og mål i en γ-teller.
- Beregne prosent opptaket av sammensatt av cellene med % (teller i celler/totalt antall).
3. i Vitro Serum stabilitet
- Legg til 500 µL av nylagde musen serum, 500 µL av humant serum og 500 µL av PBS. Inkuber blandingen ved 37 ° C i 2 timer.
- Vurdere ved ITLC med de definerte tidsintervallene (30, 60, 90 og 120 min). Spot 1-2 µL aliquot av blandingen av ITLC platen (mobil fase: 0.1 M sitronsyre). Utvikle platen som i trinn 1.7.
Merk: 68Ga3 + forventes å gå med løsemiddel foran, mens den merkede sammensatt forblir på opprinnelsen.
4. fastsettelse av lipofile stoffer
- Legge til 68Ga-RGD-peptid (3.7 MBq, 3,7 µL) i octanol-PBS systemet (1:1, v/v, totalt 1 mL).
- Bland hetteglass kraftig for 5 min ved romtemperatur og sentrifuge 10.000 x g for 5 min ved romtemperatur.
- Ta 100 µL prøver fra hvert lag og måle radioaktiviteten med en γ-teller. Rapportert logge P verdien er basert på gjennomsnittlig tre prøvene.
5. svulst modell
Merk: BALB/c naken mus (6-8 ukens gamle, kvinne, n = 23) ble brukt for denne studien. Mus ble brukt i PET studier (n = 3) og biodistribution (n = 20) når svulst volumene nådd 200-300 mm3 (1-2 uker etter implantasjon).
- Legg kreftceller i 28 G, 1/2 tommers insulin sprøyter.
- Injisere U87MG celler (5 x 106) i 100 µL av PBS i regionen venstre arm.
- Bedøve musen med 2% isoflurane i oksygen gass i celle injeksjon.
- Kontroller at musen har vært anesthetized av tapet av pedal uttak refleks følgende knipe med tang mellom tærne på den høyre bakben fot. Ikke la et dyr uovervåket før det har gjenvunnet tilstrekkelig bevissthet for å opprettholde sternal recumbency.
6. i Vivo kvantifisering av αvβ3 Integrin bruker PET
- Bedøve mus med 2% isoflurane i oksygen.
- Kontroller at musen har vært anesthetized av tapet av pedal uttak refleks følgende knipe med tang mellom tærne på den høyre bakben fot. Ikke la et dyr uovervåket før det har gjenvunnet tilstrekkelig bevissthet for å opprettholde sternal recumbency.
- Plass hodet i midten av PET Portal.
- Intravenøst administrere 68Ga-RGD-peptid løsning (7,4 MBq, 200 µL) til xenograft mus modell via hale venen for 1 min.
- Skanner PET i listemodus (dynamisk skanning) etter 150 min på samme tid.
Merk: PET rådata ble rekonstruert av en bruker-definerte tidsramme (dvs.enhver 30 min). Etter PET skanningen, en mikro-beregnet tomografi (CT) skanning (50 kVp av X-ray, 0,16 mA) ble gjennomført for demping korreksjon.
7. Ex Vivo Biodistribution
- Injisere 68Ga-RGD-peptid (0.37 MBq, 200 µL) i halen åre xenograft musemodell. Bedøve musen med 2% isoflurane i oksygen gass under injeksjoner.
Merk: BALB/c naken mus, som beskrevet i seksjon 5, var delt inn i fire grupper og ofret på ulike tidspunkt (n = 5 per gruppe). - Våkne mus umiddelbart etter administrasjon av 68Ga-RGD-peptid og ofre dem på 30, 60, 90 og 120 min postinjection med karbondioksid euthanasia.
Merk: Vev rundt ble pakket ut. Valgte mål var blod, muskel, hjerte, lunge, leveren, milt, mage, tarm, nyrer, bein og svulst. - Veie vevet og måle radioaktiviteten med en γ-teller.
Merk: Resultatene ble uttrykt som prosent injisert dose per gram vev (% ID/g).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Chelation på 68GaCl3 med NOTA-RGD-peptid var grei radiolabeling avkastningen var 99%. Reaksjon urenheter er fjernet som vist i figur 2. Radiochemical renhet av 68Ga-RGD-peptid var større enn 99%, og aktiviteten på slutten av syntesen var 90-130 MBq/nmol (Figur 3).
