Summary
Este artículo proporciona métodos detallados para fabricar y caracterizar un dispositivo microfluídico de accionamiento neumático para la compresión de condrocitos.
Abstract
Se sabe que los estímulos mecánicos modulan las funciones biológicas de las células y los tejidos. Estudios recientes han sugerido que el estrés compresivo altera la arquitectura del cartílago de la placa de crecimiento y resulta en la modulación del crecimiento de los huesos largos de los niños. Para determinar el papel de la tensión compresiva en el crecimiento óseo, creamos un dispositivo microfluídico accionado por presión neumática, para comprimir dinámicamente (o estáticamente) los condrocitos de la placa de crecimiento incrustados en cilindros de hidrogel de alginato. En este artículo, describimos métodos detallados para fabricar y caracterizar este dispositivo. Las ventajas de nuestro protocolo son: 1) Se pueden generar cinco magnitudes diferentes de tensión compresiva en cinco réplicas técnicas en una sola plataforma, 2) Es fácil visualizar la morfología celular a través de un microscopio de luz convencional, 3) Las células pueden aislarse rápidamente desde el dispositivo después de la compresión para facilitar los ensayos aguas abajo, y 4) La plataforma se puede aplicar para estudiar la mecanobiología de cualquier tipo de célula que pueda crecer en hidrogeles.
Introduction
Las plataformas micro-ingeniería son herramientas valiosas para estudiar la biología molecular, celular y de nivel tisular porque permiten el control dinámico de los microambientes físicos y químicos1,2,3 ,4,5,6,7,8. Por lo tanto, múltiples hipótesis se pueden probar simultáneamente de una manera estrechamente controlada. En el caso del cartílago de la placa de crecimiento, hay crecientes evidencias de un papel importante de la tensión compresiva en la modulación del crecimiento óseo a través de la acción en el cartílago de la placa de crecimiento9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25. Sin embargo, el mecanismo de acción del estrés compresivo– en particular, cómo el estrés guía la formación de columnas de condrocitos en la placa de crecimiento – se entiende mal.
El objetivo de este protocolo es crear un dispositivo de compresión de condrocitos microfluídicos de accionamiento neumático26 para dilucidar los mecanismos de mecanobiología en condrocitos de placas de crecimiento(Figura 1a-c). El dispositivo consta de dos partes: la unidad de accionamiento neumático y la construcción del gel de alginato. La unidad de accionamiento neumático microfluídico se fabrica utilizando polidimetilsiloxano (PDMS) basado en la fotolitografía y la litografía blanda. Esta unidad contiene una matriz de 5 x 5 de globos de membrana PDMS delgados que se pueden inflar de manera diferente en función de sus diámetros. La construcción del gel de alginato consiste en los condrocitos incrustados en una matriz de 5 x 5 cilindros de gel de alginato, y todas las construcciones de alginato-condrocitos se ensamblan con la unidad de accionamiento. Las construcciones de gel de alginato son comprimidas por los globos PDMS inflados neumáticamente(Figura 1b). El dispositivo microfluídico puede generar cinco niveles diferentes de tensión de compresión simultáneamente en una sola plataforma en función de las diferencias en el diámetro del globo PDMS. Por lo tanto, una prueba de alto rendimiento de la mecanobiología de condrocitos bajo múltiples condiciones de compresión es posible.
El dispositivo microfluídico descrito en este protocolo tiene muchas ventajas sobre el dispositivo de compresión convencional, como los fijadores externos14,21,23 y los dispositivos de compresión macroscópica16, 19 , 27 , 28 para el estudio de la mecanobiología del condrocitos: 1) El dispositivo microfluídico es rentable porque consume un volumen de muestras más pequeño que el dispositivo de compresión macroscópica, 2) El dispositivo microfluídico es eficaz en el tiempo porque puede probar múltiples condiciones de compresión simultáneamente, 3) El dispositivo microfluídico puede combinar estímulos mecánicos y químicos formando un gradiente de concentración de productos químicos basado en la mezcla limitada en microcanales, y 4) Diversas técnicas de microscopía (time-lapse microscopía microscópica y microscopía confocal de fluorescencia) se puede aplicar con el dispositivo microfluídico hecho de PDMS transparente.
