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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Humanisierten NOD/SCID/IL2rγnull (Hu-NSG) Maus-Modell für HIV-Replikation und Latenz-Studien

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58255
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1, 1
1Department of Molecular and Cellular Biology, Beckman Research Institute of City of Hope, 2Irell and Manela Graduate School of Biological Sciences, Beckman Research Institute of City of Hope

Summary

Dieses Protokoll stellt eine Methode zum humanisierten Mäuse (Hu-NSG) schaffen über intrahepatischen Injektion von humanen hämatopoetischen Stammzellen in Strahlung bedingt neonatale NSG Mäuse. Die Hu-NSG-Maus ist anfällig für HIV-Infektion und kombinatorische antiretrovirale Therapie (cART) und dient als ein geeignetes pathophysiologischen Modell für HIV-Replikation und Latenz-Untersuchungen.

Abstract

Ethischen Vorschriften und technischen Herausforderungen für die Forschung in menschliche Pathologie, Immunologie und therapeutische Entwicklung haben kleiner Tiermodelle in der hohen Nachfrage gelegt. Mit einer genetischen und Verhaltensstörungen Ähnlichkeit mit Menschen sind kleine Tiere wie der Maus gute Kandidaten für menschliche Krankheitsmodelle, durch die menschlich-wie Symptome und Antworten zusammengefaßt werden können. Darüber hinaus kann Maus genetischen Hintergrund geändert werden, um unterschiedlichen Anforderungen gerecht. Die NOD/SCID/IL2rγnull (NSG) Maus ist eines der am weitesten verbreitete immungeschwächten Mausstämme; Es ermöglicht Engraftment mit humanen hämatopoetischen Stammzellen und/oder menschlichem Gewebe und die anschließende Entwicklung eines funktionellen menschlichen Immunsystems. Dies ist ein entscheidender Meilenstein in der Prognose und Pathophysiologie des Mensch-spezifische Krankheiten wie HIV/AIDS zu verstehen und unterstützen die Suche nach einem Heilmittel. Hier berichten wir über ein detailliertes Protokoll zur Erzeugung von einem humanisierten Mausmodell der NSG (Hu-NSG) von hämatopoetischen Stammzelltransplantation in eine Strahlung bedingt neonatale NSG Maus. Die Hu-NSG-Maus-Modell zeigt Multi-Linie Entwicklung der transplantierten Stammzellen und die Anfälligkeit für virale Infektion HIV-1. Es fasst auch wichtige biologische Eigenschaften als Reaktion auf kombinatorische antiretrovirale Therapie (cART).

Introduction

Denn Festlegung geeigneter Tiermodelle für menschliche Krankheiten Schlüssel zur Suche nach einem Heilmittel, wurden entsprechende Tiere Modelle lange verfolgt und im Laufe der Zeit verbessert. Mehrere Stämme von immungeschwächten murinen Modelle wurden entwickelt, die das Engraftment von menschlichen Zellen bzw. Gewebe und die anschließende Ausführung von humanisierten Funktionen1,2zulassen. Solchen humanisierte Mausmodelle sind entscheidend für Untersuchungen von Mensch-spezifische Krankheiten3,4,5.

Acquired Immune Deficiency Syndrome (AIDS) durch Infektion mit dem Human Immunodeficiency Virus (HIV) ist ein Beispiel. Vor der Gründung der humanisierte Mausmodelle beschränkt ethischen und technische Einschränkungen HIV/AIDS präklinische tierexperimentellen Studien an nicht-humanen Primaten3. Allerdings behindern die hohen Kosten und Anforderungen für Spezialbehandlungen für solche Tier HIV/AIDS Studien in typischen akademischen Umfeld. Vor allem HIV infiziert menschliche CD4 + T-Zellen und wirkt sich auf die Entwicklung und die Immunantwort von anderen menschlichen Immunzellen wie B-Zellen, Makrophagen und dendritischen Zellen6; gefragt sind daher kleiner Tiermodelle mit funktionalen menschlichen Immunsystem transplantiert.

Einen Durchbruch im Jahr 1988, als CB17 -scid -Mäuse mit einer Prkdcscid -Mutation entwickelt wurden und zeigte erfolgreiche Engraftment des menschlichen Immunsystems1. Der Prkdcscid -Mutation resultiert Defekte T - und B-Zell-Funktionen und eine Ablation adaptiven Immunsystems bei Mäusen, wodurch das Engraftment des menschlichen peripheren Mononukleäre Zellen (PBMCs), hämatopoetischen Stammzellen (HSCs), Blut und fetalen hämatopoetischen Geweben7,8. Dennoch werden geringe Mengen an Engraftment häufig in diesem Modell beobachtet; mögliche Ursachen sind 1) verbleibende angeborene Immunaktivität moduliert über natürliche Killer (NK)-Zellen und (2) der späten Entwicklung der Maus T - und B-Zellen (Undichtigkeit)5. Die spätere Entwicklung der nicht-adipösen Diabetiker (NOD)-scid -Maus-Modell erreicht dramatische Down-Regulierung von NK-Zell-Aktivität; so ist es in der Lage, ein höheres Niveau und weitere nachhaltige Engraftment des menschlichen Immunsystems Komponenten9zu unterstützen. Weiter zu unterdrücken oder hemmen die Entwicklung der angeborenen Immunität, Maus-Modellen (NOD) abschneiden oder total KO von Interleukin-2 Rezeptor γ-Kette (Il2rg) eingedenk -scid Hintergrund entstanden. Il2rg, auch bekannt als gemeinsame Zytokin-Rezeptor γ-Kette, ist ein unverzichtbarer Bestandteil von verschiedenen Zytokin-Rezeptoren10,11,12,13. Stämme wie NICKEN. CG -PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG) und NODShi.Cg -PrkdcscidIl2rgtm1Sug (NOG) präsentieren Sie robuste Störung der Maus Cytokine signaling und vollständige Abtragung der NK-Zell-Entwicklung, Zusätzlich zu schwerer Beeinträchtigung der adaptiven Immunität14,15,16.

Drei humanisierte Mausmodelle trägt ein scid -Mutation und Il2rg Knockout werden häufig eingesetzt, in HIV/AIDS-Forschung: der BLT (Knochenmark, Leber, Thymus) Modell, das PBL (periphere Blut Leukozyten) Modell und das SRC (SCID Repopulating Zelle) Modell 3. der BLT-Modell wird über chirurgische Transplantation von menschlichen fetalen Leber und Thymus unter der Maus Niere Kapsel begleitet mit intravenöser Injektion der fetalen Leber HSCs3,17,18erstellt. Die BLT-Maus-Modell bietet hohe Engraftment Wirksamkeit, Entwicklung menschlicher hämatopoetischen Zellen in allen Linien und Etablierung eines starken menschlichen Immunsystems; Zusätzlich T-Zellen sind in einem menschlichen autologen Thymus ausgebildet und weisen HLA-eingeschränkten Immunantwort4,5,17,19. Die Forderung nach chirurgischen Eingriffen bleibt jedoch den großen Nachteil das BLT-Modell. Die PBL-Maus-Modell wird durch intravenöse Injektion mit menschlichen peripheren lymphatischen Zellen aufgebaut. Das PBL-Modell bietet Komfort und erfolgreiche T-Zell-Engraftment ergibt, aber seine Anwendung ist begrenzt aufgrund unzureichender B-Zell und myeloische Zellen Engraftment, niedrige Engraftment Ebenen insgesamt und das Auftreten von schweren Graft - Versus - Host-Seuche (GVHD)3 ,20. Die SRC-Maus-Modell wird durch Injektion von menschlichen HSCs in Neugeborenen oder jungen Erwachsenen SCID Mäuse hergestellt. Es weist durchschnittliche Engraftment Effizienz über 25 % (gemessen als peripheren Blut CD45 Prozentsatz) und unterstützt die Entwicklung der Multiple-Linie des injizierten HSCs und die Ausarbeitung eines angeborenen menschlichen Immunsystems. Die Beschränkung der SRC-Modells ist jedoch, dass die T-Zell-Antwort ist Maus H2 statt menschliche HLA-eingeschränkten14,21beschränkt.

Die SRC-Maus-Modell gilt als einfache und zuverlässige Vorbild für präklinische HIV/AIDS kleine Tierstudien, veranschaulicht durch die konsequente Engraftment eines menschlichen Immunsystem und erfolgreiche hämatopoetischen Entwicklung. Wir zuvor berichtet die Errichtung einer NSG Hu-SRC-SCID (Hu-NSG) Maus-Modell und seine Anwendung in der HIV-Replikation und Latenz Studien22,23,24beschrieben. Diese Hu-NSG Mausmodell weist hohe Knochenmark Homing, Anfälligkeit für eine HIV-Infektion und Reprise der HIV-Infektion und Pathogenese. Darüber hinaus die Hu-NSG-Maus-Modell reagiert angemessen auf kombinatorische antiretrovirale Therapie (cART) und rekapituliert Plasma viralen Rebound nach Warenkorb Zurücknahme, bestätigt die Gründung einer HIV Latenz Reservoir25,26 ,27. Diese HIV-Latenz-Reservoir ist weiter durch die Produktion von Replikation-kompetente HIV Viren Ex Vivo induziert durch menschliche ruhenden CD4 + T-Zellen isoliert von infizierten und Wagen behandelt Hu-NSG Mäuse belegt.

Hier beschreiben wir das ausführliche Protokoll für Einrichtung von Hu-NSG-Maus-Modell von Neugeborenen NSG-Mäusen, einschließlich der Verfahren im Zusammenhang mit HIV-Infektion und Karren Behandlung für Latenz-Entwicklung. Wir erwarten, dass dieses Protokoll eine Reihe neue Ansätze in HIV tierexperimentellen Studien bezüglich HIV Virologie, Latenz und Behandlung anbieten.

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Protocol

Alle Tierpflege und Verfahren wurden nach Protokollen überprüft und genehmigt durch die Stadt der Hoffnung institutionelle Tier Pflege und Nutzung Committee (IACUC) im Besitz der principal Investigator der Studie (Dr. John Rossi, IACUC #12034) durchgeführt. Menschlichen fetalen Lebergewebe wurde von Advanced Bioscience Resources (Alameda, CA), eine gemeinnützige Organisation, Bundes- und einzelstaatlichen Vorschriften erhalten. Der Lieferant hat seine eigenen institutionellen Review Board (IRB) und ist kompatibel mit menschlichen Subjekts Schutzanforderungen. Menschlichen PBMCs sind isoliert aus ausrangierten peripherem Blutproben von anonymen gesunden Spendern von City of Hope Blood Donor Center (Duarte, CA), mit keine Kennzeichnung bezüglich Alter, Rasse, Geschlecht oder ethnischer Zugehörigkeit. IRB #/ REF #: 97071/075546

1. aseptische Allgemeinmedizin

  1. Durchführen Sie Gewebekultur Experimente in den dafür vorgesehenen Laminar-Flow Schränken.
  2. Gewebekultur Medium und Ergänzungen unter sterilen Bedingungen halten und Filtern mit 0,22 µm Filtrierung Einheit Prior um zu verwenden.
  3. Bewahren Sie vorbereitete menschlichen HSCs in sterilen Röhrchen zu und auf Eis bis Injektion.
  4. Als Folge der schweren Immunschwäche behandeln Sie NSG Mäuse aseptisch. Tragen Sie ein Einweg-Chirurgie-Kleid, Haare Kappe, Gesichtsmaske, Überschuhe und Handschuhe um Kontaminationen zu vermeiden. Desinfizieren Sie die Arbeitsfläche, Bestrahlung Halter und Induktion Kammer für Anästhesie mit Chlor Dioxid Basis Sterilisationsmittel (z.B.Clidox), vor und nach der Experimente.
  5. Auftragen Sie Erdöl-basierten Augensalbe nach Retro-Orbital Blutungen um zu verhindern, dass trockene Augen.
  6. Ändern Sie auf Antibiotika-haltige Ernährung zur Vorbeugung von Infektionen durch Retro-Orbital Blutungen.

2. Umgang mit HIV-Virus infizierten Nagetieren und Virus-haltigen Blut/Gewebeproben

Achtung: HIV ist ein Klasse 3 menschliche Krankheitserreger; die Umgang mit Regeln müssen genau befolgt werden.

  1. HIV Virus-haltigen Proben in einer dafür vorgesehenen BSL2 Griff + / 3 Laborfläche. Virus-haltigen Reagenzien sicher in einem sekundären Behälter während des Transports zu sperren. Desinfizieren Sie die äußere Oberfläche aller Container durch gründlich abwischen mit 10 % Bleichmittel und Isopropanol vor dem Transport.
  2. Halten Sie alle Virus-haltige Abfälle in die dafür vorgesehenen Abfallbehälter mit 2-3 Schichten von biogefährlichen Müllbeutel. Desinfizieren Sie vor der Entsorgung durch großzügig besprühen die Abfälle mit Jod/Ethoxylated Nonylphenol Lösung (z.B. Wescodyne) und Autoklaven.
  3. Persönlichen Schutzausrüstung zu tragen: Haare Kappe, Gesicht zu bedecken, Spritzschutz Gesichtsschutz, Überschuhe, Einweg-Chirurgie Kleid und Doppelschicht-Handschuhe.
  4. Infizierten Nagetieren mit äußerster Vorsicht zu behandeln. Durchführen Sie Injektionen und Blut Sammlungen, während Mäuse unter Narkose (Schritte 5.1-5.2, 6,3-6,5, 7.3 und 8.1-8.2) sind.

3. Isolation von hämatopoetischen Stammzellen

  1. Gewebe-Verdauung Kollagenase/Dispase Lösung vorbereiten.
    1. Lösen Sie Kollagenase/Dispase Pulver in einer Konzentration von 100 mg/mL Stammlösung zu, und speichern Sie Kollagenase/Dispase-Stammlösung in 150 µL-Aliquots bei-20 ° C.
    2. Verdünnen Sie für die Arbeit Kollagenase Lösung 150 µL Kollagenase/Dispase Lager mit 15 mL RPMI 1640 mit 10 % FCS und 1 % Penicillin/Streptomycin ergänzt.
      Hinweis: Die Endkonzentration von Kollagenase/Dispase für Gewebe Verdauung ist 1 mg/mL.
  2. Geschnitten Sie mit einer sterilen Rasierklinge fetale Lebergewebe (16-24 Wochen Schwangerschaft) in kleine Stücke (ca. 2-3 mm3 in der Größe) gefolgt von Verdauung mit Kollagenase/Dispase Lösung (1 mg/mL) für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Stellen Sie die Lautstärke der Aufschlusslösung, sodass alle Gewebe Stücke vollständig eingetaucht sind. Verwenden Sie das hintere Ende der Spritzenkolben vorsichtig Schleifen die Gewebeprobe um die Verdauung zu erleichtern.
  3. Durchlaufen Sie die Verdauung Mischung eine 70 µm sterile Nylon Siebfilter, eine einzelne Zelle Aussetzung zu erwerben.
  4. CD34 + HSCs mit einem Mac-System pro Anweisungen des Herstellers zu bereichern.
  5. Zählen Sie den lebensfähigen Prozentsatz der angereicherten CD34 + HSCs mit einem Hemacytometer28 und fahren Sie mit intrahepatischen Injektion in Neugeborenen NSG Mäuse.
  6. Frieren Sie der verbleibenden angereicherten CD34 + HSCs in Medien (z. B.CryoStor CS2) Einfrieren ein und konservieren Sie Zellen in einem flüssigen Stickstoff-Tank. Erzählen Sie bei der zukünftigen Verwendung die tragfähigen Prozentsatz der aufgetauten CD34 + HSCs vor der Injektion. Mit dem Einsatz des Einfrierens Medien ist nach dem Tauwetter-Lebensfähigkeit zwischen 80 bis 90 %.

(4) intrahepatischen Injektion von menschlichen CD34 + HSCs bei Neugeborenen NSG Mäusen

Hinweis: Neonatale NSG Mäuse sind 2-3 Tage von der Geburt am besten geeignet für dieses Verfahren sind stark genug, um die Bestrahlung bei halb-tödliche Dosis, während jung genug, um völlig Immunsystem beeinträchtigt zu ertragen. Keine Anästhesie ist erforderlich für die HSC-Injektion.

  1. Legen Sie die ganze Wurf von Neugeborenen NSG-Mäusen (in der Regel 5 bis 10 Mäuse, beide Geschlechter) in einem sterilen Kuchen-förmigen Bestrahlung Käfig und setzen Sie eine Gesamtdosis von 200-250 cGy Gammastrahlen-Strahlung aus einer Strahlungsquelle Cäsium-137. Gewährleisten Sie, dass die Strahlendosis innerhalb des Bereichs liegt, da erheblichen Gewichtsverlust oder sogar zum Tod beobachtet werden kann als NSG Mäuse, hochdosierte Bestrahlung ausgesetzt sind. 12
    Hinweis: Strahlung ist eine Gefahr für die Gesundheit, persönlichen Strahlenschutz getroffen werden.
  2. Nach Bestrahlung, Spritzen jeder Neugeborenen NSG-Maus mit 5 x 105 lebensfähigen menschlichen CD34 + HSCs mit einer Spritze/Nadel-Setup (Abbildung 1). Injizieren Sie Zellen in der Leber direkt.

5. Engraftment Validierung durch Retro-Orbital Blutungen und Flow Cytometry Analysis

  1. 10-12 Wochen Post-HSC-Injektion betäuben Sie Mäuse verwenden ein Isofluran/Sauerstoff-Inhalation-Apparat. Passen Sie die Sauerstoffzufuhr um Isofluran bei 4-5 % beizubehalten. Betäubung dauert ca. 3-5 Minuten, je nach individuellen Maus. Richtig narkotisierten Mäuse zeigen eine langsame und tiefe Atmung und keine Reaktion auf die Zehe kneifen Stimulation.
  2. Sammeln Sie 50-100 µL des peripheren Blutes aus jeder Maus durch Retro-Orbital Probenahme28. Speichern Sie Blutproben in K2EDTA oder heparinisierten Blutentnahmeröhrchen Gerinnung zu verhindern.
    Hinweis: Blutentnahmeröhrchen sind verpflichtet, blutgerinnungshemmende Beschichtung haben, so dass Maus PBMCs von Vollblut für Flow-Zytometrie Analyse isoliert werden können. EDTA ist bekanntermaßen enzymatische Reaktionen wie PCR und qRT-PCR hemmen; Also, wenn nachgeschaltete enzymatische Reaktionen erforderlich sind, benutzen Sie eine heparinisierten Blut Sammlung Gerät.
  3. Zentrifugieren Sie für 20 Minuten bei 4 ° C zu Blutzellen Pellets Blutproben bei 2.000 x g.
    1. Übertragen Sie die Überstände Plasma nach Zentrifugation und Store bei-80 ° C an neuen Mikrozentrifugenröhrchen, wenn Zytokin Analyse erforderlich ist.
    2. Lyse der roten Blutkörperchen (Erythrozyten) innerhalb der Blutkörperchen Pellet bei Raumtemperatur für 10 Minuten mit roten Blutzelle Lysis Puffer (Table of Materials).
      Hinweis: Wenn Plasma-Proben nicht erforderlich sind, lysieren Sie direkt Vollblut mit Lyse Lösung ohne Zentrifugation.
  4. Pellet-übrigen Blutzellen nach RBC Lyse bei 300 X g für 5 Minuten bei 4 ° C; den Überstand abgesaugt. Waschen Sie die Zelle-Pellets mit 0,01 % BSA mit DPBS, Zentrifuge bei 300 X g für 5 Minuten bei 4 ° C und aspirieren Sie überstand. Wiederholen Sie die Wäsche noch einmal.
  5. Block-Zellen mit 100 µL 1 X blockieren cocktail (Tabelle 3 für Rezept) 20 min bei 4 ° C.
  6. Nach der Blockierung, direkt jeder Antikörperlösung in die Zellsuspension in einer Konzentration von 2 µL/106 Zellen hinzufügen und 30 Minuten bei 4 ° C inkubieren. Antikörper für Engraftment Validierung sind: Anti-Human CD45 (Leukozyten, RRID: AB_2732068), Anti-Human CD3 (T-Zellen, RRID: AB_396896), Anti-Human CD4 (Helfer T-Zellen, RRID: AB_397037), Anti-Human CD8 (zytotoxische T-Zellen, RRID: AB_2722501), Anti-Human CD14 (Monozyten, RRID: AB_10373536), und Anti-Human CD19 (B-Zellen, RRID: AB_10373382). Empfohlene Flow Panel entnehmen Sie bitte Tabelle 4 und Tabelle der Materialien für die Katalognummern, RRIDs und Chargennummern.
    Hinweis: Antikörper Färbung in blocking-Lösung eliminiert unspezifische Bindung der Antikörper Anti-Human in Richtung Maus Oberflächenmarker, als mehrere Oberflächenmarker teilen Homologie zwischen Mensch und Maus.
  7. Isolieren Sie menschlichen PBMCs von gesunden Spendern zu und bereiten Sie Single-gefärbten Flow Cytometry Entschädigung Steuerelemente mit gereinigtem menschlichen PBMCs. Alternativ, verwenden Sie Fluoreszenz-markierten Mikrosphären, als Entschädigung29kontrolliert.
  8. Die peripheren Blutproben mit einem Durchflusszytometer analysieren und den Prozentsatz der menschlichen CD45 + Zellen, CD3 + Zellen, menschlichen CD14 + Zellen und menschliche Zellen CD19 + vom totalen peripheren Blutzellen zu quantifizieren.
    1. Für nachgeschaltete HIV-Infektion und Latenz Studien Berechnung des Prozentsatzes der CD4 + T-Zellen und CD8 + T-Zellen innerhalb der CD3 + Zellen.
      Hinweis: In der Regel wird ein CD4:CD8 Verhältnis zwischen 1,5 und 2,5 vor HIV-Infektion30beobachtet.

6. Analyse der HIV-Infektion von Hu-NSG Mäusen und Plasma-Viruslast mittels qRT-PCR

  1. HIV-BaL virale bestand im menschlichen PBMCs von gesunden Spendern zu propagieren, geerntet am 10. Tag nach der Infektion und titrieren mit p24 ELISA kit31.
  2. Wählen Sie Hu-NSG Mäuse mit mehr als 20 % Zellen menschlichen CD45 + im peripheren Blut HIV-Infektion.
  3. Hu-NSG Mäuse verwenden ein Isofluran/Sauerstoff-Inhalation-Apparat (Schritt 5.1) zu betäuben.
  4. Nach der Bestätigung Tier betäubt ist, injizieren BaL HIV Virus bei einer Dosis von 200 ng von p24 per Mausklick durch intraperitoneale Route.
    Hinweis: Seien Sie extrem vorsichtig mit der Nadel, nicht wiederverwenden Sie, Nadeln, und sofort nach Gebrauch in bestimmten scharfe Behälter entsorgen. Bereich der Injektion nach Virus-Verabreichung zu desinfizieren.
  5. Drei Wochen nach der Infektion, Hu-NSG Mäuse zu betäuben und peripherem Blut durch Retro-Orbital sammeln Blutungen mit heparinisierten Kapillare und Röhrchen.
  6. Separate Plasma und Blutzellen durch Zentrifugation bei 2.000 x g für 20 Minuten.
  7. Lyse der Erythrozyten. Block und Flecken übrigen Blutzellen mit Antikörpern für Flow-Zytometrie-Analyse (Abschnitt 5.3-5.8).
    Hinweis: Flow-Zytometrie-Analyse sollte im Mittelpunkt CD4:CD8 Verhältnis zu vergleichen, vor und nach der Infektion. Signifikante Abnahme der CD4 + Zellzahl wird erwartet, da die CD4 Antigen dient als ein Ko-Rezeptor für virale Eintrag.
  8. Verwendung Plasma-Proben zu analysieren, das HIV Virus laden mittels qRT-PCR. Virale RNA von Plasmaproben mit einem viralen RNA Mini-Kit zu isolieren. Führen Sie qRT-PCR mit HIV-1 LTR-spezifische Primer und Sonde setzt (Sequenz Details in Tabelle 5), Protokoll des Herstellers verwenden.

7. orale Verabreichung von cART und Validierung der virale Suppression (optional)

Hinweis: Dieser Schritt ist optional für Untersuchungen zur HIV-Prognose, Virologie oder Infektion-bezogenen Pathophysiologie während der akuten Infektionsphase. Warenkorb-Behandlung von HIV-infizierten Hu-NSG wird verwendet, um HIV-Latenz bei menschlichen Patienten, die Karre zu rekapitulieren. Hu-NSG erfolgreich HIV-infizierte Mäuse sind Warenkorb für 4 Wochen gegeben. Die Warenkorb-Therapie besteht aus Tenofovir Disoproxil Fumarat (TDF, 300 mg/Kapsel), Emtricitabin (FTC; 200 mg/Kapsel) und Raltegravir (RAL; 400 mg/Kapsel). Die Dosis von Wagen für die Behandlung von HIV-infizierten Hu-NSG Mäuse ist je nach Körper Fläche (Tabelle 1, Formel 1, Tabelle 2)32angepasst.

  1. Berechnen Sie die Höhe der jedes Medikament für jeden Käfig während einer Woche der Behandlung, unter Berücksichtigung der Volumen der Flasche Wasser, die Anzahl der Mäuse in jedem Käfig und einer durchschnittlichen täglichen Wasseraufnahme von 4 mL pro Maus erforderlich.
    Hinweis: Der entscheidende Punkt in diesem Schritt soll sicherstellen, dass jede Maus seine tägliche Dosis innerhalb von 4 mL Trinkwasser erwirbt.
  2. Alle drei Medikamente mit angepassten Dosen zu feinen Pulver mahlen und löst die Pulvermischung in gesüßtem Wasser (z. B. Medidrop Suralose). Ändern Sie die Flasche Wasser jede Woche mit frisch gelöster Warenkorb Cocktail in gesüßtem Wasser geliefert.
    Hinweis: Das Medikament Pulver kann nicht sofort auflösen, kräftig schütteln, um eine homogene Suspension zu erreichen, bevor Sie wieder die Flasche an den Käfig halten.
  3. Sammeln Sie peripheren Blutproben über Retro-Orbital Blutungen alle zwei Wochen und analysieren Sie sowohl das CD4:CD8 Verhältnis mittels Durchflusszytometrie (Abschnitt 5.3-5,8) und der Plasma-Viruslast mittels qRT-PCR (Ziffer 6.6).
    Hinweis: In der Regel nach 4 Wochen der Behandlung, die Plasma-Viruslast sinkt auf unter der Nachweisgrenze und eine typische CD4:CD8-Verhältnis wird wiederhergestellt.

8. Bewertung der viralen Rebound auf Warenkorb Widerrufsrecht (optional)

Hinweis: Dieser Schritt ist entscheidend für die Validierung der Latenz-Modells, da viralen Rebound nach Zurücknahme der Warenkorb direkte Beweise für eine Latenz-Reservoir bietet. Es wird auch empfohlen, als ein Kontrollexperiment für therapeutische Untersuchungen auf HIV Rebound Suppressants dienen.

  1. Planen Sie für den Warenkorb Rückzug nach Plasma-Viruslast aus peripherem Blutproben unterhalb der Nachweisgrenze sind und das CD4:CD8 Verhältnis in einem Bereich zwischen 1,5 und 2,5 wiederhergestellt wird.
  2. Sammeln Sie peripheren Blutproben durch Retro-Orbital Blutungen alle 2 Wochen nach Abzug der Warenkorb. Verfolgen Sie die Änderung im Plasma-Viruslast (Ziffer 6.6) sowie das CD4:CD8 Verhältnis (Abschnitt 5.3-5.8).

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Representative Results

Flow-Zytometrie-Analyse wird häufig durchgeführt, um die Reinheit der isolierten HSCs zu validieren, Engraftment Ebenen, Profil Immunantwort auf virale Infektion, zu bewerten und Übersicht Warenkorb Wirksamkeit. Eine typische Antikörper-Panel enthält 4-6 individuelle Eindringmittel beschriftete Antikörper; Daher ist ein Durchflusszytometer mit mehreren Lasern und eine große Auswahl an Filter entscheidend, um genaue Ergebnisse zu erzielen.

Für die ersten Engraftment Validierung die menschlichen CD45 + Zellzahl kann zwischen 20 % und 80 %, und Teilmengen von menschlichen Leukozyten sollte erscheinen als diskreten Populationen auf dem Fluss Dot-Plot (Abbildung 2). Ein gesunder Mensch bleibt das Verhältnis der CD4:CD8 zwischen 1,5 und 2,5; bedeutende CD4 + Erschöpfung wird in der Regel auf virale Infektion, wodurch ein niedrigeres Verhältnis der CD4:CD8 beobachtet; und Wiederherstellung des gesunden Verhältnisses auf Warenkorb Behandlung (Abbildung 3) beobachtet.

qRT-PCR gibt eine Nachweisgrenze von 40 RNA Kopien/mL Plasma; richtige Verdünnungen sind erforderlich ist, bevor das Experiment. Plasma-Viruslast nachgewiesen mit qRT-PCR im Verlauf der Infektion und Warenkorb-Therapie können geplottet und verwendet, um die Effizienz der Infektion und Karren (Abbildung 4) zu bewerten.

Figure 1
Abbildung 1. Spritze/Nadel Setup für intrahepatischen Injektion verwendet.
Die maßgeschneiderte Hamilton 80508 Spritzennadel/Setup enthält eine 30-Gauge, 51 mm lange Nadel mit einer abgeschrägten Kante und einer angehängten 50 µL Glasspritze. Maximale Injektionsvolumen in diesem Verfahren ist 25 µL. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2. Flow Cytometry Daten stehen für erfolgreiche Engraftment und die Entwicklungen der lymphatischen und myeloischen Zellen im peripheren Blut.
Erfolgreich vorbereitet peripheren Blutproben sollten diskrete Bevölkerung Trennungen, und eine gut eingepflanzt Hu-NSG-Maus sollte T-Zellen, B-Zell und Monocyte positive Populationen im peripheren Blut vorgestellt haben. Ein CD4:CD8-Diagramm wird für Verhältnisberechnung empfohlen. ein) erfolgreiche Engraftment zeigte mehr als 25 % CD45 + menschlichen Leukozyten im peripheren Blut; diskrete Bevölkerung der b) B-Zellen, c) Monozyten, d) T-Zellen unter humanen CD45 + Leukozyten; e) Helfer CD4 + T-Zellen und f) CD8 + zytotoxische T-Zellen gut voneinander getrennt sind, und g) ergibt sich ein Verhältnis von 1,5 bis 2,5 in dieser nicht infizierten Hu-NSG. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3. CD4 + Zellen zählen Änderungen im Laufe der Virusinfektion, Karren und Wagen zurückzuziehen.
Als Infektion fortschreitet, verringert sich das CD4:CD8-Verhältnis von 1,5-2,5 bis > 1.0, CD4:CD8 Verhältnis hat gedient, als klinische Parameter bei der Bewertung von HIV Prognose sowie Behandlung Wirksamkeiten. ein) repräsentative Daten zeigt die Veränderung der CD4:CD8 Verhältnisse im experimentellen Verlauf; b) Trend Vergleichstabelle zeigt die Wirksamkeit der Karren, der als erkennbar sind restauriert Anteil der CD4 + T-Zellen. Erkennung von CD4 + T-Zellzahl von Durchflusszytometrie. N: Anzahl der getesteten Mäuse = 6; Fehlerindikatoren: ± SEM bedeutet * p < 0,05, ** p < 0,01, ***p < 0,001, *** p < 0,0001, ns: keine nennenswerten anders. Zwei-Wege-ANOVA-Analyse beschäftigt. Abbildung ist mit Erlaubnis22abgedruckt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4. Änderungen der viralen RNA Serum kopieren Sie zahlen im Laufe der Virusinfektion, Karren und Wagen zurückziehen
Erkennung von Plasma Virämie in den Hu-NSG HIV-infizierten Mäusen durch qRT-PCR. Der schattierte Bereich zeigt den Zeitraum, während dessen die Mäuse Wagen (ab Tag 28 bis 70 Tag wie gezeigt) erhalten. Der Nachweisgrenze (angegeben durch die gestrichelte Linie) des PCR-Assays ist (~ 110-160 RNA Kopien/mL) in 50 bis 80 µL des Plasmas durch die Rute Vene erhalten. Stern (*) steht für virale RNA im Warenkorb behandelt Tiere am Tag 56 nicht erkannt. Serum virale RNA Exemplarzahl analysiert aus peripherem Blutproben dient als direkte Hinweise auf den Grad der viralen Infektion. Es sollte in der Vereinbarung mit der CD4-Flow-Analyse sein. N: Anzahl der getesteten Mäuse = 6; Fehlerindikatoren: ± SEM bedeutet * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, *** p < 0,0001, ns: keine nennenswerten anders. Zwei-Wege-ANOVA-Analyse beschäftigt. Abbildung ist mit Erlaubnis22abgedruckt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Equation
Gleichung 1. Dosis Übersetzung basiert auf der Körperoberfläche (BSA).
Gleichung für die Übersetzung von menschlichen Dosis, Dosierung gegen kleine Versuchstiere. Die K-m -Faktor finden Sie in Tabelle 2.

Medikamente Tägliche Dosis (mg)
Tenofovir Disoproxil Fumarat 300
Emtricitabin 200
Raltegravir 800

Tabelle 1. Tagesdosis von einzelnen Medikamenten in Warenkorb Therapie

Arten Gewicht (kg) BSA (m2) K-m -Faktor
Menschlichen
Erwachsenen 60 1.6 37
Kind 20 0,8 25
Maus 0.02 0.0007 3

Tabelle 2: Gewicht, BSA und Km für Dosis Umwandlung Faktor Diagramm

Reagenz Volumen (μl) * Endkonzentration
0,01 % BSA mit PBS-Puffer 98
10 mg/ml Human IgG 1 100 μg/ml
10 mg/ml Maus IgG 1 100 μg/ml
100
* Rezept ist für eine Zellprobe in 100 μl blocking cocktail blockiert. Stellen Sie die Lautstärke entsprechend mit Probennummern.

Tabelle 3. Cocktail für isolierten Blutzellen blockiert

Antikörper Fluorophor Beispiel: Max EM. Max
CD45 BB515 490 nm 515 nm
CD3 PE-Cy7 496 nm 785 nm
CD4 Pacific Blue 401 nm 452 nm
CD8 BUV395 348 nm 395 nm
CD14 APC-Alexa 750 650 nm 774 nm
CD19 PE 496 nm 578 nm

Tabelle 4. Multi-Color Flow Panel vorgeschlagen

Forward Primer 5'-GCCTCAATAAAGCTTGCCTTG-3 "
Rückwärts-Primer 5'-GGCGCCACTGCTAGAGATTTT-3 "
Sonde * 5'-AAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTAGTGTTGACT-3 "
* 5'-FAM, 3'-Schwarzes Loch Quenche 1

Tabelle 5. HIV-1 LTR Primer und Sonde

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Discussion

Immungeschwächte Mäuse mit menschlichen Zellen/Gewebe pfropfte menschenähnliche physiologische Merkmale aufweisen und einen enormen Wert für Pathologie, Pathophysiologie und Immunologie Studien zur Mensch-spezifische Krankheiten sind. Unter mehreren Stämmen immungeschwächte Mäuse, den Zuschlag. CG -PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG) Modell ist die am meisten immungeschwächte aufgrund seiner mangelnden angeborenen und der adaptiven Immunität sowie abgetragene Maus-spezifischen Cytokine signaling3,12,19 . Daher NSG Mäuse wurden ausgiebig genutzt, in der Humanisierung Prozess, und es ist allgemein bekannt, dass menschliche Zellen im murinen peripheren Blut, lymphatischen besiedeln und myeloischen Gewebe und, dass die Mäuse zeigen entsprechende menschliche Immunantworten auf infektiöse Stimulationen wie HIV27,33.

Durch die Host-Beschränkung von HIV beschränkten sich präklinische tierexperimentellen Studien der HIV Virologie und Infektion Prognose zuvor nichtmenschlichen Primaten infiziert mit simian Immunodeficiency Virus (SIV, die nichtmenschlichen Primaten Version von HIV)3. Wissenschaftlichen Fortschritte in der Stammzellenforschung und der Generation der NSG Mäuse haben die Möglichkeit der Durchführung von HIV-Forschung auf murinen Kleintiere mit geringeren Kosten und schneller experimentelle Umsatz eröffnet. Derzeit kann NSG Humanisierung durch Transplantation von (1) fetaler Gewebe und menschlichen HSCs (BLT-Modell), (2) menschliche PBMCs (PBL-Modell) und (3) menschlichen HSCs (SRC-Modell) erreicht werden. Die BLT-Modell bietet die höchste Engraftment Effizienz sowie die umfassende Entwicklung der beiden Funktionen lymphatischen und myeloischen34,35, aber ist technisch anspruchsvoll. Das PBL-Modell ist die bequemste herstellen aber hat ein kurzen experimentellen Fenster auf Engraftment infolge GVHD; Zusätzlich nur bietet anständige periphere T-Zell-Reaktionen und lymphatischen und myeloischen Entwicklung fehlt. Aus diesen Gründen haben wir das SRC-Modell in diesem Protokoll mit Anpassungen an die Anforderungen für HIV Untersuchungen beschäftigt. Die Hu-NSG-Modell ist vollkommen frei von Immunfunktion und effizient bei der Knochenmark homing auf Strahlung und Transplantation; Darüber hinaus ermöglicht es virale Herausforderung und anschließende Untersuchungen in einem jüngeren Alter, die Entwicklung der altersbedingten pathologische Probleme bekannt, NOD Stamm Hintergrund zu vermeiden. Obwohl T-Zellen in der Hu-NSG-Modell in einer Maus Zebrafischembryonen Umgebung erzogen werden und sind nur H2 beschränkt, können mehrere, wenn nicht sogar alle, Teilmengen der menschlichen Immunzellen im entwickeln und Maus myeloischen und lymphatischen Organe zu besiedeln. Darm-assoziierte Lymphgewebe des Hu-NSG Modells ist spürbar, auch mit menschlichen Immunzellen rekonstituiert; Dieses Modell könnte somit potenziell Schleimhaut Übertragung von HIV, ähnlich wie die BLT Modell22,23unterstützen.

Eines der größten Hindernisse zu beseitigen HIV ist die Existenz eines Latenz Reservoirs unter Patienten mit suppressive Wagen33,36,37,38,39. Latent infizierte Zellen bleiben ruhenden und tragen zur HIV viralen Rebound nach Warenkorb Zurücknahme. Latenz Stauseen befinden sich anatomisch in der Leber, Milz, Gehirn und anderen lymphatischen Geweben und bestehen hauptsächlich aus Speicher CD4 + T-Zellen36,40,41. Wie von unserer Fraktion berichtet, unterstützt das Hu-NSG Modell Entwicklung der T-Zell-Linie, eignet sich für pathologische Modellierung von HIV Latenz. Wir haben gezeigt, dass dieses Modell sehr anfällig auf virale Infektion und anschließend die Warenkorb-Therapie per oraler Gabe ist. Dramatische viralen Rebound tritt sofort nach Warenkorb Zurücknahme, die die Existenz eines Reservoirs Latenz unterstützt. Latent infizierte Speicher CD4 + T-Zellen kann im Warenkorb aus den lymphatischen Organen der HIV-infizierten Hu-NSG isoliert werden und virale Auswuchs Assays rekapitulieren viralen Rebound Ex Vivo41. Die Hu-NSG-Modell und die HIV-Infektion/Warenkorb-Therapie beschrieben in diesem Protokoll haben somit breite Anwendungen in Bereichen, die im Zusammenhang mit HIV Virologie, Infektion Prognose, Latenz Pathophysiologie und antiretrovirale Therapie Entwicklung.

Die Hu-NSG-Maus-Modell in diesem Protokoll erfordert eine Bestrahlung und intrahepatischen Injektion von HSZ am Tag 2-3 nach Geburt; eigene Zucht und spezifischen Wohnbedingungen sind daher erforderlich. Obwohl neonatale HSC-Transplantation in der Regel hohe Engraftment Wirkungsgrade ergibt, kann in einigen Fällen schwere GVHD auftreten. In einigen Fällen eine signifikante Abnahme der peripheren CD45 + Zellzahl auf Infektion beobachtet werden, und unter extremen Bedingungen, peripherem Blut CD45 + Erschöpfung beobachtet werden; Sammlung und Flow Cytometry Blutanalyse kann daher schwierig sein. Eine wichtige Einschränkung dieses Hu-NSG-Maus-Modells liegt in der Chimären Natur seiner T-Zellen. T-Zellen in der Hu-NSG-Maus-Modell sind innerhalb der Maus Zebrafischembryonen Umgebung ausgebildet und H2 beschränkt, anstatt HLA beschränkt sind; Daher ist volle Reprise der dynamischen Veränderungen der T-Zelle Teilmengen nach Infektion weniger wahrscheinlich. Obwohl die Hu-NSG-Maus-Modell gut Anfälligkeit für eine HIV-1 Infektion aufweist, kann die beobachteten Plasma-Viruslast weiter, um ein Vielfaches niedriger als in der BLT-Modell, vielleicht wegen irgent Rekonstitution der menschlichen lymphatischen und myeloischen Funktionen sein.

Zusammenfassend lässt sich sagen bietet die Hu-NSG Maus dargestellt in diesem Protokoll eine einfache und effiziente Methode zur Erzeugung von einem humanisierten Mausmodell für HIV Virologie und Latenz Studien, als Alternative zu den BLT-Modell. Trotz ihrer Einschränkungen in umfassende lymphatischen und myeloischen Entwicklung ist das Hu-NSG Modell anfällig für Infektionen und reagiert auf Behandlung oder anderen Therapeutika22,23,24Warenkorb nachgewiesen worden. Die Latenz-Pathologie-Modell gegründet nach diesem Protokoll rekapituliert HIV viralen Rebound in Vivo und latent infizierten Speicher, dass CD4 + T-Zellen werden zur weiteren Untersuchung isoliert.

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Disclosures

Die Autoren Interessenkonflikte keine.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde unterstützt durch die National Institutes of Health [gewähren, J.J.R. Zahlen, R01AI29329, R01AI42552 und R01HL07470] und National Cancer Institute der National Institutes of Health [Grant-Nummer P30CA033572, Stadt der Hoffnung Integrative Genomics zu unterstützen Analytische Pharmakologie und analytische Zytometrie Kerne]. Die folgende Reagenz wurde durch die AIDS-Forschung NIH und Referenzprogramm Reagenz, Division of AIDS NIAID, NIH erhalten: BaL HIV Virus.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CD34 MicroBead Kit, human MiltenyiBiotec 130-046-703
CryoStor CS2 Stemcell Technologies 07932
NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wji The Jackson Laboratory 005557 Order breeders instead of experimental mice
IsoFlo Patterson Veterinary 07-806-3204 Order through animal facility, restricted item
Clidox disinfectant Fisher Sicentific NC9189926
Wescodyne Fisher Sicentific 19-818-419
Hamilton 80508 syringe/needle Hamilton 80508 Custom made
Blood collection tube (K2EDTA) BD Bioscience 367843
Blood collection tube (Heparin) BD Bioscience 365965
Capillary tube (Heparinized) Fisher Sicentific 22-362574
Red Blood Cell Lysis Buffer Sigma Aldrich 11814389001
QIAamp Viral RNA mini kit Qiagen 52906
TaqMan Fast VIrus 1-step Master Mix Thermofisher 4444434
HIV-1 P24 ELISA (5 Plate kit) PerkinElmer NEK050B001KT
IgG from human serum Sigma Aldrich I4506-100MG
IgG from mouse serum Sigma Aldrich I5381-10MG
BB515 Mouse Anti-Human CD45 (clone HI30) BD Biosciences 564586 RRID: AB_2732068, LOT 6347696
PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD3 (Clone SK7) BD Biosciences 557851 RRID: AB_396896, LOT 6021877
Pacific Blue Mouse Anti-Human CD4 (Clone RPA-T4) BD Biosciences 558116 RRID: AB_397037, LOT 6224744
BUV395 Mouse Anti-Human CD8 (Clone RPA-T8) BD Biosciences 563795 RRID: AB_2722501, LOT 6210668
APC-Alexa Fluor 750 Mouse Anti-Human CD14 (TuK4) ThermoFisher MHCD1427 RRID: AB_10373536, LOT 1684947A
PE Mouse Anti-Human CD19 (SJ25-C1) ThermoFisher MHCD1904 RRID: AB_10373382, LOT 1725304B

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References

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Immunologie und Infektion Ausgabe 143 neonatale NSG Maus Mäuse HSCs HIV vermenschlicht Warenkorb Latenz
Humanisierten NOD/SCID/IL2rγ<sup>null</sup> (Hu-NSG) Maus-Modell für HIV-Replikation und Latenz-Studien
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Xia, X., Li, H., Satheesan, S., Zhou, J., Rossi, J. J. Humanized NOD/SCID/IL2rγnull (hu-NSG) Mouse Model for HIV Replication and Latency Studies. J. Vis. Exp. (143), e58255, doi:10.3791/58255 (2019).

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