Cellen opptaket verdier for 68Ga-RGD-peptid var 1,49%, 0,85%, 0,36% og 0,39% på 30, 60 og 90 120 min, henholdsvis. Serum stabilitet viste at 68Ga-RGD-peptid forble nesten intakt etter 2 timer med inkubering med menneskelige eller musen serum samt PBS (> 92% stabilitet på 2 h). Partisjon koeffisient (Logg P) var 2,96, som indikerer høy lipofile stoffer. PET viste en første høy opptak i store organer, inkludert lever, nyre, hjerte, muskler og svulst. Men i slutten perioden (90-150 min), var svulst regionen tydelig visualisert. Svulst-til-muskel forholdet 90 minutter var 17.57 og forble uendret, indikerer kinetic stabilitet. Ex vivo biodistribution viste at den akkumulerte radioaktiviteten i svulsten var 6.19, 4.96, 4.44 og 4.39 (% ID/g) på 30, 60, 90 og 120 min, henholdsvis. Resultatene av ex vivo eksperimentet var i samsvar med den i vivo PET funn (Figur 4).
Figur 1 : Sekvensdiagram for eksperimentell prosedyrene. Denne illustrasjonen viser en skjematisk oversikt over utviklingen av radiopharmaceutical. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Rensing av 68Ga-RGD-peptid av HPLC. Blå radioaktivitet signal og svart er ultrafiolett (UV)-signalet. UV bølgelengden er 314 nm. X-aksen er tid og y-aksen er absorbansen enhet (AU). De 68Ga-RGD-peptid har 12,4 min av tiden. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : 68Ga-RGD-peptid og sin radiochemical renhet. ITLC på 68Ga-RGD-peptid viste høy radiochemical renhet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : PET imaging (øvre) og ex vivo biodistribution data 68 Ga-RGD-peptid (nedre). PET data ble uttrykt på SUV skala fra 0 til 5. Biodistribution dataene er gjennomsnittlig ± standardavviket fra fem mus på hvert tidspunkt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne studien, vi innført en protokoll for å forberede en radiopeptide î±vβ3 integrin og biologiske evalueringen. Tradisjonelle narkotika utvikling innebærer komplisert. Det krever en stor mengde referansemateriale og relativt lange evaluering tid. Selv om foreslåtte metodikken ikke kan erstatte delikat evalueringsprosessen, kan dette systemet brukes for screening formål. Denne foreslåtte systemet vil vesentlig redusere tid og kostnader.
Det siste tiåret, har mange radiolabeled RGD-peptider vært grundig studert som radiotracers for imaging svulster16. For å få lovende radiopharmaceuticals for kliniske studier, bør systemiske tilnærminger for narkotika utvikling gis. Radiochemical gjennomførbarhet, høy selektivitet-affinitet til målet, metabolske stabilitet og riktig farmakokinetikken er fire store bekymringer. For en rutinemessig PET studie sikrer en rimelig radiochemical avkastning pålitelighet i radiopharmaceuticals. Saker av høy affinitet (> nM) og selektivitet (> 100 x) til målet protein er også fornøyd. I farmakokinetikken, kandidat PET tracer utskilles raskt fra ikke-vevet og har en lang tiden svulsten, slik at en høy målet-å-referanse ratio. Kandidaten radiopharmaceuticals skal ikke ha plagsom metabolitter i vivo som kan øke uspesifikke og gir lav kontrast bildebehandling. Det er viktig å vurdere omfattende egenskaper fordi hver term påvirker de andre egenskapene, som ikke er uavhengige.
