Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

פלטפורמת מיקרופלואידיג לעירור כונדרוציטים עם דחיסה דינמית

Published: September 13, 2019 doi: 10.3791/59676
Automatic Translation
1, 2, 1, 3,4
1Department of Genetics, Cell Biology and Anatomy, University of Nebraska Medical Center, 2Department of Physiology and Pharmacology, Karolinska Institutet, 3Department of Mechanical and Materials Engineering, University of Nebraska-Lincoln, 4Nebraska Center for Materials and Nanoscience, University of Nebraska-Lincoln

Summary

מאמר זה מספק שיטות מפורטות לגבי בדיית ואפיון מכשיר מיקרופלואידיג בעלי דלקת ריאות לדחיסת כונדרוציט.

Abstract

גירויים מכניים ידועים לווסת פונקציות ביולוגיות של תאים ורקמות. מחקרים שנעשו לאחרונה הציעו כי הלחץ בלחיצה משנה את ארכיטקטורת הסחוס לוחית הצמיחה ותוצאות אפנון גדילה של עצמות ארוכות של ילדים. כדי לקבוע את התפקיד של מתח הדוק בצמיחת העצם, יצרנו מכשיר מיקרופלואידיג המופעל על ידי הלחץ הפניאומטי, באופן דינאמי (או סטטי) לדחוס את צלחת הצמיחה כונדרוציטים מוטבע בגלילים הידרוג'ל של קילוף פלסטיצידיות. במאמר זה אנו מתארים שיטות מפורטות לבדיית ואפיון התקן זה. היתרונות של הפרוטוקול שלנו הם: 1) חמישה גניטודות שונים של לחץ מדגיש ניתן ליצור על חמש משכפל טכני בפלטפורמה אחת, 2) קל לדמיין את המבנה התא באמצעות מיקרוסקופ אור קונבנציונאלי, 3) תאים יכולים להיות מבודדים במהירות מהמכשיר לאחר הדחיסה כדי להקל על המטה במורד הזרם, ו -4) ניתן ליישם את הפלטפורמה על מנת ללמוד מכניאולוגיה של כל סוג תא שיכול לצמוח בהידרולים.

Introduction

פלטפורמות מיקרו מהונדסים הם כלים יקרי ערך ללמוד את הביולוגיה מולקולרית, תאית, רקמות ברמה כי הם לאפשר שליטה דינמית הן מיקרוסביבות פיזיות וכימיות1,2,3 ,4,5,6,7,8. לפיכך, ניתן לבדוק השערות רבות באופן סימולטני בצורה מבוקרת היטב. במקרה של סחוס הצלחת הצמיחה, יש להגדיל את העדויות של תפקיד חשוב של הלחץ בלחיצה בצמיחה עצם מודליטינג באמצעות פעולה על הסחוס לוחית הצמיחה9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25. עם זאת, מנגנון הפעולה של מתח ברור – בפרט, כיצד מנחה המתח את היווצרות עמודי כונדרוציטים בצלחת הצמיחה-מובן בצורה גרועה.

המטרה של פרוטוקול זה היא ליצור התקן מיקרופלאידיג מיקרו מבחינה כונדרולוגיה מכשיר דחיסה26 כדי להבהיר מנגנונים של מכניביולוגיה בצלחת הצמיחה כונדרוציטים (איור 1א-ג). המכשיר מורכב משני חלקים: יחידת האקטוציה הפניאומטית ובניית ג'ל האלגיאט. יחידת האקטואריה הפניאומטית של מיקרופלואידיג מפוברק בעזרת polydiמתיל siloxane (PDMS) בהתבסס על הצילום-וליתוגרפיה הרכה. יחידה זו מכילה 5 x 5 מערך של בלוני קרום PDMS דק אשר ניתן מנופח באופן שונה בהתבסס על קטרים שלהם. בניית ג'ל קילוף פלסטיצידיות מורכב כונדרוציטים מוטבע 5 x 5 מערך של בגלילים ג'ל קילוף פלסטיצידיות, ואת בנייה קילוף פלסטיצידיות כונדרוציטים מורכבים עם יחידת הגשמה. מבנים ג'ל קילוף פלסטיצידיות נדחסים על ידי בלונים pdms מנופח בדרך הריאה (איור 1b). המכשיר המיקרו-פלואידיג יכול ליצור חמש רמות שונות של לחץ הדוק בו זמנית בפלטפורמה אחת המבוססת על הבדלים בקוטר בלון PDMS. לפיכך, ניתן לבדוק את התפוקה הגבוהה של כונדרולוגיה ביולוגית בתנאי דחיסה מרובים.

המכשיר microflu, המתואר בפרוטוקול זה יש יתרונות רבים על התקן הדחיסה המקובלת כגון תופסני חיצוניים14,21,23 ו התקנים דחיסה מאקרוסקופי16, מיכל בן 19 , בן 27 , 28 ללימוד כונדרוביולוגיה מכניאולוגיה: 1) המכשיר microflu, מיקרופלואידים הוא עלות אפקטיבית משום שהוא צורכת נפח קטן יותר של דגימות מאשר התקן דחיסה מאקרוסקופי, 2) המכשיר microflu, c הוא הזמן יעיל כי זה יכול לבדוק מספר תנאי דחיסה בו זמנית, 3) מכשיר המיקרו-פלואידיג יכול לשלב גירויים מכניים וכימיים על ידי יצירת מעבר ריכוז של כימיקלים המבוססים על ערבוב מוגבל במיקרוערוצים, ו-4. טכניקות מיקרוסקופ שונות (בזמן הצניחה מיקרוסקופיה ומיקרוסקופיה של מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית) ניתן להחיל עם מכשיר מיקרופלואידיג מתוצרת PDMS שקופה.

