Summary
Hier presenteren we een protocol voor het gebruik van reeds bestaande antibiotica resistentie-cassette schrapping constructies als basis voor het maken van schrapping mutanten in andere stammen van E. coli . Dergelijke mutaties schrapping kunnen worden gemobiliseerd en ingevoegd in de corresponderende locus van een geadresseerde stam met behulp van P1 bacteriofaag transductie.
Abstract
Een eerste benadering voor het bestuderen van de functie van een onbekend gen in bacteriën is het creëren van een knock-out van dit gen. Hier beschrijven we een krachtige en snelle protocol voor het overbrengen van genmutaties schrapping van een Escherichia coli -stam naar de andere met behulp van gegeneraliseerde transductie met de bacteriofaag P1. Deze methode vereist dat de mutatie selecteerbare (bijvoorbeeld op basis van gene verstoringen met behulp van antibiotica cassette invoegingen). Dergelijke antibiotica cassettes kunnen worden gemobiliseerd van een donor-stam en geïntroduceerd in een ontvangende stam van belang om snel en eenvoudig genereren van een gen schrapping mutant. De antibiotica cassette kan worden ontworpen om flippase erkenning sites waarmee de excisie van de cassette door een site-specific recombinase tot een schone knock-out met alleen een opeenvolging van ~ 100-base-paar-lang litteken in het genoom. We tonen het protocol door het gen van de tamA codering een vergadering factor die betrokken zijn bij de autotransporter biogenese uitsparen en testen van het effect van deze knock-out op de biogenese en functie van twee trimeric autotransporter adhesines. Hoewel gene schrapping door P1 transductie zijn beperkingen heeft, maken het gemak en de snelheid van de uitvoering ervan het een aantrekkelijk alternatief voor andere methoden van gene verwijdering.
Introduction
Een gemeenschappelijke eerste aanpak voor het bestuderen van de functie van een gen is het uitvoeren van knock-out mutagenese en observeren van de resulterende fenotype. Dit heet ook omgekeerde genetica. De bacterie van E. coli is het werkpaard van de moleculaire biologie om de laatste 70 jaar of zo, ten gevolge van het gemak van het kweken en haar inschikkelijkheid aan genetische manipulatie-1. Verschillende methoden zijn ontwikkeld voor het produceren van gene verwijderingen in E. coli, waaronder markeerdraad uitwisseling mutagenese2,3 en, meer recent, recombineering met de λ rood of Rac ET systemen4,5 , 6.
In een veelgebruikt systeem, worden codering sequenties van afzonderlijke genen vervangen door een antibiotica-resistentie-cassette die later kan worden weggesneden uit de chromosoom5,7. De codering sequenties worden vervangen, bijvoorbeeld door een cassette kanamycine (Kan) weerstand, die wordt geflankeerd door flippase (FLP) erkenning doel (FRT) sites aan beide zijden. De FRT sites worden herkend door de recombinase FLP, die site-specifieke recombinatie tussen de sites van de FRT leiden tot het schrappen van de cassette Kan doorgeeft. Op deze manier kan een volledige schrapping van een bepaalde de codering gensequentie worden bereikt, weggaand achter slechts een minimale litteken opeenvolging van ongeveer 100 basenparen (bp) (Figuur 1).
Iets meer dan een decennium geleden, werd de zogenaamde Keio-collectie ontwikkeld. Dit is een bacteriële bibliotheek op basis van een standaard laboratorium E. coli K12 stam, waar bijna alle niet-essentiële genen individueel werden geschrapt door λ rode recombinatie7,8. De klonen binnen deze collectie hebben één codering opeenvolging een accijns Kan weerstand cassette hebt vervangen. De Keio-collectie heeft bewezen een nuttig hulpmiddel voor veel toepassingen9. Een dergelijke toepassing is de productie van schrapping mutanten in andere stammen van E. coli . De cassette Kan uit een bepaalde schrapping kloon kan worden gemobiliseerd door in het algemeen transducing bacteriofagen, zoals P110,11,12,13,14. Een voorraad van de bacteriofaag bereid uit een dergelijke stam kan vervolgens worden gebruikt om te infecteren een geadresseerde E. coli stam van belang, waar met een laag maar betrouwbare frequentie de Kan cassette-bevattende regio kan worden opgenomen in het ontvangende genoom van homologe recombinatie (Figuur 2). Transductants kunnen worden geselecteerd voor de groei op het medium Kan bevatten. Na dit, indien verwijdering van de antibiotica-resistentie-cassette is gewenst, kan het FLP-recombinase worden geleverd aan de transductant-stam in trans. Na het uitharden van het FLP-bevattende plasmide, die draagt een marker van de weerstand ampicilline (Amp), Kan en Amp-gevoelige klonen zijn gescreend en de juiste excisie van de wild-type codering sequentie en de cassette Kan worden geverifieerd door PCR van de kolonie.
Hier, wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd, met een beschrijving van elk van de stappen in het produceren van een knock-out E. coli stam gebaseerd op de hierboven beschreven strategie. Als voorbeeld, wordt een schrapping van de tamA gen aangetoond. tamA codeert een buitenmembraan β-vat-eiwit dat behoort tot het vervoer en de vergadering Module (TAM), die bij de biogenese van bepaalde autotransporter eiwitten en pili15,16,17 betrokken is. Deze spanning knock-out werd vervolgens gebruikt om te onderzoeken van het effect van de schrapping van de tamA op de biogenese van twee trimeric autotransporter adhesines (TAAs), de Yersinia antistoffen YadA en de E. coli immunoglobulin (Ig)-bindende TAA EibD 18,19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. de stammen en plasmiden
-
Bacteriestammen
- Gebruik de E. coli stammen BW251135, JW4179 (BW25113 tamA::kan)7en BL21(DE3)20BL21ΔABCF21. Zie Tabel van materialen voor meer informatie.
-
Bacteriofagen
- Gebruik de bacteriofaag P1vir voor de algemene transductie. De faag opslaat als een vloeibare voorraad met een paar druppels chloroform (zie stap 2.2). Voor meer informatie, Zie Tabel van materialen.
-
Plasmiden
- Gebruik de volgende plasmiden in dit protocol: pCP2022, pIBA2-YadA23en24van de pEibD10. Gebruikt als besturingselement plasmiden, pASK-IBA2 en pET22b (Zie Tabel van materialen).
-
Groei voorwaarden
- Het doorgeven van bacteriën in een lysogenie Bouillon (LB) middellange25 met krachtig schudden (180-200 rpm) bij 37 ° C of 30 ° C in het geval van BL21ΔABCF en de spanningen met pCP20.
- Uitvoeren van plasmide genezen bij 43 ° C.
- Voor een solide medium, door LB te vullen met 1% agar (w/v).
- Aanvulling voor top agar, LB met 0,7% agar en 10 mM CaCl2 en autoclaaf het medium. Gebruik SOC medium voor het herstel na electroporation26.
- Gebruik de volgende concentraties voor antibiotica: 100 μg/mL voor Amp en 25 μg/mL voor Kan.