Radiopeptide i denne forskningen har egnet narkotika-lignende egenskaper. De 68Ga-RGD-peptid har en høy radiochemical avkastning av 99%, metabolske stabilitet og riktig lipofile stoffer. I i vivo forsøket, radiopeptide utstilt høy selektivitet (svulst-til-referanse forholdet = 17.57), og ex vivo biodistribution data viste også betydelig svulst opptak (opp til 6.19% ID/g).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av en kjernefysisk forskning og utviklingsprogram for National Research Foundation av Korea (NRF) innvilgelse finansiert av koreanske regjeringen (nr. 2017M2A2A6A02019904).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 68Ga/68Ge generator | ITG Company | - | 10 mCi |
| Hydrogen chloride solution | Sigma-aldrich | 84429 | |
| Sodium acetate | Sigma-aldrich | S2889 | |
| C18 reverse-phase cartridge | Waters | WAT020515 | |
| 0.22-μm sterile filter | Milllipore | SLGV033RS | |
| Radio-TLC scanner | Bioscan | AR2000 | |
| ITLC paper | Agilent | SGI001 | |
| Citric acid | Sigma-aldrich | 251275 | |
| HPLC | Waters | - | Waters 1525 system containing binary pump, photo diode array (Waters 2998), radioactivity detector (Raytest, Gabi) |
| Acetonitrile | J.T. Baker | 14-650-359 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-aldrich | 302031 | |
| Dulbecco's modified Eagle media | Thermo fisher scientific | 11965092 | |
| fetal bovine serum | Thermo fisher scientific | 16000044 | |
| T175 flasks | Corning | CLS431080 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo fisher scientific | 25200072 | |
| penicillin-streptomycin | Thermo fisher scientific | 15240112 | |
| γ-counter | Perkin Elmer | - | 1480 Wizard 3 |
| Insunlin syringe | Becton Dickinson | 326105 | |
| Synringe pump | Harvard Apparatus | 70-4500 | |
| micro-PET/CT | Siemens Inveon | - |
References
- Friedlander, M., et al. Definition of Two Angiogenic Pathways by Distinct alpha v integrins. Science. 270 (5241), 1500-1502 (1995).
- Janssen, M. L., et al. Tumor Targeting with Radiolabeled alpha v beta 3 Integrin Binding Peptides in a Nude Mouse Model. Cancer Research. 62, 6146-6151 (2002).
- Kok, R. J., et al. Preparation and functional evaluation of RGD-modified proteins as αvβ3 integrin directed therapeutics. Bioconjugate Chemistry. 13 (1), 128-135 (2002).
- Garanger, E., et al. New multifunctional molecular conjugate vector for targeting, imaging, and therapy of tumors. Molecular Therapy. 12 (6), 1168-1175 (2005).
- Dijkgraaf, I., et al. PET imaging of αvβ3 integrin expression in tumours with 68Ga-labelled mono-, di- and tetrameric RGD peptides. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 38 (1), 128-137 (2011).
- Liu, Z., et al. 68Ga-labeled cyclic RGD dimers with Gly3and PEG4linkers: Promising agents for tumor integrin αvβ3 PET imaging. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 36 (6), 947-957 (2009).
- Li, Z. B., Chen, K., Chen, X. 68Ga-labeled multimeric RGD peptides for microPET imaging of integrin αvβ3expression. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 35 (6), 1100-1108 (2008).
- Liu, S., et al. Isomerism and solution dynamics of 90Y-labeled DTPA-biomolecule conjugates. Bioconjugate Chemistry. 12 (1), 84-91 (2001).
- Haubner, R., et al. Glycosylated RGD-containing peptides: tracer for tumor targeting and angiogenesis imaging with improved biokinetics. Journal of Nuclear Medicine. 42 (2), 326-336 (2001).
- Sivolapenko, G. B., et al. Imaging of metastatic melanoma utilising a technetium-99m labelled RGD-containing synthetic peptide. Euroean Journal of Nuclear Medicine. 25 (10), 1383-1389 (1998).
- Haubner, R., et al. Noninvasive Imaging of αvβ3 Integrin Expression Using 18 F-labeled RGD-containing Glycopeptide and Positron Emission Tomography. Cancer Research. 61, 1781-1785 (2001).
- Clarke, E. T., Martell, A. E. Stabilities of trivalent metal ion complexes of the tetraacetate derivatives of 12-, 13- and 14-membered tetraazamacrocycles. Inorganica Chimica Acta. 190 (1), 37-46 (1991).
- Clarke, E. T., Martell, A. E. Stabilities of the Fe(III), Ga(III) and In(III) chelates of N,N′,N″-triazacyclononanetriacetic acid. Inorganica Chimica Acta. 181 (2), 273-280 (1991).
- Shetty, D., Lee, Y. S., Jeong, J. M. 68Ga-labeled radiopharmaceuticals for positron emission tomography. Nuclear Medicine Molecular Imaging. 44 (4), 233-240 (2010).
- Shin, U. C., et al. Synthesis and Preliminary Evaluation of 68Ga-NOTA-Biphenyl-c(RGDyK) for the Quantification of Integrin αvβ3. Bulletin of the Korean Chemical Society. 38 (12), 1415-1418 (2017).
- Cai, W., Chen, X. Multimodality Molecular Imaging of Tumor Angiogenesis. Journal of Nuclear Medicine. 49, suppl2 113-128 (2008).
