Summary
이 프로토콜 신생아 NSG 쥐 방사선 조절로 인간 조 혈 줄기 세포의 intrahepatic 주입을 통해 humanized 쥐 (hu-NSG)를 설정 하는 방법을 제공 합니다. Hu NSG 마우스 HIV 감염 및 조합 항 레트로 바이러스 치료 (장바구니)에 취약 하 고 HIV 복제 및 대기 시간 조사에 대 한 적합 한 병 태 생리 모델 역할.
Abstract
윤리 규정 및 인간의 병 리, 면역학, 및 치료 개발 연구를 위한 기술 과제 수요에 작은 동물 모델에 놓여 있다. 인 간에 게 가까운 유전과 행동 닮았다, 마우스 같은 작은 동물 인간 질병 모델을 통해 인간과 같은 증상 및 응답은 지 수 수에 대 한 좋은 후보 있습니다. 또한, 마우스 유전 배경 다양 한 요구에 맞게 변경할 수 있습니다. 끄 덕/SCID/IL2rγnull (NSG) 마우스는 가장 널리 사용 되 immunocompromised 마우스 긴장; 인간 조 혈 줄기 세포 및 인간 조직 및 기능 인간의 면역 시스템의 후속 개발 engraftment를 수 있습니다. 이 예 지 및 HIV/에이즈 등 인간의 특정 질병의 병 태 생리학을 이해 하 고 치료에 대 한 검색을 원조에 중요 한 이정표 이다. 여기, 우리는 조 혈 줄기 세포 이식 방사선 조절 신생아 NSG 마우스에 의해 humanized NSG 마우스 모델 (hu-NSG)를 생성 하기 위한 상세한 프로토콜을 보고 합니다. Hu-NSG 마우스 모델 이식된 인간 줄기 세포의 hiv-1 바이러스 감염 민감성 멀티 리니지 개발을 보여줍니다. 그것은 또한 주요 생물 학적 특성 조합 항 레트로 바이러스 치료 (장바구니)에 대 한 응답을.
Introduction
인간의 질병에 대 한 적절 한 동물 모델을 확립 치료법을 찾는 열쇠입니다, 때문에 적절 한 동물 모델 오래 되었습니다 추구 있고 시간이 지나면서 개선. Immunocompromised murine 모델의 여러 변종 인간 세포 및 조직의 engraftment 및 인간 답게 된 기능1,2의 후속 실행을 허용 하는 개발 되었습니다. 이러한 인간 답게 마우스 모델은 인간의 특정 질병3,,45의 수사를 위해 중요 합니다.
후천성 면역 결핍 증후군 (에이즈) 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) 감염에서 발생 한 예입니다. 인간 답게 마우스 모델의 설립 이전에 윤리적, 기술적 한계 국한 HIV/에이즈 비 인간 영장류3전 임상 동물 연구. 그러나, 높은 비용 및 이러한 동물에 대 한 전문적인된 치료에 대 한 요구 사항을 일반적인 학술 설정에서 HIV/에이즈 연구를 방해. 에이즈는 주로 인간의 CD4 + T 세포를 감염 및 개발 및 B 세포, 대 식 세포, 수지상 세포6; 등 다른 인간의 면역 세포의 면역 반응에 미치는 영향 따라서, 기능 인간의 면역 시스템으로 이식 하는 작은 동물 모델 높은 수요에 있습니다.
돌파구는 1988 년에 때 Prkdcscid 돌연변이와 CB17-scid 쥐 개발 되었고 인간의 면역 시스템1의 성공적인 engraftment를 보여 왔다. 결함이 T-와 B-세포 기능에 Prkdcscid 돌연변이 결과 쥐에 연기나 적응 면역 체계, 단 세포 (PBMCs), 조 혈 줄기 세포 (HSCs), 혈액의 인간의 주변 engraftment 하도록 하 고 태아의 조 혈 조직7,8. 그럼에도 불구 하 고, engraftment의 저급은 자주 관찰이 모델; 가능한 원인은 자연 킬러 (NK)를 통해 변조 1) 잔여 타고 난 면역 활동-세포와 마우스 T와 B 세포 (시키는)5의 2) 단계의 개발. 비만 아닌 당뇨병 (끄 덕)의 후속 개발-scid 마우스 모델 달성 극적인 다운 레 귤 레이 션의 NK 세포 활동; 따라서, 그것은 높은 수준과 인간의 면역 체계 구성 요소9의 더 많은 지속 가능한 engraftment를 지원할 수 있습니다. 더 억제 또는 마우스 모델 베어링 잘림 또는 interleukin-2 수용 체 γ-체인 (Il2rg)의 총 녹아웃 (끄 덕)에서 타고 난 면제의 발전을 방해-scid 배경 설치 되었다. Il2rg, 일컬어 일반적인 cytokine 수용 체 γ-체인, 다양 한 cytokine 수용 체10,11,,1213의 필수적인 구성 요소입니다. 끄 덕 같은 변종. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG)와 NODShi.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug (노 그)에서 마우스 cytokine 신호의 강력한 중단 및 NK 세포 개발의 완전 한 절제를 제시 적응 면역14,,1516의 심한 장애 뿐만 아니라.