2. voorbereiding van een bacteriofaag Lysate
-
Infectie van de donor-stam
- Groeien van de stam van de donor JW4197 in 5 mL van LB medium aangevuld met 10 mM CaCl2 en optioneel met Kan (25 µg/mL) met een optische dichtheid 600 nm (OD600) van ~ 1.0. De OD-waarde600 met een spectrofotometer meten.
- Maken van een verdunningsreeks van een bestaande P1 faag voorraad in het LB-medium: aanbevolen verdunningen zijn tussen 10-3 tot 10-7.
- Mix 200 μL van de bacteriële schorsing en 100 μl van een bepaalde faag verdunning in een tube van 15 mL centrifuge of een vergelijkbare groep. Bereiden zo veel buizen als phage verdunningen. Incubeer de buizen gedurende 20 minuten bij 37 ° C zonder schudden.
- Voeg ~ 3 mL gesmolten top agar (~ 50 ° C) aangevuld met 10 mM CaCl2 tot de buizen, meng de inhoud door vortexing de buizen kort en giet het mengsel op voorverwarmde LB platen te maken zelfs lagen.
- Incubeer de platen 's nachts bij 37 ° C.
-
Lysate voorbereiding
- De volgende dag Kies een plaat met een semi-confluente groei van phage plaques. Op een semi-confluente plaat, ongeveer de helft het oppervlak van de plaat is duidelijk (Figuur 3).
- Schraap de top agar laag van dergelijke een plaat met een inenting lus of een soortgelijk gereedschap en plaats de bovenste agar in een centrifugebuis. Voeg 1-2 mL LB en een daling van chloroform en vortex de buis krachtig gedurende ~ 1 min. toevoegen de chloroform in een zuurkast.
- Centrifugeer de buis gedurende 15 minuten op 4.000 x g of sneller aan de pellet de agar en bacteriële cellen.
- Verplaats het supernatant naar een verse microcentrifuge buis, het vermijden van om over alle puin van de pellet te dragen. Voeg 2 druppels chloroform en slaan de lysate op 4-10 ° C. Voeg chloroform in een zuurkast. Niet invriezen de bacteriofaag lysate aangezien dit in een aanzienlijke vermindering van het aantal infectieuze deeltjes resulteren zal.
-
Bepaling van de lysate titer
- Groeien BW25113 in LB aangevuld met 10 mM CaCl2 bij 37 ° C, totdat de cultuur een OD-600 voor ~ 1.0 bereikt.
- Voorbereiden van een verdunningsreeks van de bacteriofaag lysate in LB (bijv., 10-6–10-9).
Opmerking: Wees voorzichtig aan het monster Pipetteer vanaf de bovenkant van de lysate om te voorkomen dat chloroform om de verdunningen. - Mix 200 μL van de bacteriële schorsing en 100 μl van een bepaalde faag verdunning in een tube van 15 mL centrifuge of een vergelijkbare groep. Bereiden zo veel buizen als phage verdunningen. Incubeer de buizen gedurende 20 minuten bij 37 ° C zonder schudden.
- Voeg ~ 3 mL gesmolten top agar (~ 50 ° C) aangevuld met 10 mM CaCl2 tot de buizen, meng de inhoud door vortexing de buizen kort en giet het mengsel op voorverwarmde LB platen te maken zelfs lagen.
- Incubeer de platen 's nachts bij 37 ° C.
- De volgende dag tellen het aantal plaques (duidelijk regio's in de bacteriële mat) voor elke plaat en de titer van de lysate met de volgende formule berekenen:
Voorbeeld: Op de platen met de verdunningen 10-7, 10-8en 10-9, er zijn 231, 27 en 2 platen, respectievelijk. 100 μl van elke verdunning werd gebruikt voor de infectie, en omdat de titer wordt uitgedrukt als plaque-vormende eenheden (pfu) / mL, de beplating factor is 10. Deze getallen worden ingevoerd in de formule:
De titer is dus ongeveer 2 x 1010 besmettelijke phage deeltjes/mL.
3. P1 transductie
-
Voorbereiding van de ontvangende cellen
- Groeien de ontvangende stam BL21ΔABCF in LB aangevuld tot een optische dichtheid bij 600 nm (OD600) van ~ 1.0. Gebruik een spectrofotometer de OD600 waarde te meten.
- Bereken het volume van de bacteriofaag lysate die nodig zijn om een veelheid van infectie (MOI) waarde van 0,5. Voor het berekenen van de MOI, schatten het aantal bacteriën op basis van de OD600 van de cultuur. Neem aan dat een600 OD-waarde van 1.0 komt met ~ 109 cfu/mL overeen. Bereken het volume vereist op basis van de bekende titer van de lysate.
Voorbeeld (gebaseerd op de titer, berekend in het voorbeeld na stap 2.3.6):
- Voeg CaCl2 aan de stam van de ontvangende cultuur tot 10 mM en meng. Neem 1 mL van de cultuur voor signaaltransductie.
-
Presterende transductie
- Voeg het juiste volume van bacteriofaag lysate tot 1 mL van de ontvangende cultuur (inclusief CaCl2 op 10 mM), zoals berekend in stap 3.1.2 en meng voorzichtig.
Opmerking: Wees voorzichtig om Pipetteer van de monster uit de bovenkant van de lysate om te voorkomen dat chloroform aan de mix. - Statisch Incubeer de mix gedurende 20 minuten bij 37 ° C.
- Stop de infectie door het toevoegen van Natriumcitraat, pH 5.5, tot 100 mM.
- Centrifugeren van de bacteriën (5000 x g gedurende 2 minuten) en verwijder het supernatant en resuspendeer hen in 1 mL verse LB aangevuld met 100 mM Natriumcitraat, pH 5.5.
- Wassen van de cellen tweemaal meer zoals in stap 3.2.4 om de verwijdering van vrije bacteriofagen en calcium.
- Resuspendeer de bacteriën in 1 mL verse LB aangevuld met 100 mM Natriumcitraat, pH 5.5. Incubeer de bacteriën bij 30 ° C gedurende 1 h met schudden (> 100 rpm).
- Verzamel de bacteriën door middel van centrifugeren (5000 x g gedurende 2 minuten) en resuspendeer hen in ~ 100 μl van LB met 100 mM Natriumcitraat, pH 5.5.
- Verspreiding van de bacteriën op een plaat van de LB aangevuld met Kan op 25 µg Mo/mL en 10 mM Natriumcitraat, pH 5.5, en groeien de bacteriën bij 30 ° C tot kolonies verschijnen (~ 24 h).
- Voeg het juiste volume van bacteriofaag lysate tot 1 mL van de ontvangende cultuur (inclusief CaCl2 op 10 mM), zoals berekend in stap 3.1.2 en meng voorzichtig.
-
Selecteren van de transductants
- Zodra de kolonies op de plaat van de selectie zijn gegroeid, restreak hen op LB + Kan voor één kolonies en groeien bij 30 ° C tot één kolonies worden weergegeven.
4. middendoor de cassette Kan
-
De transformatie met recombinatie plasmide
- Controleer de electrocompetent van de stam Kan-resistente BL21ΔABCF.
- Het groeien van de stam uit een één kolonie in verse LB (5 mL) aangevuld met Kan (25 µg/mL) bij 30 ° C, totdat de OD600 ~0.5 – 0.7.
- Vanaf hier, voeren de volgende stappen uit bij 4 ° C of op ijs. Centrifugeer de bacteriën (5000 x g gedurende 10 minuten) en verwijder de bovendrijvende substantie.
- Wassen van de cel pellet met ijskoud water twee keer de vorige centrifugeren door stap te herhalen en, ten slotte resuspendeer de pellet cel in 100 µL ijskoude 10% glycerol.
- 1 mm electroporation cuvettes op ijs afkoelen.
- 1 pg van plasmide DNA (pCP20) toevoegen aan de celsuspensie, meng voorzichtig de opschorting en over te brengen naar een gekoelde electroporation cuvette.
- De electroporator ingesteld op 1,8 kV en electroporate de cellen.
- Getransformeerde cellen redden door toevoeging van 1 mL van SOC medium en het verbouwen ervan voor 1 h bij 30 ° C.
- Plaat 100 µL van de cellen op LB + versterker platen en groeien de cellen bij 30 ° C's nachts.
- Controleer de electrocompetent van de stam Kan-resistente BL21ΔABCF.
-
Inductie van de recombinatie
- Pick enkele kolonies van de LB + Amp plaat en verse LB weglaten van alle antibiotica worden geënt.
- De cellen op de niet-tolerante temperatuur (43 ° C) 's nachts voor het opwekken van de expressie van FLP recombinase groeien.
-
Selecteren van recombinanten
- Maken van de seriële verdunningen en plaat 50 µL van een 10-5-106 verdunning op niet-selectieve platen en groeien het 's nachts bij 30 ° C.
5. controle van de gen-verwijdering
-
Verificatie van de plasmide verlies en succesvolle recombinatie
- Streak enkele kolonies van de platen bereid in stap 4.3.1 op LB Kan, LB + Amp en LB platen zonder antibiotica, in deze volgorde. Om te helpen bij de strepen, een kolonie raster gebruiken (Zie aanvullende bestand 1). Groeien de platen bij 30 ° C tot kolonies verschijnen (~ 24 h).
- Kies 10 – 20 klonen die zijn geteeld op de niet-selectieve plaat maar verzuimde te groeien op het selectieve medium voor verdere verificatie.
-
Aanvullende verificatie door PCR van de kolonie
- Uitvoeren van een PCR van de kolonie met begeleidende de tamA codering reeks inleidingen (Zie Tabel van materialen).
- Voorbereiding van een master PCR-mix. Het bedrag van de mix die nodig zijn, is afhankelijk van het aantal kolonies te beproeven (Zie het voorbeeld in tabel 1). Meng de reagentia op ijs, voeg de polymerase laatst.
- Meng de master mix van PCR, dan afzien van 20 µL in buizen van een PCR-strip. Neem een kleine hoeveelheid elke kolonie worden onderzocht met behulp van een steriele pipette uiteinde en toe te voegen aan een buis. Vergeet niet om de oorspronkelijke geadresseerden stam voor vergelijking. Eventueel ook de spanning van de donor.
- Uitvoeren van een PCR-reactie (Zie tabel 2 voor het programma gebruikt).
- Voorbereiden van een 1% agarose gel.
- Voor een gel 50 mL, 0,5 g agarose meten en voeg 50 mL van TAE-buffer (40 mM Tris, 20 mM azijnzuur en 1 mM EDTA, pH 8.0). Verwarm het mengsel in een magnetron-oven totdat alle agarose heeft opgelost.
- Zodra de agarose is opgelost, cool de oplossing tot ongeveer 50 ° C, en voeg vervolgens toe 5 μL van DNA kleuring kleurstof. Meng de oplossing goed en giet het in een gel-lade in een zaal gieten. Voeg een of meer rijen met goed kammen zodat er voldoende putten voor alle monsters, evenals de grootte van de moleculaire merkers. Laat de gel gedurende 30 minuten instellen.
- Zodra de PCR-run voltooid is, 4 µL van 6 x DNA laden kleurstof aan elk monster toevoegen. Plaats van de gel in de zaal van elektroforese en Voeg TAE-buffer tot de putten vallen.
- Breng 10 – 15 µL van elke PCR reactie aan een putje in de gel. Ook Voeg 5 µL van een marker van moleculaire grootte. Vervolgens voert u de gel voor 30 min 75 V.
- Zodra de run voltooid is, het imago van de gel met een blauw-licht imager.
6. andere technieken
-
Eiwit expressie
Opmerking: De expressie van test eiwitten (YadA en EibD) heeft al23,24in detail elders beschreven. Dit is een korte samenvatting van de belangrijkste stappen.- BL21ΔABCF ΔtamA with transformeren de nodige plasmiden (pIBA2-YadA en pEibD10 en de bijbehorende control-plasmiden) en selecteer voor transformants op LB + Amp.
- Voor het eiwit expressie, beënten 100 mL LB medium + Amp met 1 mL van een overnachting cultuur van getransformeerde bacteriën en groeien deze bij 30 ° C tot halverwege log fase, op dat moment, veroorzaken de eiwitproductie met beide anhydrotetracycline (bij 100 ng/mL) of Isopropyl thiogalactoside (op 0.5 mM).
- Na 2 h van inductie bij 30 ° C, het meten van de troebelheid van de culturen en verzamelen een aantal cellen die overeenkomt met 50 mL bij OD600 = 1.0 door de culturen gedurende 15 minuten bij 4000 x gcentrifugeren. Wassen van de pellet 1 x met 10 mM HEPES pH 7.4 en vervolgens een opgeslagen bij-20 ° C of proces verder zoals in stap 6.2.
-
Buitenmembraan extractie
Opmerking: De buitenmembraan extractie wordt uitgevoerd zoals in detail beschreven door Leo et al. 27. de belangrijkste stappen zijn hieronder samengevat.- Resuspendeer de pellet in 1 mL van de cel van 10 mM HEPES, pH 7.4, aangevuld met 10 mM MgCl2 en MnCl2, lysozym (0,1 mg/mL) en een mespuntje DNase ik.
- Lyse de cellen (bijvoorbeeldmet behulp van een klopper kraal).
- Centrifugeer de cellen kort (2 min op 15,600 x g) te verwijderen van puin van de cel en het supernatant naar een verse buis.
- Centrifugeer de cellen gedurende 30 minuten bij 16.000 x g, waarna, resuspendeer de pellet in 400 μL van 1% N-natriumlauriolsarcosinaat sarcosine in 10 mM HEPES, pH 7.4.
- Incubeer de cellen met agitatie gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, waarna, centrifugeer ze gedurende 30 min als hierboven.
- Wassen de doorschijnende pellet 1 x met 200 μl van 10 mM HEPES, pH 7.4, en dan het resuspendeer in 30 μL van 10 mM HEPES en voeg 10 μL van 4 x SDS-pagina monster buffer.
-
Activiteit testen
Opmerking: Voer SDS-pagina en activiteit testen voor YadA en EibD als beschreven28. De belangrijkste stappen zijn hieronder samengevat. -
SDS-PAGINA
- Verwarm de monsters bij 50 ° C gedurende 5 minuten voordat ze worden geladen op een polyacrylamide-gel, om te voorkomen dat de denaturering van de eiwitten.
- Na de scheiding in SDS-pagina, door de eiwitten te overbrengen in een Polyvinylideenfluoride (PVDF) difluoride membraan.
- Na de overdracht, blokkeren het membraan met 2% magere-melkpoeder in PBS.
-
YadA-collageen ver-westelijke vlek
- Na het blokkeren, boviene collageen type die ik verdund in blokkeerbuffer toevoegen aan een concentratie van 10 μg/mL en Incubeer het membraan gedurende 1 uur.
- Wassen van het membraan 2 x met PBS + 0,05% Tween20 (PBS-T).
- Het primaire antilichaam (monoklonaal anti-collageen COL-1) aan de membraan, verdunde 1:2,000 in blokkeerbuffer toevoegen.
- Na incubatie van het membraan gedurende 1 uur, 2 x wassen, zoals vermeld in stap 6.3.2.2 en voeg vervolgens de secundair antilichaam [geit anti-muis IgG-horseradish peroxidase (HRP) conjugaat], verdunde 1:10,000 in de blokkeerbuffer.
- Incubeer de membraan voor 1 h, dan wassen 2 x met PBS-T. Een verbeterde chemiluminescentie substraat toevoegen aan het membraan volgens de instructies van de fabrikant en de band met behulp van een CCD camera detecteren.
-
EibD-IgG bindende bepaling
- Na het blokkeren, voeg een secundair antilichaam (geit anti-konijn HRP), verdunde 1:2,000 in de blokkeerbuffer.
- Incubeer de membraan voor 1 h, dan wassen 2 x met PBS. Chemiluminescentie detectieproces zoals vermeld in stap 6.3.2.5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Generatie van een tamA Knock-out van BL21ΔABCF:
De hierboven beschreven strategie heeft eerder gebruikt voor de productie van een afgeleide stam van BL21(DE3), de stam van een standaard laboratorium gebruikt voor de productie van eiwitten, die is geoptimaliseerd voor de productie van de eiwitten van de buitenmembraan en genaamd BL21ΔABCF21. Deze spanning mist vier genen die coderen voor overvloedige buitenmembraan eiwitten en, bijgevolg, kan produceren meer geïnfecteerd uitgedrukt buitenmembraan eiwitten dan de stam van de wild-type. Om te testen of de TAM is betrokken bij TAA biogenese, was de tamA -gen op deze achtergrond verwijderd.
Een P1 lysate opgesteld van de Keio collectie stam JW4179, waar de tamA gen (voorheen genaamd yftM) codering reeks is vervangen door een cassette Kan weerstand. Vervolgens werd een transductie experiment uitgevoerd met BL21ΔABCF als de ontvangende stam. Verschillende Kan-resistente kolonies werden verkregen, waarna twee werden gekozen voor de besnijdenis van de cassette Kan. De pCP20 van de plasmide, codering van het FLP-recombinase, was deze klonen binnengebracht en vervolgens genezen door een groeiende bij 43 ° C in afwezigheid van een antibioticum selectie. Een aantal klonen waren gescreend voor gevoeligheid voor zowel Amp (dat is een marker van pCP20) en Kan, en verschillende klonen gevoelig voor beide werden verkregen. Deze klonen zijn geverifieerd door PCR van de kolonie gebruikend inleidingen flankerend de tamA codering volgorde en vond dat het gen tamA had verwijderd (Figuur 4).
TamA de rol in TAA biogenese:
TamA is aangetoond te worden betrokken bij de biogenese van enkele klassieke autotransporters-16 en de inverse autotransporter intimin15. Om te testen of TamA belangrijk voor de biogenese van TAAs is, was BL21ΔABCF ΔtamA getransformeerd met plasmiden codering van twee eiwitten van de test, de Yersinia antistoffen YadA en de E. coli Ig-bindend-proteïne EibD. Deze eiwitten zijn bekend bij express goed in E. coli en zijn gebruikt als modellen voor TAA biogenese in eerdere studies23,28.
Na inducerende eiwitproductie, waren de buitenmembraan breuken van de culturen van de expressie geïsoleerd en geanalyseerd door SDS-PAGE. De monsters werden niet gekookt om aan te tonen van de trimerization van de eiwitten. De trimeren draaien op maten boven 100 kDa, overwegende dat de monomeren grootte van 45 kDa (YadA) en 51 kDa (EibD verwacht). Geen grote verschillen tussen de ontwikkelingsniveaus van de expressie in BL21ΔABCF en BL21ΔABCF werden waargenomen ΔtamA, hoewel YadA lijkt te worden geproduceerd op een iets lager niveau in de ΔtamA stam (figuur 5A). Echter lijkt het tegendeel het geval voor EibD.
Om te onderzoeken of het ontbreken van TamA de juiste folding of vervoer van de eiwitten kan beïnvloeden, werd hun vermogen om te binden aan liganden getest. Voor YadA, werd dit bereikt door een collageen ver-westelijke vlek (figuur 5B). YadA, afhankelijk in beide stammen, van collageen op een vergelijkbaar niveau, waaruit blijkt dat het eiwit goed gevouwen en functioneel. Evenzo, IgG-bindende activiteiten van EibD in de twee stammen gecorreleerd met het niveau van de expressie (figuur 4C). Deze resultaten tonen aan dat de verwijdering van tamA geen een significant effect op TAA biogenese, althans niet voor deze twee model TAAs heeft.
Figuur 1: generatie van knock-outs met accijnsplichtige antibiotica cassettes. Voor de productie van de gen knock-outs, wordt een gen van belang (Gene B in dit voorbeeld) vervangen door een Kan weerstand cassette geflankeerd door FRT sites. De cassette van de FRT-Kan, op zijn beurt, wordt geflankeerd door korte (~ 50 bp) strekt zich uit van sequentie homoloog aan de upstream- en downstream regio's van de Gene-B. De codering opeenvolging van Gene B wordt omgewisseld voor de FRT-Kan cassette door λ rode recombinatie. Zodra dit wordt verwezenlijkt, kan de cassette Kan zelf worden verwijderd door de invoering van het FLP-recombinase, die een site-specifieke recombinatie tussen de FRT sites zal bemiddelen. Dit excises de Kan cassette, waardoor een minimale (~ 100 bp) volgorde in de B-locus litteken. Zie voor volledige details, Baba et al. 7. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Gene schrapping door P1 transductie. De donor stam (beige) draagt een cassette Kan die het gen van belang (geel) op het chromosoom (blauw) heeft vervangen. De donor is geïnfecteerd met P1 bacteriofaag. De faag vermenigvuldigt in de stam van de donor, het produceren van een groot aantal nakomelingschap. Zijn meest wild-type (rode genoom), maar een fractie zijn transducing bacteriofagen die een deel van de donor stam chromosoom in plaats van phage DNA (blauwe genoom) opgenomen. Een deel hiervan zal de Kan cassette (gele genoom) bevatten. Uiteindelijk, de geïnfecteerde gastheercel lyses en het vrijkomen van de bacteriofagen in het medium. Deze worden gebruikt om voor te bereiden een lysate. In de signaaltransductie experiment, is de ontvangende stam (lichtblauw) besmet met de lysate bereid uit de stam van de donor. In een minderheid van de gevallen, zit de ontvanger septisch tegen een transducing faag uitvoering van de Kan-cassette (hier afgebeeld). Als de regio's grenzend aan de cassette Kan ondergaan homologe recombinatie, is de cassette Kan opgenomen in de ontvangende chromosoom ter vervanging van de endogene allel, resulterend in Kan-resistente klonen die kunnen worden geselecteerd voor. De toevoeging van FLP recombinase op een drogende plasmide excises de cassette Kan, alleen een korte litteken sequentie (hier afgebeeld in geel), die hersteld van de kloon het fenotype Kan-gevoelige verlaten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: voorbeelden van platen na een infectie van de P1. (A) dit paneel toont een plaat met individuele plaques. (B) dit paneel toont een semi-confluente plaat. (C) dit paneel toont een overdreven besmette plaat, waar bijna alle bacteriën hebben zijn lysed door phage. Sommige resistente kolonies zijn gegroeid uit de bovenste agar-laag. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: Schrapping van de tamA opeenvolging te coderen. De tamA::kan schrapping allel werd geïntroduceerd in de stam BL21ΔABCF door P1 transductie. Na de besnijdenis van de Kan-cassette, een litteken-reeks (~ 100 bp) is dat alles blijft bij de tamA locus. Dit werd gecontroleerd door PCR, gebruikend inleidingen flankerend de verwijdering site. In BL21ΔABCF en zijn stam, BL21(DE3), geeft de PCR een product de lengte van de tamA codering volgorde (de verwachte grootte is 1.7 kilobase paren). In BL21ΔABCF, waar de cassette Kan heeft is weggesneden, het product komt overeen met de volgorde van de verwachte litteken (145 bp). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: Expressie van TAAs door een stam van de schrapping tamA . (A) dit paneel toont de SDS-pagina van buitenste membranen bereid uit cellen uiten TAAs (YadA of EibD) en vector besturingselementen (pIBA2 en pET22). De stammen zijn BL21ΔABCF en zijn afgeleide spanning ontbreekt TamA (ΔtamA). (B) dit paneel toont een collageen ver-westelijke vlek van YadA monsters. De YadA monsters en pIBA2 controles van paneel A werden overgebracht naar een membraan PVDF en geïncubeerd met collageen type I. Ze waren dan gesondeerd met een anti-collageen antilichaam en ontdekt door ECL. (C) dit paneel toont een antilichaam-bindende assay voor EibD monsters. De EibD monsters en pET22 controles van paneel A werden overgebracht naar een membraan PVDF en geïncubeerd met een HRP-geconjugeerde secundair antilichaam en dan ontdekt door ECL. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Reagens | 1 x mix | 7 x-mix |
| PCR-grade water | 17 ΜL | 119 ΜL |
| 10 x polymerase buffer | 2 ΜL | 14 ΜL |
| 10 mM deoxyribonucleotide mix | 0.4 ΜL | 2.8 ΜL |
| 100 µM voorwaartse primer | 0.2 ΜL | 1.4 ΜL |
| 100 µM omgekeerde primer | 0.2 ΜL | 1.4 ΜL |
| Polymerase van DNA Taq | 0.2 ΜL | 1.4 ΜL |
| Totaal | 20 ΜL | 140 ΜL |
Tabel 1: PCR van de kolonie master mix. Het bedrag van de mix, is afhankelijk van het aantal kolonies worden vertoond. Daarnaast bereiden een controle reactie (oorspronkelijke geadresseerden stam). Bijvoorbeeld, als screening vijf klonen, zes reacties nodig, met inbegrip van het besturingselement. Het is de moeite waard een extra reactie om ervoor te zorgen is er genoeg PCR-mix voor alle monsters (doorlopend pipetteren versterkt kleine pipetting fouten) voorbereiden. In dit voorbeeld, bereiden een 7 x-mix (5 kolonies, 1 controle en 1 extra reactie).
| Stap | Temperatuur | Tijd | Notities |
| 1. | 94 ° C | 3 min | |
| 2. | 94 ° C | 30 s | |
| 3. | 50 ° C | 30 s | |
| 4. | 70 ° C | 2 min | 1 min/kb kan worden versterkt, ronden |
| Terug naar stap 2 24 keer | |||
| 5. | 70 ° C | 5 min | |
| 6. | 12 ° C | Voor eeuwig | laatste greep |
Tabel 2: PCR van de kolonie programma.
Aanvullende bestand 1: een voorbeeld van de kolonie raster. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
P1 transductie is een snelle, robuuste en betrouwbare methode voor het genereren van gene verwijderingen in E. coli. Dit blijkt hier uit een tamA schrapping mutant van een Keio donor-stam naar een geadresseerde BL21-afgeleide transducing. De grote fasen in het proces van de transductie zijn de productie van de transducing lysate de signaaltransductie zelf, de besnijdenis van de cassette Kan weerstand en de verificatie van de knock-out door PCR. In totaal, het proces duurt ongeveer 1 week en vereist geen moleculaire biologiemethodes worden gebruikt, behalve de laatste PCR voor de verificatie. Dus, P1 transductie kan concurreren in verbruikte inspanning en tijd met λ rode recombinatie en is veel sneller dan traditionele marker uitwisseling mutagenese.
Het gepresenteerde protocol is zeer robuust en voorziet in wijziging van vele van deze stappen. Er zijn echter een paar kritische parameters. P1 infecties is het noodzakelijk calciumionen aan het medium toevoegen. Calcium is nodig voor de adsorptie van de bacteriofaag aan de bacteriën, en gebrek aan voldoende calcium aan het medium toevoegen zal aanzienlijk verminderen de efficiency van de infectie. Sommige bacteriële spanningen zoals BL21ΔABCF de neiging om statistische in aanwezigheid van CaCl221. In dergelijke gevallen kunnen de bacteriën worden gekweekt zonder CaCl2, die tot de schorsing kort voordat de infectie kan worden toegevoegd. Echter voor meer conventionele stammen, kunnen 10 mM CaCl2 worden opgenomen in het groeimedium vanaf het begin.
Omgekeerd is het belangrijk om het gratis calcium van het medium na de signaaltransductie. Citraat is een complexvormer van calciumionen en omdat deze nodig zijn voor de adsorptie van P1 naar cellen van de gastheer, het gratis calcium uit het medium verwijderen voorkomt verdere infecties. Als het calcium wordt niet verwijderd, zal de bacteriofagen verder cellen in de cultuur, in het beste vermindering van de efficiëntie van de transductie en in het slechtste geval lysing de hele cultuur, met inbegrip van het transductants besmetten.
Een andere belangrijke stap is het kweken van bacteriën die de plasmide-pCP20. pCP20 is een voorwaardelijk replicerende plasmide die niet gerepliceerd bij een temperatuur van 37 ° C of hoger; Dus, om vast te stellen het plasmide in de cellen, incubations met deze plasmide moeten worden uitgevoerd bij 30 ° C (of lager), een temperatuur tolerant zijn voor de replicatie van pCP20. Voor het genezen van pCP20, wordt een hoge temperatuur (43 ° C) gebruikt. Sommige stammen groeien niet goed bij deze temperatuur; in dergelijke gevallen, 37 ° C moeten voldoende zijn, hoewel het plasmide genezen iets minder efficiënt bij deze temperatuur zijn zal.
Wanneer bacteriën om te testen voor antibiotische gevoeligheid plating, is de volgorde van plaat strepen belangrijk. Het protocol verlangt dat klonen te worden eerst op antibioticum-bevattende streaked platen en ten slotte op niet-selectieve medium. Op deze manier de onderzoeker kunt er zeker van te zijn dat een gebrek aan groei op het selectieve medium als gevolg van de antibiotica gevoeligheid zullen en in plaats van een mogelijke gebrek aan materiaal overgedragen op de platen. Na het protocol, geen groei op de LB + Kan plaat valideert de excisie van de cassette van de weerstand Kan; geen groei op de LB + Amp plaat valideert het verlies van de recombinatie plasmide pCP20; stammen groeien op de LB-plaat (die niet op de platen van de selectie in hetzelfde strepen experiment deed groeien) bevat de positieve recombinanten.
De meeste van de andere stappen mogelijk voor aanzienlijke speelruimte. In het protocol zoals gepresenteerd, wordt BL21ΔABCF gekweekt bij 30 ° C, aangezien deze soort niet goed bij 37 ° C. groeit E. coli stammen zonder groei gebreken kunnen echter worden gekweekt bij 37 ° C (behalve wanneer getransformeerd met pCP20).
Het aantal bacteriën gebruikt voor infecties kan tot op zekere hoogte worden gevarieerd. De relatie tussen OD600 en een levensvatbare telling is ongeveer lineair tussen een600 OD-waarde van 0,1 en 1,0, waar de voormalige komt overeen met ongeveer 108 cfu/mL en de laatste ~ 109 cfu/mL. Deze relatie kan echter variëren tot op zekere hoogte afhankelijk van de soort in kwestie, het groeimedium, en andere factoren. Het wordt aanbevolen dat de relatie tussen OD600 en de levensvatbare telling moet worden vastgesteld voor elk laboratorium en stam, met name voor de berekening van de waarden van de MOI. Het aantal bacteriën gebruikt in experimenten van de infectie is niet bijzonder kritisch en 109 cfu/mL is de vroege stationaire fase, die een redelijk compromis tussen de celdichtheid en het aantal levensvatbare cellen in de cultuur. Indien een lager aantal levensvatbare bacteriën worden gebruikt voor signaaltransductie, moet het aantal bacteriofagen gewoon dienovereenkomstig worden aangepast. De MOI zelf kan ook tot op zekere hoogte worden gevarieerd. Het protocol verlangt dat een MOI-waarde van 0,5, hoewel om het even wat tussen 0,1 en 0,5 zou moeten in een goede efficiëntie resulteren. De verhouding van bacteriofagen voor bacteriën is een MOI van 0,5, 1:2 (dat wil zeggen, de helft van het aantal bacteriofagen ten opzichte van het aantal bacteriën). In het voorbeeld in het protocol, de OD600 van de cultuur is 1.0, en 1 mL van de cultuur wordt gebruikt voor de transductie; het aantal bacteriofagen vereist is dus 5 x 10,8. Een MOI-waarde van 0,5 geeft een hoog niveau van infectie, maar vermindert het aantal bacteriën die dubbel geïnfecteerd zijn, die de efficiëntie van de transductie verminderen zou, zoals de wild-type (besmettelijke) bacteriofagen veel talrijker zijn dan de transducing bacteriofagen. Een dubbele infectie met een transducing faag en een besmettelijke faag zou leiden tot cel lysis, waardoor deze transductant uit de pool van overlevenden. Daarom mag een MOI van 0,5 niet worden overschreden.
Het protocol voorziet ook in een aantal sneltoetsen. In plaats van voorbereiding lysates van platen, sommige auteurs pleiten voor voorbereiding van phage lysates in vloeibare middellange29. Dit bespaart tijd als een overnachting incubatie stap niet nodig is. Ook macht titrating de bacteriofaag lysate niet zitten noodzakelijk. Zoals hierboven vermeld, de MOI is niet zeer kritisch, en redelijke efficiëntie kan worden bereikt door simpelweg ervan uitgaande dat een titer van 1010 pfu/mL voor een standaard lysate.
Ondanks het gemak van de techniek, P1 transductie is niet universeel toepasbaar, en verschillende voorwaarden moet worden voldaan voor het nuttig. Ten eerste, een stam van de donor met een selecteerbare knock-out-allel moet beschikbaar zijn. Dit wordt meestal gedaan met behulp van een schrapping waar een antibiotica-resistentie-cassette is vervangen door het gen van belang. De Keio-collectie is vooral nuttig in dit verband, want het biedt een kant-en-klare bibliotheek van antibiotica cassette gebaseerde gene knock-outs die betrekking hebben op bijna alle niet-essentiële genen in E. coli K12. Deze collectie is vooral handig voor het uitsparen van geconserveerde genen gevonden in de meeste stammen van E. coli (d.w.z., bestanddelen van het genoom van de kern E. coli ). Voor minder gemeenschappelijke genen, zoals virulentiefactoren van pathogene E. coli stammen of zeldzame metabolische weg genen, de mutatie moet mogelijk worden gemaakt van DOVO. In dergelijke gevallen P1 transductie mogelijk goed niet de methode van keuze. Naast de essentiële genen zijn genen die vereist zijn voor P1 infectie, zoals galU, mutaties die tot P1 weerstand30 leiden, slechte doelen voor een schrapping door P1 transductie. Een andere opmerking bij het gebruik van de Keio-collectie, in het bijzonder is dat een paar stammen een verdubbeling van het beoogde gen dragen, waar slechts één exemplaar werd verstoord door de Kan weerstand cassette8. In dergelijke gevallen kan het gen van belang zijn essentieel; onderzoekers worden aanbevolen om te controleren op bijgewerkte aantekeningen voor dergelijke genen8. Gezien deze beperkingen, staat P1 transductie echter de schrapping van de meeste genen in laboratorium E. coli stammen. Bijvoorbeeld, de verschillen tussen BW25113 en BL21(DE3) zijn klein en slechts een handvol eiwit-codeert genen31beïnvloeden.
Ten tweede, is het belangrijk om te benadrukken dat de ontvangende stam mag kunnen een homologe recombinatie voor de signaaltransductie om te werken. Een spanning ontbreekt de recombinase die Reca kan daarom worden niet gewijzigd door deze methode. Dit sluit alle standaard klonen stammen, zoals DH5α, HB101, TOP10, en XL-1 blauw. RecA kan bemiddelen recombinaties tussen identieke stukken zo kort als 8 bp; echter een langere regio van hoge gelijkenis zal aanzienlijk de kans van recombinatie32,33. Een ander probleem, met name met klinische E. coli stammen, is dat lang O-antigeen ketens de receptor voor P1, die in de kern-oligosaccharide lipopolysaccharide34 ligtkunnen maskeren. Naast deze vereisten voor de ontvangende stam moet de gebruikte voor signaaltransductie P1-stam een mutant vir ; Deze mutatie is vereist voor een volledige lytische infectie35.
Een derde waarschuwing van P1 transductie is dat het gen te worden gevloerd zich in een gebied met hoge gelijkenis in de begeleidende regio's tussen de donor en de ontvanger spanningen bevinden moet. Als er een gebrek aan synteny tussen de stammen is, kan de vervanging van de target-gen dat codeert opeenvolging met de cassette Kan ook mislukken als gevolg van verschillen in de inhoud van de begeleidende regio's. Daarom, alvorens op P1-gemedieerde gene schrapping, onderzoekers dient de sequenties van de donor en ontvanger stammen om ervoor te zorgen dat de flankerende sequenties zijn homologe. Dit is natuurlijk alleen mogelijk als de stammen hebben zijn gesequentieerd. In het geval van stammen met een onbekende reeks, kan P1 transductie mislukken of andere problemen veroorzaken, zoals een gen-conversie in de begeleidende regio's. P1 kunt transduce ongeveer 90 kilobase paren van DNA; Als er verschillen in de inhoud van het gen in de regio's rond het target-gen (bvkleine verwijderingen en invoegingen), is het waarschijnlijk dat dit naar de volgorde van de donor terugkeren zal. Dit zou kunnen hebben onbedoelde gevolgen op het fenotype van de ontvangende stam. Dus, waar mogelijk, de sequenties van de donor en de ontvanger rond het gen van belang moeten altijd worden vergeleken vóór P1 transductie.
Kortom, is P1 transductie een snelle manier van overdracht van een specifiek gen knock-out naar een aantal stammen, zodra de eerste knock-out-mutatie is gegenereerd. Hoewel de techniek zijn beperkingen heeft, maken het gemak en de snelheid van de uitvoering ervan het een aantrekkelijk alternatief voor andere methoden van gene verwijdering. P1 infecteert alleen E. coli, die normaliter het gebruik ervan tot deze soort beperkt. Echter, sommige varianten van P1 ontwikkeld die hebben een breder scala van host en andere soorten binnen de familie Enterobacteriaceae, en zelfs sommige andere γ-proteobacterial-soorten, kan besmetten zij op verminderde efficiëntie36, 37. zelfs de transductie van gekloonde DNA van E. coli Myxococcus xanthus, een δ-proteobacterium, gerapporteerde38is geweest. In toekomstige experimenten, kon deze varianten met de vir mutatie uit te breiden het bereik van geadresseerden stammen gebruikt bij antibiotica cassette gebaseerde gene verwijdering door algemene transductie worden opgedreven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Keio collectie stammen zijn afkomstig van de nationale BioResource Project (NIG, Japan): E. coli. Wij danken Dirk Linke (departement van biowetenschappen, Universiteit van Oslo) voor zijn voortdurende steun. Dit werk werd gefinancierd door de Onderzoeksraad van Noorwegen Young Researcher subsidie 249793 (aan Jack C. Leo).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Strains | |||
| E. coli BW25113 | NIG | ME6092 | Wild-type strain of Keio collection |
| E. coli BL21(DE3) | Merck | 69450-3 | Expression strain |
| E. coli BL21DABCF | Addgene | 102270 | Derived from BL21(DE3) |
| E. coli JW4179 | NIG | JW4179-KC | tamA deletion mutant |
| P1 vir | NIG | HR16 | Generally transducing bacteriophage |
| Plasmids | |||
| pCP20 | CGSC | 14177 | conditionally replicating plasmid with FLP |
| pASK-IBA2 | IBA GmbH | 2-1301-000 | expression vector |
| pEibD10 | N/A | N/A | for production of EibD; plasmid available on request |
| pET22b+ | Merck | 69744-3 | expression vector |
| pIBA2-YadA | N/A | N/A | for production of YadA; plasmid available on request |
| Chemicals | |||
| Acetic acid | ThermoFisher | 33209 | |
| Agar | BD Bacto | 214010 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Ampicillin | Applichem | A0839 | |
| Anhydrotetracycline | Abcam | ab145350 | |
| anti-collagen type I antibody COL-1 | Sigma | C2456 | |
| Bovine collagen type I | Sigma | C9791 | |
| Calcium chloride | Merck | 102382 | |
| Chloroform | Merck | 102445 | |
| Di-sodium hydrogen phosphate | VWR | 28029 | |
| DNA dye | Thermo | S33102 | |
| DNA molecular size marker | New England BioLabs | N3232S | |
| DNase I | Sigma | DN25 | |
| dNTP mix | New England Biolabs | N0447 | |
| ECL HRP substrate | Advansta | K-12045 | |
| EDTA | Applichem | A2937 | |
| Glycerol | VWR | 24388 | |
| goat anti-mouse IgG-HRP | Santa Cruz | sc-2005 | |
| goat anti-rabbit IgG-HRP | Agrisera | AS10668 | |
| HEPES | VWR | 30487 | |
| Isopropyl thiogalactoside | VWR | 43714 | |
| Kanamycin | Applichem | A1493 | |
| Lysozyme | Applichem | A4972 | |
| Magnesium chloride | VWR | 25108 | |
| Manganese chloride | Sigma | 221279 | |
| N-lauroyl sarcosine | Sigma | L9150 | |
| Skim milk powder | Sigma | 70166 | |
| Sodium chloride | VWR | 27808 | |
| tamA forward primer | Invitrogen | N/A | Sequence 5'-GAAAAAAGG ATATTCAGGAGAAAATGTG-3' |
| tamA reverse primer | Invitrogen | N/A | Sequence 5'-TCATAATT CTGGCCCCAGACC-3' |
| Taq DNA polymerase | New England Biolabs | M0267 | |
| Tri-sodium citrate | Merck | 106448 | |
| Tryptone | VWR | 84610 | |
| Tween20 | Sigma | P1379 | |
| Yeast extract | Merck | 103753 | |
| Equipment | |||
| Agarose gel electrophoresis chamber | Hoefer | SUB13 | |
| Bead beater | Thermo | FP120A-115 | |
| CCD camera | Kodak | 4000R | |
| Electroporation cuvettes | Bio-Rad | 165-2089 | |
| Electroporation unit | Bio-Rad | 1652100 | |
| Gel imager | Nippon Genetics | GP-03LED | |
| Incubating shaker | Infors HT | Minitron | |
| Incubator | VWR | 390-0482 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| Microwave oven | Samsung | CM1099A | |
| PCR machine | Biometra | Tpersonal | |
| PCR strips | Axygen | PCR-0208-CP-C | |
| pH meter | Hanna Instruments | HI2211-01 | |
| PVDF membrane | ThermoFisher | 88518 | |
| SDS-PAG electrophoresis chamber | ThermoFisher | A25977 | |
| Tabletop centrifuge | Beckman Coulter | B06322 | |
| Vortex mixer | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Water bath | GFL | D3006 | |
| Wet transfer unit | Hoefer | TE22 |
References
- Blount, Z. D. The unexhausted potential of E. coli. eLife. 4, e05826 (2015).
- Hamilton, C. M., Aldea, M., Washburn, B. K., Babitzke, P., Kushner, S. R. New method for generating deletions and gene replacements in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 171 (9), 4617-4622 (1989).
- Link, A. J., Phillips, D., Church, G. M. Methods for generating precise deletions and insertions in the genome of wild-type Escherichia coli: application to open reading frame characterization. Journal of Bacteriology. 179 (20), 6228-6237 (1997).
- Sawitzke, J. A., Thomason, L. C., Costantino, N., Bubunenko, M., Datta, S., Court, D. L. Recombineering: in vivo genetic engineering in E. coli, S. enterica, and beyond. Methods in Enzymology. 421, 171-199 (2007).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (12), 6640-6645 (2000).
- Muyrers, J. P., Zhang, Y., Stewart, A. F. Techniques: Recombinogenic engineering--new options for cloning and manipulating DNA. Trends in Biochemical Sciences. 26 (5), 325-331 (2001).
- Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Molecular Systems Biology. 2, (2006).
- Yamamoto, N., et al. Update on the Keio collection of Escherichia coli single-gene deletion mutants. Molecular Systems Biology. 5, 335 (2009).
- Baba, T., Huan, H. -C., Datsenko, K., Wanner, B. L., Mori, H. The applications of systematic in-frame, single-gene knockout mutant collection of Escherichia coli K-12. Methods in Molecular Biology. 416, Clifton, NJ. 183-194 (2008).
- Chattopadhyay, M. K., Tabor, C. W., Tabor, H. Polyamines are not required for aerobic growth of Escherichia coli: preparation of a strain with deletions in all of the genes for polyamine biosynthesis. Journal of Bacteriology. 191 (17), 5549-5552 (2009).
- Xie, X., Wong, W. W., Tang, Y. Improving simvastatin bioconversion in Escherichia coli by deletion of bioH. Metabolic Engineering. 9 (4), 379-386 (2007).
- Maeda, T., Sanchez-Torres, V., Wood, T. K. Escherichia coli hydrogenase 3 is a reversible enzyme possessing hydrogen uptake and synthesis activities. Applied Microbiology and Biotechnology. 76 (5), 1035-1042 (2007).
- Meehan, B. M., Landeta, C., Boyd, D., Beckwith, J. The disulfide bond formation pathway is essential for anaerobic growth of Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 199 (16), (2017).
- Niba, E. T. E., Naka, Y., Nagase, M., Mori, H., Kitakawa, M. A genome-wide approach to identify the genes involved in biofilm formation in E. coli. DNA Research. 14 (6), 237-246 (2008).
- Heinz, E., et al. Conserved features in the structure, mechanism, and biogenesis of the inverse autotransporter protein family. Genome Biology and Evolution. 8 (6), 1690-1705 (2016).
- Selkrig, J., et al. Discovery of an archetypal protein transport system in bacterial outer membranes. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (5), 506-510 (2012).
- Stubenrauch, C., et al. Effective assembly of fimbriae in Escherichia coli depends on the translocation assembly module nanomachine. Nature Microbiology. 1 (7), 16064 (2016).
- Leo, J. C., Goldman, A. The immunoglobulin-binding Eib proteins from Escherichia coli are receptors for IgG Fc. Molecular Immunology. 46 (8-9), 1860-1866 (2009).
- Mühlenkamp, M., Oberhettinger, P., Leo, J. C., Linke, D., Schütz, M. S. Yersinia adhesin A (YadA) - Beauty & beast. International Journal of Medical Microbiology. 305 (2), 252-258 (2015).
- Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. Journal of Molecular Biology. 189 (1), 113-130 (1986).
- Meuskens, I., Michalik, M., Chauhan, N., Linke, D., Leo, J. C. A new strain collection for improved expression of outer membrane proteins. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 464 (2017).
- Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene. 158 (1), 9-14 (1995).
- Grosskinsky, U., et al. A conserved glycine residue of trimeric autotransporter domains plays a key role in Yersinia adhesin A autotransport. Journal of Bacteriology. 189 (24), 9011-9019 (2007).
- Leo, J. C., et al. The structure of E. coli IgG-binding protein D suggests a general model for bending and binding in trimeric autotransporter adhesins. Structure. 19 (7), London, UK. 1021-1030 (1993).
- Bertani, G. Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 62 (3), 293-300 (1951).
- Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. Journal of Molecular Biology. 166 (4), 557-580 (1983).
- Leo, J. C., Oberhettinger, P., Linke, D. Assessing the outer membrane insertion and folding of multimeric transmembrane β-barrel proteins. Methods in Molecular Biology. , Clifton, NJ. 157-167 (2015).
- Mikula, K. M., Leo, J. C., Łyskowski, A., Kedracka-Krok, S., Pirog, A., Goldman, A. The translocation domain in trimeric autotransporter adhesins is necessary and sufficient for trimerization and autotransportation. Journal of Bacteriology. 194 (4), 827-838 (2012).
- Thomason, L. C., Costantino, N., Court, D. L., et al. E. coli genome manipulation by P1 transduction. Current Protocols in Molecular Biology. Ausubel, F. M., et al. , Chapter 1, Unit 1.17 (2007).
- Franklin, N. C. Mutation in gal U gene of E. coli blocks phage P1 infection. Virology. 38 (1), 189-191 (1969).
- Jeong, H., et al. Genome sequences of Escherichia coli B strains REL606 and BL21(DE3). Journal of Molecular Biology. 394 (4), 644-652 (2009).
- Greene, E. C. DNA Sequence Alignment during Homologous Recombination. Journal of Biological Chemistry. 291 (22), 11572-11580 (2016).
- Watt, V. M., Ingles, C. J., Urdea, M. S., Rutter, W. J. Homology requirements for recombination in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (14), 4768-4772 (1985).
- Ho, T. D., Waldor, M. K. Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 gal mutants are sensitive to bacteriophage P1 and defective in intestinal colonization. Infection and Immunity. 75 (4), 1661-1666 (2006).
- Ikeda, H., Tomizawa, J. I. Transducing fragments in generalized transduction by phage P1. I. Molecular origin of the fragments. Journal of Molecular Biology. 14 (1), 85-109 (1965).
- Murooka, Y., Harada, T. Expansion of the host range of coliphage P1 and gene transfer from enteric bacteria to other Gam-negative bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 38 (4), 754-757 (1979).
- Goldberg, R. B., Bender, R. A., Streicher, S. L. Direct selection for P1-sensitive mutants of enteric bacteria. Journal of Bacteriology. 118 (3), 810-814 (1974).
- O'Connor, K. A., Zusman, D. R. Coliphage P1-mediated transduction of cloned DNA from Escherichia coli to Myxococcus xanthus: use for complementation and recombinational analyses. Journal of Bacteriology. 155 (1), 317-329 (1983).