Adoptamos y modificamos el método de Moraes et al.7,29 para crear diferentes niveles de tensión compresiva en un solo dispositivo para permitir estudios de mecanobiología de alto rendimiento de compresión de condrocitos. Nuestro enfoque es apropiado para las células (por ejemplo, condrocitos) que necesitan un entorno de cultivo tridimensional (3D) y para ensayos biológicos después de comprimir las células. Aunque algunos dispositivos de compresión celular microfluídica pueden comprimir células cultivadas en sustratos bidimensionales (2D)30,31,32,no se pueden utilizar para condrocitos porque los condrocitos cultivados 2D desdiferenciado. Existen plataformas microfluídicas para comprimir células cultivadas en 3D en hidrogeles fotopolimerizados7,33,pero están limitadas en el aislando de células después de experimentos de compresión porque aislar las células de fotopolimerizado hidrogel no es fácil. Además, es posible que sea necesario evaluar los efectos de la exposición ultravioleta (UV) y los iniciadores de reticulación foto en las células. Por el contrario, nuestro método permite un rápido aislamiento de las células después de experimentos de compresión para ensayos postbiológicos porque los hidrogeles de alginato pueden ser despolimerizados rápidamente por los quelantes de calcio. Los métodos detallados de fabricación y caracterización del dispositivo se describen en este protocolo. En la Figura 2se muestra un breve procedimiento para fabricar el dispositivo de compresión de condrocitos microfluídicos.
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Protocol
NOTA: Use equipo de protección personal (EPP) como guantes y capa de laboratorio para cada paso de este protocolo.
1. Fabricación de moldes maestros
NOTA: Realice los pasos 1.1 - 1.3 en una campana de humo.
- Tratamiento de vidrio
NOTA: Use un protector facial, guantes y una capa de laboratorio para el paso 1.1.- Hacer la solución de Piranha (60 mL) mezclando ácido sulfúrico (H2SO4) y peróxido de hidrógeno (H2O2) con una relación de volumen de 3:1.
ADVERTENCIA: No utilice la solución y la acetona de Piranha en la misma campana de humodebido al riesgo de explosión. - Colocar una placa de vidrio (50,8 mm x 76,2 mm x 1,2 mm) en la solución de Piranha durante 30 minutos a 40 oC.
- Enjuague la placa de vidrio con agua desionizada (diH2O).
- Coloque la placa de vidrio en acetona a temperatura ambiente durante 10 min.
- Enjuagar la placa de vidrio con isopropanol y secarla con nitrógeno (N2) gas.
- Hornee la placa de vidrio a 200 oC durante 20 minutos sobre un plato caliente. Todos los pasos posteriores para hornear utilizan un plato caliente.
- Hacer la solución de Piranha (60 mL) mezclando ácido sulfúrico (H2SO4) y peróxido de hidrógeno (H2O2) con una relación de volumen de 3:1.
- Formación de la capa de semillas SU-8 en la placa de vidrio
- Extienda su-8 5 en la placa de vidrio con una pipeta desechable para cubrir alrededor de 2/3 de la superficie de la placa.
- Gire la placa de vidrio con fotorresistentes SU-8 5 a 500 rpm durante 35 s (ciclo de hilado inicial) y luego 2.500 rpm para 40 s (ciclo de hilado final) utilizando una recubridora de giro. Todos los pasos posteriores del recubrimiento de giro incluyen el mismo ciclo de hilado inicial.
- Hornee la placa de vidrio recubierta SU-8 5 a 65 oC durante 2 min y luego a 95 oC durante 5 min.