אימצנו ושינו את השיטה של moraes ואח '7,29 כדי ליצור רמות מצוקה שונות של הלחץ במכשיר אחד כדי לאפשר תפוקה גבוהה לימודי מכניבביולוגיה של דחיסת כchondrocyte. הגישה שלנו מתאים לתאים (למשל, כונדרוציטים) אשר צריך תלת מימדי (3d) התרבות הסביבה עבור בחני יולוגי לאחר דחיסת תאים. למרות שחלק מהתקני הדחיסה של תא microflu, מיקרופלואידים יכולים לדחוס תאים הנמצאים בשימוש בשני מימדים (2d) ב-30,31,32, לא ניתן להשתמש בהם עבור כונדרוציטים כגון כונדרוציטים מסוג 2d להבדיל. יש פלטפורמות מיקרופלואידיג לדחיסת תאים תלת-ממדיים באמצעות הידרו-ג'ל פוטופוליזציה7,33, אבל הם מוגבלים בבידוד תאים אחרי ניסויים בדחיסה משום שבידוד תאים מפוטופוליזציה הידרוג'ל אינו קל. בנוסף, ההשפעות של אולטרה סגול (UV) חשיפה ומיזמים מרובי קישורים על התאים ייתכן שיהיה צורך להעריך. לעומת זאת, השיטה שלנו מאפשרת בידוד מהיר של תאים לאחר ניסויים הדחיסה עבור פוסט ביולוגי בחני כי קילוף פלסטיצידיות הידרוג יכול להיות מקובע במהירות על ידי מכשירי סידן. בפרוטוקול זה מתוארים השיטות המפורטות לייצור ואפיון. הליך קצר עבור בדיית כונדרופלואידיג מכשיר דחיסה מוצג באיור 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: לבשו ציוד הגנה אישי (PPE) כגון כפפות ומעיל מעבדה לכל שלב בפרוטוקול זה.

1. ייצור עובש מאסטר

הערה: בצע את השלב 1.1-1.3 במכסה המנוע.

  1. טיפול בזכוכית
    הערה: לבש מגן פנים, כפפות ומעיל מעבדה לשלב 1.1.
    1. להפוך את הפתרון פיראניה (60 mL) על ידי ערבוב חומצה גופרתית (H2SO4) ו חמצן מימן (h2O2) עם יחס נפח של 3:1.
      התראה: אין להשתמש בתמיסה ובאצטון באותו מכסה המנוע בשל סכנת הפיצוץ.
    2. מניחים צלחת זכוכית (50.8 mm × 76.2 מ"מ × 1.2 מ"מ) בפתרון פיראניה עבור 30 דקות ב 40 ° c.
    3. שטפו את צלחת הזכוכית במים מפוהים (diH2O).
    4. מניחים את צלחת הזכוכית באצטון בטמפרטורת החדר עבור 10 דקות.
    5. לשטוף את צלחת הזכוכית עם איזופנול ולייבש אותו עם חנקן (N2) גז.
    6. אופים את צלחת הזכוכית ב 200 ° c עבור 20 דקות על צלחת חמה. כל צעדי האפייה הבאים משתמשים בפלטה חמה.
  2. מערך שכבת זרע SU-8 על צלחת הזכוכית
    1. הפיצו SU-8 5 על צלחת הזכוכית עם פיפטה חד פעמי כדי לכסות סביב 2/3 משטח הצלחת של הלוח.
    2. ספין את צלחת הזכוכית עם SU-8 5 photoresists ב 500 rpm עבור 35 s (מחזור התחלתי מסתובב) ולאחר מכן 2,500 סל ד עבור 40 s (מחזור הסופי ספינינג) באמצעות coater ספין. כל הצעדים הבאים ציפוי ספין לכלול את אותו מחזור מסתובב הראשונית.
    3. אופים את צלחת הזכוכית מצופה SU-8 5 ב 65 ° c עבור 2 דקות ולאחר מכן ב 95 ° צ' עבור 5 דקות.
    4. לחשוף את הצלחת הזכוכית מצופה SU-8 5 לאור UV (60 mW/cm2, מרחק בין מנורת uv ו פושאול הוא 20 ס מ, כמות כוללת של אנרגיה אור uv = 60 mJ/cm2) עבור 1 s.
      הערה: זמן חשיפה UV צריך להיות מותאם על פי העוצמה של אור UV משמש.
    5. אופים את פלטת הזכוכית מצופה SU-8 5 ב-65 ° c עבור 2 דקות ו-95 ° צ' עבור 5 דקות.
    6. מניחים את צלחת הזכוכית אפוי במפתח SU-8 עבור 2 דקות.
    7. אופים את SU-8 5 זכוכית מצופה ב 180 ° צ' עבור 20 דקות.
  3. הייצור הערוץ SU-8 באמצעות פוטוגרפיה (איור 2a שלב 1-3)
    1. יוצקים SU-8 100 על הלוח הנזרע SU-8 5 כדי לכסות את ה2/3 של שטח המשטח של הלוח.
    2. ספין צלחת זכוכית עם SU-8 100 בשעה 3,000 rpm עבור 38 s (≈ 90 יקרומטר עבה).
    3. אופים את צלחת הזכוכית מצופה SU-8 100 ב 65 ° c עבור 10 דקות ולאחר מכן ב 95 ° צ' עבור 30 דקות. אם SU-8 100 עדיין דביק לאחר הליך זה, אופים את צלחת הזכוכית במשך זמן רב יותר ב 95 ° צ' עד SU-8 100 הופך לא דביק.
    4. במקום ברזולוציה גבוהה microchannel מיקרוערוץ (25,400 dpi, ראה המשלים איור 1) על הצלחת מצופה SU-8 100 הזכוכית ולחשוף את צלחת זכוכית מכוסה פושאל כדי אור UV עבור 4 s (סכום כולל של אנרגיה אור uv = 240 mJ/cm2).
      הערה: זמן חשיפה UV צריך להיות מותאם על פי העוצמה של אור UV משמש.
    5. הסירו את הפושאול מלוחית הזכוכית ואופים את צלחת הזכוכית ב-65 ° c עבור 2 דקות ולאחר מכן 95 ° c עבור 20 דקות.
    6. שמור את צלחת זכוכית אפוי במיכל, אשר עטוף ברדיד אלומיניום כדי לחסום כל אור, עבור ריפוי לילה.
    7. פיתוח הערוץ SU-8 100 על צלחת הזכוכית במפתח SU-8 במשך 15 דקות.
    8. רוחצים את הצלחת זכוכית בדוגמת SU-8 (תבנית אב) עם אלכוהול איזופרופיל ויבש אותו עם N2 גז. אם חלקיקים לבנים נשארים במהלך תהליך זה, חזור על שלב 7 עבור 5 דקות.

2. יחידת הופעה פניאומטית

  1. שכבת מיקרוערוץ (שכבה 1)
    הערה: בצע את הצעד 2.1.1-2.1.2 בתוך מכסה המנוע.
    1. ירידה 200 μL של (Tridecafluoro-1, 1, 2, 2-הטטרלטיל) -1-Triכלורוסילאן על כיסוי ומניחים אותו בחדר ואקום עם תבנית המאסטר.
    2. החל ואקום עבור 2 דקות בחדר ולחכות 6 h (או לילה) עבור silanization של העובש.
    3. מערבבים PDMS עם יחס משקל של 10:1 (prepolymer: ריפוי הסוכן) עבור 5 דקות.
      הערה: כל שלב הליהוק של PDMS שלאחר מכן מכיל את אותו יחס משקל טרום-פולימר וריפוי הסוכן (10:1).
    4. יוצקים PDMS על תבנית הבסיס ואת דגה PDMS בחדר ואקום עבור 30 דקות.
    5. כריך PDMS עם פיסת סרט שקיפות.
    6. הדק את ההרכבה למעלה דחוקה עם צלחת זכוכית, רפידות קצף וצלחות פלקסיגלס (איור 2a שלב 4).
    7. לרפא PDMS בתנור ב 80 ° c עבור 6 ה.
    8. בודד את שכבת PDMS (שכבה 1) עם סרט השקיפות מהמבנה שדחוקה (איור 2a שלב 5).
    9. הפעל משטחים של שכבה 1 וצלחת זכוכית נקייה (צלחת זכוכית 1; 50.8 mm × 76.2 mm × 1.2 מ"מ) באמצעות מנקה פלזמה עבור 1 דקות.
      הערה: זמן ניקוי פלזמה עשוי להשתנות בהתאם לכוחו של מנקה פלזמה משומש.
    10. בונד שכבה 1 על צלחת זכוכית 1 ולמקם אותם בתנור ב 80 ° c עבור 30 דקות.
    11. הסר את סרט השקיפות משכבה 1.
  2. קרום PDMS דק (שכבה 2)
    1. ספין מעיל ללא נרפא pdms בסרט שקיפות ב 1,000 סל ד עבור 1 דקות כדי לקבל 60 יקרומטר עבה שכבה pdms.
    2. מרפא חלקי לטווח מצופה PDMS (שכבה 2) בתנור ב 80 ° c עבור 20-30 דקות.
    3. הפעל שכבה 1 על צלחת זכוכית 1 ושכבה 2 באמצעות מנקה פלזמה עבור 1 דקות.
      הערה: זמן ניקוי פלזמה עשוי להשתנות בהתאם לכוחו של מנקה פלזמה משומש.
    4. בונד 2 על שכבה 1 ומניחים אותם בתנור ב 80 ° c ללילה.
  3. מחסום אבובים
    1. מניחים צינורות מתכת אנכית על צלחת פטרי.
    2. בעדינות למזוג PDMS בצלחת להטביע על 3/4 של צינורות מתכת.
    3. לרפא PDMS בתנור ב 60 ° c עבור 6 h (או לילה).
    4. חותכים פיסת בלוק PDMS המכילה צינור מתכת אחד.
    5. אגרוף חור בשכבה 2 עבור כניסת הים.
    6. הפעל את בלוק PDMS ושכבה 2 באמצעות מנקה פלזמה עבור 1 דקות.
    7. חבר את הבלוק PDMS אל החלק השני של שכבה 2 ולמקם את יחידת האקטואריה כולה בתנור ב 80 ° c עבור לילה.

3. אלגיאט-כונדרוציט (או חרוז) בנייה

  1. צלחת זכוכית silanized אמינית
    1. חותכים צלחת זכוכית (50.8 מ"מ × 76.2 מ"מ × 1.2 מ"מ) לשתי צלחות זכוכית חצי בגודל (50.8 mm × 38.1 mm × 1.2 mm) באמצעות שובר יהלום.
    2. מניחים את צלחות זכוכית 0.2 M מימן כלוריד (HCl) ולנער בעדינות (למשל, 55 rpm) אותם בלילה.
    3. לשטוף את צלחות זכוכית עם diH2O.
    4. לנער את צלחות זכוכית 0.1 M נתרן הידרוקסיד (NaOH) עבור 1 h ב 55 סל ד ולשטוף אותם עם diH2O.
    5. לנער את צלחות זכוכית ב 1% (v/v) 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTES) עבור 1 h ב 55 rpm ולשטוף אותם עם diH2O.
    6. מייבשים את צלחות הזכוכית הsilanized של האמינו בתוך כיפה לילה.
  2. כייר ג'ל לצמח אלגיאט ג'ל
    1. מערבבים 5% (w/v) agarose ו 200 מ"מ סידן כלוריד (CaCl2) ב dih2O.
    2. מרתיחים את התמיסה האגנה עם תנור מיקרוגל (או צלחת חמה). זמן הרתיחה משתנה בהתאם לעוצמת התמיסה של הצמח ולעוצמת המיקרוגל (או הטמפרטורה של הפלטה החמה).
    3. יוצקים את הפתרון ג'ל מבושל על גבי עובש אלומיניום (ראה המשלים S2), וכריך אותו עם צלחת זכוכית.
    4. המתן 5 דקות והסרת העובש ג'ל התחזק מעובש האלומיניום.
  3. לוחית צמיחה כונדרוציט הקציר
    1. בידוד לוחות הצמיחה מן הגפיים האחוריות של עכברים ה,.
    2. מניחים את לוחיות הצמיחה ב 1 מ ל של 0.25% הקולגן במשך 3 שעות בחממה ב 37 ° צ' ו 8% פחמן דו חמצני (CO2), כדי להסיר מטריצה החילוץ (ecm).
    3. צנטריפוגה את המדגם מתעכל עבור 5 דקות ב 125 x g כדי ליצור גלולה כchondrocyte ולהסיר supernatant מן המדגם. כאן, 1 x g היא האצת הכבידה.
    4. להשעות מחדש את הגלולה כchondrocyte ב 1 מ ל של מדיום הנשר של דולבקה שונה (DMEM).
    5. לספור את מספר כונדרוציטים ב-DMEM באמצעות מונה התא.
    6. צנטריפוגה את כונדרוציטים ב DMEM עבור 5 דקות ב 125 x g כדי לעשות גלולה כchondrocyte שוב ולהסיר supernatant מן המדגם.
    7. באופן אופציונלי, להשעות מחדש את הגלולה כchondrocyte במדיה התרבותית כונדרוציטוט (CCM)34 המכיל 2 μm calcein AM, ו מודיית את המדגם ב 37 ° c עבור 30 דקות. חזור על שלב 3.3.6 ולעבור לשלב 3.3.8.
    8. להשעות את הגלולה כchondrocyte בנפח הרצוי של CCM ולשמור אותם בחממה ב 37 ° צ' ו 8% CO2 לפני השימוש.
  4. Alginate-כונדרוציט (או חרוז) בונה (איור 2 ג)
    1. לערבב 1.5% (w/v) קילוף פלסטיצידיות מלוחים באגירה פוספט (PBS) עם 5 מ"ג/mL של sulfo-כיום, 10 מ"ג/ml של 1-אתיל-3-(3-dimethylaminopropyl) קרבודיאימיד הידרוכלוריד (edc).
    2. הוסף 8 x 106 כונדרוציטים לתוך 1 מ ל של קילוף פלסטיצידיות ג'ל הפתרון [או להוסיף 3 μl של 1 מחרוזות פלורסנט בקוטר μm (542/612 nm) ב 1 mL של הפתרון ג'ל קילוף פלסטיצידיות (0.3% (v/v)]].
    3. מקום 150 μL של alginate-כונדרוסיטה (או חרוז) פתרון על צלחת זכוכית אמינית-silanized מפוברק בשלב 3.1.
    4. לכסות את הפתרון ג'ל קילוף פלסטיצידיות עם עובש ג'ל agarose עבור 3 דקות.
    5. להסיר את הפתרון ג'ל מוגזם קילוף פלסטיצידיות מוצפת בתבנית agarose ג'ל עם להב תער ולהסיר את העובש ג'ל agarose. אז, מבנים גלילי alginate-כchondrocyte (או חרוז) בנייה מתקבלים על צלחת זכוכית silanized אמינית.
    6. מניחים את מבנים alginate-כונדרוציטים בפתרון חוצה קישור (50 mM CaCl2 /140 MM הנאל ב-dih2O) עבור 1 דקות עבור פילמור.

4. הרכבת התקן (איור 2d)

הערה: מפרידי PDMS ומלחציים מודפסים תלת-ממדיים צריכים להיות מוכנים בנפרד.

  1. אתר ארבעה מרווחים מסוג PDMS בעובי 1 מ"מ בארבע הפינות של השכבה 2 של יחידת האקטורות.
  2. מקום 700 μL של CCM כדי לכסות את תאי האוויר של שכבה 2.
  3. מניחים את alginate-כchondrocyte (או חרוז) מבנים על שכבה 2 תוך בזהירות יישור המבנים עם תאי האוויר.
  4. הדק את ההתקן בעזרת תפסים מודפסים תלת-ממדיים (איור 1c).

5. הגשמה של המכשיר

  1. לחבר את השקע של משאבת אוויר (ראה טבלת חומרים) עם כניסת שסתום חשמלי עם אבובים סיליקון.
  2. לחבר את השקע של שסתום חשמלי עם הפרץ של המכשיר התאספו עם אבובים סיליקון.
  3. חבר את שסתום החשמלי עם גנרטור פונקציה.
  4. מניפולציה עם שסתום חשמלי עם גל מרובע (למשל, 1 Hz) שנוצר על ידי גנרטור פונקציה.
  5. הפעל את משאבת האוויר כדי להפעיל את המכשיר בריאות.

6. הדמיה של כונדרוציטים במכשיר

הערה: כדי לקבל איכות תמונה טובה, כונדרוציטים תמונה (או חרוזי פלורסנט) ב קילוף פלסטיצידיות ג'ל באמצעות צלחת זכוכית 2 משום מורחבת בלוני pdms ותאי האוויר יכול לעוות תמונות אופטיות. אם מיקרוסקופ הפוך משמש לדימות, המכשיר צריך להיות מוגדר כך צלחת זכוכית 2 פונה כלפי מטה.

  1. הכן את המכשיר עם כונדרוציטים (או חרוזי פלורסנט) כפי שמוצג בסעיפים קודמים.
  2. קח את התמונות zמחסנית של כונדרוציטים (או חרוזי פלורסנט) עם מיקרוסקופ קונפוקלית וקד לפני ותחת דחיסה, בהתאמה. בחר גודל z-step המבוסס על עומק השדה של מערכת דימות מיקוד משומשים.
  3. הגובה של כונדרוציטים (או לבנות חרוזים alginate-חרוז) יכול להיות נמדד עם שיטת עיבוד תמונה אוטומטית המוצגת בספרות הקודמות של26,35.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מאמר זה מציג שלבים מפורטים של התקן הדחיסה של המיקרופלואידיג (איור 2). המכשיר מכיל 5 x 5 מערכים של גליל alginate מבנים כונדרוציטים, ובנייה אלה ניתן לדחוס עם חמישה גניטודות שונים של דחיסה (איור 1, איור 3 ואיור 4). הגובה של המיקרוערוץ הפנאומטי הוא סביב 90 μm, ואת קטרים בלון PDMS הם 1.2, 1.4, 1.6, 1.8 ו-2.0 מ"מ, בהתאמה. הביצועים של המכשיר היתה כמותית עם מיקרוסקופ קונפוקלית עם תנאי דחיסה סטטי עיבוד תמונה. דחיסה סטטית היתה מועסק עבור הדמיה מיקרוסקופית כי הדמיה z-מחסנית עם המיקרוסקופיה לוקח כמה דקות, אז זה איטי מדי עבור דימות כמותי במהלך הדחיסה הדינמית.

איור 3a מראה את 5 × 5 מערכים של קילוף פלסטיצידיות עמודות הידרוג'ל (קוטר: ~ 0.8 מ"מ, גובה: ~ 1 מ"מ) יצוק על צלחת זכוכית 2. מבנים אלה ג'ל התמונה על ידי הוספת חרוזי פלורסנט ב ג'ל. איור 3b מציג מקרה לדוגמה כי העמודה ג'ל נדחס על ידי 33.8% בגובה על ידי בלון pdms הגדול ביותר. המתח הקשה ביותר של מונה הג גדל בכ-5% לכל 0.2 מ"מ בקוטר הבלון של pdms כמוצג באיור 3 ג.

דפורמציה בהיקף של כונדרוציטים נקבע על ידי הדמיה התאים 613 יקרומטר × 613 יקרומטר × 40 – 55 יקרומטר (x × y × z) אמצעי אחסון ליד מרכז בניית ג'ל כפי שמוצג באיור 4a. איור 1d מציג תמונה לדוגמה של כchondrocyte שנדחס על-ידי 16% בבלון pdms הגדול ביותר. איור 4b מציג את התפלגות ערכי המתח של התאים הנמדדים, והתאים הכוללים נדחסו יותר באמצעות בלוני pdms גדולים יותר. לכן, כמות ג'ל קילוף פלסטיצידיות ודחיסת כchondrocyte נשלטים על ידי קוטר בלוני pdms (איור 3 ואיור 4) עם לחץ מתמיד של 14 kPa.

Figure 1
איור 1. כונדרופלואידיג מכשיר דחיסה.
(א) סכמטי של המכשיר המורכב. A 5 × 5 מערך של alginate – מבנים כchondrocyte מיושרים על בלוני PDMS עם 5 קטרים שונים (D = 1.2, 1.4, 1.6, 1.8 ו- 2.0 מ"מ), כאשר D הוא קוטר של בלון pdms (או תא אוויר). (ב) סכמטי של פעולת ההתקן. המכשיר מועד ללחץ פנאומטי המרחיב את בלוני PDMS. (ג) תמונה של התקן בפועל (קוטר המטבע = 19 מ"מ). (ד) הצלב האנכי סעיפים של כchondrocyte לפני (משמאל) ותחת (מימין) דחיסה על בלון pdms הגדול ביותר (d = 2.0 mm) (מאמץ מתוח תא, εcell = | שינוי גובה התא/תא התחלתית גובה | x 100 = 16%). דמות זו שוחזר מ -26.

Figure 2
. איור 2 שלבים מפורטים של כונדרופלואידיג התקן דחיסה ייצור.
(א) פוטוליתוגרפיה ליצירת עובש מאסטר SU-8 וליתוגרפיה רכה ליצירת שכבת PDMS עם מיקרוערוצים פנאומטיים (שכבה1). (ב) ממברנה pdms דק (שכבה 2) על סרט שקיפות שנוצר על ידי ציפוי ספין. (ג) מיטת הליהוק של ג'ל גלילי על זכוכית (צלחת זכוכית 2). (ד) הרכבה של מכשיר הדחיסה של המיקרופלואידיג. דמות זו שוחזר מ -26. אנא לחץ כאן כדי להוריד גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
. איור 3 מדידת דפורמציה של ג'ל אלגיאט תחת דחיסה סטטית.
(a) 5 x 5 מערכים של גליל קילוף פלסטיצידיות מבנים ג'ל (קוטר: ~ 800 μm, גובה: ~ 1 מ"מ). (ב) alginate ג'ל דחוס על ידי בלון pdms הגדול ביותר (D = 2.0 mm). הנבג המאמץ של ג'ל האלגיאט הוא 33.8%. (ג) המתח המאמץ של קילוף פלסטיצידיות ג'ל (εgel) מגדיל סביב 5% לכל 0.2 מ"מ בקוטר של בלון pdms (D). שורת שגיאה: סטיית תקן. קו אדום: קו התאמה ליניארי איור זה מועתק מ -26.

Figure 4
איור 4. מדידה של דפורמציה כונדרוציט תחת דחיסה סטטית.
(a) תמונת zמחסנית [613 יקרומטר × 613 יקרומטר × 40 – 55 יקרומטר (x × y × z)] התקבל באמצע המבנה ג'ל, 300 – 400 יקרומטר מלמטה ג'ל. (ב) גניטודות שונים של מאמץ מתוח של כchondrocyte (εcell) הביא כפונקציה של קוטר בלון pdms (D). Icon : ערכים ממוצע. Icon : כל נקודות נתונים. למעלה (או למטה) והקווים האמצעיים של התיבה הם סטיית התקן והערך החציוני, בהתאמה. דמות זו שוחזר מ -26.

איור S1. עיצוב מיקרוערוץ הפוטוגרפי עבור שלב 1.3.4 (יחידה = mm). אנא לחץ כאן כדי להוריד את האיור.

איור S2. עיצוב עובש אלומיניום עבור שלב 3.2.3 (יחידה = mm). אנא לחץ כאן כדי להוריד את האיור.

איור S3. עיוות קבוע של ג'ל קילוף פלסטיצידיות (1.5%, w/v) תחת 1 h-ארוך דינאמי (1 Hz) ודחיסה סטטית. דמות זו שוחזר מ -26. אנא לחץ כאן כדי להוריד את האיור.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כדי לבדוק את ההשפעות של לחץ מדגיש על לוחית הצמיחה כונדרוציטים, פיתחנו את מכשיר הדחיסה microflu, כונדרוציטים (איור 1) כדי להחיל רמות שונות של מתח בלחץ על כונדרוcytes בפיגום הידרו-ג'ל לתלת-ממד תרבות בדרכים של תפוקה גבוהה. כדי לסייע לחוקרים אחרים לאמץ את המכשיר שלנו או לפתח מכשירים דומים, סיפקנו את הפרטים של השלבים בייצור המכשיר במאמר זה פרוטוקול.

הצעדים הקריטיים בפרוטוקול זה הם 1) בדיית שכבת PDMS עם מיקרוערוצים פנאומטיים (שכבה 1) ללא כל בועות אוויר מאז בועות האוויר בשכבה 1 עלול לפגוע מיקרו ערוצים פנאומטיים בעוד הסרט שקיפות הגיבוי מקולף, 2) שמירה על טמפרטורה קבועה (למשל, 80 ° c) לריפוי בלונים pdms (שכבה 2) מכיוון שהאלסטיות של pdms ידוע תלוי בטמפרטורה הריפוי36, 3) יישור מבנים ג'ל קילוף פלסטיצידיות עם בלונים pdms, ו 4) באמצעות silanized טרי אמינו-זכוכית צלחת (צלחת זכוכית 2) לחיבור עמודות ג'ל קילוף פלסטיצידיות על צלחת זכוכית 2 תוך יומיים לאחר הטיפול המלחה.

המגבלה העיקרית של פרוטוקול זה היא כי היא יחסית עבודה אינטנסיבית כדי להמציא את המכשיר כי התהליך כרוך פוטוגרפיה ושלבים מרובים של ליתוגרפיה רכה. בנוסף, הביצועים של תא microfluidic התקנים דחיסה מפוברק בהתבסס על הפרוטוקול שלנו צריך להיות מוערך בכל פעם סוגים שונים של הידרוג'לים ותאים משמשים. הסיבה לכך היא שכל הבדלים בתכונות מכניות של הידרוג'לים ותאים ישפיעו על ביצועי המכשיר.

למרות מכשיר הדחיסה המיקרופלואידיג שלנו הוא להחלת דחיסה דינמית על כונדרוציטים, הביצועים שלו הוערכו על ידי הדמיה של ג'ל דחוס לגיגינג ותאים באופן סטטי. זה בגלל שהיה קשה לצלם ג'לים ותאים תחת דחיסה דינמית עם המיקרוסקופיה המקובלת. אנו משווים סטטי (14 kpa, 1 h) ודחיסה דינמית (14 kpa, 1-הרץ, 1 h) במונחים של דפורמציה הקבע של ג'ל קילוף פלסטיצידיות ומצא כי עיוות הקבע של ג'ל תחת הדחיסה הדינמית היה זניח בהשוואה לדחיסה הסטטית (ראה S3 דמות משלימה).

אחד היתרונות של השיטה שלנו היא שזה יכול לשמש עבור סוגי תאים אחרים הזקוקים לסביבת תרבות תלת-ממדית. הדחיסה הנובעת של המכשיר יכולה להיות מאופנן בהתאם ליישומים על ידי שינוי הקוטר והעובי של בלוני PDMS ו/או הלחץ בבלון. ניתן גם לשנות את האלסטיות של בלון PDMS על ידי התאמת היחס ערבוב בין prepolymer לבין סוכן ריפוי. תאים בהתקן זה ניתן לדימות בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופ אור/זריחה, והמכשיר יכול להיות מפורק במהירות עבור הקציר התא כדי לאפשר ניתוח במורד הזרם. יתרון נוסף הוא היכולת ליצור חמש רמות לחץ מכני ברורים עם חמש משכפל טכני לכל רמת המתח באמצעות מכשיר אחד. שילוב של שכפול וניתוח מינון-תגובה מבטיח רמה גבוהה של הקשיחות והקפדה על התוצאות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

אנו מודים לד"ר כריסטופר מוראיס וסטיבן א. מורין על תמיכתם בעיצוב ובייצור המכשירים. מחקר זה היה נתמך על ידי Bioהנדסאים למענק בריאות האדם מאוניברסיטת נברסקה-לינקולן (UNL) ו אוניברסיטת נברסקה המרכז הרפואי (UNL), ולהעניק AR070242 מ NIH/NIAMS. אנו מודים לג א. טיילור ו ג'יימס ר. Talaska של המתקן המיקרוסקופיה המתקדמת במרכז הרפואי של אוניברסיטת נברסקה למתן סיוע במיקרוסקופיה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-Aminopropyl)triethoxysilane (ATPES) Sigma-Aldrich 741442-100ML
(Tridecafluoro-1, 1, 2, 2-Tetrahydrooctyl)-1-Trichlorosilane United Chemical Technologies T2492-KG
Acrylic sheet McMaster-Carr 8560K354
Air pump Schwarzer Precision SP 500 EC-LC4.5V DC We used the model purchased in 2015. The internal design and performance of air pump (SP 500 EC-LC) changed in early 2016. Also, air pump performance has changed in the course of time. Thus, air pressure generated by an SP 500 EC-LC air pump should be calibrated before use.
Alginate powder FMC Corporation Pronova UP MVG
Barb Straight Connectors (Metal tube) Pneumadyne EB40-250
Calcein AM Invitrogen C3100MP
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11960-044
Dyed red aqueous fluorescent particles Thermo Fisher Scientific R0100
EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride) Thermo Fisher Scientific 22980
Foam pad GRAINGER Item # 5GCE8
Function / Arbitrary Waveform Generator Keysight Technologies 33210A
Hydrochloric acid Fisher Chemical A144-500
Hydrogen peroxide Fisher BioReagents BP2633500
Isopropyl alcohol BDH1174-4LP VWR
Microscope slides Thermo Fisher Scientific 22-267-013
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-001
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning 184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Power supply Keysight Technologies E3630A
SeaKem LE Agarose Lonza 50004
Sodium hydroxide Fisher Chemical S318-1
Solenoid manifold Pneumadyne MSV10-1
Solenoid valve Pneumadyne S10MM-30-12-3
Spin coater Laurell Technologies WS-650Mz-23NPPB
SU8 Developer MicroChem Corp. Y020100 4000L1PE
SU8-100 MicroChem Corp. Y131273 0500L1GL
SU8-5 MicroChem Corp. Y131252 0500L1GL
Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) Thermo Fisher Scientific 24510
Sulfuric acid EMD Millipore MSX12445

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lu, H., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Analytical Chemistry. 76 (18), 5257-5264 (2004).
  2. Malek, A. M., Izumo, S. Mechanism of endothelial cell shape change and cytoskeletal remodeling in response to fluid shear stress. Journal of Cell Science. 109 (4), 713-726 (1996).
  3. Paguirigan, A. L., Beebe, D. J. Microfluidics meet cell biology: bridging the gap by validation and application of microscale techniques for cell biological assays. BioEssays. 30 (9), 811-821 (2008).
  4. García-Cardeña, G., Comander, J., Anderson, K. R., Blackman, B. R., Gimbrone, M. A. Biomechanical activation of vascular endothelium as a determinant of its functional phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (8), 4478-4485 (2001).
  5. Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
  6. Moraes, C., Chen, J. H., Sun, Y., Simmons, C. A. Microfabricated arrays for high-throughput screening of cellular response to cyclic substrate deformation. Lab on a Chip. 10 (2), 227-234 (2010).
  7. Moraes, C., Wang, G., Sun, Y., Simmons, C. A. A microfabricated platform for high-throughput unconfined compression of micropatterned biomaterial arrays. Biomaterials. 31 (3), 577-584 (2010).
  8. Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. Neurite growth in 3D collagen gels with gradients of mechanical properties. Biotechnology and Bioengineering. 102 (2), 632-643 (2009).
  9. Bougault, C., Paumier, A., Aubert-Foucher, E., Mallein-Gerin, F. Molecular analysis of chondrocytes cultured in agarose in response to dynamic compression. BMC Biotechnology. 8 (1), 71 (2008).
  10. Kaviani, R., Londono, I., Parent, S., Moldovan, F., Villemure, I. Compressive mechanical modulation alters the viability of growth plate chondrocytes in vitro. Journal of Orthopaedic Research. 33 (11), 1587-1593 (2015).
  11. Ménard, A. L., et al. In vivo dynamic loading reduces bone growth without histomorphometric changes of the growth plate. Journal of Orthopaedic Research. 32 (9), 1129-1136 (2014).
  12. Robling, A. G., Duijvelaar, K. M., Geevers, J. V., Ohashi, N., Turner, C. H. Modulation of appositional and longitudinal bone growth in the rat ulna by applied static and dynamic force. Bone. 29 (2), 105-113 (2001).
  13. Sergerie, K., et al. Growth plate explants respond differently to in vitro static and dynamic loadings. Journal of Orthopaedic Research. 29 (4), 473-480 (2011).
  14. Valteau, B., Grimard, G., Londono, I., Moldovan, F., Villemure, I. In vivo dynamic bone growth modulation is less detrimental but as effective as static growth modulation. Bone. 49 (5), 996-1004 (2011).
  15. Walsh, A. J. L., Lotz, J. C. Biological response of the intervertebral disc to dynamic loading. Journal of Biomechanics. 37 (3), 329-337 (2004).
  16. Zimmermann, E. A., et al. In situ deformation of growth plate chondrocytes in stress-controlled static vs dynamic compression. Journal of Biomechanics. 56, 76-82 (2017).
  17. Akyuz, E., Braun, J. T., Brown, N. A. T., Bachus, K. N. Static versus dynamic loading in the mechanical modulation of vertebral growth. Spine. 31 (25), E952-E958 (2006).
  18. Alberty, A., Peltonen, J., Ritsilä, V. Effects of distraction and compression on proliferation of growth plate chondrocytes: A study in rabbits. Acta Orthopaedica Scandinavica. 64 (4), 449-455 (1993).
  19. Amini, S., Veilleux, D., Villemure, I. Tissue and cellular morphological changes in growth plate explants under compression. Journal of Biomechanics. 43 (13), 2582-2588 (2010).
  20. Aronsson, D. D., Stokes, I. A. F., Rosovsky, J., Spence, H. Mechanical modulation of calf tail vertebral growth: implications for scoliosis progression. Journal of Spinal Disorders. 12 (2), 141-146 (1999).
  21. Cancel, M., Grimard, G., Thuillard-Crisinel, D., Moldovan, F., Villemure, I. Effects of in vivo static compressive loading on aggrecan and type II and X collagens in the rat growth plate extracellular matrix. Bone. 44 (2), 306-315 (2009).
  22. Reich, A., et al. Weight loading young chicks inhibits bone elongation and promotes growth plate ossification and vascularization. Journal of Applied Physiology. 98 (6), 2381-2389 (2005).
  23. Stokes, I. A., Mente, P. L., Iatridis, J. C., Farnum, C. E., Aronsson, D. D. Enlargement of growth plate chondrocytes modulated by sustained mechanical loading. Journal of Bone and Joint Surgery. 84 (10), 1842-1848 (2002).
  24. Stokes, I. A. F., Clark, K. C., Farnum, C. E., Aronsson, D. D. Alterations in the growth plate associated with growth modulation by sustained compression or distraction. Bone. 41 (2), 197-205 (2007).
  25. Lee, D., Erickson, A., Dudley, A. T., Ryu, S. Mechanical stimulation of growth plate chondrocytes: previous approaches and future directions. Experimental Mechanics. , (2018).
  26. Lee, D., Erickson, A., You, T., Dudley, A. T., Ryu, S. Pneumatic microfluidic cell compression device for high-throughput study of chondrocyte mechanobiology. Lab on a Chip. 18 (14), 2077-2086 (2018).
  27. Guilak, F. Compression-induced changes in the shape and volume of the chondrocyte nucleus. Journal of Biomechanics. 28 (12), 1529-1541 (1995).
  28. Knight, M. M., Ghori, S. A., Lee, D. A., Bader, D. L. Measurement of the deformation of isolated chondrocytes in agarose subjected to cyclic compression. Medical Engineering & Physics. 20 (9), 684-688 (1998).
  29. Moraes, C., Sun, Y., Simmons, C. A. Microfabricated platforms for mechanically dynamic cell culture. Journal of Visualized Experiments. (46), e224 (2010).
  30. Sim, W. Y., et al. A pneumatic micro cell chip for the differentiation of human mesenchymal stem cells under mechanical stimulation. Lab on a Chip. 7 (12), 1775-1782 (2007).
  31. Hosmane, S., et al. Valve-based microfluidic compression platform: single axon injury and regrowth. Lab on a Chip. 11 (22), 3888-3895 (2011).
  32. Ho, K. K. Y., Wang, Y. L., Wu, J., Liu, A. P. Advanced microfluidic device designed for cyclic compression of single adherent cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6 (148), (2018).
  33. Seo, J., et al. Interconnectable dynamic compression bioreactors for combinatorial screening of cell mechanobiology in three dimensions. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (16), 13293-13303 (2018).
  34. Erickson, A. G., et al. A tunable, three-dimensional in Vitro culture model of growth plate cartilage using alginate hydrogel acaffolds. Tissue Engineering Part A. 24 (1-2), 94-105 (2018).
  35. Lee, D., Rahman, M. M., Zhou, Y., Ryu, S. Three-dimensional confocal microscopy indentation method for hydrogel elasticity measurement. Langmuir. 31 (35), 9684-9693 (2015).
  36. Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering. Journal of Micromechanics and Microengineering. 24 (3), 035017 (2014).

Tags

ביו-הנדסה גיליון 151 מיקרופלואידיקה פוטוגרפיה ליתוגרפיה רכה לוחית צמיחה כונדרוציטים מכניביולוגיה מכניקת התאים הידרוג'ל מיקרוסקופיה קונפוקלית ניתוח תמונה
פלטפורמת מיקרופלואידיג לעירור כונדרוציטים עם דחיסה דינמית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, D., Erickson, A., Dudley, A.… More

Lee, D., Erickson, A., Dudley, A. T., Ryu, S. A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression. J. Vis. Exp. (151), e59676, doi:10.3791/59676 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter