Summary
Dit protocol biedt een methode om vast te stellen gehumaniseerd muizen (hu-NSG) via Intrahepatische injectie van menselijke hematopoietische stamcellen in straling-geconditioneerd neonatale NSG muizen. De hu-NSG muis is gevoelig voor HIV-infectie en combinatorische antiretrovirale therapie (cART) en dient als een geschikt pathofysiologisch model voor HIV-replicatie en latentie onderzoeken.
Abstract
Ethische regels en technische uitdagingen voor onderzoek in de menselijke pathologie, immunologie en therapeutische ontwikkeling hebben kleine diermodellen geplaatst in hoge vraag. Met een nauwe genetische en gedragsmatige gelijkenis met mensen zijn kleine dieren zoals de muis goede kandidaten voor ziekten bij de mens modellen, waarlangs mens-achtige symptomen en reacties kunnen worden gerecapituleerd. Verder kan de genetische achtergrond van muis aangepast aan uiteenlopende eisen worden gewijzigd. De KNIPOOG/SCID/IL2rγnull (NSG) muis is één van de meest gebruikte immuungecompromitteerde muis spanningen; Hierdoor engraftment met menselijke hematopoietische stamcellen en/of menselijke weefsels en de verdere ontwikkeling van een functionele menselijk immuun systeem. Dit is een kritieke mijlpaal in het begrip van de prognose en pathofysiologie van mens-specifieke ziekten zoals HIV/AIDS en medeplichtigheid aan het zoeken naar een remedie. Hierin, rapporteren we een gedetailleerd protocol voor het genereren van een gehumaniseerd NSG muismodel (hu-NSG) door hematopoietische stamceltransplantatie in een muis neonatale NSG straling-geconditioneerd. De hu-NSG muismodel toont meerdere lineage ontwikkeling van getransplanteerde menselijke stamcellen en de gevoeligheid voor HIV-1 virale infectie. Het recapituleert ook belangrijke biologische kenmerken in respons op combinatorische antiretrovirale therapie (cART).
Introduction
Omdat de vaststelling van geschikte diermodellen voor ziekten bij de mens is de sleutel tot het vinden van een remedie, hebben passende dieren modellen lang voortgezet en verbeterd na verloop van tijd. Meerdere stammen van immuungecompromitteerde lymfkliertest modellen zijn ontwikkeld die de engraftment van menselijke cellen en/of weefsels en de latere uitvoering van gehumaniseerd functies1,2 toelaten. Dergelijke gehumaniseerd Muismodellen staan kritisch tegenover voor onderzoek van mens-specifieke ziekten3,4,5.
Acquired immune deficiency syndrome (AIDS) als gevolg van infectie met het humaan immunodeficiëntie virus (HIV) is een voorbeeld. Voorafgaand aan de vaststelling van gehumaniseerd Muismodellen beperkt ethische en technische beperkingen HIV/AIDS preklinische dierstudies naar niet-menselijke primaten3. Echter, de hoge kosten en vereisten voor gespecialiseerde zorg voor zo'n dier een belemmering vormen voor HIV/AIDS studies in typische academische instellingen. HIV voornamelijk infecteert menselijke CD4 + T-cellen en impact van de ontwikkeling en de immuunrespons van andere menselijke immune cellen zoals B-cellen, macrofagen en dendritische cellen6; kleine dierlijke modellen met een functionele menselijk immuunsysteem getransplanteerd zijn daarom in hoge vraag.
Een doorbraak kwam in 1988, toen CB17 -scid muizen met een mutatie Prkdcscid ontwikkeld en succesvolle engraftment van het menselijke immuunsysteem1toonde. De resultaten van de mutatie Prkdcscid in defecte T - en B-cel-functies en een ablated adaptieve immuunsysteem in muizen, waardoor de engraftment van menselijke perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs), hematopoietische stamcellen (HSCs), en foetale hematopoietische weefsels7,8. Niettemin, lage niveaus van engraftment worden vaak waargenomen bij dit model; mogelijke oorzaken zijn 1) residuele aangeboren immuun activiteit gemoduleerd via natural killer (NK)-cellen en 2) de ontwikkeling van de late-stadium van muis T - en B-cellen (leakiness)5. De verdere ontwikkeling van de nietzwaarlijvige diabetische (NOD)-scid muismodel bereikt dramatische down-regulatie van de activiteit van de NK-cel; het is dus een hoger niveau en meer duurzame engraftment van menselijke immuunsysteem componenten9kunnen steunen. Verder onderdrukken of belemmeren de ontwikkeling van aangeboren immuniteit, Muismodellen truncation of totale knockout van de interleukin-2 receptor γ-keten (Il2rg) rekening houdend met in de (NOD) -scid achtergrond werden opgericht. Il2rg, ook bekend als gemeenschappelijk cytokine-receptor γ-keten, is een onmisbaar onderdeel van verschillende cytokine receptoren10,11,12,13. Stammen zoals de KNIPOOG. CG -PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG) en NODShi.Cg -PrkdcscidIl2rgtm1Sug (NOG) presenteren robuuste verstoring van muis cytokine signalering en volledige ablatie van NK-cel ontwikkeling, in aanvulling op ernstige aantasting van adaptieve immuniteit14,15,16.
Drie gehumaniseerd muismodellen, rekening houdend met een scid mutatie en Il2rg knock-out in HIV/AIDS-onderzoek vaak werkzaam zijn: de BLT (beenmerg/lever/zwezerik)-model, het model van de PGO (perifere bloed leukocyten) en de SRC (SCID repopulatie cel) model 3. de BLT model is gemaakt via chirurgische transplantatie van menselijke foetale lever en thymus onder de muis nier capsule vergezeld met intraveneuze injectie van foetale lever HSCs3,17,18. De BLT muismodel biedt hoge engraftment werkzaamheid, ontwikkeling van menselijke hematopoietische cellen in alle geslachten, en totstandbrenging van een sterke menselijke immuunsysteem; Daarnaast is T-cellen zijn opgeleid in een menselijke autologe zwezerik en vertonen immuunresponsen HLA-beperkte4,5,17,19. De eis voor chirurgische procedures blijft echter het belangrijkste nadeel van de BLT-model. De muismodel van PGO is opgericht door intraveneuze injectie met menselijke perifere lymfoïde cellen. Het PGO-model biedt gemak en succesvolle T-cel engraftment levert, maar de toepassing ervan is beperkt als gevolg van onvoldoende B-cel en myeloïde cel engraftment, laag engraftment niveau algemene en het ontstaan van ernstige graft - versus - host-ziekte (GVGH)3 ,20. De SRC muismodel is door injectie van menselijke HSCs in pasgeboren of jonge volwassen SCID muizen aangetoond. Het gemiddelde engraftment efficiëntie boven 25% (beoordeeld als perifeer bloed CD45 percentage) vertoont en ondersteunt de ontwikkeling van meerdere-bloedlijn van geïnjecteerd HSCs en het uitwerken van een aangeboren menselijke immuunsysteem. De beperking van het SRC-model is echter dat de T-cel-respons is muis H2-beperkt in plaats van menselijke HLA-beperkte14,21.
De SRC muismodel wordt beschouwd als een model voor facile en betrouwbare voor preklinische HIV/AIDS kleine dierlijke studies, wordt geïllustreerd door het consistent engraftment van een menselijke immuunsysteem en succesvolle hematopoietische ontwikkeling. Wij eerder gemeld van de oprichting van een muismodel NSG Hu-SRC-SCID (hu-NSG) en de toepassing ervan in de HIV-replicatie en latentie studies22,23,24beschreven. Deze hu-NSG muismodel vertoont hoge niveaus van beenmerg homing, gevoeligheid voor HIV-infectie, en de recapitulatie van HIV-infectie en pathogenese. Bovendien, de hu-NSG muismodel correct reageert op combinatorische antiretrovirale therapie (cART) en recapituleert de virale rebound plasma bij kar geldopname, bevestiging van de oprichting van een HIV latency reservoir25,26 ,27. Dit reservoir van HIV latency wordt verder onderbouwd door overlegging van replicatie-bevoegde HIV virussen ex vivo geïnduceerd door mens rust CD4 + T-cellen van geïnfecteerde en kar-behandeld hu-NSG muizen geïsoleerd.
Hierin beschrijven we de gedetailleerd protocol voor oprichting van de hu-NSG muismodel van neonatale NSG muizen, met inbegrip van de procedures met betrekking tot HIV-infectie en kar behandeling voor latency ontwikkeling. Wij verwachten dat dit protocol te bieden een nieuwe reeks van benaderingen in HIV dierlijke studies met betrekking tot HIV Virologie, latency en behandeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierenverzorgers en procedures hebben ondergaan volgens protocollen gecontroleerd en goedgekeurd door de stad van hoop institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) gehouden door de hoofdonderzoeker van dit onderzoek (Dr. John Rossi, IACUC #12034). Menselijke foetale leverweefsel is verkregen uit geavanceerde Bio-Resources (Alameda, CA), een non-profitorganisatie, overeenstemming met federale en nationale regelgeving. De leverancier heeft zijn eigen institutionele Review Board (IRB) en voldoet aan de eisen inzake de bescherming van de menselijke onderwerp. Menselijke PBMCs zijn geïsoleerd uit afgedankte perifeer bloed monsters van anonieme gezonde donoren centrum van stad van hoop bloed Donor (Duarte, CA), met geen identificatie met betrekking tot leeftijd, ras, geslacht of etnische afkomst. IRB #/ REF #: 97071/075546
1. algemene aseptische praktijk
- Weefselkweek experimenten uitvoeren in aangewezen laminaire flow kasten.
- Weefsel kweekmedium en supplementen onder steriele omstandigheden houden en filter op basis van een voorafgaande 0.22-µm filtratie eenheid te gebruiken.
- Bewaren bereid menselijke HSCs in steriele buizen en houden op ijs tot injectie.
- Als gevolg van ernstige immuundeficiëntie, NSG muizen aseptisch te behandelen. Draag een wegwerp chirurgie jurk, haar GLB gezichtsmasker, schoen covers en handschoenen om verontreiniging te voorkomen. Sanitize de bench oppervlak, bestraling houder en inductie kamer voor anesthesie met chloor kooldioxide gebaseerd sterilant (bijvoorbeeldClidox) vóór en na experimenten.
- Breng aardolie gebaseerde oog zalf na retro-orbitaal bloeden om te voorkomen dat droge ogen.
- Omzetten in antibioticum-bevattende voeding om te voorkomen dat infectie als gevolg van retro-orbitaal bloeden.
2. hantering HIV-Virus, besmette knaagdieren en bloed Virus-bevattende/weefselsteekproeven
Let op: HIV is een klasse 3 menselijke pathogene agens oplevert; de regels voor de verwerking moeten precies worden gevolgd.
- Behandelen van HIV virus-bevattende monsters in een aangewezen BSL2 +/ 3 laboratorium ruimte. Vergrendelen virus-bevattende reagentia veilig in een secundaire container tijdens het vervoer. Desinfecteer het buitenoppervlak van alle containers door grondige afvegen met 10% bleekwater en isopropanol en voorafgaand aan het vervoer.
- Houd alle afvalstoffen van het virus-bevattende aangewezen afvalcontainers met 2-3 lagen van biohazardous afval zakken. Voorafgaand aan de verwijdering van het afval, ontsmetten door royaal spuiten de afvalstoffen met jodium/geëthoxyleerde nonylfenol oplossing (bijvoorbeeld Wescodyne) en autoclaaf.
- Draag persoonlijke beschermingsmiddelen: haar GLB, gezicht cover, anti-splash gelaatsscherm, schoen covers, wegwerp chirurgie jurk en dubbellaags handschoenen.
- Omgaan met besmette knaagdieren met uiterste voorzichtigheid. Injecties en bloed collecties verrichten terwijl muizen onder verdoving (stappen 5.1-5.2, 6.3-6.5, 7.3 en 8.1-8.2 zijn).
3. isolatie van hematopoietische stamcellen
- Bereid collagenase/dispase-oplossing voor weefsel spijsvertering.
- Los collagenase/dispase poeder zodat stockoplossing met een concentratie van 100 mg/mL en slaat u de stamoplossing collagenase/dispase in 150 µL aliquots bij-20 ° C.
- Verdun voor collagenase werkoplossing, 150 µL van collagenase/dispase voorraad met 15 mL RPMI 1640 aangevuld met 10% FCS en 1% penicilline/streptomycine.
Opmerking: De uiteindelijke concentratie van collagenase/dispase voor weefsel spijsvertering is 1 mg/mL.
- Knippen met een steriele scheermesje, foetale leverweefsel (16-24 weken zwangerschap) in kleine stukjes (ongeveer 2-3 mm3 in grootte) gevolgd door de spijsvertering met collagenase/dispase oplossing (1 mg/mL) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Regel het volume van de spijsvertering oplossing zodat alle weefsel stukken zijn volledig ondergedompeld. Gebruik de back-end van de zuiger van de spuit te voorzichtig slijpen het weefsel monster ter vergemakkelijking van de spijsvertering.
- Laat het mengsel van de spijsvertering door een 70-µm steriele nylon mesh filter te verwerven van de schorsing van een enkele cel.
- Verrijken voor CD34 + HSCs met behulp van een systeem van MACS per fabrikant instructie.
- Het haalbare percentage van verrijkte CD34 + HSCs met behulp van een hemacytometer28 tellen en overgaan tot Intrahepatische injectie in neonatale NSG muizen.
- Bevriezen van de resterende verrijkte CD34 + HSCs in het bevriezen van de media (bvCryoStor CS2) en behouden van cellen in een tank met vloeibare stikstof. Bij toekomstig gebruik, vertellen het haalbare percentage van ontdooide CD34 + HSCs vóór injectie. Met het gebruik van de bevriezing van de media, is na dooi levensvatbaarheid tussen 80 à 90%.
4. Intrahepatische injectie van menselijke CD34 + HSCs in neonatale NSG muizen
Opmerking: Neonatale NSG muizen 2-3 dagen vanaf de geboorte zijn het meest geschikt voor deze procedure, als ze sterk genoeg zijn te verduren van bestraling bij half-letale dosis, terwijl jong genoeg om het geheel visueel gehandicapten immuunsysteem. Geen anesthesie is vereist voor de HSC-injectie.
- Plaats het hele nest van neonatale NSG muizen (gewoonlijk 5-10 muizen, zowel mannen als vrouwen) in een steriele taart-vormige bestraling kooi en bloot aan een totale dosis van 200-250 cGy gamma-ray straling van een stralingsbron cesium-137. Zorg ervoor dat stralingsdosis binnen het bereik, als significant gewichtsverlies of zelfs de dood kan worden waargenomen wanneer de NSG muizen zijn blootgesteld aan hoge doses bestraling. 12
Opmerking: Straling is een gevaar voor de gezondheid, persoonlijke bescherming tegen straling dient te worden gehouden. - Na bestraling, Injecteer elke neonatale NSG-muis met 5 x 10,5 haalbare menselijke CD34 + HSCs met behulp van een injectiespuit/naald setup (Figuur 1). Rechtstreeks injecteren cellen in de lever.
5. engraftment validatie door middel van Retro-orbitaal bloeden en Stroom Cytometry analyse
- Anesthetize op 10-12 weken post-HSC injectie, muizen met behulp van een apparaat van de inademing Isofluraan/zuurstof. Aanpassen van de stroom van zuurstof te handhaven Isofluraan percentage op 4-5%. Verdoving duurt 3-5 minuten, afhankelijk van individuele muis. Goed narcose muizen Toon een langzame en diepe ademhaling patroon en geen reactie op de stimulatie van de teen-knijpen.
- 50-100 µL van perifeer bloed van elke muis via retro-orbitaal bemonstering28verzamelen. Opslaan van bloedmonsters in K2EDTA of bloed EDTA collectie buizen om te voorkomen dat coagulatie.
Opmerking: Bloed collectie buizen dienen te hebben van anticoagulatie coating zodat muis PBMCs geïsoleerd uit volbloed stroom cytometry p.a. worden kunnen. EDTA is bekend dat remt enzymatische reacties zoals PCR en qRT-PCR; Dus, als downstream enzymatische reacties nodig zijn, gebruiken een EDTA bloed collectie apparaat. - Centrifugeer bloedmonsters bij 2.000 x g gedurende 20 minuten bij 4 ° C tot pellet bloedcellen.
- Overbrengen in het plasma supernatant nieuwe microcentrifuge buizen na centrifugeren en winkel bij-80 ° C als cytokine analyse vereist is.
- Lyse de rode bloedcellen (RBC) binnen de bloedcel pellet bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten met behulp van de rode bloedcel Lysis-buffermengsel (Tabel van materialen).
Opmerking: Als de plasma monsters zijn niet nodig, direct lyse de volbloed met lysis oplossing zonder centrifugeren.
- Pellet resterende bloedcellen na lysis van de RBC bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 ° C; de bovendrijvende substantie gecombineerd. Spoel de cel pellets met 0,01% BSA met DPBS, centrifuge op 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 ° C en supernatant gecombineerd. Herhaal de wassen stap één meer tijd.
- Blok cellen met 100 µL van het blokkeren van 1 x cocktail (tabel 3 voor recept) gedurende 20 minuten bij 4 ° C.
- Na het blokkeren, direct elke antilichaam-oplossing in de celsuspensie bij een concentratie van 2 µL/106 cellen toevoegen en Incubeer bij 4 ° C gedurende 30 minuten. Antilichamen voor engraftment validatie zijn: Anti-menselijke CD45 (leukocyten, RRID: AB_2732068), Anti-menselijke CD3 (T-cellen, RRID: AB_396896), Anti-menselijke CD4 (helper T-cellen, RRID: AB_397037), Anti-menselijke CD8 (cytotoxische T-cellen, RRID: AB_2722501), Anti-menselijke CD14 (monocyten, RRID: AB_10373536), en anti-menselijke CD19 (B-cellen, RRID: AB_10373382). Raadpleeg tabel 4 en Tabel van materialen voor catalogus, RRIDs en lotnummers voor voorgestelde stroom deelvenster.
Opmerking: Niet-specifieke binding van de anti-menselijke antilichamen richting muis oppervlakte markeringen antilichaam vlekken in het blokkeren van oplossing elimineert, als verschillende oppervlakte markeringen delen homologie tussen mens en muis. - Isoleren van menselijke PBMCs van gezonde donoren en bereiden van één gebeitste stroom cytometry compensatie controles met behulp van gezuiverde menselijke PBMCs. als alternatief, fluorescentie-geëtiketteerden microsferen gebruiken als compensatie29 besturingselementen.
- Analyseren van de monsters van perifeer bloed met behulp van een cytometer van de stroom en kwantificeren van het percentage van de menselijke CD45 + cellen, menselijke CD3 + cellen, menselijke CD14 + cellen en menselijk CD19 + cellen uit totale perifere bloedcellen.
- Bereken het percentage van CD4 + T-cellen en CD8 + T-cellen binnen de cellen CD3 + voor downstream HIV-infectie en latentie studies.
Opmerking: Doorgaans een CD4:CD8 ratio tussen 1.5 en 2.5 wordt waargenomen vóór HIV infectie30.
- Bereken het percentage van CD4 + T-cellen en CD8 + T-cellen binnen de cellen CD3 + voor downstream HIV-infectie en latentie studies.
6. analyse van HIV-infectie van hu-NSG muizen en virale lading Plasma via qRT-PCR
- Verspreiden van de virale voorraad HIV BaL in menselijke PBMCs van gezonde donoren, oogsten op dag 10 na infectie en titreer met behulp van p24 ELISA kit31.
- Selecteer hu-NSG muizen met meer dan 20% menselijke CD45 + cellen in het perifere bloed voor HIV-infectie.
- Anesthetize hu-NSG muizen met behulp van een apparaat inademing Isofluraan/zuurstof (stap 5.1).
- Na het bevestigen van dier wordt verdoofd, injecteren van de BaL van het HIV virus bij een dosis van 200 ng van p24 per muis via intraperitoneaal route.
Opmerking: Wees zeer voorzichtig met de naald, geen hergebruik van naalden en werp onmiddellijk na gebruik in aangewezen scherpe container. Desinfecteer de oppervlakte van injectie na toediening van het virus. - Drie weken na infectie, anesthetize hu-NSG muizen en verzamelen van perifeer bloed door middel van retro-orbitaal bloeden met behulp van EDTA capillaire buizen en pijpen van de collectie.
- Aparte plasma en bloedcellen door centrifugeren op 2.000 x g gedurende 20 minuten.
- Lyse van RBC. Block en vlek resterende bloedcellen met antilichamen stroom cytometry p.a. (sectie 5.3-5.8).
Opmerking: Stroom cytometry analyse moet richten op het vergelijken van CD4:CD8 verhouding vóór en na de infectie. Significante afname in het aantal van CD4 +-cellen wordt verwacht, als de CD4 antigeen fungeert als een co receptor voor virale invoer. - Gebruik plasma monsters te analyseren van de HIV viral load met behulp qRT-PCR. Isoleren van virale RNA van plasma monsters met behulp van een virale RNA mini kit. Het uitvoeren van qRT-PCR met HIV-1 LTR-specifieke primers en sonde ingesteld (reeks details in tabel 5), met behulp van het protocol van de fabrikant.
7. orale toediening van kar en validatie van virale onderdrukking (optioneel)
Opmerking: Deze stap is optioneel voor onderzoeken met betrekking tot HIV-prognose, virologie, of infectie-gerelateerde pathofysiologie tijdens de fase van acute infectie. Kar behandeling voor HIV-geïnfecteerde hu-NSG wordt gebruikt om te recapituleren HIV latency onder menselijke patiënten die cART. Hu-NSG succesvol HIV-geïnfecteerde muizen krijgen winkelwagen voor 4 weken. De kar regime bestaat uit tenofovir disoproxil fumaraat (TDF; 300 mg/capsule), emtricitabine (FTC; 200 mg/capsule), en raltegravir (RAL; 400 mg/capsule). De dosis van kar voor de behandeling van HIV-geïnfecteerde hu-NSG muizen wordt aangepast volgens lichaam oppervlakte (tabel 1, vergelijking 1, tabel 2)32.
- Berekent het bedrag van elke medicatie nodig voor elke kooi gedurende een week van behandeling, rekening houdend met het volume van de waterfles, het aantal muizen in iedere kooi en een gemiddelde dagelijkse wateropname van 4 mL per muis.
Opmerking: Het belangrijkste punt in deze stap is om ervoor te zorgen dat elke muis zijn dagelijkse dosis binnen de 4 mL drinkwater verwerft. - Alle drie medicijnen met aangepaste doses tot fijn poeder vermalen en los het poeder mengsel in gezoete water (bv Medidrop Suralose). Wijzig de waterfles wekelijks met vers opgeloste kar cocktail geleverd in gezoete water.
Opmerking: Het drug-poeder kan niet onmiddellijk te ontbinden, schud krachtig om een homogene suspensie alvorens de fles terug te keren naar de kooi van het bedrijf. - Perifeer bloedmonsters verzamelen via retro-orbitaal bloeden om de twee weken en analyseren zowel de verhouding van de CD4:CD8 met behulp van stroom cytometry (sectie 5.3-5.8) en de virale lading van plasma via qRT-PCR (sectie 6.6).
Opmerking: Doorgaans na 4 weken van de behandeling, de virale lading plasma afneemt tot onder de detectiegrens en de verhouding van een typische CD4:CD8 is hersteld.
8. validatie van virale Rebound op kar terugtrekking (optioneel)
Opmerking: Deze stap is van cruciaal belang bij het valideren van de latentie model, zoals virale rebound bij kar geldopname rechtstreeks bewijs van een latency-reservoir biedt. Het is ook aanbevolen om te dienen als een controle-experiment voor therapeutisch onderzoek naar HIV rebound suppressants.
- Plan voor terugtrekking van de kar nadat plasma virale ladingen uit perifeer bloedmonsters onder de detectiegrens liggen en de verhouding tussen de CD4:CD8 is hersteld naar een bereik tussen 1.5 en 2.5.
- Het verzamelen van monsters van perifeer bloed door de retro-orbitaal bloeden elke 2 weken na de terugtrekking van de kar. Nauwlettend toezien op de verandering in plasma virale ladingen (sectie 6.6) evenals de CD4:CD8 verhouding (sectie 5.3-5.8).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Stroom cytometry analyse wordt vaak uitgevoerd om te valideren van de zuiverheid van geïsoleerde HSCs, engraftment niveaus, profiel immuun reacties op virale infectie, evalueren en enquête kar werkzaamheid. Een typische antilichaam deelvenster bevat 4-6 individuele fluorescently gelabelde antilichamen; een cytometer van de stroom met meerdere lasers en een brede selectie van filters is dus cruciaal om accurate resultaten te behalen.
De menselijke cel graaf CD45 + kan variëren van 20% tot 80% voor een initiële engraftment validatie, en deelverzamelingen van menselijke leukocyten moeten worden weergegeven als afzonderlijke populaties op het stroom dot-perceel (Figuur 2). De verhouding van de CD4:CD8 blijft tussen 1.5 en 2.5 voor een gezonde persoon; belangrijke CD4 + uitputting wordt meestal waargenomen na virale infectie, levert een lagere ratio van CD4:CD8; en herstel van de gezonde ratio wordt nageleefd op een kar behandeling (Figuur 3).
qRT-PCR geeft een detectiegrens van 40 RNA kopieën/mL plasma; juiste verdunningen zijn vereist voorafgaand aan het experiment. Plasma virale ladingen gedetecteerd via qRT-PCR in de loop van de infectie en kar regime kunnen worden uitgezet en gebruikt voor het evalueren van de doeltreffendheid van de infectie en kar (Figuur 4).
Figuur 1. Spuit/naald instellingen voor Intrahepatische injectie.
De op maat gemaakte Hamilton 80508 spuit/naald setup bevat een 30-gauge, 51-mm lange naald met een afgeschuinde rand en een bijgevoegde 50-µL glas spuiten. Maximale geïnjecteerde volume in deze procedure is 25 µL. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. Stroom cytometry gegevens vertegenwoordigen succesvolle engraftment en de ontwikkelingen van lymfoïde en myeloïde cellen in het perifere bloed.
Succesvol bereid perifeer bloedmonsters moeten discrete bevolking scheidingen, en een goed werk hu-NSG muis moet T-cel, B-cel en monocyt positieve populaties gepresenteerd in het perifere bloed. Een grafiek van de CD4:CD8 wordt aanbevolen voor de berekening van de verhouding. een) succesvol engraftment bleek meer dan 25% CD45 + menselijk leukocyten in het perifere bloed; discrete bevolking van b) B-cellen, c) monocyten, d) T-cellen onder menselijke CD45 + leukocyte; e) CD4 + helper T-cellen en f) CD8 + cytotoxische T-cellen goed gescheiden zijn, en g) levert een ratio tussen 1.5 tot en met 2.5 in deze niet-geïnfecteerde hu-NSG. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3. CD4 + cel graaf wijzigingen in de loop van virale infectie, de kar en de kar trekken.
Naarmate de infectie vordert, neemt de CD4:CD8 verhouding af tot 1.5-2.5 naar > 1.0, CD4:CD8 verhouding heeft gediend als een klinische parameter bij de evaluatie van HIV prognose alsook behandeling efficacies. een) vertegenwoordiger stroom gegevens met vermelding van de verandering in CD4:CD8 verhoudingen in de experimentele loop; b) trend vergelijkingstabel met vermelding van de effectiviteit van kar, die kan worden geïdentificeerd als percentage van CD4 + T cellen hersteld. Detectie van CD4 + T cel graaf door stroom cytometry. N: aantal geteste muizen = 6; Foutbalken: ± SEM. betekent * p < 0,05, ** p < 0,01, ***p < 0.001, *** p < 0.0001, ns: niet significant verschillend. Two-way ANOVA-analyse wordt gebruikt. Figuur is herdrukt met toestemming22. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4. Wijzigingen van de virale RNA serum kopiëren nummers in de loop van virale infectie, wagen en kar trekken
Detectie van plasma voorjaarsviremie in de HIV-geïnfecteerde hu-NSG muizen door qRT-PCR. Het gearceerde gebied geeft aan de periode waarin de muizen kar (vanaf dag 28 tot dag 70 zoals) ontvangen. De detectiegrens (aangegeven door de gestippelde lijn) van de PCR-test is (~ 110-160 RNA kopieën/mL) in 50 tot 80 µL van plasma verkregen door middel van de ader van de staart. Sterretje (*) betekent dat virale RNA niet gedetecteerd in winkelwagen behandelde dieren bij dag 56. Serum virale RNA exemplaaraantal geanalyseerd van perifeer bloedmonsters fungeert als directe bewijs met betrekking tot de mate van virale infectie. Het moet in de overeenkomst met de CD4 flow analyse. N: aantal geteste muizen = 6; Foutbalken: ± SEM. betekent * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0.001, *** p < 0.0001, ns: niet significant verschillend. Two-way ANOVA-analyse wordt gebruikt. Figuur is herdrukt met toestemming22. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Vergelijking 1. Dosis vertaling gebaseerd op lichaamsoppervlak (BSA).
De vergelijking voor het vertalen van humane dosis te doseren tegen kleine proefdieren. De K-m -factor kan worden gevonden in tabel 2.
| Medicatie | Dagelijkse dosis (mg) |
| Tenofovir disoproxil fumaraat | 300 |
| Emtricitabine | 200 |
| Raltegravir | 800 |
Tabel 1. Dagelijkse dosis van individuele medicatie in winkelwagen regime
| Soorten | Gewicht (kg) | BSA (m2) | Km factor |
| Menselijke | |||
| Volwassene | 60 | 1.6 | 37 |
| Kind | 20 | 0.8 | 25 |
| Muis | 0.02 | 0.0007 | 3 |
Tabel 2. Gewicht, BSA en Km factor grafiek voor dosis conversie
| Reagens | Volume (μl) * | Eindconcentratie |
| 0,01% BSA in PBS | 98 | |
| 10 mg/ml mens IgG | 1 | 100 μg/ml |
| 10 mg/ml muis IgG | 1 | 100 μg/ml |
| 100 | ||
| * Recept is voor één cel monster geblokkeerd in 100 µl blokkeren cocktail. Het volume aanpassen met monster nummers. | ||
Tabel 3. Cocktail voor geïsoleerde bloedcellen blokkeren
| Antilichaam | Fluorophore | Ex. Max | Em. Max |
| CD45 | BB515 | 490 nm | 515 nm |
| CD3 | PE-Cy7 | 496 nm | 785 nm |
| CD4 | Pacific Blue | 401 nm | 452 nm |
| CD8 | BUV395 | 348 nm | 395 nm |
| CD14 | APC-Alexa 750 | 650 nm | 774 nm |
| CD19 | PE | 496 nm | 578 nm |
Tabel 4. Voorgestelde Multi-Color stroom paneel
| Voorwaartse Primer | 5'-GCCTCAATAAAGCTTGCCTTG-3 ' | |||
| Omgekeerde Primer | 5'-GGCGCCACTGCTAGAGATTTT-3 ' | |||
| Sonde * | 5'-AAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTAGTGTTGACT-3 ' | |||
| * 5'-FAM, 3'-zwart gat Quenche 1 | ||||
Tabel 5. HIV-1 LTR Primers en sonde
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Immuungecompromitteerde muizen geaccepteerd met menselijke cellen/weefsels fysiologische kenmerken van mens-achtig aanwezig en een enorme waarde voor immunologie, pathologie en pathofysiologie studies betreffende mens-specifieke ziekten. Onder meerdere muizenstammen immuungecompromitteerde, de knik. CG -PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG) model is het meest immunodeficiëntie als gevolg van het ontbreken van zowel aangeboren en adaptieve immuniteit, evenals ablated worden muis-specifieke cytokine signalering van3,,12,19 . Daarom, NSG muizen hebben uitgebreid gebruikt in de humanisering proces, en het is reeds lang gevestigd dat menselijke cellen opnieuw in de lymfkliertest perifeer bloed, lymfe en myeloïde weefsels, en dat de muizen vertonen passende menselijk immuun reacties op besmettelijke stimulaties zoals HIV27,33.
Als gevolg van de beperking van de gastheer van HIV waren preklinische dierstudies van HIV Virologie en infectie prognose eerder beperkt tot niet-menselijke primaten besmet met simian immunodeficiëntie virus (SIV, de niet-menselijke primaten versie van HIV)3. Wetenschappelijke vooruitgang in stamcelonderzoek en de generatie van NSG muizen hebben de mogelijkheid van HIV-onderzoek op kleine lymfkliertest dieren met lagere kosten en snellere experimentele omzet opengesteld. Op dit moment kan NSG humanisering worden bereikt door transplantatie van 1) foetale weefsels en menselijke HSCs (BLT model), 2) menselijke PBMCs (PGO model) en 3) menselijke HSCs (SRC model). De BLT-model biedt het hoogste engraftment efficiëntie, evenals uitgebreide ontwikkeling van beide functies lymfoïde en myeloïde34,35, maar is technisch veeleisend. Het PGO-model is het meest geschikt om vast te stellen, maar heeft een korte experimentele venster op engraftment als gevolg van GVGH; Bovendien het alleen biedt fatsoenlijk perifere reacties van T-cel en mist lymfoïde en myeloïde ontwikkeling. Om deze redenen werkzaam we het model van de SRC in dit protocol, met aanpassingen om te voldoen aan de eisen voor HIV-onderzoek. De hu-NSG-model is volledig verstoken van immune functie en efficiënt op het beenmerg homing op straling en -transplantatie; Bovendien kunnen virale uitdaging en daaropvolgende onderzoeken op een jongere leeftijd, het vermijden van de ontwikkeling van leeftijdsgebonden pathologische problemen bekend aan de achtergrond van de stam van de NOD. Hoewel T-cellen in het model hu-NSG zijn opgeleid in een serie omgeving van muis en alleen H2-beperkt zijn, kunnen meerdere, zo niet alle, deelverzamelingen van menselijke immune cellen ontwikkelen in en koloniseren muis lymfoïde en myeloïde organen. Merkbaar, is gut-geassocieerde lymfoïde weefsel van het hu-NSG-model ook gereconstitueerd met menselijke immune cellen; dus kan dit model potentieel ondersteunen HIV mucosal transmissie, vergelijkbaar met de BLT model22,23
Een van de belangrijkste belemmeringen voor uitroeiing HIV is het bestaan van een reservoir van de latentie bij patiënten behandeld met onderdrukkende kar33,36,,37,38,39. Latent geïnfecteerde cellen blijven geven en bijdragen aan HIV virale rebound bij kar geldopname. Latency reservoirs anatomisch bevinden zich in de lever, milt, hersenen en andere lymfoïde weefsels, en zijn hoofdzakelijk samengesteld uit geheugen CD4 + T-cellen36,40,41. Zoals gemeld door onze fractie, steunt de hu-NSG model ontwikkeling van de T-cel-bloedlijn, makend het geschikt voor pathologische modelleren van HIV latentie. We toonden dat dit model is zeer gevoelig aan virale infectie en vervolgens aan de kar regime via orale toediening. Dramatische virale rebound vindt onmiddellijk plaats bij kar geldopname, die steunt op het bestaan van een latency-reservoir. Latent geïnfecteerd geheugen CD4 + T-cellen kan worden geïsoleerd van lymfoïde organen van HIV-geïnfecteerde hu-NSG tijdens kar en virale uitgroei assays recapituleren virale rebound ex vivo41. De hu-NSG-model en de HIV-infectie/kar regime beschreven in dit protocol hebben dus brede toepassingen in aan HIV Virologie, infectie prognose, latency pathofysiologie en ontwikkeling van antiretrovirale therapieën gerelateerde velden.
De hu-NSG muismodel in dit protocol vereist bestraling en Intrahepatische injectie van HSCs op dag 2-3 na geboorte; in-house fok- en specifieke huisvestingsomstandigheden zijn dus vereist. Hoewel neonatale HSC-transplantatie over het algemeen hoge engraftment efficiëntie levert, in sommige gevallen kan ernstige GVGH optreden. In sommige gevallen een aanzienlijke afname van de perifere CD45 + cel tellen na infectie kan worden waargenomen en in extreme omstandigheden, perifeer bloed CD45 + uitputting kan worden waargenomen; Daarom kunnen bloedwaarden collectie en stroom cytometry uitdagend zijn. Een van de belangrijkste beperkingen van deze hu-NSG muismodel ligt binnen het chimeer karakter van de T-cellen. T-cellen in de muismodel van hu-NSG zijn opgeleid binnen de muis serie omgeving en zijn H2-beperkt in plaats van HLA-beperkt; Daarom is de volledige recapitulatie van de dynamische veranderingen van T-cel deelverzamelingen na infectie minder waarschijnlijk. Verder, hoewel de hu-NSG muismodel exposities goede gevoeligheid voor HIV-1 infectie, virale lading van de waargenomen plasma kan worden several-fold lager dan in de BLT-model, mogelijk als gevolg van onbegrijpende reconstitutie van menselijke lymfe en myeloïde functies.
Kortom biedt de muis van de hu-NSG afgebeeld in dit protocol een gemakkelijke en efficiënte methode voor het genereren van een gehumaniseerd muismodel voor HIV Virologie en latentie studies, als alternatief voor de BLT-model. Ondanks de beperkingen in uitgebreide lymfoïde en myeloïde ontwikkeling, heeft de hu-NSG-model bewezen gevoelig voor infectie en responsieve aan winkelwagen behandeling of andere therapeutics22,23,24. De latency pathologie model gevestigd volgens dit protocol recapituleert HIV virale rebound in vivo en latent besmette geheugen dat CD4 + T-cellen verder kunnen worden geïsoleerd voor extra onderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs vermelden geen belangenconflicten.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de National Institutes of Health [J.J.R. verlenen nummers R01AI29329, R01AI42552 en R01HL07470] en het National Cancer Institute van de National Institutes of Health [subsidie nummer P30CA033572 ter ondersteuning van de stad van hoop integratieve Genomics Analytische farmacologie en analytische Cytometry Cores]. De volgende reagens werd verkregen door de NIH AIDS-onderzoek en reagens referentieprogramma, divisie van AIDS, NIAID, NIH: BaL van het HIV-virus.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD34 MicroBead Kit, human | MiltenyiBiotec | 130-046-703 | |
| CryoStor CS2 | Stemcell Technologies | 07932 | |
| NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wji | The Jackson Laboratory | 005557 | Order breeders instead of experimental mice |
| IsoFlo | Patterson Veterinary | 07-806-3204 | Order through animal facility, restricted item |
| Clidox disinfectant | Fisher Sicentific | NC9189926 | |
| Wescodyne | Fisher Sicentific | 19-818-419 | |
| Hamilton 80508 syringe/needle | Hamilton | 80508 | Custom made |
| Blood collection tube (K2EDTA) | BD Bioscience | 367843 | |
| Blood collection tube (Heparin) | BD Bioscience | 365965 | |
| Capillary tube (Heparinized) | Fisher Sicentific | 22-362574 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Sigma Aldrich | 11814389001 | |
| QIAamp Viral RNA mini kit | Qiagen | 52906 | |
| TaqMan Fast VIrus 1-step Master Mix | Thermofisher | 4444434 | |
| HIV-1 P24 ELISA (5 Plate kit) | PerkinElmer | NEK050B001KT | |
| IgG from human serum | Sigma Aldrich | I4506-100MG | |
| IgG from mouse serum | Sigma Aldrich | I5381-10MG | |
| BB515 Mouse Anti-Human CD45 (clone HI30) | BD Biosciences | 564586 | RRID: AB_2732068, LOT 6347696 |
| PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD3 (Clone SK7) | BD Biosciences | 557851 | RRID: AB_396896, LOT 6021877 |
| Pacific Blue Mouse Anti-Human CD4 (Clone RPA-T4) | BD Biosciences | 558116 | RRID: AB_397037, LOT 6224744 |
| BUV395 Mouse Anti-Human CD8 (Clone RPA-T8) | BD Biosciences | 563795 | RRID: AB_2722501, LOT 6210668 |
| APC-Alexa Fluor 750 Mouse Anti-Human CD14 (TuK4) | ThermoFisher | MHCD1427 | RRID: AB_10373536, LOT 1684947A |
| PE Mouse Anti-Human CD19 (SJ25-C1) | ThermoFisher | MHCD1904 | RRID: AB_10373382, LOT 1725304B |
References
- Greiner, D. L., Hesselton, R. A., Shultz, L. D. SCID mouse models of human stem cell engraftment. Stem cells. 16 (3), 166-177 (1998).
- Rongvaux, A., et al. Development and function of human innate immune cells in a humanized mouse model. Nature. 32 (4), 364-372 (2014).
- Walsh, N. C., et al. Humanized Mouse Models of Clinical Disease. Annual review of pathology. 12, 187-215 (2017).
- Shultz, L. D., Brehm, M. A., Garcia-Martinez, J. V., Greiner, D. L. Humanized mice for immune system investigation: progress, promise and challenges. Nature reviews. Immunology. 12 (11), 786-798 (2012).
- Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature reviews. Immunology. 7, (2007).
- Moir, S., Fauci, A. S. B cells in HIV infection and disease. Nature reviews. Immunology. 9 (4), 235-245 (2009).
- McCune, J. M., et al. The SCID-hu mouse: murine model for the analysis of human hematolymphoid differentiation and function. Science. 241 (4873), 1632-1639 (1988).
- Mosier, D. E., Gulizia, R. J., Baird, S. M., Wilson, D. B. Transfer of a functional human immune system to mice with severe combined immunodeficiency. Nature. 335, 256 (1988).
- Shultz, L. D., et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. Journal of immunology. 154 (1), 180-191 (1995).
- Ohbo, K., et al. Modulation of hematopoiesis in mice with a truncated mutant of the interleukin-2 receptor gamma chain. Blood. 87 (3), 956-967 (1996).
- Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. Journal of immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).
- Ishikawa, F., et al. Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice. Blood. 106 (5), 1565-1573 (2005).
- Watanabe, Y., et al. The analysis of the functions of human B and T cells in humanized NOD/shi-scid/gammac(null) (NOG) mice (hu-HSC NOG mice). International immunology. 21 (7), 843-858 (2009).
- McDermott, S. P., Eppert, K., Lechman, E. R., Doedens, M., Dick, J. E. Comparison of human cord blood engraftment between immunocompromised mouse strains. Blood. 116 (2), 193-200 (2010).
- Mazurier, F., Doedens, M., Gan, O. I., Dick, J. E. Rapid myeloerythroid repopulation after intrafemoral transplantation of NOD-SCID mice reveals a new class of human stem cells. Nature. 9 (7), 959-963 (2003).
- Melkus, M. W., et al. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nature medicine. 12, 1316 (2006).
- Lan, P., Tonomura, N., Shimizu, A., Wang, S., Yang, Y. -G. Reconstitution of a functional human immune system in immunodeficient mice through combined human fetal thymus/liver and CD34+ cell transplantation. Blood. 108 (2), 487-492 (2006).
- Brehm, M. A., Bortell, R., Verma, M., Shultz, L. D., Greiner, D. L. Humanized Mice in Translational Immunology. Translational Immunology. , 285-326 (2016).
- King, M. A., et al. Hu-PBL-NOD-scid IL2rgnull mouse model of xenogeneic graft-versus-host-like disease and the role of host MHC. Clinical & Experimental Immunology. 157, 104-118 (2009).
- Halkias, J., et al. Conserved and divergent aspects of human T-cell development and migration in humanized mice. Immunology and cell biology. 93 (8), 716-726 (2015).
- Satheesan, S., et al. HIV replication and latency in a humanized NSG mouse model during suppressive oral combinational ART. Journal of virology. , (2018).
- Zhou, J., et al. Receptor-targeted aptamer-siRNA conjugate-directed transcriptional regulation of HIV-1. Theranostics. 8 (6), 1575-1590 (2018).
- Zhou, J., et al. Cell-specific RNA aptamer against human CCR5 specifically targets HIV-1 susceptible cells and inhibits HIV-1 infectivity. Chemistry & biology. 22 (3), 379-390 (2015).
- Brechtl, J. R., Breitbart, W., Galietta, M., Krivo, S., Rosenfeld, B. The use of highly active antiretroviral therapy (HAART) in patients with advanced HIV infection: impact on medical, palliative care, and quality of life outcomes. Journal of pain and symptom management. 21 (1), 41-51 (2001).
- Richman, D. D., Margolis, D. M., Delaney, M., Greene, W. C., Hazuda, D., Pomerantz, R. J. The Challenge of Finding a Cure for HIV Infection. Science. 323 (5919), 1304-1307 (2009).
- Pace, M. J., Agosto, L., Graf, E. H., O'Doherty, U. HIV reservoirs and latency models. Virology. 411 (2), 344-354 (2011).
- Van Herck, H., et al. Blood sampling from the retro-orbital plexus, the saphenous vein and the tail vein in rats: comparative effects on selected behavioural and blood variables. Laboratory animals. 35 (2), 131-139 (2001).
- Autissier, P., Soulas, C., Burdo, T. H., Williams, K. C. Evaluation of a 12-color flow cytometry panel to study lymphocyte, monocyte, and dendritic cell subsets in humans. Cytometry. 77 (5), 410-419 (2010).
- Lu, W., Mehraj, V., Vyboh, K., Cao, W., Li, T., Routy, J. -P. CD4:CD8 ratio as a frontier marker for clinical outcome, immune dysfunction and viral reservoir size in virologically suppressed HIV-positive patients. Journal of the International AIDS Society. 18, 20052 (2015).
- van't Wout, A. B., Schuitemaker, H., Kootstra, N. A. Isolation and propagation of HIV-1 on peripheral blood mononuclear cells. Nature protocols. 3, 363 (2008).
- Reagan-Shaw, S., Nihal, M., Ahmad, N. Dose translation from animal to human studies revisited. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 22 (3), 659-661 (2008).
- Han, Y., Wind-Rotolo, M., Yang, H. -C., Siliciano, J. D., Siliciano, R. F. Experimental approaches to the study of HIV-1 latency. Nature reviews. Microbiology. 5 (2), 95-106 (2007).
- Marsden, M. D., et al. HIV Latency in the Humanized BLT Mouse. Journal of virology. 86 (1), 339-347 (2012).
- Karpel, M. E., Boutwell, C. L., Allen, T. M. BLT humanized mice as a small animal model of HIV infection. Current opinion in virology. 13, 75-80 (2015).
- Durand, C. M., Blankson, J. N., Siliciano, R. F. Developing strategies for HIV-1 eradication. Trends in immunology. 33 (11), 554-562 (2012).
- Van Lint, C., Bouchat, S., Marcello, A. HIV-1 transcription and latency: an update. Retrovirology. 10, 67 (2013).
- Xu, L., Zhang, Y., Luo, G., Li, Y. The roles of stem cell memory T cells in hematological malignancies. Journal of hematology & oncology. 8, 113 (2015).
- Chun, T. -W., Moir, S., Fauci, A. S. HIV reservoirs as obstacles and opportunities for an HIV cure. Nature immunology. 16 (6), 584-589 (2015).
- Redel, L., et al. HIV-1 regulation of latency in the monocyte-macrophage lineage and in CD4+ T lymphocytes. Journal of leukocyte biology. 87 (4), 575-588 (2010).
- Laird, G. M., et al. Rapid Quantification of the Latent Reservoir for HIV-1 Using a Viral Outgrowth Assay. PLoS pathogens. 9 (5), e1003398 (2013).