3 인간 답게 마우스 모델 베어링 scid 돌연변이 및 Il2rg 녹아웃 자주 HIV/에이즈 연구에서 채택 된다: 샌드위치 (골/간/Thymus) 모델, PBL (주변 혈액 백혈구) 모델 및 SRC (SCID 다시 채우기 셀) 모델 3.는 샌드위치 모델 인간 태아 간, 태아 간 HSCs3,,1718의 정 맥 주사와 함께 마우스 신장 캡슐 아래 thymus의 외과 이식 통해 만들어집니다. 높은 engraftment 효능, 모든 계보에서 인간 조 혈 모 세포의 개발 및 강한 인간의 면역 시스템;의 설립을 제공 하는 샌드위치 마우스 모델 또한, T-세포는 인간의 헌 thymus에서 교육 하 고 면역 응답 HLA 제한4,5,,1719전시. 그러나, 수술 절차에 대 한 요구 사항은 샌드위치 모델의 주요 단점은 남아 있습니다. PBL 마우스 모델 인간의 주변 림프 세포를 정 맥 주사에 의해 설정 됩니다. PBL 모델 편의 제공 하 고 성공적인 T-셀 engraftment를 생성 하지만 응용 프로그램은 부족 한 B-세포 및 골수성 세포 engraftment, 낮은 engraftment 수준 전체, 그리고 심한 이식-비교-호스트 질병 (GVHD)3의 발병으로 인해 제한 ,20. SRC 마우스 모델 신생아 또는 젊은 성인 SCID 쥐로 인간의 HSCs의 주사를 통해 설정 됩니다. 그것은 (말 초 혈액 CD45 비율으로 평가) 25% 이상 평균 engraftment 효율성을 전시 하 고 주입된 HSCs의 다중 계보 개발 및 타고 난 인간의 면역 시스템의 퇴 고를 지원 합니다. 그러나, SRC 모델의 한계가 이다 T 세포 응답 인간의 HLA 제한14,21대신 H2 제한 마우스입니다.
SRC 마우스 모델 연구를 위한 전 임상 HIV/에이즈 작은 동물, 인간의 면역 체계와 성공적인 조 혈 개발의 일관성 engraftment exemplified 손쉬운 고 안정적인 모델을 간주 됩니다. 우리는 이전 보고 NSG Hu-SRC-SCID (hu-NSG) 마우스 모델의 설립 하 고 HIV 복제 및 대기 연구22,,2324그것의 응용 프로그램을 설명. 이 hu NSG 마우스 모델 골 유도, HIV에 감염 자화 율의 높은 수준 및 HIV 감염의 병 인 재현 부를 전시 한다. 또한, hu NSG 마우스 모델 조합 항 레트로 바이러스 치료 (장바구니)에 적절 하 게 응답 하 고 카트 철수, 확인 된 에이즈 대기 저수지25,26의 설립에 따라 플라즈마 바이러스 리바운드를이 ,27. 이 HIV 대기 저수지는 인간의 휴식 하는 CD4 + T 세포 감염 및 카트 취급 hu NSG 쥐에서 분리에 의해 유도 된 복제 유능한 HIV 바이러스 전 비보 의 생산에 의해 더 입증 된다.
여기, 우리 대기 시간 개발에 대 한 HIV 감염 및 카트 치료에 관련 된 절차를 포함 하 여 신생아 NSG 쥐에서 hu NSG 마우스 모델의 설립에 대 한 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 우리는 새로운 HIV 에이즈 바이러스학, 대기 시간 및 치료에 관한 동물 연구에 접근을 제공 하는이 프로토콜을 기대 합니다.
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Protocol
모든 동물 보호 및 절차 프로토콜 검토 및 승인 하 여 시의 희망 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 개최 (닥터 존으로 시, IACUC #12034)이이 연구의 책임자에 의해 수행 되었습니다. 인간 태아 간 조직 비영리 단체, 연방 및 주 규정에 따라 고급 생명 자원 (Alameda, CA)에서 얻은 했다. 공급 업체 자체 기관 검토 위원회 (IRB) 및 인간 주제 보호 요구 사항을 준수. 인간의 PBMCs 나이, 인종, 성별, 또는 민족성에 관한 아무 식별과 시의 희망 혈액 기증자 센터에서 (듀 래 이트, 캘리포니아), 익명 건강 한 기증자 로부터 폐기 말 초 혈액 표본 으로부터 격리 됩니다. IRB #/ REF #: 97071/075546
1. 일반 무 균 연습
- 지정 된 층 류 캐비닛에 조직 배양 실험을 수행 합니다.
- 조직 문화 매체와 무 균 조건 하에서 보충을 유지 하 고 사용 하는 0.22 μ m 여과 단위 이전을 사용 하 여 필터링.
- 무 균 튜브에 준비 된 인간의 HSCs를 보존 하 고 주입까지 얼음에 계속.
- 심각한 면역 결핍의 결과로 NSG 마우스를 aseptically으로 처리 합니다. 일회용 수술 복, 헤어 캡, 얼굴 마스크, 신발 커버, 그리고 오염을 방지 하기 위해 장갑을 착용 합니다. 실험 전후 벤치 표면, 방사선 홀더, 및 염소 기반으로 산화물 sterilant (예를 들어, Clidox)와 마 취 유도 챔버를 청소.
- 복고풍 궤도 건조 한 눈을 방지 하기 위해 출혈 후 석유 기반 눈 연 고를 적용 합니다.
- 포함 하는 항생제를 변경 복고풍 궤도 출혈 때문에 감염을 방지 하기 위해 다이어트.
2. 처리 에이즈 바이러스 감염 된 설치류와 바이러스를 포함 하는 혈액/조직 샘플
주의: HIV는 클래스 3 인간의 병원 체; 처리 규칙 정확 하 게 따라야 합니다.
- 지정 된 BSL2에서 HIV 바이러스 포함 된 샘플 처리 + 3 실험실 공간. 운송 시 보조 컨테이너에 안전 하 게 바이러스를 포함 하는 시 약을 잠금. 10% 표 백제와 소 프로 파 놀 운송 전에 철저 하 게 닦아 하 여 모든 컨테이너의 외부 표면 소독.
- 2-3 레이어 유해 쓰레기 봉투의 지정된 폐기물 용기에 모든 바이러스 포함 된 폐기물을 유지. 폐기물 처리, 이전 아낌없이 요오드/ethoxylated nonylphenol 솔루션 (예: Wescodyne)와 고압 폐기물을 살포 하 여 소독.
- 개인 보호 장비 착용: 머리 모자, 얼굴 커버, 안티 스플래시 얼굴 방패, 신발 커버, 일회용 수술 가운, 및 더블 레이어 장갑.
- 극단주의 함께 감염 된 설치류를 처리 합니다. 마우스 (단계 5.1-5.2, 6.3-6.5, 7.3, 그리고 8.1-8.2) 취하는 동안 주사 및 혈액 컬렉션을 수행 합니다.
3입니다. 조 혈 줄기 세포의 분리
- 조직 소화 콜라/dispase 솔루션을 준비 합니다.
- 100 mg/mL의 농도에서 재고 솔루션을 만들기 위해 콜라/dispase 분말을 녹이 고-20 ° c.에서 150 µ L aliquots에서 콜라/dispase 재고 솔루션을 저장
- 콜라 솔루션 작업에 대 한 10 %FCS 1% 페니실린/스 보충 RPMI 1640의 15 mL와 콜라/dispase 재고의 150 µ L를 희석.
참고: 콜라/dispase 조직 소화의 최종 농도 1 mg/mL.
- 살 균 면도날, 태아 간 조직 (16-24 주 임신) 작은 조각 (약 2-3 m m3 크기에서)으로 실 온에서 30 분 동안 콜라/dispase 솔루션 (1 mg/mL)와 소화 다음 잘라. 모든 조직 조각을 완전히 잠긴 소화 솔루션의 볼륨을 조정 합니다. 주사기 플런저의 백 엔드를 사용 하 여 부드럽게 소화를 촉진 하기 위하여 조직 샘플을.
- 단일 세포 현 탁 액을 얻으려고 70 µ m 메 마른 나일론 메쉬 필터를 통해 소화 혼합물을 전달 합니다.
- CD34 + HSCs 제조 업체의 지시 당 맥 시스템을 사용 하 여에 대 한 풍부.
- Hemacytometer28 를 사용 하 여 풍부한 CD34 + HSCs의 가능한 비율을 계산 하 고 신생아 NSG 쥐로 intrahepatic 주입을 진행 합니다.
- 고정 미디어 (예를 들어, CryoStor CS2)에 남은 농축된 CD34 + HSCs 고 셀 액체 질소 탱크에 보존 한다. 앞으로 사용에 따라 주입 전에 해 동된 CD34 + HSCs의 가능한 비율 재검표. 사용 하 여 미디어를 동결, 해 동 후 생존 80 ~ 90% 사이입니다.
4. intrahepatic 인간 CD34 + HSCs 신생아 NSG 쥐에 주입
참고: 신생아 NSG 쥐 출생에서 2-3 일은이 절차에 대 한 가장 적합 한 그들은 완전히 면역 시스템 장애는 충분히 젊은 동안 반 치명적인 복용량에 방사선을 견딜 만큼 강한. 아니 마 취는 HSC 주입을 위해 필요 합니다.
- 살 균 원형 방사선 장에 신생아 NSG 쥐 (일반적으로 5-10 쥐, 두 성 전부)의 전체 쓰레기를 놓고 Caesium 137 방사선 소스에서 200-250 cGy 감마-레이 방사선의 총계 복용량에 노출 합니다. 상당한 체중 감소 또는 죽음 NSG 마우스 고용량의 방사선에 노출 되는 때 관찰 될 수 있는 범위 내에서, 그 방사선 복용량은 확인 합니다. 12
참고: 방사선은 건강 위험, 방사선에 대 한 개인 보호가지고 야 한다. - 방사선 조사, 다음 5 x 105 와 각 신생아 NSG 마우스 주사 가능한 인간 CD34 + HSCs 주사기/바늘 설치 (그림 1)를 사용 하 여. 직접 간으로 세포를 주사.
5. engraftment 유효성 검사 역 궤도 출혈 및 교류 Cytometry 분석을 통해
- 10-12 주 게시물-HSC 주입에 쥐 isoflurane/산소 흡입 기구를 사용 하 여 anesthetize. 4-5%에서 isoflurane 비율을 유지 하기 위해 산소 흐름을 조정 합니다. 마 취 개별 마우스에 따라 3-5 분 걸립니다. 제대로 마 취 쥐 천천히 깊은 호흡 패턴, 그리고 발가락 곤란 자극에 아무 반응을 보여줍니다.
- 28역 궤도 샘플링 통해 각 마우스에서 말 초 혈액의 50-100 µ L를 수집 합니다. 응고를 방지 하기 위해 K2EDTA 또는 heparinized 혈액 컬렉션 튜브에 혈액 샘플을 저장 합니다.
참고: 혈액 컬렉션 튜브 마우스 PBMCs 흐름 cytometry 분석에 대 한 전체 혈액 으로부터 격리 될 수 있도록 항 응 혈 약 코팅을 할 필요가 있습니다. EDTA는 PCR 등 qRT-PCR; 효소 반응을 억제 하기 위해 알려져 있다 따라서, 다운스트림 효소 반응이 필요한 경우 heparinized 혈액 수집 장치를 사용 합니다. - 2000 x g에서 혈액 샘플 혈 펠 렛을 4 ° C에서 20 분간 원심.
- 전송 플라즈마 supernatants 새로운 microcentrifuge 튜브 스토어-80 ° C에서 원심 분리 후 사이토카인 분석 필요한 경우.
- 붉은 혈액 세포 세포의 용 해 버퍼 (테이블의 재료)를 사용 하 여 10 분 동안 실내 온도에 혈액 세포 펠 렛 내에서 적혈구 (RBCs)를 lyse.
참고: 경우 플라즈마 샘플 필요 하지 않습니다, 직접 원심 분리 하지 않고 세포 솔루션 전체 혈액 lyse.
- 4 ° C에서 5 분간 300 x g에서 RBC 세포의 용 해 후 나머지 혈액 세포를 작은 상쾌한 발음 DPBS, 4 ° C에서 5 분간 300 x g에서 원심 분리기를 포함 하는 0.01 %BSA 셀 펠 릿을 세척 하 고 상쾌한 발음. 한 번 더 세척 단계를 반복 합니다.
- 100 µ L 1 x 차단의 칵테일 (제조 법에 대 한표 3 ) 4 ° c.에 20 분 동안 블록 셀
- 차단, 후 직접 2 µ L/106 세포의 농도에 세포 현 탁 액에 각 항 체 솔루션을 추가 하 고 30 분간 4 ° C에서 품 어. Engraftment 유효성 검사에 대 한 항 체는: 안티 인간 CD45 (백혈구, RRID: AB_2732068), 안티-인간의 CD3 (T-세포, RRID: AB_396896), 안티-인간의 CD4 (헬퍼 T-세포, RRID: AB_397037), 반대로 인간 CD8 (세포 독성 T-세포, RRID: AB_2722501), 반대로 인간의 CD14 (monocytes, RRID: AB_10373536)와 반대로 인간 CD19 (B 세포, RRID: AB_10373382). 제안 된 흐름 패널 참조 하십시오 표 4 및 테이블의 자료 카탈로그 번호, RRIDs 및 로트 번호에 대 한.
참고: 마우스 표면 표식으로 반대로 인간 항 체의 일반적인 바인딩을 제거 솔루션을 차단에 얼룩이 지는 항 체, 여러 표면 표식으로 인간 사이의 상 동을 공유 하 고 마우스. - 건강 한 기증자 로부터 인간의 PBMCs 격리 준비 단일 스테인드 흐름 cytometry 보상 컨트롤 사용 하 여 순화 된 인간의 PBMCs. 또는, 보상29컨트롤로 형광 표시 스피어를 사용.
- 교류 cytometer를 사용 하 여 주변 혈액 샘플을 분석 하 고 계량 인간의 CD45 + 세포, 인간의 CD3 + 세포, 인간의 CD14 + 셀, 및 인간의 CD19 + 총 주변 혈액 세포에서 세포의 비율.
- 다운스트림 HIV 감염 및 대기 시간 연구, CD4 + T 세포와 CD8 + CD3 + 세포 내 T 세포의 비율을 계산 합니다.
참고: 일반적으로, 1.5와 2.5 사이 CD4:CD8 비율 HIV 감염30전에 관찰 된다.
- 다운스트림 HIV 감염 및 대기 시간 연구, CD4 + T 세포와 CD8 + CD3 + 세포 내 T 세포의 비율을 계산 합니다.
6. hu-NSG 마우스와 플라즈마 바이러스 부하 qRT-PCR를 사용 하 여 HIV 감염의 분석
- 건강 한 기증자 로부터 인간의 PBMCs에 에이즈 발 바이러스 주식 전파, 감염 된 후 10 일에서 수확 및 적정 p24를 사용 하 여 ELISA 키트31.
- HIV 감염에 대 한 말 초 혈액에서 20% 이상의 선택 hu-NSG 쥐 인간 CD45 + 세포.
- Hu-NSG 쥐 isoflurane/산소 흡입 장치 (단계 5.1)를 사용 하 여 anesthetize
- 동물 마 취를 확인 한 후 200의 복용량에 에이즈 발 바이러스를 주사 복 경로 통해 마우스 당 p24의 ng.
참고: 바늘 매우 신중, 바늘, 재사용 및 지정 된 날카로운 컨테이너로 사용 후 즉시 삭제 하지 할. 바이러스 관리 후 주입의 영역을 치료. - 3 주 후 감염, hu NSG 마우스 anesthetize와 레트로 궤도 통해 주변 혈액 수집 모 세관 튜브 및 컬렉션 튜브 heparinized 사용 하 여 출혈.
- 별도 플라즈마 고 20 분 동안 2000 x g에서 원심 분리 하 여 혈액 세포.
- Rbc 블록을 lyse 고 흐름 cytometry 분석 (섹션 5.3-5.8)에 대 한 항 체와 나머지 혈 얼룩.
참고: 흐름 cytometry 분석 CD4:CD8 비율을 비교 하는 감염 전후에 집중 해야 한다. CD4 + 세포 수에서 상당한 감소 예상는 CD4로 항 바이러스 항목에 대 한 공동 수용 체 역할. - HIV 바이러스 분석을 사용 하 여 플라즈마 샘플 qRT-PCR를 사용 하 여 로드 합니다. 바이러스 성 RNA 미니 키트를 사용 하 여 플라즈마 샘플에서 바이러스 성 RNA를 분리. QRT-PCR 에이즈-1 LTR 특정 한 뇌관으로 수행 하 고 프로브 세트 ( 표 5에서 시퀀스 정보), 제조 업체의 프로토콜을 사용 하 여.
7. 카트 및 유효성 검사의 바이러스 억제 (선택 사항) 구강 관리
참고:이 단계는 급성 감염 단계 HIV 예 후, 바이러스학, 또는 감염 관련 이상 관련 조사에 대 한 선택 사항입니다. 에이즈에 감염 된 hu-NSG의 카트 치료 카트를 받는 인간의 환자 중 HIV 대기 시간을 정리 하는 데 사용 됩니다. Hu-NSG 성공적으로 HIV에 감염 된 쥐 4 주에 대 한 장바구니를 주어진 다. 카트 처방 (TDF, 300 m g/캡슐), 테 노 포 (공정 위, 200 m g/캡슐), emtricitabine 및 raltegravir (RAL; 400 m g/캡슐)으로 구성 됩니다. Hu-NSG 에이즈에 감염 된 쥐를 치료를 위한 손수레의 복용량 바디 표면 영역 (표 1, 방정식 1, 표 2)32에 따라 조정 됩니다.
- 각 약물 치료, 물병, 각 장에 마우스와 마우스 당 4 mL의 평균 일일 물 섭취 량의 볼륨을 고려의 1 주 동안 각 감 금 소에 필요한 금액을 계산 합니다.
참고:이 단계에서 핵심 포인트는 각 마우스 내 4 mL 식용 수의 매일 복용량의 취득 하는 것을 보장 하기 위해. - 정밀한 분말으로 조정된 복용량으로 모든 3 개의 약품을 갈기 고 청량된 물 (예: Medidrop Suralose)에 가루 혼합물을 분해. 갓 녹아 카트 칵테일 청량된 물에 제공 매주 물 병 변경.
참고: 마약 분말 수 있습니다 하지 즉시 해산, 병 들고 케이지를 반환 하기 전에 균질 정지를 달성 하기 위해 적극적으로 악수. - 복고풍 궤도 출혈 매 2 주를 통해 주변 혈액 샘플을 수집 하 고 모두 cytometry (섹션 5.3-5.8)와 qRT-PCR (단면도 6.6)를 사용 하 여 플라즈마 바이러스 부하를 사용 하 여 CD4:CD8 비율 분석.
참고: 일반적으로 4 주 후 치료, 플라즈마 바이러스 부하 감소를 검출 한계 아래 고 전형적인 CD4:CD8 비율 복원 됩니다.
8. 카트 (옵션) 철수 시 바이러스 반동의 유효성 검사
참고:이 단계는 대기 저수지의 직접 증거를 제공 하는 카트 철수 시 바이러스 리바운드 대기 모델 유효성 검사에서 중요 한. 그것은 또한 HIV 리바운드 억제제에 치료 조사에 대 한 제어 실험으로 것이 좋습니다.
- 플라즈마 주변 혈액 샘플에서 바이러스 부하 검출 한계 같습니다 CD4:CD8 비율 1.5와 2.5 사이 범위에 복원 후 카트 철수 계획.
- 복고풍 궤도 출혈 카트 철수 후 매 2 주를 통해 주변 혈액 샘플을 수집 합니다. CD4:CD8 비율 (섹션 5.3-5.8) 뿐만 아니라 플라즈마 바이러스 부하 (단면도 6.6)에서 변화를 밀접 하 게 모니터링 합니다.
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Representative Results
교류 cytometry 분석은 자주 고립된 HSCs의 순도 확인, 평가 하 engraftment 수준, 프로필 면역 반응에 바이러스 성 감염, 고 카트 효능을 조사 수행 됩니다. 일반적인 항 체 패널 포함 4-6 개인 붙일 레이블된 항 체; 따라서, 다양 한 필터와 여러 레이저 교류 cytometer은 정확한 결과 달성 하기 위한 중요 합니다.
초기 engraftment 유효성 검사에 대 한 인간의 CD45 + 세포 수 범위는 20%에서 80%, 그리고 인간 백혈구의 하위 흐름-줄거리 점 (그림 2)에 개별 인구로 표시 되어야 합니다. CD4:CD8의 비율 유지 1.5와 2.5 사이 건강 한 개인; 중요 한 CD4 + 소모는 일반적으로 바이러스 성 감염, 저조한 CD4:CD8;의 더 낮은 비율에 따라 관찰 그리고 건강 한 비율의 복원 카트 치료 (그림 3)에 따라 관찰 됩니다.
qRT-PCR의 플라즈마; 40 RNA 복사본/mL의 검출 한계를 제공 적절 한 희석이 실험 전에 필요 합니다. 감염 및 카트 처방의 과정을 통해 qRT-PCR를 사용 하 여 검출 하는 플라즈마 바이러스 중 플롯 고 감염과 카트 (그림 4)의 효율성을 평가 하는 데 사용 될 수 있습니다.
그림 1입니다. 주사기/바늘 intrahepatic 주입에 사용 되는 설치.
맞춤 해밀턴 80508 주사기/바늘 설치 beveled 가장자리와 연결 된 50 µ L 유리 주사기 30 게이지, 51 m m 긴 바늘을 포함 되어 있습니다. 이 절차에서는 최대 주입 량은 25 µ L. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. 교류 cytometry 데이터 성공적인 engraftment와 말 초 혈액에서 림프 및 골수성 세포의 개발을 나타냅니다.
그리고 성공적으로 준비 된 주변 혈액 샘플 개별 인구 분판 있어야 잘 engrafted hu-NSG 마우스 T-세포, B 세포 및 monocyte 긍정적인 인구 주변 혈액에서 제시 해야 합니다. CD4:CD8 차트 비율 계산에 대 한 것이 좋습니다. 는) 성공적인 engraftment 보여주 이상 25 %CD45 + 인간 백혈구 주변 혈액; 개별 인구 b) B-세포, c) monocytes, d) T-세포 가운데 인간의 CD45 + 백혈구; e) CD4 + 조 수 T 세포와 f) CD8 + 세포 독성 T-세포는 잘 구분 하 고, 그리고 g) 이 감염 되지 않은 hu NSG에서 1.5 ~ 2.5 사이의 비율을 생성. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3입니다. 바이러스 성 감염, 손수레 및 손수레의 과정을 통해 CD4 + 세포 수 변경 철회.
감염 진행 되는 동안, 1.5-2.5에서 CD4:CD8 비율 감소 > 1.0, CD4:CD8 비율 되었습니다 역임 했다 HIV 예 후 치료 평가에서 임상 매개 변수 신진대사. 는) 실험 과정; CD4:CD8 비율에 변화를 나타내는 대표적인 흐름 데이터 b) 비교 추세 차트 카트, 식별 될 수 있습니다의 효과 나타내는 CD4 + T 세포의 비율을 복원. Cytometry 여 CD4 + T 세포 수의 탐지. N: 시험된 쥐의 번호 6; = 오차 막대: ± SEM. 의미 * p < 0.05, * * p < 0.01, * * *p < 0.001, * * * p < 0.0001, ns: 더 중요 한 다른. 양방향 ANOVA 분석 채택 된다. 그림은 권한을22와 매 판. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4입니다. 혈 청 바이러스 성 RNA의 바이러스 성 감염의 과정을 통해 숫자를 복사, 카트, 카트 철회
QRT-PCR에 의해 hu-NSG 에이즈에 감염 된 생쥐에서 플라즈마 니의 탐지. 음영된 지역은 쥐 (하루 70 같이 하루 28)에서 장바구니를 받은 기간을 나타냅니다. PCR 분석 결과의 (점선으로 표시) 하는 탐지의 한계는 (110 ~ 160 RNA 복사본/mL)의 플라즈마 꼬리 정 맥을 통해 얻은 50 ~ 80 µ L에서. 별 (*)는 하루 56에서 취급 하는 카트 동물에서 감지 되지 않는 바이러스 성 RNA를 나타냅니다. 혈 청 바이러스 성 RNA 복사본 수 주변 혈액 샘플에서 바이러스 감염의 정도 관한 직접적인 증거로 역할 분석. 그것은 CD4 흐름 분석 계약에 있어야 한다. N: 시험된 쥐의 번호 6; = 오차 막대: ± SEM. 의미 * p < 0.05, * * p < 0.01, * * * p < 0.001, * * * p < 0.0001, ns: 더 중요 한 다른. 양방향 ANOVA 분석 채택 된다. 그림은 권한을22와 매 판. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
방정식 1입니다. 번역 체 표면적 (BSA)에 따라 복용량.
변환 하는 작은 실험 동물에 대 한 주입을 인간의 복용량 방정식입니다. Km 요소는 표 2에서 찾을 수 있습니다.
| 약물 치료 | 매일 복용량 (mg) |
| 테 노 포 | 300 |
| Emtricitabine | 200 |
| Raltegravir | 800 |
표 1. 카트 처방에 개별 약물의 일일 복용량
| 종 | 무게 (kg) | BSA (m2) | Km 인자 |
| 인간의 | |||
| 성인 | 60 | 1.6 | 37 |
| 아이 | 20 | 0.8 | 25 |
| 마우스 | 0.02 | 0.0007 | 3 |
표 2입니다. 무게, BSA와 Km 복용량 변환 요소 차트
| 시 약 | 볼륨 (μ) * | 최종 농도 |
| PBS에서 0.01% BSA | 98 | |
| 10 mg/ml 인간 IgG | 1 | 100 μ g/ml |
| 10 mg/ml 마우스 IgG | 1 | 100 μ g/ml |
| 100 | ||
| * 레시피 100 μ 칵테일 차단에서 차단 하나 셀 샘플입니다. 볼륨 조절 샘플 숫자. | ||
표 3입니다. 격리 된 혈액 세포에 대 한 칵테일 차단
| 항 체 | Fluorophore | 예: 최대 | Em입니다. 최대 |
| CD45 | BB515 | 490 nm | 515 nm |
| CD3 | PE-Cy7 | 496 nm | 785 nm |
| CD4 | 태평양 파랑 | 401 nm | 452 nm |
| CD8 | BUV395 | 348 nm | 395 nm |
| CD14 | APC-알 렉 사 750 | 650 nm | 774 nm |
| CD19 | PE | 496 nm | 578 nm |
표 4입니다. 멀티 컬러 흐름 패널 제안
| 앞으로 뇌관 | GCCTCAATAAAGCTTGCCTTG-3-5' ' | |||
| 반전 뇌관 | GGCGCCACTGCTAGAGATTTT-3-5' ' | |||
| 프로브 * | AAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTAGTGTTGACT-3-5' ' | |||
| * 5'-식구 들, 3'-블랙 홀 Quenche 1 | ||||
표 5입니다. 에이즈-1 LTR 뇌관 및 프로브
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Discussion
인간의 세포/조직으로 engrafted immunocompromised 쥐 인간과 같은 생리 적 특성을 제시 하 고 인간의 특정 질병에 관한 병 리, 병 태 생리학, 및 면역학 연구에 대 한 엄청난 가치. 가운데 immunocompromised 쥐, 끄 덕의 여러 변종. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG) 모델은 가장 타고 난과 적응 면역,3,12,19 신호 연기나 마우스 관련 cytokine의 그것의 부족 때문에 immunodeficient . 따라서, NSG 쥐 인간 화 과정에서 광범위 하 게 이용 되었습니다 그리고 그것을 잘 설립 murine 주변 혈액, 림프에 다시 인간 세포 및 골수성 조직, 그리고 쥐 전시 인간의 면역 응답을 적절 한 전염 성 stimulations HIV27,33등.
에이즈의 호스트 제한으로 인해 HIV 바이러스학 및 감염 예 후의 전 임상 동물 연구 이전 비 인간 영장류 유인원 면역 결핍 바이러스 (SIV, HIV의 비 인간 영장류 버전)3감염을 제한 했다. 줄기 세포 연구와 NSG 쥐의 세대에서 과학 발전 비용 절감 및 실험적인 회전율 빠른 작은 murine 동물에 에이즈 연구의 가능성을 열었습니다. 현재, NSG 인간 화 3) 인간의 HSCs (SRC 모델), 2) 인간 PBMCs (PBL 모델), 및 인간의 HSCs (샌드위치 모델), 1) 태아 조직 이식 통해 얻을 수 있습니다. 샌드위치 모델 engraftment 효율성 뿐만 아니라 두 림프 및 골수성 기능34,35, 포괄적인 개발 제공 하지만 기술적으로 요구 합니다. PBL 모델 구축에 가장 편리 하지만 engraftment GVHD;에서 발생 시 짧은 실험 창 또한 그것은 단지 괜찮은 주변 T 세포 응답을 제공 하 고 림프 및 골수성 개발 부족. 이러한 이유로, 우리는 에이즈 조사에 대 한 요구 사항에 맞게 각 색 한와이 프로토콜에서 SRC 모델 고용. Hu-NSG 모델 이며 완전히 면역 기능 없는 골 방사선 및 이식; 귀환에 효율적 또한, 그것은 수 있습니다 바이러스 도전과 후속 조사 젊은 나이에 끄 덕 스트레인 배경으로 알려진 나이 관련 된 병 적인 문제 개발을 피하. Hu-NSG 모델에서 T-세포 마우스 thymic 환경에서 교육 하 고 H2 제한만, 인간의 면역 세포의 경우에 여러 하위 집합에 개발 하 고 마우스 림프 및 골수성 장기 식민지 수 있습니다. 눈에 띄게, hu NSG 모델의 창 자 연관 된 림프 조직 또한 인간의 면역 세포;와 재구성 따라서,이 모델은 잠재적으로 에이즈 점 막 전송, 비슷한 샌드위치 모델22,23를 지원할 수 있습니다.
근절 에이즈 주요 장애물 중 하나 진압 카트33,36,,3738,39로 치료 하는 환자 중 대기 저수지의 존재입니다. Latently 감염 된 세포, 유지 하 고 카트 철수 시 에이즈 바이러스 성 반 등을. 대기 저수지 간, 비장, 뇌, 그리고 다른 림프 조직에 있는 해부학 그리고 메모리 CD4 + T 세포36,,4041의 주로 구성 됩니다. 우리의 그룹에 의해 보고, hu NSG 모델은 완벽 하 게 에이즈 대기 시간의 병 적인 모델링에 적합 만드는 T 세포 계보의 개발을 지원 합니다. 우리는이 모델은 바이러스 성 감염을 연속적으로 구강 관리를 통해 카트 처방에 매우 취약 것을 보였다. 극적인 바이러스 리바운드 대기 저수지의 존재를 완벽 하 게 지원 카트 철수 때 즉시 발생 합니다. Latently 감염 메모리 CD4 + T 세포는 카트, 동안 에이즈에 감염 된 hu-NSG의 림프 기관에서 격리 될 수 있습니다 그리고 바이러스 파생물 분석 정리 바이러스 리바운드 ex vivo41. Hu-NSG 모델과이 프로토콜에서 설명 하는 HIV 감염/카트 처방 따라서 HIV 바이러스학, 감염 예 후, 대기 시간 이상과 항 레트로 바이러스 치료제 개발에 관련 된 분야에서 광범위 한 응용 프로그램 있다.
이 프로토콜에서 hu NSG 마우스 모델에서는 방사선 및 하루에 HSCs의 intrahepatic 사출 2-3 후 출생; 따라서, 자체 번 식 및 특정 주택 조건 필요 됩니다. 신생아 HSC 이식에는 일반적으로 높은 engraftment 효율성 수율, 있지만 경우에 따라 심각한 GVHD 발생할 수 있습니다. 경우에 따라 감염 시 주변 CD45 + 세포 수에 상당한 감소를 관찰할 수 있다 고 극한 조건에서 말 초 혈액 CD45 + 고갈 관찰 될 수 있다; 따라서, 혈액 수집 및 교류 cytometry 분석 전하실 수 있습니다. 이 주석-NSG 마우스 모델의 주요 제한 사항 중 하나는 T-세포의 공상 자연 이내에 거짓말. T-세포 hu NSG 마우스 모델에서 마우스 thymic 환경 내에서 교육 그리고 HLA 제한; 되 고 대신 H2 제한 따라서, 감염에 따라 T 세포 부분 집합의 동적 변경의 전체 재현 부는 확률이 낮아집니다. 또한, hu NSG 마우스 모델 전시 좋은 민감성 에이즈-1 감염에, 관찰 된 플라즈마 바이러스 부하 선택할 인간 림프 및 골수성 함수 incomprehensive 재구성으로 인해 샌드위치 모델에 비해 낮은 될 수 있습니다.
요약 하자면,이 프로토콜에 묘사 된 hu NSG 마우스 샌드위치 모델 대신 에이즈 바이러스학 및 대기 시간 연구, 인간 답게 된 마우스 모델을 생성 하기 위한 간단 하 고 효율적인 방법론을 제공 합니다. 포괄적인 림프 및 골수성 개발의 한계에도 불구 하 고 hu NSG 모델 감염에 취약 하 고 치료 또는 다른 치료제22,,2324장바구니에 응답 입증 되었습니다. 대기 시간 병 리 모델 설립이 프로토콜이 HIV 바이러스 리바운드 비보 에 따르면 latently 감염 된 메모리 CD4 + T 세포는 더 일 수 있다 추가 조사에 대 한 격리.
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Disclosures
저자는 충돌의 관심을 공개.
Acknowledgments
이 작품은 건강의 국가 학회 [J.J.R. R01AI29329, R01AI42552 및 R01HL07470 번호 부여] 건강의 국가 학회 [부여 번호 희망 통합 유전체학의 도시를 지원 하기 위해 P30CA033572의 국립 암 연구소에 의해 지원 되었다 분석 약 학 및 분석 Cytometry 코어]. NIH 에이즈 연구 및 참조 시 약 프로그램, 사단의 에이즈, NIAID, NIH를 통해 얻은 다음 시 약: 에이즈 발 바이러스.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD34 MicroBead Kit, human | MiltenyiBiotec | 130-046-703 | |
| CryoStor CS2 | Stemcell Technologies | 07932 | |
| NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wji | The Jackson Laboratory | 005557 | Order breeders instead of experimental mice |
| IsoFlo | Patterson Veterinary | 07-806-3204 | Order through animal facility, restricted item |
| Clidox disinfectant | Fisher Sicentific | NC9189926 | |
| Wescodyne | Fisher Sicentific | 19-818-419 | |
| Hamilton 80508 syringe/needle | Hamilton | 80508 | Custom made |
| Blood collection tube (K2EDTA) | BD Bioscience | 367843 | |
| Blood collection tube (Heparin) | BD Bioscience | 365965 | |
| Capillary tube (Heparinized) | Fisher Sicentific | 22-362574 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Sigma Aldrich | 11814389001 | |
| QIAamp Viral RNA mini kit | Qiagen | 52906 | |
| TaqMan Fast VIrus 1-step Master Mix | Thermofisher | 4444434 | |
| HIV-1 P24 ELISA (5 Plate kit) | PerkinElmer | NEK050B001KT | |
| IgG from human serum | Sigma Aldrich | I4506-100MG | |
| IgG from mouse serum | Sigma Aldrich | I5381-10MG | |
| BB515 Mouse Anti-Human CD45 (clone HI30) | BD Biosciences | 564586 | RRID: AB_2732068, LOT 6347696 |
| PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD3 (Clone SK7) | BD Biosciences | 557851 | RRID: AB_396896, LOT 6021877 |
| Pacific Blue Mouse Anti-Human CD4 (Clone RPA-T4) | BD Biosciences | 558116 | RRID: AB_397037, LOT 6224744 |
| BUV395 Mouse Anti-Human CD8 (Clone RPA-T8) | BD Biosciences | 563795 | RRID: AB_2722501, LOT 6210668 |
| APC-Alexa Fluor 750 Mouse Anti-Human CD14 (TuK4) | ThermoFisher | MHCD1427 | RRID: AB_10373536, LOT 1684947A |
| PE Mouse Anti-Human CD19 (SJ25-C1) | ThermoFisher | MHCD1904 | RRID: AB_10373382, LOT 1725304B |
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