- Exponga la placa de vidrio recubierto SU-8 5 a la luz UV (60 mW/cm2, la distancia entre la lámpara UV y la fotomáscara es de 20 cm, cantidad total de energía de luz UV a 60 mJ/cm2) durante 1 s.
NOTA: El tiempo de exposición UV debe ajustarse de acuerdo con la potencia de una luz UV usada. - Hornee la placa de vidrio recubierta SU-8 5 a 65oC durante 2 min y a 95oC durante 5 min.
- Coloque la placa de vidrio al horno en el desarrollador SU-8 durante 2 min.
- Hornee el vaso recubierto SU-8 5 a 180 oC durante 20 min.
- Fabricación de patrones de canal SU-8 mediante fotolitografía(Figura 2a Paso 1-3)
- Vierta SU-8 100 en la placa de vidrio SU-8 5 sembrada para cubrir alrededor de 2/3 de la superficie de la placa.
- Gire la placa de vidrio con SU-8 100 a 3.000 rpm durante 38 s (90 m de espesor).
- Hornee la placa de vidrio recubierta SU-8 100 a 65 oC durante 10 min y luego a 95 oC durante 30 min. Si su-8 100 sigue pegajoso después de este procedimiento, hornee la placa de vidrio durante más tiempo a 95 oC hasta que su-8 100 se vuelva no pegajoso.
- Coloque una fotomáscara de microcanal de alta resolución (25.400 ppp, véase la figura suplementaria 1) en la placa de vidrio recubierta SU-8 100 y exponga la placa de vidrio cubierta de fotomáscara a la luz UV durante 4 s (cantidad total de energía de luz UV a 240 mJ/cm2).
NOTA: El tiempo de exposición UV debe ajustarse de acuerdo con la potencia de una luz UV usada. - Retirar la fotomascarilla de la placa de vidrio y hornear la placa de vidrio a 65 oC durante 2 min y luego 95 oC durante 20 min.
- Mantenga la placa de vidrio horneada en un recipiente, que está envuelta con papel de aluminio para bloquear cualquier luz, para el curado durante la noche.
- Desarrolle patrones de canal SU-8 100 en la placa de vidrio en el desarrollador SU-8 durante 15 min.
- Lave la placa de vidrio con patrón SU-8 (molde maestro) con alcohol isopropílico y séquela con gas N2. Si las partículas blancas permanecen durante este proceso, repita el paso 7 durante 5 min.
2. Unidad de accionamiento neumático
- Capa de microcanal (Capa 1)
NOTA: Realice los pasos 2.1.1 - 2.1.2 en una campana de humo.- Dejar caer 200 l de (Tridecafluoro-1,1,2,2-Tetrahydrooctyl)-1-Triclorosilano en un cubreobjetos y colocarlo en una cámara de vacío con el molde maestro.
- Aplicar vacío durante 2 minutos en la cámara y esperar 6 h (o durante la noche) para la silanización del molde.
- Mezclar PDMS con una relación de peso de 10:1 (prepolímero:agente de curado) durante 5 min.
NOTA: Todos los pasos de fundición PDMS subsiguientes contienen el mismo prepolímero y la misma relación de peso del agente de curado (10:1). - Vierta PDMS en el molde maestro y desgasifique PDMS en una cámara de vacío durante 30 min.
- Sandwich PDMS con una película de transparencia.
- Sujete el conjunto emparedado anterior con una placa de vidrio, almohadillas de espuma y placas de plexiglás(Figura 2a Paso 4).
- Curar PDMS en un horno a 80oC durante 6 h.
- Aísle la capa PDMS (Capa 1) con la película de transparencia de la estructura emparecida(Figura 2a Paso 5).
- Active las superficies de la Capa 1 y una placa de vidrio limpia (placa de vidrio 1; 50,8 mm x 76,2 mm x 1,2 mm) utilizando un limpiador de plasma durante 1 min.
NOTA: El tiempo de limpieza del plasma puede variar en función de la potencia de un limpiador de plasma usado. - Una capa 1 sobre la placa de vidrio 1 y colóquelas en el horno a 80 oC durante 30 min.
- Elimine la película de transparencia de la Capa 1.
- Membrana Thin PDMS (Capa 2)
- Recubre PDMS sin curar en una película de transparencia a 1.000 rpm durante 1 min para obtener una capa PDMS de 60 m de espesor.
- Curar parcialmente PDMS recubierto de espín (Capa 2) en el horno a 80oC durante 20-30 min.
- Active la Capa 1 en la placa de vidrio 1 y la capa 2 utilizando el limpiador de plasma durante 1 min.
NOTA: El tiempo de limpieza del plasma puede variar en función de la potencia de un limpiador de plasma usado. - Une la Capa 2 sobre la Capa 1 y colócala en el horno a 80oC durante la noche.
- Bloque de tubos
- Coloque los tubos metálicos verticalmente en una placa de petri.
- Vierta suavemente PDMS en el plato para sumergir alrededor de 3/4 de los tubos metálicos.
- Curar PDMS en el horno a 60oC durante 6 h (o durante la noche).
- Corte un trozo de bloque PDMS que contenga un tubo metálico.
- Haga un agujero en la capa 2 para la entrada.
- Active el bloque PDMS y la Capa 2 utilizando el limpiador de plasma durante 1 min.
- Coloque el bloque PDMS en la parte de entrada de la Capa 2 y coloque toda la unidad de accionamiento en el horno a 80 oC durante la noche.
3. Construcciones de alginato-condrocitos (o perlas)
- Placa de vidrio amino-silanizado
- Cortar una placa de vidrio (50,8 mm x 76,2 mm x 1,2 mm) en dos placas de vidrio de tamaño medio (50,8 mm a 38,1 mm x 1,2 mm) con un escriba de diamante.
- Coloque las placas de vidrio en cloruro de hidrógeno de 0,2 M (HCl) y agítelas suavemente (por ejemplo, 55 rpm) durante la noche.
- Enjuague las placas de vidrio con diH2O.
- Agitar las placas de vidrio en hidróxido de sodio de 0,1 M (NaOH) durante 1 h a 55 rpm y enjuagarlas con diH2O.
- Agitar las placas de vidrio en 1% (v/v) 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTES) durante 1 h a 55 rpm y enjuagar con diH2O.
- Seque las placas de vidrio amino-silanizadas en una campana de humodurante la noche.
- Molde de gel de agarosa para construcciones de gel de alginato
- Mezclar 5% (p/v) agarosa y 200 mM de cloruro de calcio (CaCl2) en diH2O.
- Hervir la solución de gel de agarosa con un horno microondas (o una placa caliente). El tiempo de ebullición varía en función del volumen de la solución de gel de agarosa y la potencia del horno microondas (o la temperatura de la placa caliente).
- Vierta la solución de gel de agarosa hervida en un molde de aluminio (ver Figura Suplementaria S2) y empareje con una placa de vidrio.
- Espere 5 minutos y desmolde el gel de agarosa solidificado del molde de aluminio.
- Cosecha de condrocitos de placas de crecimiento
- Aislar las placas de crecimiento de las extremidades posteriores de los ratones neonatales.
- Colocar las placas de crecimiento en 1 ml de colagenasa al 0,25% durante 3 h en una incubadora a 37oC y 8% de dióxido de carbono (CO2),para eliminar la matriz extracelular (ECM).
- Centrifugar la muestra digerida durante 5 min a 125 x g para hacer un pellet de condrocitos y eliminar el sobrenadante de la muestra. Aquí, 1 x g es la aceleración de la gravedad.
- Resuspenda el pellet de condrocitos en 1 ml del medio de águila modificado (DMEM) modificado de Dulbecco.
- Cuente el número de condrocitos en DMEM utilizando un contador de células.
- Centrifugar los condrocitos en DMEM durante 5 min a 125 x g para hacer un pellet de condrocitos de nuevo y eliminar el sobrenadante de la muestra.
- Opcionalmente, resuspenda el pellet de condrocitos en los medios de cultivo de condrocitos (CCM)34 que contiene 2 M de calceína AM, e incubar la muestra a 37 oC durante 30 minutos. Repita el paso 3.3.6 y pase al paso 3.3.8.
- Resuspenda el pellet de condrocitos en el volumen deseado de MCP y guárdalos en la incubadora a 37oC y 8% deCO2 antes de su uso.
- Construcciones de alginato-condrocitos (o perlas) (Figura 2c)
- Mezclar 1.5% (p/v) de alginato en solución salina tamponada de fosfato (PBS) con 5 mg/ml de sulfo-NHS, 10 mg/ml de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropyl) clorhidrato de carbodiimida (EDC).
- Añadir 8 x 106 condrocitos en la solución de 1 ml de gel de alginato [o Añadir 3 éL de perlas fluorescentes de 1 m de diámetro (542/612 nm) en 1 ml de solución de gel de alginato (0,3% (v/v))].
- Colocar 150 l de la solución de alginato-condrocitos (o perla) en la placa de vidrio amino-silanizado fabricada en el paso 3.1.
- Cubra la solución de gel de alginato con el molde de gel de agarosa durante 3 min.
- Retire la solución excesiva de gel de alginato que se desborda del molde de gel de agarosa con una cuchilla de afeitar y retire el molde de gel de agarosa. Luego, las construcciones cilíndricas de alginato-condrocitos (o perlas) se obtienen en la placa de vidrio amino-silanizado.
- Colocar las construcciones de alginato-condrocitos en solución reticulante (50 mM CaCl2 / 140 mM NaCl en diH2O) durante 1 min para una mayor polimerización.
4. Montaje del dispositivo (Figura 2d)
NOTA: Los espaciadores PDMS y las abrazaderas impresas en 3D deben prepararse por separado.
- Localice cuatro espaciadores PDMS de 1 mm de espesor en las cuatro esquinas de la Capa 2 de la unidad de accionamiento.
- Coloque 700 l de MCP para cubrir las cámaras de aire de la capa 2.
- Coloque las construcciones de alginato-condrocitos (o perlas) en la Capa 2 mientras alinea cuidadosamente las construcciones con las cámaras de aire.
- Sujete el dispositivo con abrazaderas impresas en 3D(Figura 1c).
5. Actuación del dispositivo
- Conecte la salida de una bomba de aire (ver Tabla de Materiales)con la entrada de una válvula solenoide con un tubo de silicio.
- Conecte la salida de la válvula solenoide con la entrada del dispositivo montado con un tubo de silicio.
- Conecte la válvula solenoide con un generador de funciones.
- Manipular la válvula solenoide con una onda cuadrada (por ejemplo, 1 Hz) generada por el generador de funciones.
- Encienda la bomba de aire para accionar el dispositivo neumáticamente.
6. Imágenes de condrocitos en el dispositivo
NOTA: Para obtener una buena calidad de imagen, los condrocitos de imagen (o cuentas fluorescentes) en gel de alginato a través de la placa de vidrio 2 porque los globos PDMS expandidos y las cámaras de aire pueden distorsionar las imágenes ópticas. Si se utiliza un microscopio invertido para la toma de imágenes, el dispositivo debe configurarse de modo que la placa de vidrio 2 se dirija hacia abajo.
- Prepare el dispositivo con condrocitos (o perlas fluorescentes) como se muestra en las secciones anteriores.
- Tome imágenes de pila zde condrocitos (o cuentas fluorescentes) con un microscopio confocal antes y bajo compresión, respectivamente. Elija un tamaño de paso zen función de la profundidad de campo de un sistema de imágenes confocales utilizado.
- La altura de los condrocitos (o una construcción de alginato-perla) se puede medir con el método de procesamiento automático de imágenes mostrado en las literaturas anteriores26,35.
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Representative Results
Este artículo muestra los pasos detallados de la fabricación del dispositivo de compresión de condrocitos microfluídicos (Figura 2). El dispositivo contiene 5 matrices x 5 de construcciones cilíndricas de alginato-condrocitos, y estas construcciones se pueden comprimir con cinco magnitudes diferentes de compresión(Figura 1, Figura 3 y Figura 4). La altura del microcanal neumático es de alrededor de 90 m, y los diámetros de los globos PDMS son 1,2, 1,4, 1,6, 1,8 y 2,0 mm, respectivamente. El rendimiento del dispositivo se cuantificó con microscopía confocal con condiciones de compresión estática y procesamiento de imágenes. Se empleó compresión estática para la toma de imágenes microscópicas porque la imagen de pila zcon la microscopía confocal tarda unos minutos, por lo que es demasiado lenta para la toma de imágenes cuantitativas durante la compresión dinámica.
La Figura 3a muestra las matrices de 5 x 5 de columnas de hidrogel de alginato (diámetro: 0,8 mm, altura: 1 mm) fundidas en la placa de vidrio 2. Estas construcciones de gel fueron imágenes mediante la adición de cuentas fluorescentes en el gel. La figura 3b muestra un caso de ejemplo que la columna de gel se comprimió en un 33,8% de altura por el globo PDMS más grande. La cepa compresiva resultante de las construcciones de gel aumentó aproximadamente un 5% por incremento de 0,2 mm en el diámetro del globo PDMS, como se muestra en la Figura 3c.
La deformación compresiva de los condrocitos se determinó mediante la toma de imágenes de las células en un volumen de 613 m a 613 m a 40–55 m (x x y á z) cerca del centro de construcción de gel, como se muestra en la Figura 4a. La Figura 1d muestra una imagen de ejemplo de un condrocitos comprimido en un 16% por el globo PDMS más grande. La Figura 4b muestra la distribución de los valores de deformación unitaria de compresión de celda medidos y las celdas generales se comprimieron más mediante globos PDMS más grandes. Por lo tanto, la cantidad de gel de alginato y compresión de condrocitos fue controlada por el diámetro de los globos PDMS(Figura 3 y Figura 4) con una presión constante de 14 kPa.
Figura 1. Dispositivo de compresión de condrocitos microfluídicos.
(a ) Esquema del dispositivo ensamblado. Una matriz de 5 x 5 de construcciones de alginato-condrocitos se alinean en globos PDMS con 5 diámetros diferentes (D a 1,2, 1,4, 1,6, 1,8 y 2,0 mm), donde D es el diámetro del globo PDMS (o cámara de aire). (b) Esquema del funcionamiento del dispositivo. El dispositivo es accionado por presión neumática que expande los globos PDMS. (c) Imagen de un dispositivo real (diámetro de la moneda 19 mm). (d) Secciones transversales verticales de un condrocitos antes (izquierda) y debajo (derecha) de compresión en el globo PDMS más grande (D a 2,0 mm) (tensión de compresión celular, celda, cambio de altura de celda / altura inicial de la celda x 100 á 16%). Esta cifra se reproduce a partir de 26.
Figura 2. Pasos detallados de la fabricación de dispositivos de compresión de condrocitos microfluídicos.
(a ) Fotolitografía para generar un molde maestro SU-8 y seguir litografía suave para crear la capa PDMS con microcanales neumáticos (Capa 1). (b) Membrana Thin PDMS (Capa 2) en una película de transparencia generada por recubrimiento de espín. (c) Método de fundición de gel de alginato cilíndrico en vidrio (placa de vidrio 2). (d) Montaje del dispositivo de compresión de condrocitos microfluídicos. Esta cifra se reproduce a partir de 26. Haga clic aquí para descargar una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Medición de la deformación del gel de alginato bajo compresión estática.
(a ) 5 x 5 matrices de construcciones de gel de alginato cilíndrico (diámetro: 800 m, altura: 1 mm). (b) Gel de alginato comprimido por el globo PDMS más grande (D a 2,0 mm). La cepa compresiva del gel de alginato es del 33,8%. (c) La tensión compresiva del gel de alginato(gel)aumenta alrededor del 5% por incremento de 0,2 mm de diámetro del globo PDMS (D). Barra de error: desviación estándar. Línea roja: línea de conexión lineal Esta figura se reproduce a partir de 26.
Figura 4. Medición de la deformación del condrocitos bajo compresión estática.
(a) Una imagen de pila z[613 m a 613 m a 40–55 ám (x a y á z)] en el centro de la construcción del gel, a 300–400 m del fondo del gel. (b) Diferentes magnitudes de la deformación de compresión de chondrocitos(célula)resultaron en función del diámetro del globo PDMS (D). 
: valores medios. 
: cada punto de datos. Las líneas superior (o inferior) y media del cuadro son la desviación estándar y el valor mediano, respectivamente. Esta cifra se reproduce a partir de 26.
Figura S1. Diseño de fotomáscara de microcanal para el paso 1.3.4 (unidad de mm). Haga clic aquí para descargar esta figura.
Figura S2. Diseño de molde de aluminio para el paso 3.2.3 (unidad de mm). Haga clic aquí para descargar esta figura.
Figura S3. Deformación permanente del gel de alginato (1,5%, p/v) bajo 1 h de largo dinámico (1 Hz) y compresión estática. Esta cifra se reproduce a partir de 26. Haga clic aquí para descargar esta figura.
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Discussion
Para probar los efectos de la tensión compresiva en los condrocitos de la placa de crecimiento, desarrollamos el dispositivo de compresión de condrocitos microfluídicos(Figura 1) para aplicar varios niveles de tensión compresiva a los condrocitos en el andamio de hidrogel de alginato para 3D cultura de alto rendimiento. Para ayudar a otros investigadores a adoptar nuestro dispositivo o desarrollar dispositivos similares, proporcionamos detalles de los pasos de fabricación del dispositivo en este artículo de protocolo.
Los pasos cruciales en este protocolo son 1) la fabricación de la capa PDMS con microcanales neumáticos (Capa 1) sin burbujas de aire, ya que las burbujas de aire en la Capa 1 pueden dañar los microcanales neumáticos mientras se despega la película de transparencia de respaldo, 2) manteniendo una temperatura constante (p. ej., 80 oC) para curar globos PDMS (Capa 2) porque se sabe que la elasticidad de PDMS depende de la temperatura de curado36, 3) alinear las construcciones de gel de alginato con los globos PDMS, y 4) utilizando vidrio amino fresco silanizado placa (placa de vidrio 2) para la unión de las columnas de gel de alginato en la placa de vidrio 2 dentro de los dos días después del tratamiento de salinización.
La principal limitación de este protocolo es que es relativamente laborioso fabricar el dispositivo porque el proceso implica fotolitografía y múltiples pasos de litografía suave. Además, el rendimiento de los dispositivos de compresión de células microfluídicas fabricados en base a nuestro protocolo debe evaluarse siempre que se utilicen diferentes tipos de hidrogeles y células. Esto se debe a que cualquier diferencia en las propiedades mecánicas de los hidrogeles y células afectará el rendimiento del dispositivo.
Aunque nuestro dispositivo de compresión celular microfluídica es para aplicar compresión dinámica a los condrocitos, su rendimiento fue evaluado por imágenes de geles y células de alginato comprimidos estáticamente. Esto se debe a que era difícil tomar imágenes de geles y células bajo compresión dinámica con la microscopía confocal convencional. Comparamos la compresión estática (14 kPa, 1 h) y dinámica (14 kPa, 1 Hz, 1 h) en términos de la deformación permanente del gel de alginato y encontramos que la deformación permanente del gel bajo la compresión dinámica era insignificante en comparación con la compresión estática (ver Figura suplementaria S3).
Una ventaja de nuestro método es que se puede utilizar para otros tipos de celda que necesitan un entorno de referencia cultural 3D. La compresión resultante del dispositivo se puede modular dependiendo de las aplicaciones cambiando el diámetro y el grosor de los globos PDMS y/o la presión en el globo. También es posible modificar la elasticidad del globo PDMS ajustando la relación de mezcla entre el prepolímero y el agente de curado. Las células de este dispositivo se pueden tomar imágenes en tiempo real mediante microscopía de luz/fluorescencia, y el dispositivo se puede desmontar rápidamente para la cosecha celular para permitir el análisis posterior. Otra ventaja es la capacidad de generar cinco niveles de tensión mecánica distintos con cinco réplicas técnicas por cada nivel de tensión utilizando un solo dispositivo. La combinación de replicación y un análisis dosis-respuesta garantiza un alto grado de rigor y reproducibilidad en los resultados.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a los doctores Christopher Moraes y Stephen A. Morin su apoyo para el diseño y la fabricación de dispositivos. Este estudio fue apoyado por la beca Bioingeniería para la Salud Humana de la Universidad de Nebraska-Lincoln (UNL) y el Centro Médico de la Universidad de Nebraska (UNMC), y la subvención AR070242 del NIH/NIAMS. Agradecemos a Janice A. Taylor y James R. Talaska de la Instalación Central de Microscopía Avanzada en el Centro Médico de la Universidad de Nebraska por proporcionar asistencia con microscopía confocal.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane (ATPES) | Sigma-Aldrich | 741442-100ML | |
| (Tridecafluoro-1, 1, 2, 2-Tetrahydrooctyl)-1-Trichlorosilane | United Chemical Technologies | T2492-KG | |
| Acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K354 | |
| Air pump | Schwarzer Precision | SP 500 EC-LC4.5V DC | We used the model purchased in 2015. The internal design and performance of air pump (SP 500 EC-LC) changed in early 2016. Also, air pump performance has changed in the course of time. Thus, air pressure generated by an SP 500 EC-LC air pump should be calibrated before use. |
| Alginate powder | FMC Corporation | Pronova UP MVG | |
| Barb Straight Connectors (Metal tube) | Pneumadyne | EB40-250 | |
| Calcein AM | Invitrogen | C3100MP | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11960-044 | |
| Dyed red aqueous fluorescent particles | Thermo Fisher Scientific | R0100 | |
| EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | 22980 | |
| Foam pad | GRAINGER | Item # 5GCE8 | |
| Function / Arbitrary Waveform Generator | Keysight Technologies | 33210A | |
| Hydrochloric acid | Fisher Chemical | A144-500 | |
| Hydrogen peroxide | Fisher BioReagents | BP2633500 | |
| Isopropyl alcohol | BDH1174-4LP | VWR | |
| Microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 22-267-013 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Power supply | Keysight Technologies | E3630A | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Chemical | S318-1 | |
| Solenoid manifold | Pneumadyne | MSV10-1 | |
| Solenoid valve | Pneumadyne | S10MM-30-12-3 | |
| Spin coater | Laurell Technologies | WS-650Mz-23NPPB | |
| SU8 Developer | MicroChem Corp. | Y020100 4000L1PE | |
| SU8-100 | MicroChem Corp. | Y131273 0500L1GL | |
| SU8-5 | MicroChem Corp. | Y131252 0500L1GL | |
| Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | Thermo Fisher Scientific | 24510 | |
| Sulfuric acid | EMD Millipore | MSX12445 |
References
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