Summary
Her præsenterer vi en protokol til brug af allerede eksisterende antibiotisk resistens-kassette sletning konstruktioner som grundlag for at foretage sletning mutanter i andre E. coli stammer. Sådan sletning mutationer kan mobiliseres og indsættes i den tilsvarende locus af en modtagende stamme ved hjælp af P1 bacteriophage transduktion.
Abstract
En første tilgang til at studere funktionen af en ukendt gen i bakterier er at skabe en knock-out af dette gen. Her, beskriver vi en robust og hurtig protokol til at overføre genmutationer sletning fra én Escherichia coli stamme til en anden ved hjælp af generaliseret transduktion med bacteriophage P1. Denne metode kræver, at mutationen er valgbar (f.eks. baseret på gen forstyrrelser ved hjælp af antibiotika kassette indrykninger). Sådanne antibiotika kassetter kan mobiliseres fra en donor stamme og tilføres en modtagende stamme af interesse for hurtigt og generere nemt en gen sletning mutant. Den antibiotiske kassette kan designes til at omfatte flippase anerkendelse steder der tillader excision af kassetten ved en lokationsspecifik recombinase at producere en ren knock-out med kun ~ 100-base par lange ar sekvens i genomet. Vi demonstrere protokollen ved at udskære tamA genet kodning en forsamling faktor involveret i autotransporter Biogenese og teste effekten af denne knock-out på Biogenese og funktion af to trimeric autotransporter adhesins. Selvom genet sletning af P1 transduktion har sine begrænsninger, gøre lethed og hastighed af dens gennemførelse det et attraktivt alternativ til andre metoder til gen sletning.
Introduction
En fælles første tilgang til at studere funktionen af et gen er at udføre knock-out mutagenese og observere den resulterende fænotype. Dette kaldes også omvendt genetik. Bakterien E. coli har været arbejdshesten i Molekylærbiologi for de sidste 70 år eller så, på grund af lethed af dens dyrkning og sin imødekommenhed til genmanipulation1. Flere metoder er blevet udviklet for at producere gen sletninger i E. coli, herunder markør exchange mutagenese2,3 og mere for nylig, recombineering bruger λ rød eller Rac ET systemer4,5 , 6.
I et almindeligt anvendte system, er kodning sekvenser af enkelte gener erstattet af en antibiotisk resistens kassette, der senere kan være skåret ud fra kromosom5,7. De kodning sekvenser erstattes, for eksempel ved en kanamycin (Kan) modstand kassette, der er flankeret af flippase (FLP) genkendelsessekvenser mål (FRT) på begge sider. FRT websteder er anerkendt af recombinase FLP, der medierer lokationsspecifikke rekombination mellem FRT websteder fører til sletning af Kan kassette. På denne måde opnås en fuldstændig sletning af en given genet kodende sekvens på efterlod kun en minimal ar sekvens af ca. 100 basepar (bp) (figur 1).
Lidt over et årti siden, blev den såkaldte Keio samling udviklet. Dette er en bakteriel bibliotek baseret på en standard laboratorium E. coli K12 stamme, hvor næsten alle ikke-væsentlige gener var individuelt slettet af λ røde rekombination7,8. Kloner i denne samling har en kodende sekvens erstattet med en punktafgiftspligtige Kan modstand kassette. Samlingen Keio har vist sig for at være et nyttigt redskab for mange applikationer9. En sådan anvendelse er produktion af sletning mutanter i andre E. coli stammer. Kan kassette fra en given sletning klon kan tilvejebringes af generelt transducing Bakteriofager, som P110,11,12,13,14. En phage bestand fremstillet af sådan en stamme kan derefter bruges til at inficere en modtager E. coli stamme af interesse, hvor en lav, men pålidelige frekvens Kan kassette-holdige region kan indarbejdes i den modtagende genom af homologe rekombination (Figur 2). Transductants kan vælges for vækst på de Kan-holdige medium. Efter dette, eventuelt fjernelse af antibiotikaresistens kassette kan FLP recombinase også leveres til transductant stammen i trans. Efter hærdning FLP-holdige plasmidet, som bærer en ampicillin (Amp) modstand markør, Kan og Amp-følsomme kloner er screenet for, og den korrekte excision af vildtype kodende sekvens og Kan kassette er verificeret af kolonien PCR.
Her præsenteres en detaljeret protokol, der beskriver hvert af trinene i producerer en knock-out E. coli stamme baseret på den strategi, der er skitseret ovenfor. Som et eksempel, er en sletning af tamA -genet påvist. tamA koder en ydre membran β-tønde protein, der er en del af Transport og montage modul (TAM), som er involveret i Biogenese af visse autotransporter proteiner og pili15,16,17. Denne knock-out stamme blev derefter brugt til at undersøge effekten af tamA sletning på Biogenese to trimeric autotransporter adhesins (TAAs), Yersinia adhesin YadA og E. coli immunglobulin (Ig)-bindende TAA EibD 18,19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. stammer og plasmider
-
Bakteriestammer
- Bruge E. coli stammer BW251135, JW4179 (BW25113 tamA::kan)7, BL21(DE3)20og BL21ΔABCF21. Yderligere oplysninger finder du i Tabellen af materialer .
-
Bakteriofager
- Bruge phage P1vir for den generelle transduktion. Gemme phage som en flydende materiel med et par dråber chloroform (Se trin 2.2). For mere information, se Tabel af materialer.
-
Plasmider
- Brug de følgende plasmider i denne protokol: pCP2022, pIBA2-YadA23og pEibD1024. Som kontrol plasmider, bruge pASK-IBA2 og pET22b (Se Tabel af materialer).
-
Vækstbetingelser
- Udbrede bakterier i en lysogeny bouillon (LB) medium25 under kraftig omrystning (180-200 omdr. / min.) på 37 ° C og 30 ° C for BL21ΔABCF og stammer, der indeholder pCP20.
- Udføre plasmid hærdning ved 43 ° C.
- For en solid medium, supplere LB med 1% agar (w/v).
- Top agar, supplere LB med 0,7% agar og 10 mM CaCl2 og autoklave medium. Bruge SOC medium til genopretning efter elektroporation26.
- Brug følgende koncentrationer for antibiotika: 100 μg/mL for Amp og 25 μg/mL for Kan.
2. udarbejde en Phage Lysate
-
Infektion af donor stamme
- Vokse donor stamme JW4197 i 5 mL af LB medium suppleret med 10 mM CaCl2 og eventuelt Kan (25 µg/mL) til en optisk tæthed på 600 nm (OD600) ~ 1.0. Måle værdien OD600 bruger et spektrofotometer.
- Gøre en fortyndingsrække af en eksisterende P1 phage materiel i LB medium: anbefalede fortyndinger er mellem 10-3 til 10-7.
- Mix 200 μl af den bakterielle suspension og 100 μL af en given phage fortynding i en 15 mL centrifugeglas eller tilsvarende. Forbered så mange rør som phage fortyndinger. Inkuber rør i 20 min. ved 37 ° C uden rystelser.
- Tilføje ~ 3 mL af smeltet top agar (~ 50 ° C) suppleres med 10 mM CaCl2 til rør, bland indholdet grundigt af vortexing rør kort, og hæld blandinger på forvarmet LB plader til at gøre selv lag.
- Inkuber plader natten over ved 37 ° C.
-
Lysate forberedelse
- Den følgende dag vælge en plade med en semi-sammenflydende vækst af phage plaques. På en semi-sammenflydende plade, ca halv overfladearealet af pladen er klart (figur 3).
- Skrabe det øverste agar lag fra sådan en plade ved hjælp af en podning loop eller en ligedannet værktøj og placere den øverste agar i et centrifugeglas. Tilføje 1-2 mL af LB og en dråbe af chloroform og vortex rør kraftigt i ~ 1 min. Tilføj chloroform i et stinkskab.
- Der centrifugeres tube for 15 min på 4.000 x g eller hurtigere at sammenpresse agar og bakterieceller.
- Flytte supernatanten til en frisk microcentrifuge røret, undgå fremførsel eventuelle rester fra toerstoffet. Tilsæt 2 dråber chloroform og gemme den lysate på 4-10 ° C. Tilføje chloroform i et stinkskab. Ikke fryse phage lysate da dette vil resultere i en betydelig reduktion af antallet af smitsomme partikler.
-
Bestemmelse af lysate titer
- Vokse BW25113 i LB suppleret med 10 mM CaCl2 ved 37 ° C, indtil kulturen når en OD600 ~ 1.0.
- Forberede en fortyndingsrække af phage lysate i LB (f.eks, 10-6– 10-9).
Bemærk: Vær forsigtig til afpipetteres prøven fra toppen af den lysate til at undgå at overføre chloroform til koncentrationer. - Mix 200 μl af den bakterielle suspension og 100 μL af en given phage fortynding i en 15 mL centrifugeglas eller tilsvarende. Forbered så mange rør som phage fortyndinger. Inkuber rør i 20 min. ved 37 ° C uden rystelser.
- Tilføje ~ 3 mL af smeltet top agar (~ 50 ° C) suppleres med 10 mM CaCl2 til rør, blande indholdet grundigt af vortexing rør kort og hæld blandingen på forvarmet LB plader til at gøre selv lag.
- Inkuber plader natten over ved 37 ° C.
- Den følgende dag tælle antallet af plaques (klart regioner i den bakterielle mat) for hver plade og beregne titer lysate ved brug af følgende formel:
Eksempel: På plader med fortyndinger 10-7, 10-8og 10-9er der 231, 27 og 2 plaques, henholdsvis. Som 100 μL af hver fortynding blev brugt til infektionen, og fordi titer udtrykkes som plak-dannende enheder (pfu) / mL, plating faktor er 10. Disse numre angives i formlen:
Således er titer ca 2 x 1010 smitsomme phage partikler/mL.
3. P1 transduktion
-
Forberede de modtagende celler
- Vokser den modtagende stamme BL21ΔABCF i LB suppleres til en optisk tæthed på 600 nm (OD600) ~ 1.0. Brug et spektrofotometer til måling af OD600 værdi.
- Beregning af volumen af phage lysate nødvendig for at opnå en mangfoldighed af infektion (MOI) værdi på 0,5. For at beregne MOI, estimere antallet af bakterier baseret på OD600 af kultur. Antage, at en OD600 værdi på 1,0 svarer til ~ 109 cfu/mL. Beregning af volumen kræves baseret på den kendte titer af den lysate.
Eksempel (baseret på titer beregnet i eksempel efter trin 2.3.6):
- Tilføje CaCl2 til den modtagende stamme kultur til 10 mM og bland. Tage 1 mL af kulturen for transduktion.
-
Udfører transduktion
- Tilføje den passende mængde phage lysate til 1 mL af modtagerens kultur (herunder CaCl2 på 10 mM) som beregnet i trin 3.1.2 og bland forsigtigt.
Bemærk: Vær forsigtig til afpipetteres prøve fra toppen af den lysate til at undgå at overføre chloroform til mix. - Statisk Inkuber mix i 20 min. ved 37 ° C.
- Stop infektionen ved at tilføje natriumcitrat, pH 5,5, til 100 mM.
- Centrifugeres bakterier (5.000 x g i 2 min.) og Fjern supernatanten, derefter resuspend dem i 1 mL frisk LB suppleret med 100 mM natriumcitrat, pH 5,5.
- Vaske cellerne to gange mere som i trin 3.2.4 at sikre fjernelse af gratis phages og calcium.
- Resuspend bakterier i 1 mL frisk LB suppleret med 100 mM natriumcitrat, pH 5,5. Inkuber bakterier ved 30 ° C i 1 time med rysten (> 100 rpm).
- Indsamle bakterier ved centrifugering (5.000 x g i 2 min.) og resuspend dem i ~ 100 μL af LB med 100 mM natriumcitrat, pH 5,5.
- Sprede bakterier på en LB plade suppleret med Kan på 25 µg/mL og 10 mM natriumcitrat, pH 5,5, og vokse bakterier ved 30 ° C, indtil kolonier vises (~ 24 h).
- Tilføje den passende mængde phage lysate til 1 mL af modtagerens kultur (herunder CaCl2 på 10 mM) som beregnet i trin 3.1.2 og bland forsigtigt.
-
At vælge transductants
- Når kolonierne er vokset på udvalg plade, restreak dem på LB + Kan for enkelte kolonier og vokse ved 30 ° C, indtil enkelt kolonier vises.
4. udtagelse Kan kassette
-
Transformation med rekombination plasmid
- Gøre Kan-resistent BL21ΔABCF stamme electrocompetent.
- Vokse stamme fra en enkelt koloni i frisk LB (5 mL) suppleret med Kan (25 µg/mL) ved 30 ° C indtil OD600 er ~0.5 – 0,7.
- Udfør følgende trin ved 4 ° C eller på is herfra på. Centrifugeres bakterier (5.000 x g i 10 min.) og Fjern supernatanten.
- Vaske celle pellet med iskold destilleret vand to gange ved at gentage trinnet tidligere centrifugering, og endelig resuspend celle pellet i 100 µL af iskold 10% glycerol.
- Køle ned 1 mm elektroporation kuvetter på is.
- Tilføje 1 pg af plasmid DNA (pCP20) til cellesuspension, bland suspension forsigtigt, og overføre det til en afkølet elektroporation kuvette.
- Sæt electroporator til 1,8 kV og electroporate celler.
- Rescue transformerede celler ved tilsætning af 1 mL af SOC medium og voksende dem i 1 time ved 30 ° C.
- Plade 100 µL af celler på LB + Amp plader og dyrke celler ved 30 ° C natten over.
- Gøre Kan-resistent BL21ΔABCF stamme electrocompetent.
-
Induktion af rekombination
- Pick enkelt kolonier fra LB + Amp plade og podes frisk LB udelade alle antibiotika.
- Vokse celler på den ikke-eftergivende temperatur (43 ° C) natten til inducerer udtryk af FLP recombinase.
-
Valg af recombinants
- Serielle fortyndinger og plade 50 µL af en 105-106 fortynding på non-selektive plader og dyrke det natten over ved 30 ° C.
5. efterprøvning af genet sletning
-
Verifikation af plasmid tab og vellykket rekombination
- Streak enkelt kolonier fra pladerne forberedt i trin 4.3.1 på £ + Kan, LB + Amp og £ plader uden antibiotika, i denne rækkefølge. For at støtte i de striber, bruge en koloni gitter (Se supplerende fil 1). Vokse plader ved 30 ° C, indtil kolonier vises (~ 24 h).
- Vælge 10 – 20 kloner, der har dyrket på de non-selektive plade men mislykkedes at vokse på selektiv medierne for yderligere kontrol.
-
Yderligere kontrol af kolonien PCR
- Udføre en koloni PCR med primere flankerende tamA kodende sekvens (Se Tabel af materialer).
- Forberede en master PCR mix. Bland nødvendige mængde afhænger af antallet af kolonier skal testes (se eksempel i tabel 1). Bland reagenser på is, tilføje polymerasen sidst.
- Bland PCR master mix grundigt, så undvære 20 µL til rør af en PCR strip. Vælge en lille mængde af hver koloni skal screenes ved hjælp af en steril pipette tip og føje det til et rør. Husk at medtage den oprindelige modtagende stamme for sammenligning. Eventuelt også medtage donor stamme.
- Køre en PCR reaktion (Se tabel 2 for programmet bruges).
- Forberede en 1%-agarosegel.
- For en 50 mL gel, måle 0,5 g Agarosen og tilsættes 50 mL af TAE buffer (40 mM Tris, 20 mM eddikesyre og 1 mM EDTA, pH 8,0). Opvarm blandingen i en mikrobølgeovn, indtil alle Agarosen er opløst.
- Når Agarosen er opløst, cool løsning til cirka 50 ° C, og derefter tilsættes 5 μl DNA farvning farvestof. Bland opløsningen godt og hæld det i en gel bakke i en støbning afdeling. Indsæt en eller flere rækker med godt kamme, så der er tilstrækkelig brønde for alle prøver samt Molekylær størrelse markører. Tillad gel til at sætte i 30 min.
- Når PCR-kørslen er færdig, skal du tilføje 4 µL af 6 x DNA lastning farvestof til hver prøve. Placere gel elektroforese her og tilføje TAE buffer, indtil brøndene er dækket.
- Anvende 10 – 15 µL fra hver PCR reaktion til en brønd i gelen. Også tilføje 5 µL af molekylært størrelse markør. Kør derefter gelen i 30 min på 75 V.
- Når kørslen er færdig, image gel ved hjælp af et blåt-lys imager.
6. andre teknikker
-
Protein udtryk
Bemærk: Udtryk for test proteiner (YadA og EibD) er blevet beskrevet udførligt andetsteds23,24. Dette er et kort resumé af de vigtigste skridt.- Omdanne BL21ΔABCF ΔtamA wi'te de nødvendige plasmider (pIBA2-YadA og pEibD10 og de tilsvarende kontrol plasmider) og vælg for transformants på LB + Amp.
- For udtrykket, protein, podes 100 mL af LB medium + Amp med 1 mL af en overnight kultur af transformerede bakterier og dyrke disse ved 30 ° C indtil midten log fase, på hvilket tidspunkt, fremkalde protein produktion med enten anhydrotetracycline (ved 100 ng/mL) eller isopropyl thiogalactoside (på 0,5 mM).
- Efter 2 h af induktion ved 30 ° C, måle turbiditet kulturer og samle et antal celler svarende til 50 mL på OD600 = 1,0 ved centrifugering kulturer for 15 min på 4.000 x g. Vaske pelleten 1 x med 10 mM HEPES, pH 7,4, og derefter enten gemme det på-20 ° C eller proces den yderligere som i trin 6.2.
-
Ydre membran udvinding
Bemærk: Ydre membran ekstraktion foretages som beskrevet i detaljer af Leo et al. 27. de vigtigste trin er opsummeret nedenfor.- Resuspend celle pellet i 1 mL af 10 mM HEPES, pH 7,4, suppleret med 10 mM MgCl2 og frihedsbevægelse2, lysozym (0,1 mg/mL) og en knivspids af DNase jeg.
- Lyse celler (f.eks.ved hjælp af en perle tæppebanker).
- Der centrifugeres celler kort (2 min til 15,600 x g) for at fjerne celle debris og flytte supernatanten til en frisk tube.
- Der centrifugeres celler i 30 min på 16.000 x g, hvorefter, resuspenderes i 400 μL af 1% N-lauroyl sarcosine i 10 mM HEPES, pH 7,4.
- Inkuber celler med agitation i 30 min. ved stuetemperatur, hvorefter, centrifugeres dem i 30 min. som ovenfor.
- Vask det gennemskinnelige pellet 1 x med 200 μl af 10 mM HEPES, pH 7,4, derefter resuspend det i 30 μL af 10 mM HEPES og tilsættes 10 μL af 4 x SDS-PAGE prøvebuffer.
-
Aktivitet assays
Bemærk: Udføre SDS-PAGE og aktivitet assays for YadA og EibD som beskrevet28. De vigtigste trin er opsummeret nedenfor. -
SDS-PAGE
- Opvarme prøverne ved 50 ° C i 5 min inden du lægger dem på en polyacrylamid gel, til at undgå denaturering af proteiner.
- Efter separation i SDS-PAGE, overføre proteiner til en polyvinylidene xenondifluorid (PVDF) membran.
- Efter overførslen, blokere membran med 2% skummetmælkspulver i PBS.
-
YadA-kollagen langt-western skamplet
- Efter blokering, tilføje bovine kollagen type jeg fortyndet i blokerende buffer til en koncentration på 10 μg/mL, og der inkuberes membran for 1 h.
- Vaske membran 2 x med PBS + 0,05% Tween20 (PBS-T).
- Tilføj primære antistof (monoklonale anti-kollagen COL-1) til membranen, fortyndet 1:2,000 i blokerende buffer.
- Efter inkubation membran for 1 h, vask 2 x som nævnt i trin 6.3.2.2 og derefter tilføje sekundær antistof [ged anti-mus IgG-peberrod peberrodsperoxidase (HRP) konjugat], fortyndet 1:10,000 i blokerende buffer.
- Inkuber membran for 1 h, derefter vaske det 2 x med PBS-T. Tilføj et forstærket kemiluminescerende substrat til membran ifølge producentens anvisninger og opdage bandet ved hjælp af en CCD kamera.
-
EibD-IgG bindende assay
- Efter blokering, tilføje en sekundær antistof (ged anti-kanin HRP), fortyndet 1:2,000 i blokerende buffer.
- Inkuber membran for 1 h, derefter vaske det 2 x med PBS. Udføre kemiluminescens registrering som nævnt i trin 6.3.2.5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Generation af en tamA Knock-out af BL21ΔABCF:
Den strategi, der er skitseret ovenfor har tidligere været brugt til at producere en afledte stamme af BL21(DE3), en standard laboratorium stamme anvendes ved produktion af protein, som er optimeret til ydre membran protein produktion og kaldte BL21ΔABCF21. Denne stamme mangler fire gener, der koder for rigelige ydre Membranproteiner og derfor er i stand til at producere mere heterologously udtrykt ydre Membranproteiner end vildtype stamme. For at teste, om TAM er involveret i TAA Biogenese, blev tamA genet slettet i denne baggrund.
En P1 lysate blev udarbejdet fra Keio samling stamme JW4179, hvor tamA genet (tidligere kaldet yftM) kodende sekvens er erstattet af en Kan modstand kassette. Derefter, en transduktion eksperimentet blev udført med BL21ΔABCF som de modtagende stamme. Flere Kan-resistente kolonier blev opnået, hvorefter to blev valgt for excision af Kan kassette. Plasmidet pCP20, kodning recombinase FLP blev indført i disse kloner og efterfølgende helbredt ved at dyrke ved 43 ° C i mangel af en antibiotisk udvalg. En række kloner blev screenet for følsomhed over for både Amp (som er en markør for pCP20) og Kan, og flere kloner følsomme over for begge blev indhentet. Disse kloner var kontrolleret af kolonien PCR ved hjælp af primere flankerende tamA kodende sekvens og fundet at tamA gen havde været slettet (figur 4).
Tamas rolle i TAA Biogenese:
TamA har vist sig at være involveret i Biogenese af nogle klassiske autotransporters16 og inverteret autotransporter intimin15. For at teste, om TamA er vigtigt for Biogenese af TAAs, blev BL21ΔABCF ΔtamA omdannet med plasmider kodning to test proteiner, Yersinia adhesin YadA og E. coli Ig-bindende protein EibD. Disse proteiner er kendt for at udtrykke vel i E. coli og har været brugt som modeller for TAA Biogenese i tidligere undersøgelser23,28.
Efter inducerende protein produktion, blev de ydre membran brøker udtryk kulturer isoleret og analyseret af SDS-PAGE. Prøverne blev ikke kogt for at vise trimerization af proteiner. Trimere køre på størrelser over 100 kDa, hvorimod monomerer har forventede størrelser af 45 kDa (YadA) og 51 kDa (EibD). Ingen større forskelle blev observeret mellem udtryk i BL21ΔABCF og BL21ΔABCF ΔtamA, selvom YadA synes at være produceret på et noget lavere niveau i ΔtamA stamme (figur 5A). Men modsat synes at være tilfældet for EibD.
For at undersøge, om manglen TamA kan påvirke den korrekte folding eller transport af proteiner, blev deres evne til at binde til ligander testet. For YadA, var dette udført af en kollagen langt-western skamplet (figur 5B). YadA, bundet i begge stammer, collagen på et tilsvarende niveau, viser, at proteinet er korrekt foldet og funktionelle. På samme måde, IgG-bindende aktiviteter af EibD i de to stammer korreleret med udtryk niveau (figur 4 c). Disse resultater viser, at sletningen af tamA ikke har en betydelig indvirkning paa TAA Biogenese, i det mindste ikke for disse to model TAAs.
Figur 1: Generation af knock-outs med punktafgiftspligtige antibiotika kassetter. For at producere gen-knock-outs, er et gen af interesse (genet B i dette eksempel) erstattet af en Kan modstand kassette flankeret af FRT websteder. FRT-Kan kassette, til gengæld er flankeret af kort (~ 50 bp) strækninger af sekvens homologe til upstream og downstream regioner af genet B. Den kodende sekvens af genet B er udvekslet for FRT-Kan kassette af λ røde rekombination. Når dette er opnået, kan Kan kassetten, selv fjernes ved at indføre FLP-recombinase, som vil mægle en lokationsspecifik rekombination mellem FRT websteder. Dette punktafgifter Kan kassette, forlader en minimal (~ 100 bp) ar sekvens i B locus. For alle detaljer, se Baba et al. 7. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: gen sletning af P1 transduktion. Donor stamme (beige) bærer en Kan kassette, der har erstattet gen af interesse (gul) på kromosom (blå). Donoren er smittet med P1 bacteriophage. Phage ganger i donor stamme, producerer et stort antal descendenter. De fleste er wild-type (rød genom), men en fraktion der transducing phages, der har indarbejdet en del af donor stamme kromosom snarere end phage DNA (blå genom). En del af disse vil indeholde Kan kassette (gul genom). Til sidst, den inficerede vært celle lyses og frigiver phages i mediet. Disse bruges til at forberede en lysate. I transduktion eksperiment, er den modtagende stamme (lyseblå) inficeret med den lysate forberedt fra donor stamme. I et mindretal af tilfældene, er modtageren inficeret af en transducing phage transporterer Kan kassette (vist her). Hvis de regioner, der støder op til Kan kassette undergår homologe rekombination, er Kan kassette indarbejdet i den modtagende kromosom erstatter den endogene allel, hvilket resulterer i Kan-resistente kloner, der kan vælges til. Tilsætning af FLP recombinase på en helbredelig plasmid punktafgifter Kan kassette, forlader kun en kort ar sekvens (vist her i gult), som vender klon til Kan-følsomme fænotype. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: eksempler på plader efter en P1 infektion. (A) dette panel viser en plade med individuelle plaques. (B) dette panel viser en semi-sammenflydende plade. (C) dette panel viser en over inficerede plade, hvor næsten alle bakterier har været mængden af phage. Nogle resistente kolonierne er vokset ud af top agar lag. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Sletning af tamA kodende sekvens. TamA::kan sletning allel blev introduceret til stamme BL21ΔABCF af P1 transduktion. Efter excision af Kan kassette, en scar sekvens (~ 100 bp) er alt, resterne i tamA locus. Dette blev bekræftet ved PCR, ved hjælp af primere flankerende webstedet sletning. I BL21ΔABCF og dens overordnede stamme, BL21(DE3), giver PCR et produkt længden af tamA kodende sekvens (den forventede størrelse er 1,7 kilobase par). I BL21ΔABCF, hvor har været skåret ud Kan kassette, produktet svarer til den forventede ar sekvens (145 bp). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Udtryk for TAAs af en tamA sletning stamme. (A) dette panel viser SDS-PAGE af ydre membraner fremstillet af celler, der udtrykker TAAs (YadA eller EibD) og vektor kontrol (pIBA2 og pET22). Stammer er BL21ΔABCF og dens afledte stamme mangler TamA (ΔtamA). (B) dette panel viser en kollagen langt-western skamplet YadA prøver. YadA prøver og pIBA2 kontrol panelet A blev overført til en PVDF membran og inkuberes med kollagen type. De blev derefter aftestede med en anti-kollagen antistof og opdaget af ECL. (C) dette panel viser et antistof bindende assay for EibD prøver. EibD prøver og pET22 kontrol fra panelet A blev overført til en PVDF membran og inkuberes med et HRP-konjugerede sekundær antistof og derefter opdaget af ECL. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Reagens | 1 x mix | 7 x mix |
| PCR-grade vand | 17 ΜL | 119 ΜL |
| 10 x polymerase buffer | 2 ΜL | 14 ΜL |
| 10 mM deoxyribonucleotide mix | 0,4 ΜL | 2.8 ΜL |
| 100 µM fremad primer | 0.2 ΜL | 1.4 ΜL |
| 100 µM omvendt primer | 0.2 ΜL | 1.4 ΜL |
| Taq DNA polymerase | 0.2 ΜL | 1.4 ΜL |
| I alt | 20 ΜL | 140 ΜL |
Tabel 1: koloni PCR master mix. Blandingen afhænger af antallet af kolonier skal screenes. Derudover forberede en kontrol reaktion (oprindelige modtager stamme). For eksempel, hvis screening fem kloner, er seks reaktioner påkrævet, herunder kontrol. Det er værd at forberede en ekstra reaktion for at sørge for der er nok PCR mix for alle prøver (gentaget pipettering forstærker lille pipettering fejl). I dette eksempel, forberede en 7 x mix (5 kolonier, 1 kontrol og 1 ekstra reaktion).
| Trin | Temperatur | Tid | Noter |
| 1. | 94 ° C | 3 min | |
| 2. | 94 ° C | 30 s | |
| 3. | 50 ° C | 30 s | |
| 4. | 70 ° C | 2 min | 1 min/kb skal forstærkes, runde op |
| Tilbage til trin 2 24 gange | |||
| 5. | 70 ° C | 5 min | |
| 6. | 12 ° C | For altid | sidste hold |
Tabel 2: Koloni PCR program.
Supplerende fil 1: et eksempel på koloni grid. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
P1 transduktion er en hurtig, robust og pålidelig metode til at generere gen sletninger i E. coli. Det fremgår her af transducing en tamA sletning mutant fra en Keio donor stamme til en BL21-afledte modtager. Hovedstadier i signaltransduktion proces er produktionen af den transducing lysate, transduktion selv, excision af Kan modstand kassette og verifikation af knock-out ved PCR. I alt, processen tager ca 1 uge og kræver ingen molekylærbiologiske metoder der skal anvendes, ud over den endelige PCR for verifikation. Således P1 transduktion kan konkurrere i forbrændte indsats og tid med λ røde rekombination og er meget hurtigere end traditionelle markør exchange mutagenese.
Præsenteres protokollen er meget robust og giver mulighed for ændringer af mange i foranstaltninger. Der er dog et par kritiske parametre. For P1 infektioner er det nødvendigt at tilføje calciumioner til medium. Calcium er nødvendig for adsorption af phage for bakterier, og undladelse af at tilføje tilstrækkeligt calcium til medium vil reducere effektiviteten af infektionen. Nogle bakterielle stammer som BL21ΔABCF har tendens til at samlede i CaCl221. I sådanne tilfælde kan bakterier dyrkes uden CaCl2, som kan føjes til udsættelse kort før infektionen. For mere konventionelle stammer, kan 10 mM CaCl2 indgå i vækstmediet fra begyndelsen.
Omvendt er det vigtigt at fjerne de gratis calcium fra mediet efter transduktion. Citrat er en chelator af calciumioner, og fordi disse er nødvendige for adsorption af P1 til værtsceller, fjernelse den frie calcium fra medium forhindrer yderligere infektioner. Hvis calcium ikke fjernes, vil phages inficere yderligere celler i hele kulturen, i bedste fald reducere effektiviteten af transduktion og i værste fald lysing hele kulturen, herunder transductants.
En anden kritisk trin dyrkning af bakterier transporterer plasmidet pCP20. pCP20 er en betinget replicerer plasmid, der ikke replikerer ved en temperatur på 37 ° C eller højere; således, for at etablere plasmid i cellerne, inkubationer med denne plasmid skal udføres ved 30 ° C (eller mindre), en eftergivende for replikering af pCP20 temperatur. For at kurere pCP20, bruges en høj temperatur (43 ° C). Nogle stammer vokser ikke godt ved denne temperatur. i sådanne tilfælde tilstrækkeligt 37 ° C, selv om plasmid hærdning bliver lidt mindre effektiv ved denne temperatur.
Når plating bakterier til at teste for antibiotika følsomhed, er bestilling af plate striber vigtigt. Protokollen kræver kloner at blive stribede først på antibiotika-holdige plader og endelig på non-selektive medium. På denne måde, investigator kan være sikker på, at manglende vækst på selektiv medierne vil være på grund af antibiotika følsomhed og i stedet for en potentiel manglende materiale overført på pladerne. Efter protokollen, ingen vækst på LB + Kan plade validerer excision af Kan modstand kassette; ingen vækst på LB + Amp plade validerer tabet af rekombination plasmidet pCP20; stammer vokser på LB-tallerkenen (som ikke vokse i de samme striber eksperiment på udvalg plader) vil indeholde de positive recombinants.
De fleste af de andre trin giver mulighed for meget stor skønsmargen. I protokollen som præsenteret, er BL21ΔABCF kulturperler ved 30 ° C, som denne stamme ikke vokser godt ved 37 ° C. Dog kan være kulturperler E. coli stammer uden vækst defekter ved 37 ° C (undtagen når omdannet med pCP20).
Antallet af bakterier anvendes til infektioner kan varieres til en vis grad. Forholdet mellem OD600 og en levedygtig count er nogenlunde lineær mellem en OD600 værdi på 0,1 og 1,0, hvor førstnævnte svarer til cirka 108 cfu/mL og sidstnævnte til ~ 109 cfu/mL. Dette forhold kan dog variere lidt afhængigt af den pågældende stamme, vækstmediet og andre faktorer. Det anbefales, at forholdet mellem OD600 og levedygtige Greven bør fastsættes for hvert laboratorium og stamme, især for beregning af MOI værdier. Antallet af bakterier infektion forsøgsdyr er ikke særligt kritisk, og 109 cfu/mL repræsenterer den tidlige stationær fase, som er et fornuftigt kompromis mellem celle tæthed og andelen af levedygtige celler i kulturen. Hvis et lavere antal levedygtige bakterier anvendes til transduktion, skal antallet af phages simpelthen justeres i overensstemmelse hermed. MOI, selv kan også varieres til en vis grad. Protokollen kræver et MOI værdien med 0,5, selv om alt mellem 0,1 og 0,5 bør resultere i en god effektivitet. På en MOI af 0,5 er forholdet mellem phages for bakterier 1:2 (dvs., halvdelen af antallet af phages i forhold til antallet af bakterier). I eksemplet med i protokollen, OD600 kultur er 1,0, og 1 mL af kulturen anvendes transduktion; antallet af phages kræves er således 5 x 108. En MOI værdien på 0,5 giver en høj grad af infektion men reducerer antallet af bakterier, der smittes dobbelt, hvilket ville reducere effektiviteten af transduktion som wild-type (smitsomme) phages overtal langt de transducing phages. En dobbelt infektion med en transducing phage og en infektiøs phage ville føre til celle lysis, hvilket eliminerer denne transductant fra puljen af overlevende. Derfor bør en MOI af 0,5 ikke overskrides.
Protokollen giver også mulighed for nogle genveje. I stedet for at forberede lysates fra pladerne, nogle forfattere generaladvokat forbereder phage lysates i flydende medium29. Dette kan spare tid, som en natten inkubation trin ikke er påkrævet. Ligeledes kan tilsætningen phage lysate ikke være nødvendigt. Som nævnt ovenfor, MOI er ikke meget kritisk, og rimelig effektivitet kan opnås ved simpelthen at antage en titer på 1010 pfu/mL for en standard lysate.
Trods lethed af teknikken, P1 transduktion er ikke finder generel anvendelse, og flere betingelser skal være opfyldt at være nyttige. Først og fremmest skal en donor stamme med en valgbar knock-out allel foreligge. Dette opnås normalt ved hjælp af en sletning hvor en antibiotikaresistens kassette har erstattet gen af interesse. Samlingen Keio er især nyttige i denne henseende, da det giver en klar-til-brug bibliotek af antibiotika kassette-baserede gen knock-outs som dækker næsten alle ikke-væsentlige gener i E. coli K12. Denne samling er især nyttig for at banke ud bevarede gener findes i de fleste E. coli stammer (dvs., bestanddele af E. coli core genom). For mindre fælles gener, såsom virulens faktorer af sygdomsfremkaldende E. coli stammer eller sjældne stofskiftevej gener, mutationen kan være nødvendigt at blive oprettet de novo. I sådanne tilfælde, kan P1 transduktion vel ikke være den foretrukne metode. Ud over væsentlige gener er gener, der er nødvendige for P1 infektion, såsom galU, mutationer som føre til P1 modstand30, dårlig mål til en sletning af P1 transduktion. En anden note, når du bruger samlingen Keio specielt, er, at et par stammer bære en overlapning af den målrettede gen, hvor kun én kopi var forstyrret af Kan modstand kassette8. I sådanne tilfælde kan gen interesse være afgørende; efterforskere er anbefales at tjekke opdateret anmærkninger for sådanne gener8. Men i betragtning af disse begrænsninger, P1 transduktion tillader sletning af de fleste gener i laboratoriet E. coli stammer. For eksempel forskellene mellem BW25113 og BL21(DE3) er små og påvirker kun en håndfuld af protein-kodning gener31.
For det andet er det vigtigt at understrege, at den modtagende stamme skal være i stand til at en homolog rekombination for transduktion arbejde. En stamme, mangler recombinase RecA kan derfor ændres ikke ved denne metode. Dette udelukker alle standard kloning stammer, såsom DH5α, HB101, TOP10 og XL-1 blå. RecA kan mægle recombinations mellem identiske strækninger så kort som 8 bp; men en længere region af høj lighed vil øge sandsynligheden for rekombination betydeligt32,33. Et andet problem, især i forbindelse med kliniske E. coli stammer, er, at længe O-antigen kæder kan maskere receptoren for P1, der ligger i den centrale oligosaccharid af LPS34. Ud over disse krav til den modtagende stamme, bør P1 stamme bruges til transduktion være en vir mutant; denne mutation er nødvendige for en fuld lytisk infektion35.
En tredje caveat af P1 transduktion er at gene at blive slået ud skal opholde sig i en region med høj lighed i regionerne flankerende mellem donor og recipient stammer. Hvis der er en mangel på synteny mellem stammer, kan udskiftning af target genet kodende sekvens med Kan kassette godt mislykkes, på grund af forskelle i indholdet af de flankerende regioner. Derfor, før der iværksættes på P1-medieret gen sletning, efterforskere bør tjekke sekvenser af donor og recipient stammer for at sikre de flankerende sekvenser er homologe. Naturligvis er dette kun muligt, hvis stammer har blevet sekventeret. For stammer med en ukendt sekvens, kan P1 transduktion enten fejle eller forårsage andre problemer, såsom en gen konvertering i regionerne flanken. P1 kan transduce ca 90 kilobase par af DNA; Hvis der er forskelle i gen indhold i regionerne omkring målet genet (fx, små sletninger eller indrykninger), er det sandsynligt, at disse vil gå tilbage til donor-sekvens. Dette kan have utilsigtede konsekvenser på Fænotypen af den modtagende stamme. Derfor, hvor det er muligt, sekvenser af donor og recipient omkring gen af interesse bør altid være sammenlignet inden P1 transduktion.
Afslutningsvis, er P1 transduktion en hurtig måde at overføre et bestemt gen knock-out til en række stammer, når den indledende knock-out mutation er blevet genereret. Selv om teknikken har sine begrænsninger, gøre lethed og hastighed af dens gennemførelse det et attraktivt alternativ til andre metoder til gen sletning. P1 inficerer kun E. coli, som normalt begrænser dets anvendelse til denne art. Men nogle varianter af P1 blevet udviklet, der har en bredere værtsspektrum og kan inficere andre arter i familien Enterobacteriaceae, og endda nogle andre γ-proteobacterial arter, om end i reduceret effektivitet36, 37. selv transduktion af klonede DNA fra E. coli til Myxococcus xanthus, en δ-proteobacterium, har været rapporteret38. I fremtidige eksperimenter, kunne disse varianter blive udvidet med vir -mutationen at udvide viften af modtagerens stammer bruges i antibiotisk kassette-baserede gen sletning af generelle transduktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Keio samling stammer blev indhentet fra de nationale BioResource projekt (NIG, Japan): E. coli. Vi takker Dirk Linke (Institut for biovidenskab, universitetet i Oslo) for hans fortsatte støtte. Dette arbejde blev finansieret af Forskningsrådet for Norge unge forsker grant 249793 (til Jack C. Leo).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Strains | |||
| E. coli BW25113 | NIG | ME6092 | Wild-type strain of Keio collection |
| E. coli BL21(DE3) | Merck | 69450-3 | Expression strain |
| E. coli BL21DABCF | Addgene | 102270 | Derived from BL21(DE3) |
| E. coli JW4179 | NIG | JW4179-KC | tamA deletion mutant |
| P1 vir | NIG | HR16 | Generally transducing bacteriophage |
| Plasmids | |||
| pCP20 | CGSC | 14177 | conditionally replicating plasmid with FLP |
| pASK-IBA2 | IBA GmbH | 2-1301-000 | expression vector |
| pEibD10 | N/A | N/A | for production of EibD; plasmid available on request |
| pET22b+ | Merck | 69744-3 | expression vector |
| pIBA2-YadA | N/A | N/A | for production of YadA; plasmid available on request |
| Chemicals | |||
| Acetic acid | ThermoFisher | 33209 | |
| Agar | BD Bacto | 214010 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Ampicillin | Applichem | A0839 | |
| Anhydrotetracycline | Abcam | ab145350 | |
| anti-collagen type I antibody COL-1 | Sigma | C2456 | |
| Bovine collagen type I | Sigma | C9791 | |
| Calcium chloride | Merck | 102382 | |
| Chloroform | Merck | 102445 | |
| Di-sodium hydrogen phosphate | VWR | 28029 | |
| DNA dye | Thermo | S33102 | |
| DNA molecular size marker | New England BioLabs | N3232S | |
| DNase I | Sigma | DN25 | |
| dNTP mix | New England Biolabs | N0447 | |
| ECL HRP substrate | Advansta | K-12045 | |
| EDTA | Applichem | A2937 | |
| Glycerol | VWR | 24388 | |
| goat anti-mouse IgG-HRP | Santa Cruz | sc-2005 | |
| goat anti-rabbit IgG-HRP | Agrisera | AS10668 | |
| HEPES | VWR | 30487 | |
| Isopropyl thiogalactoside | VWR | 43714 | |
| Kanamycin | Applichem | A1493 | |
| Lysozyme | Applichem | A4972 | |
| Magnesium chloride | VWR | 25108 | |
| Manganese chloride | Sigma | 221279 | |
| N-lauroyl sarcosine | Sigma | L9150 | |
| Skim milk powder | Sigma | 70166 | |
| Sodium chloride | VWR | 27808 | |
| tamA forward primer | Invitrogen | N/A | Sequence 5'-GAAAAAAGG ATATTCAGGAGAAAATGTG-3' |
| tamA reverse primer | Invitrogen | N/A | Sequence 5'-TCATAATT CTGGCCCCAGACC-3' |
| Taq DNA polymerase | New England Biolabs | M0267 | |
| Tri-sodium citrate | Merck | 106448 | |
| Tryptone | VWR | 84610 | |
| Tween20 | Sigma | P1379 | |
| Yeast extract | Merck | 103753 | |
| Equipment | |||
| Agarose gel electrophoresis chamber | Hoefer | SUB13 | |
| Bead beater | Thermo | FP120A-115 | |
| CCD camera | Kodak | 4000R | |
| Electroporation cuvettes | Bio-Rad | 165-2089 | |
| Electroporation unit | Bio-Rad | 1652100 | |
| Gel imager | Nippon Genetics | GP-03LED | |
| Incubating shaker | Infors HT | Minitron | |
| Incubator | VWR | 390-0482 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| Microwave oven | Samsung | CM1099A | |
| PCR machine | Biometra | Tpersonal | |
| PCR strips | Axygen | PCR-0208-CP-C | |
| pH meter | Hanna Instruments | HI2211-01 | |
| PVDF membrane | ThermoFisher | 88518 | |
| SDS-PAG electrophoresis chamber | ThermoFisher | A25977 | |
| Tabletop centrifuge | Beckman Coulter | B06322 | |
| Vortex mixer | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Water bath | GFL | D3006 | |
| Wet transfer unit | Hoefer | TE22 |
References
- Blount, Z. D. The unexhausted potential of E. coli. eLife. 4, e05826 (2015).
- Hamilton, C. M., Aldea, M., Washburn, B. K., Babitzke, P., Kushner, S. R. New method for generating deletions and gene replacements in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 171 (9), 4617-4622 (1989).
- Link, A. J., Phillips, D., Church, G. M. Methods for generating precise deletions and insertions in the genome of wild-type Escherichia coli: application to open reading frame characterization. Journal of Bacteriology. 179 (20), 6228-6237 (1997).
- Sawitzke, J. A., Thomason, L. C., Costantino, N., Bubunenko, M., Datta, S., Court, D. L. Recombineering: in vivo genetic engineering in E. coli, S. enterica, and beyond. Methods in Enzymology. 421, 171-199 (2007).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (12), 6640-6645 (2000).
- Muyrers, J. P., Zhang, Y., Stewart, A. F. Techniques: Recombinogenic engineering--new options for cloning and manipulating DNA. Trends in Biochemical Sciences. 26 (5), 325-331 (2001).
- Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Molecular Systems Biology. 2, (2006).
- Yamamoto, N., et al. Update on the Keio collection of Escherichia coli single-gene deletion mutants. Molecular Systems Biology. 5, 335 (2009).
- Baba, T., Huan, H. -C., Datsenko, K., Wanner, B. L., Mori, H. The applications of systematic in-frame, single-gene knockout mutant collection of Escherichia coli K-12. Methods in Molecular Biology. 416, Clifton, NJ. 183-194 (2008).
- Chattopadhyay, M. K., Tabor, C. W., Tabor, H. Polyamines are not required for aerobic growth of Escherichia coli: preparation of a strain with deletions in all of the genes for polyamine biosynthesis. Journal of Bacteriology. 191 (17), 5549-5552 (2009).
- Xie, X., Wong, W. W., Tang, Y. Improving simvastatin bioconversion in Escherichia coli by deletion of bioH. Metabolic Engineering. 9 (4), 379-386 (2007).
- Maeda, T., Sanchez-Torres, V., Wood, T. K. Escherichia coli hydrogenase 3 is a reversible enzyme possessing hydrogen uptake and synthesis activities. Applied Microbiology and Biotechnology. 76 (5), 1035-1042 (2007).
- Meehan, B. M., Landeta, C., Boyd, D., Beckwith, J. The disulfide bond formation pathway is essential for anaerobic growth of Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 199 (16), (2017).
- Niba, E. T. E., Naka, Y., Nagase, M., Mori, H., Kitakawa, M. A genome-wide approach to identify the genes involved in biofilm formation in E. coli. DNA Research. 14 (6), 237-246 (2008).
- Heinz, E., et al. Conserved features in the structure, mechanism, and biogenesis of the inverse autotransporter protein family. Genome Biology and Evolution. 8 (6), 1690-1705 (2016).
- Selkrig, J., et al. Discovery of an archetypal protein transport system in bacterial outer membranes. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (5), 506-510 (2012).
- Stubenrauch, C., et al. Effective assembly of fimbriae in Escherichia coli depends on the translocation assembly module nanomachine. Nature Microbiology. 1 (7), 16064 (2016).
- Leo, J. C., Goldman, A. The immunoglobulin-binding Eib proteins from Escherichia coli are receptors for IgG Fc. Molecular Immunology. 46 (8-9), 1860-1866 (2009).
- Mühlenkamp, M., Oberhettinger, P., Leo, J. C., Linke, D., Schütz, M. S. Yersinia adhesin A (YadA) - Beauty & beast. International Journal of Medical Microbiology. 305 (2), 252-258 (2015).
- Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. Journal of Molecular Biology. 189 (1), 113-130 (1986).
- Meuskens, I., Michalik, M., Chauhan, N., Linke, D., Leo, J. C. A new strain collection for improved expression of outer membrane proteins. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 464 (2017).
- Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene. 158 (1), 9-14 (1995).
- Grosskinsky, U., et al. A conserved glycine residue of trimeric autotransporter domains plays a key role in Yersinia adhesin A autotransport. Journal of Bacteriology. 189 (24), 9011-9019 (2007).
- Leo, J. C., et al. The structure of E. coli IgG-binding protein D suggests a general model for bending and binding in trimeric autotransporter adhesins. Structure. 19 (7), London, UK. 1021-1030 (1993).
- Bertani, G. Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 62 (3), 293-300 (1951).
- Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. Journal of Molecular Biology. 166 (4), 557-580 (1983).
- Leo, J. C., Oberhettinger, P., Linke, D. Assessing the outer membrane insertion and folding of multimeric transmembrane β-barrel proteins. Methods in Molecular Biology. , Clifton, NJ. 157-167 (2015).
- Mikula, K. M., Leo, J. C., Łyskowski, A., Kedracka-Krok, S., Pirog, A., Goldman, A. The translocation domain in trimeric autotransporter adhesins is necessary and sufficient for trimerization and autotransportation. Journal of Bacteriology. 194 (4), 827-838 (2012).
- Thomason, L. C., Costantino, N., Court, D. L., et al. E. coli genome manipulation by P1 transduction. Current Protocols in Molecular Biology. Ausubel, F. M., et al. , Chapter 1, Unit 1.17 (2007).
- Franklin, N. C. Mutation in gal U gene of E. coli blocks phage P1 infection. Virology. 38 (1), 189-191 (1969).
- Jeong, H., et al. Genome sequences of Escherichia coli B strains REL606 and BL21(DE3). Journal of Molecular Biology. 394 (4), 644-652 (2009).
- Greene, E. C. DNA Sequence Alignment during Homologous Recombination. Journal of Biological Chemistry. 291 (22), 11572-11580 (2016).
- Watt, V. M., Ingles, C. J., Urdea, M. S., Rutter, W. J. Homology requirements for recombination in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (14), 4768-4772 (1985).
- Ho, T. D., Waldor, M. K. Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 gal mutants are sensitive to bacteriophage P1 and defective in intestinal colonization. Infection and Immunity. 75 (4), 1661-1666 (2006).
- Ikeda, H., Tomizawa, J. I. Transducing fragments in generalized transduction by phage P1. I. Molecular origin of the fragments. Journal of Molecular Biology. 14 (1), 85-109 (1965).
- Murooka, Y., Harada, T. Expansion of the host range of coliphage P1 and gene transfer from enteric bacteria to other Gam-negative bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 38 (4), 754-757 (1979).
- Goldberg, R. B., Bender, R. A., Streicher, S. L. Direct selection for P1-sensitive mutants of enteric bacteria. Journal of Bacteriology. 118 (3), 810-814 (1974).
- O'Connor, K. A., Zusman, D. R. Coliphage P1-mediated transduction of cloned DNA from Escherichia coli to Myxococcus xanthus: use for complementation and recombinational analyses. Journal of Bacteriology. 155 (1), 317-329 (1983).
