Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

En Microfluidic platform til stimulering af chondrocytter med dynamisk kompression

Published: September 13, 2019 doi: 10.3791/59676
Automatic Translation
1, 2, 1, 3,4
1Department of Genetics, Cell Biology and Anatomy, University of Nebraska Medical Center, 2Department of Physiology and Pharmacology, Karolinska Institutet, 3Department of Mechanical and Materials Engineering, University of Nebraska-Lincoln, 4Nebraska Center for Materials and Nanoscience, University of Nebraska-Lincoln

Summary

Denne artikel indeholder detaljerede metoder til at fabrikere og karakterisere en pneumatisk aktivering mikrofluidisk enhed til af kompression.

Abstract

Mekaniske stimuli er kendt for at moduere biologiske funktioner af celler og væv. Nylige undersøgelser har antydet, at trykkende stress ændrer vækst plade brusk arkitektur og resulterer i vækst graduering af lange knogler af børn. For at bestemme rollen for trykbærende stress i knoglevækst, skabte vi en mikrofluidisk-enhed, der aktiveres af pneumatisk tryk, til dynamisk (eller statisk) komprimering af vækstpladen chondrocytter indlejret i alginat hydrogel cylindre. I denne artikel beskriver vi detaljerede metoder til opdigte og karakterisering af denne enhed. Fordelene ved vores protokol er: 1) fem forskellige størrelser af kompressions stress kan genereres på fem tekniske replikater i en enkelt platform, 2) det er nemt at visualisere celle morfologi via et konventionelt lys mikroskop, 3) celler kan hurtigt isoleres fra enheden efter komprimering for at lette downstream-assays, og 4) platformen kan anvendes til at studere mechanobiologi af enhver celletype, der kan vokse i hydrogels.

Introduction

Mikrokonstruerede platforme er værdifulde værktøjer til at studere Molekylær, cellulær og vævsniveau biologi, fordi de muliggør dynamisk kontrol af både de fysiske og kemiske mikromiljøer1,2,3 ,4,5,6,7,8. Således kan flere hypoteser testes samtidigt på en stramt kontrolleret måde. I tilfælde af vækst plade brusk, der er stigende beviser for en vigtig rolle i trykkende stress i modulering knoglevækst gennem handling på vækstpladen brusk9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25. Men virkningsmekanismen af kompressions stress-især, hvordan stress guider dannelsen af af kolonner i vækstpladen-er dårligt forstået.

Formålet med denne protokol er at skabe en pneumatisk aktuerende mikrofluidisk af kompressionsanordning26 for at belyse mekanismerne for mekanismebiologi i vækstpladen chondrocytter (figur 1a-c). Anordningen består af to dele: den pneumatiske aktuerings enhed og alginatgel konstruktionen. Den mikrofluidiske pneumatiske aktuerings enhed er fremstillet ved hjælp af Polydimethylsiloxan (PDMS) baseret på foto-og Soft-litografi. Denne enhed indeholder en 5 x 5 array af tynde PDMS membran balloner, som kan oppustet forskelligt baseret på deres diametre. Alginat gel konstruktionen består af chondrocytter indlejret i en 5 x 5 matrix af alginat gel cylindre, og hele alginat-chondrocyte konstruktioner samles med aktuerings enheden. Alginat gel-konstrukterne komprimeres af de pneumatisk oppustet PDMS-balloner (figur 1b). Den mikrofluidisk enhed kan generere fem forskellige niveauer af tryk belastning samtidigt i en enkelt platform baseret på forskelle i PDMS ballon diameter. Således er en høj gennemløb test af af mechanobiology under flere kompressionsforhold muligt.

Den mikrofluidisk-enhed, der er beskrevet i denne protokol, har mange fordele i forhold til den konventionelle kompressionsanordning, såsom eksterne fixatorer14,21,23 og makroskopiske kompressions anordninger16, 19 , 27 , 28 for at studere af mechanobiology: 1) er den mikrofluidiske enhed omkostningseffektiv, fordi den bruger mindre mængder af prøver end den makroskopiske kompressionsanordning, 2) den mikrofluidiske enhed er tidseffektiv, fordi den kan teste flere kompressionsforhold samtidigt, 3) den mikrofluidisk enhed kan kombinere mekaniske og kemiske stimuli ved at danne en koncentration gradient af kemikalier baseret på den begrænsede blanding i mikrokanaler, og 4) forskellige mikroskopi teknikker (time-lapse mikroskopi og fluorescens Konfokal mikroskopi) kan anvendes med den mikrofluidisk enhed lavet af gennemsigtige PDMS.

Vi har vedtaget og modificeret metoden til Moraes et al.7,29 at skabe forskellige trykkende stress niveauer i en enkelt enhed for at muliggøre High-gennemløb mechanobiology undersøgelser af af kompression. Vores tilgang er passende for celler (f. eks. chondrocytter), som har brug for tredimensionale (3D) kultur miljø og for biologiske assays efter komprimering af celler. Selv om nogle mikrofluidiske celle kompressions anordninger kan komprimere celler, der dyrkes på to-dimensionelle (2D) substrater30,31,32, kan de ikke bruges til chondrocytter, fordi 2D-dyrkede chondrocytter dedifferentiere. Der er mikrofluidiske platforme til komprimering af 3D-dyrkede celler i photopolymerized silicagelrogeler7,33, men de er begrænsede i isolerende celler efter komprimering eksperimenter, fordi isolerende celler fra photopolymeriseret hydrogel er ikke let. Desuden, virkningerne af ultraviolet (UV) eksponering og foto binding initiatorer på celler kan være nødvendigt at blive evalueret. I modsætning hertil tillader vores metode hurtig isolering af celler efter kompression eksperimenter for post biologiske assays, fordi alginat silicagelrogeler kan depolymeriseres hurtigt af calciumchelatorer. Den detaljerede anordning fabrikation og karakterisering metoder er beskrevet i denne protokol. I figur 2vises en kort procedure for opdigte af mikrofluidisk af kompressionsanordning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bemærk: bær personlige værnemidler (PPE) såsom handsker og lab coat for hvert trin i denne protokol.

1. Master skimmel fabrikation

Bemærk: Udfør trin 1,1-1,3 i en stinkhætte.

  1. Glas behandling
    Bemærk: bær et ansigts skjold, handsker og en laboratorie frakke til trin 1,1.
    1. Opløsningen af Piranha (60 mL) blandes ved at blande svovlsyre (H2so4) og hydrogenperoxid (h2O2) med et volumen forhold på 3:1.
      Forsigtig: Brug ikke Piranha-opløsningen og acetone i samme stinkhætte på grund af eksplosionsfaren.
    2. Anbring en glasplade (50,8 mm × 76,2 mm × 1,2 mm) i Piranha opløsning i 30 min ved 40 °C.
    3. Glaspladen skylles med deioniseret vand (diH2O).
    4. Glaspladen placeres i acetone ved stuetemperatur i 10 minutter.
    5. Skyl glaspladen med isopropanol og tør den med nitrogen (N2) gas.
    6. Bages glaspladen ved 200 °C i 20 minutter på en kogeplade. Alle efterfølgende bagetrin bruger en kogeplade.
  2. SU-8-sålagdannelse på glaspladen
    1. Spred SU-8 5 på glaspladen med en engangs pipette, der dækker omkring 2/3 af pladens overfladeareal.
    2. Drej glaspladen med su-8 5 fotoresist ved 500 rpm for 35 s (indledende roterende cyklus) og derefter 2.500 rpm for 40 s (endelig spinning Cycle) ved hjælp af en spin Coater. Alle efterfølgende spin belægning trin omfatter den samme indledende spinning cyklus.
    3. Bag SU-8 5 belagt glasplade ved 65 °C i 2 min og derefter ved 95 °C i 5 min.
    4. Udsætte Su-8 5 belagt glasplade til UV-lys (60 MW/cm2, afstanden mellem UV-lampe og Mask er 20 cm, samlet mængde UV-lys energi = 60 MJ/cm2) for 1 s.
      Bemærk: UV-eksponeringstid skal justeres i henhold til effekten af et brugt UV-lys.
    5. Bag SU-8 5 belagt glasplade ved 65 °C i 2 min og ved 95 °C i 5 min.
    6. Placer den bagte glasplade i SU-8 udvikleren i 2 min.
    7. Bag SU-8 5 belagt glas ved 180 °C i 20 min.
  3. Su-8 kanal mønster fabrikation ved hjælp af litografiske (figur 2a trin 1-3)
    1. Hæld SU-8 100 på SU-8 5 seedet glaspladen for at dække omkring 2/3 af pladens overfladeareal.
    2. Drej glaspladen med SU-8 100 ved 3.000 rpm for 38 s (≈ 90 μm tyk).
    3. Bag SU-8 100 belagt glasplade ved 65 °C i 10 min og derefter ved 95 °C i 30 min. Hvis SU-8 100 stadig er klæbrig efter denne procedure, bage glaspladen i længere tid ved 95 °C, indtil SU-8 100 bliver ikke-klæbrig.
    4. Placer en Micro Channel Mask med høj opløsning (25.400 dpi, se supplerende figur 1) på Su-8 100 coated glaspladen og Udsæt Mask-dækket glasplade til UV-lys for 4 s (samlet mængde UV-lys energi = 240 MJ/cm2).
      Bemærk: UV-eksponeringstid skal justeres i henhold til effekten af et brugt UV-lys.
    5. Fjern foto Ask fra glaspladen og bages glaspladen ved 65 °C i 2 min og derefter 95 °C i 20 min.
    6. Opbevar den bagt glasplade i en beholder, som er pakket med aluminiumsfolie for at blokere ethvert lys, til natten hærdning.
    7. Udvikle SU-8 100 kanal mønstre på glaspladen i SU-8 udvikleren i 15 min.
    8. Vask SU-8 mønstrede glasplade (Master mold) med isopropylalkohol og tør den med N2 gas. Hvis hvide partikler forbliver under denne proces, gentages trin 7 i 5 min.

2. pneumatisk aktuerings enhed

  1. Mikrokanallag (lag 1)
    Bemærk: Udfør trin 2.1.1-2.1.2 i en stinkhætte.
    1. Drop 200 μL (Tridecafluoro-1, 1, 2-Tetrahydrooctyl) -1-Trichlorosilane på en dækseddel og Placer den i et vakuumkammer med Master formen.
    2. Påfør vakuum i 2 min i kammeret og vent 6 timer (eller natten) for silanisering af formen.
    3. Bland PDMS med et vægt forhold på 10:1 (prepolymer: Hærdningsmiddel) i 5 min.
      Bemærk: alle efterfølgende PDMS Casting Step indeholder samme prepolymer og Hærdningsmiddel vægt forhold (10:1).
    4. Hæld PDMS på Master skimmel og Degas PDMS i et vakuumkammer i 30 min.
    5. Sandwich PDMS med et stykke af gennemsigtighed film.
    6. Klemmen af ovennævnte klemt med en glasplade, skumpuder og plexiglas plader (figur 2a trin 4).
    7. Cure PDMS i en ovn ved 80 °C i 6 timer.
    8. Isoler PDMS-laget (lag 1) med gennemsigtigheds filmen fra den klemt struktur (figur 2a trin 5).
    9. Aktiver overflader på lag 1 og en ren glasplade (glasplade 1; 50,8 mm × 76,2 mm × 1,2 mm) ved hjælp af en plasma renser i 1 min.
      Bemærk: plasma rengøringstid kan variere afhængigt af effekten af en brugt plasma renser.
    10. Bond Layer 1 på glaspladen 1 og anbring dem i ovnen ved 80 °C i 30 minutter.
    11. Fjern gennemsigtigheds filmen fra Layer 1.
  2. Tynd PDMS membran (lag 2)
    1. Spin coat uhærdet PDMS på en transparent film på 1.000 rpm i 1 min for at opnå et 60 μm tykt PDMS lag.
    2. Delvist helbrede spin coated PDMS (lag 2) i ovnen ved 80 °C i 20-30 min.
    3. Aktiver Layer 1 på glaspladen 1 og Layer 2 ved hjælp af plasma Cleaner i 1 min.
      Bemærk: plasma rengøringstid kan variere afhængigt af effekten af en brugt plasma renser.
    4. Bond lag 2 på lag 1 og Placer dem i ovnen ved 80 °C natten over.
  3. Slange blok
    1. Anbring metalrør lodret på en petriskål.
    2. Hæld forsigtigt PDMS i skålen til at nedsænkes omkring 3/4 af metalrør.
    3. Cure PDMS i ovnen ved 60 °C i 6 timer (eller natten over).
    4. Skær et stykke PDMS blok, der indeholder et metalrør.
    5. Punch et hul på lag 2 til indløbet.
    6. Aktivér PDMS-blokken og Layer 2 ved hjælp af plasma Cleaner i 1 min.
    7. Fastgør PDMS-blokken på indløbs delen af lag 2, og Placer hele aktiverings enheden i ovnen ved 80 °C i løbet af natten.

3. alginat-Chondrocyt (eller perle) konstruktioner

  1. Amino-silanized glasplade
    1. Skær en glasplade (50,8 mm × 76,2 mm × 1,2 mm) i to halvstore glasplader (50,8 mm × 38,1 mm × 1,2 mm) ved hjælp af en diamant-scriber.
    2. Placer glaspladerne i 0,2 M hydrogenchlorid (HCl) og Ryst forsigtigt (f. eks. 55 rpm) dem natten over.
    3. Skyl glaspladerne med diH2O.
    4. Ryst glaspladerne i 0,1 M natriumhydroxid (NaOH) i 1 time ved 55 rpm og skyl dem med diH2O.
    5. Ryst glaspladerne i 1% (v/v) 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTES) i 1 time ved 55 rpm, og skyl dem med diH2O.
    6. Tør de amino-silanized glasplader i en stinkhætte natten over.
  2. Agrose gel skimmel til alginat gel konstruktioner
    1. Bland 5% (w/v) agopstået og 200 mM calciumchlorid (CaCl2) i dih2O.
    2. Kog agrose gel opløsningen med en mikrobølgeovnen (eller en kogeplade). Kogetiden varierer afhængigt af mængden af agrose gel-opløsningen og mikrobølgeovnens effekt (eller varme pladens temperatur).
    3. Hæld den kogte agrose gel opløsning på en aluminiums skimmel (Se supplerende figur S2), og sandwich den med en glasplade.
    4. Vent i 5 min og Unmold den solidificerede agopstået gel fra aluminium skimmel.
  3. Vækst plade af høst
    1. Isolér vækst pladerne fra bagbenene på neonatal mus.
    2. Vækst pladerne placeres i 1 mL 0,25% kollagenase i 3 timer i en inkubator ved 37 °C og 8% carbondioxid (CO2) for at fjerne ekstracellulær matrix (ECM).
    3. Den Ford øjede prøve centrifugeres i 5 minutter ved 125 x g for at lave en af-pellet og fjerne supernatanten fra prøven. Her, 1 x g er acceleration af tyngdekraften.
    4. Resuspension af af pellet i 1 ml dulbecco's modificerede eagle's medium (DMEM).
    5. Tæl antallet af chondrocytter i DMEM ved hjælp af en celle tæller.
    6. Der centrifugeres chondrocytter i DMEM i 5 minutter ved 125 x g for at lave en af pellet igen og fjerne supernatanten fra prøven.
    7. Du kan eventuelt resuspendere af pellet i af Culture Media (CCM)34 , der indeholder 2 μM værelse am, og inkubere prøven ved 37 °c i 30 min. Gentag trin 3.3.6, og gå til trin 3.3.8.
    8. Resuspension af af pellet i et ønsket volumen af CCM og opbevar dem i inkubator ved 37 °c og 8% Co2 før brug.
  4. Konstruktioner af alginat-Chondrocyt (eller perle) (figur 2c)
    1. Bland 1,5% (w/v) alginat i fosfat-bufferet saltvand (PBS) med 5 mg/mL sulfo-NHS, 10 mg/mL 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimidhydrochlorid (EDC).
    2. Tilsæt 8 x 106 chondrocytter i 1 ml alginatgel-opløsning [eller Tilsæt 3 μl fluorescerende perler på 1 μm (542/612 nm) i 1 ml alginatgel-opløsning (0,3% (v/v))].
    3. 150 μL af alginat-chondrocyte (eller perle) opløsningen på den amino-silanserede glasplade fremstillet i trin 3,1.
    4. Dæk alginat gel-opløsningen med agrose gel-formen i 3 min.
    5. Fjern overdreven alginat gel opløsning overstrøet fra agrose gel skimmelsvamp med et barberblad og fjern agrose gel skimmelsvamp. Derefter, cylindrisk alginat-chondrocyte (eller perle) konstruktioner er opnået på den amino-silanized glasplade.
    6. Placer alginat-chondrocyte konstruktioner i Cross-Linking opløsning (50 mM CaCl2 /140 mm NaCl i dih2O) i 1 min for yderligere polymerisering.

4. montering af enhed (figur 2D)

Bemærk: PDMS Spacers og 3D trykte klemmer skal forberedes separat.

  1. Find fire 1 mm tykke PDMS Spacers på de fire hjørner af lag 2 af aktuerings enheden.
  2. Placer 700 μL CCM for at dække luftkamrene i lag 2.
  3. Placer alginat-chondrocyte (eller perle) konstruktioner på lag 2, mens du forsigtigt tilpasser konstrukterne med luftkamrene.
  4. Fastgør enheden med 3D-trykte klemmer (figur 1c).

5. aktivering af enheden

  1. Tilslut en luft pumpes udløb (Se tabel over materialer) med en magnetventil indgang med en silikone slange.
  2. Tilslut stikkontakten på magnetventilen med indløbet af den monterede enhed med en silikone slange.
  3. Tilslut magnetventilen med en funktionsgenerator.
  4. Manipuler magnetventilen med en firkantet bølge (f. eks. 1 Hz) genereret af funktions generatoren.
  5. Tænd for luftpumpen for at aktivere enheden pneumatisk.

6. billeddannelse af chondrocytter i enheden

Bemærk: for at opnå en god billedkvalitet, billede chondrocytter (eller fluorescerende perler) i alginat gel gennem glaspladen 2, fordi ekspanderet PDMS balloner og luft kamre kan forvrænge optiske billeder. Hvis der anvendes et inverteret mikroskop til billeddannelse, skal enheden være setup, så glaspladen 2 vender nedad.

  1. Forbered enheden med chondrocytter (eller fluorescerende perler) som vist i tidligere sektioner.
  2. Tag z-stack billeder af chondrocytter (eller fluorescerende perler) med et Konfokal mikroskop før og under kompression, hhv. Vælg en z-trins størrelse baseret på dybden af feltet i et brugt confokale Imaging System.
  3. Højden af chondrocytter (eller en alginat-perle konstruktion) kan måles med automatisk billedbehandling metode vist i tidligere litteraturer26,35.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne artikel viser detaljerede trin af mikrofluidic af kompressionsanordning fabrikation (figur 2). Enheden indeholder en 5 x 5 arrays af cylindrisk alginat-chondrocyte konstruktioner, og disse konstruktioner kan komprimeres med fem forskellige størrelser af kompression (figur 1, figur 3 og figur 4). Højden af den pneumatiske mikrokanal er omkring 90 μm, og PDMS ballon diametre er henholdsvis 1,2, 1,4, 1,6, 1,8 og 2,0 mm. Enhedens ydeevne blev kvantificeret med Konfokal mikroskopi med statiske kompressionsforhold og billedbehandling. Statisk komprimering blev anvendt til mikroskopisk billeddannelse, fordi z-stack-billeddannelse med Konfokal mikroskopi tager et par minutter, så det er for langsomt til kvantitativ billeddannelse under den dynamiske komprimering.

Figur 3a viser 5 × 5 matricer af alginat hydrogel søjler (diameter: ~ 0,8 mm, højde: ~ 1 mm) støbt på glaspladen 2. Disse gel konstruktioner blev afbildet ved at tilføje fluorescerende perler i gelen. Figur 3b viser et eksempel på, at gel-søjlen blev komprimeret med 33,8% i højden med den største PDMS-ballon. Den resulterende tryk stamme af gel konstrukterne steg med ca. 5% pr. 0,2 mm tilvækst i PDMS ballon diameter som vist i figur 3c.

Kompressiv deformation af chondrocytter blev bestemt ved at afbilde cellerne i en 613 μm × 613 μm × 40 – 55 μm (x × y × z) volumen i nærheden af gel konstruktions Center som vist i figur 4a. Figur 1d viser et eksempelbillede af en af, der blev komprimeret med 16% af den største PDMS-ballon. Figur 4b viser fordelingen af de målte celle kompressions stamme værdier, og de samlede celler blev komprimeret mere af større PDMS balloner. Derfor blev mængden af alginat gel og af kompression kontrolleret af diameteren af PDMS balloner (figur 3 og figur 4) med et konstant tryk på 14 kPa.

Figure 1
Figur 1. Microfluidic af kompressionsanordning.
a) skematisk af den monterede anordning. En 5 × 5 array af alginate – chondrocyte konstruktioner er justeret på PDMS balloner med 5 forskellige diametre (D = 1,2, 1,4, 1,6, 1,8 og 2,0 mm), hvor D er diameteren af PDMS ballon (eller luftkammer). (b) skematisk af enhedens drift. Enheden aktiveres ved pneumatisk tryk, der udvider PDMS balloner. (c) billede af en faktisk anordning (mønt diameter = 19 mm). d) lodrette tværsnit af en Chondrocyt før (til venstre) og under (højre) komprimering på den største PDMS-ballon (d = 2,0 mm) (celle kompressions stamme, εCell = | cellehøjde ændring/Initial cellehøjde | x 100 = 16%). Dette tal er gengivet fra 26.

Figure 2
Figur 2. Detaljerede trin af mikrofluidisk af kompression enhed fabrikation.
a) fotolitografi til generering af en su-8 Master mold og efter Soft litografi til oprettelse af PDMS lag med pneumatiske mikrokanaler (lag 1). (b) tynd PDMS membran (lag 2) på en transparent film genereret af spin coating. c) cylindrisk alginat-gel-støbe metode på glas (glasplade 2). d) montering af mikrofluidisk af-kompressions anordningen. Dette tal er gengivet fra 26. Venligst klik her for at downloade en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3. Måling af alginat gel deformation under statisk komprimering.
a) 5 x 5 matricer af cylindrisk alginatgel-konstruktioner (diameter: ~ 800 μm, højde: ~ 1 mm). b) alginatgel, som er komprimeret med den største PDMS-ballon (D = 2,0 mm). Den trykkende stamme af alginatgel er 33,8%. c) trykkende stamme af alginatgel (εgel) øger ca. 5% pr. 0,2 mm forøgelse af PDMS ballon diameter (D). Fejl linje: standardafvigelse. Rød linje: lineær monterings linje dette tal er gengivet fra 26.

Figure 4
Figur 4. Måling af Chondrocyt deformation under statisk komprimering.
a) et z-stack-billede [613 μm × 613 μm × 40 – 55 μm (x × y × z)] blev opnået i midten af gel konstruktionen, 300 – 400 μm fra gel bunden. b) forskellige størrelser af af kompressions stamme (ε-celle) resulterede som en funktion af PDMS ballon diameter (D). Icon : middelværdier. Icon : hvert datapunkt. De øverste (eller nederste) og midterste linjer i boksen er henholdsvis standardafvigelsen og medianværdien. Dette tal er gengivet fra 26.

Figur S1. Micro Channel Mask design til trin 1.3.4 (enhed = mm). Venligst klik her for at downloade dette tal.

Figur S2. Aluminium skimmel design til trin 3.2.3 (Unit = mm). Venligst klik her for at downloade dette tal.

Figur S3. Permanent deformation af alginatgel (1,5%, w/v) under 1 h-lang dynamisk (1 Hz) og statisk kompression. Dette tal er gengivet fra 26. Venligst klik her for at downloade dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

For at teste effekten af tryk belastning på vækstpladen chondrocytter, udviklede vi mikrofluidisk af kompressionsanordning (figur 1) for at anvende forskellige niveauer af kompressions stress til chondrocytter i alginat hydrogel stilladset for 3D kultur i høj kapacitet. For at hjælpe andre forskere til at vedtage vores enhed eller til at udvikle lignende enheder, vi leverede oplysninger om indretningen fabrikation trin i denne protokol artikel.

De afgørende skridt i denne protokol er 1) fabrisering PDMS lag med pneumatiske mikrokanaler (Layer 1) uden nogen luftbobler, da luftbobler i lag 1 kan beskadige pneumatiske mikrokanaler, mens bagsiden transparent film er skrællet, 2) opretholdelse af en konstant temperatur (f. eks. 80 °C) til hærdning af PDMS balloner (lag 2) fordi elasticiteten af PDMS er kendt for at afhænge af hærdnings temperaturen36, 3) justering af alginat gel konstruktioner med PDMS balloner, og 4) ved hjælp af frisk amino-silanized glas plade (glasplade 2) til limning af alginatgel-kolonnerne på glaspladen 2 inden for to dage efter saliniserings behandlingen.

Den største begrænsning af denne protokol er, at det er relativt arbejdskraftintensiv at fabrikere enheden, fordi processen involverer litografiske og flere trin af bløde litografi. Derudover skal ydeevnen af mikrofluidisk celle komprimerings anordninger, der er fremstillet baseret på vores protokol, evalueres, når der anvendes forskellige typer silicagelrogeler og celler. Dette skyldes, at eventuelle forskelle i de mekaniske egenskaber af silicagelrogeler og celler vil påvirke enhedens ydeevne.

Selv om vores mikrofluidisk celle komprimering enhed er til at anvende dynamisk komprimering til chondrocytter, dens ydeevne blev evalueret af Imaging statisk komprimeret alginat gels og celler. Dette skyldes, at det var svært at billed geler og celler under dynamisk komprimering med konventionel Konfokal mikroskopi. Vi sammenlignede statisk (14 kPa, 1 h) og dynamisk kompression (14 kPa, 1 Hz, 1 h) med hensyn til den permanente deformation af alginatgel og fandt ud af, at den permanente deformation af gelen under den dynamiske kompression var ubetydelig i forhold til den statiske komprimering (Se Supplerende figur S3).

En fordel ved vores metode er, at det kan bruges til andre celletyper, der har brug for 3D-kultur miljø. Den resulterende komprimering af enheden kan moduleres afhængigt af applikationer ved at ændre diameteren og tykkelsen af PDMS balloner og/eller trykket i ballonen. Det er også muligt at ændre elasticiteten i PDMS-ballonen ved at justere blandingsforholdet mellem prepolymer og Hærdningsmiddel. Celler i denne enhed kan imældes i realtid ved hjælp af lys/Fluorescens mikroskopi, og enheden kan hurtigt skilles ad for celle høst for at muliggøre downstream-analyse. En anden fordel er evnen til at generere fem forskellige mekaniske stress niveauer med fem tekniske replikater pr hvert stressniveau ved hjælp af en enkelt enhed. Kombinationen af replikation og en dosis-responsanalyse sikrer en høj grad af stringens og reproducerbarhed i resultaterne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker DRs. Christopher Moraes og Stephen A. Morin for deres støtte til indretningen design og fabrikation. Denne undersøgelse blev støttet af Bioengineering for human Health Grant fra University of Nebraska-Lincoln (UNL) og University of Nebraska Medical Center (UNMC), og Grant AR070242 fra NIH/NIAMS. Vi takker Janice A. Taylor og James R. Talaska fra Advanced Micro scopy Core Facility på University of Nebraska Medical Center for at yde assistance med confokal mikroskopi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-Aminopropyl)triethoxysilane (ATPES) Sigma-Aldrich 741442-100ML
(Tridecafluoro-1, 1, 2, 2-Tetrahydrooctyl)-1-Trichlorosilane United Chemical Technologies T2492-KG
Acrylic sheet McMaster-Carr 8560K354
Air pump Schwarzer Precision SP 500 EC-LC4.5V DC We used the model purchased in 2015. The internal design and performance of air pump (SP 500 EC-LC) changed in early 2016. Also, air pump performance has changed in the course of time. Thus, air pressure generated by an SP 500 EC-LC air pump should be calibrated before use.
Alginate powder FMC Corporation Pronova UP MVG
Barb Straight Connectors (Metal tube) Pneumadyne EB40-250
Calcein AM Invitrogen C3100MP
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11960-044
Dyed red aqueous fluorescent particles Thermo Fisher Scientific R0100
EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride) Thermo Fisher Scientific 22980
Foam pad GRAINGER Item # 5GCE8
Function / Arbitrary Waveform Generator Keysight Technologies 33210A
Hydrochloric acid Fisher Chemical A144-500
Hydrogen peroxide Fisher BioReagents BP2633500
Isopropyl alcohol BDH1174-4LP VWR
Microscope slides Thermo Fisher Scientific 22-267-013
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-001
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning 184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Power supply Keysight Technologies E3630A
SeaKem LE Agarose Lonza 50004
Sodium hydroxide Fisher Chemical S318-1
Solenoid manifold Pneumadyne MSV10-1
Solenoid valve Pneumadyne S10MM-30-12-3
Spin coater Laurell Technologies WS-650Mz-23NPPB
SU8 Developer MicroChem Corp. Y020100 4000L1PE
SU8-100 MicroChem Corp. Y131273 0500L1GL
SU8-5 MicroChem Corp. Y131252 0500L1GL
Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) Thermo Fisher Scientific 24510
Sulfuric acid EMD Millipore MSX12445

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lu, H., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Analytical Chemistry. 76 (18), 5257-5264 (2004).
  2. Malek, A. M., Izumo, S. Mechanism of endothelial cell shape change and cytoskeletal remodeling in response to fluid shear stress. Journal of Cell Science. 109 (4), 713-726 (1996).
  3. Paguirigan, A. L., Beebe, D. J. Microfluidics meet cell biology: bridging the gap by validation and application of microscale techniques for cell biological assays. BioEssays. 30 (9), 811-821 (2008).
  4. García-Cardeña, G., Comander, J., Anderson, K. R., Blackman, B. R., Gimbrone, M. A. Biomechanical activation of vascular endothelium as a determinant of its functional phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (8), 4478-4485 (2001).
  5. Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
  6. Moraes, C., Chen, J. H., Sun, Y., Simmons, C. A. Microfabricated arrays for high-throughput screening of cellular response to cyclic substrate deformation. Lab on a Chip. 10 (2), 227-234 (2010).
  7. Moraes, C., Wang, G., Sun, Y., Simmons, C. A. A microfabricated platform for high-throughput unconfined compression of micropatterned biomaterial arrays. Biomaterials. 31 (3), 577-584 (2010).
  8. Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. Neurite growth in 3D collagen gels with gradients of mechanical properties. Biotechnology and Bioengineering. 102 (2), 632-643 (2009).
  9. Bougault, C., Paumier, A., Aubert-Foucher, E., Mallein-Gerin, F. Molecular analysis of chondrocytes cultured in agarose in response to dynamic compression. BMC Biotechnology. 8 (1), 71 (2008).
  10. Kaviani, R., Londono, I., Parent, S., Moldovan, F., Villemure, I. Compressive mechanical modulation alters the viability of growth plate chondrocytes in vitro. Journal of Orthopaedic Research. 33 (11), 1587-1593 (2015).
  11. Ménard, A. L., et al. In vivo dynamic loading reduces bone growth without histomorphometric changes of the growth plate. Journal of Orthopaedic Research. 32 (9), 1129-1136 (2014).
  12. Robling, A. G., Duijvelaar, K. M., Geevers, J. V., Ohashi, N., Turner, C. H. Modulation of appositional and longitudinal bone growth in the rat ulna by applied static and dynamic force. Bone. 29 (2), 105-113 (2001).
  13. Sergerie, K., et al. Growth plate explants respond differently to in vitro static and dynamic loadings. Journal of Orthopaedic Research. 29 (4), 473-480 (2011).
  14. Valteau, B., Grimard, G., Londono, I., Moldovan, F., Villemure, I. In vivo dynamic bone growth modulation is less detrimental but as effective as static growth modulation. Bone. 49 (5), 996-1004 (2011).
  15. Walsh, A. J. L., Lotz, J. C. Biological response of the intervertebral disc to dynamic loading. Journal of Biomechanics. 37 (3), 329-337 (2004).
  16. Zimmermann, E. A., et al. In situ deformation of growth plate chondrocytes in stress-controlled static vs dynamic compression. Journal of Biomechanics. 56, 76-82 (2017).
  17. Akyuz, E., Braun, J. T., Brown, N. A. T., Bachus, K. N. Static versus dynamic loading in the mechanical modulation of vertebral growth. Spine. 31 (25), E952-E958 (2006).
  18. Alberty, A., Peltonen, J., Ritsilä, V. Effects of distraction and compression on proliferation of growth plate chondrocytes: A study in rabbits. Acta Orthopaedica Scandinavica. 64 (4), 449-455 (1993).
  19. Amini, S., Veilleux, D., Villemure, I. Tissue and cellular morphological changes in growth plate explants under compression. Journal of Biomechanics. 43 (13), 2582-2588 (2010).
  20. Aronsson, D. D., Stokes, I. A. F., Rosovsky, J., Spence, H. Mechanical modulation of calf tail vertebral growth: implications for scoliosis progression. Journal of Spinal Disorders. 12 (2), 141-146 (1999).
  21. Cancel, M., Grimard, G., Thuillard-Crisinel, D., Moldovan, F., Villemure, I. Effects of in vivo static compressive loading on aggrecan and type II and X collagens in the rat growth plate extracellular matrix. Bone. 44 (2), 306-315 (2009).
  22. Reich, A., et al. Weight loading young chicks inhibits bone elongation and promotes growth plate ossification and vascularization. Journal of Applied Physiology. 98 (6), 2381-2389 (2005).
  23. Stokes, I. A., Mente, P. L., Iatridis, J. C., Farnum, C. E., Aronsson, D. D. Enlargement of growth plate chondrocytes modulated by sustained mechanical loading. Journal of Bone and Joint Surgery. 84 (10), 1842-1848 (2002).
  24. Stokes, I. A. F., Clark, K. C., Farnum, C. E., Aronsson, D. D. Alterations in the growth plate associated with growth modulation by sustained compression or distraction. Bone. 41 (2), 197-205 (2007).
  25. Lee, D., Erickson, A., Dudley, A. T., Ryu, S. Mechanical stimulation of growth plate chondrocytes: previous approaches and future directions. Experimental Mechanics. , (2018).
  26. Lee, D., Erickson, A., You, T., Dudley, A. T., Ryu, S. Pneumatic microfluidic cell compression device for high-throughput study of chondrocyte mechanobiology. Lab on a Chip. 18 (14), 2077-2086 (2018).
  27. Guilak, F. Compression-induced changes in the shape and volume of the chondrocyte nucleus. Journal of Biomechanics. 28 (12), 1529-1541 (1995).
  28. Knight, M. M., Ghori, S. A., Lee, D. A., Bader, D. L. Measurement of the deformation of isolated chondrocytes in agarose subjected to cyclic compression. Medical Engineering & Physics. 20 (9), 684-688 (1998).
  29. Moraes, C., Sun, Y., Simmons, C. A. Microfabricated platforms for mechanically dynamic cell culture. Journal of Visualized Experiments. (46), e224 (2010).
  30. Sim, W. Y., et al. A pneumatic micro cell chip for the differentiation of human mesenchymal stem cells under mechanical stimulation. Lab on a Chip. 7 (12), 1775-1782 (2007).
  31. Hosmane, S., et al. Valve-based microfluidic compression platform: single axon injury and regrowth. Lab on a Chip. 11 (22), 3888-3895 (2011).
  32. Ho, K. K. Y., Wang, Y. L., Wu, J., Liu, A. P. Advanced microfluidic device designed for cyclic compression of single adherent cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6 (148), (2018).
  33. Seo, J., et al. Interconnectable dynamic compression bioreactors for combinatorial screening of cell mechanobiology in three dimensions. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (16), 13293-13303 (2018).
  34. Erickson, A. G., et al. A tunable, three-dimensional in Vitro culture model of growth plate cartilage using alginate hydrogel acaffolds. Tissue Engineering Part A. 24 (1-2), 94-105 (2018).
  35. Lee, D., Rahman, M. M., Zhou, Y., Ryu, S. Three-dimensional confocal microscopy indentation method for hydrogel elasticity measurement. Langmuir. 31 (35), 9684-9693 (2015).
  36. Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering. Journal of Micromechanics and Microengineering. 24 (3), 035017 (2014).

Tags

Bioteknik Microfluidics photolithography Soft litografi vækst plade chondrocytter mechanobiologi celle mekanik alginat hydrogel Konfokal mikroskopi billedanalyse
En Microfluidic platform til stimulering af chondrocytter med dynamisk kompression
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, D., Erickson, A., Dudley, A.… More

Lee, D., Erickson, A., Dudley, A. T., Ryu, S. A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression. J. Vis. Exp. (151), e59676, doi:10.3791/59676 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter