Summary
Burada açıklanan Streptococcus mutansbir gen ürün saflaştırma için basit bir yöntemdir. Bu teknik proteinlerin saflaştırılmasında, özellikle membran proteinlerinde ve yüksek moleküler kütle proteinlerinde avantajlı olabilir ve diğer çeşitli bakteri türleri ile birlikte kullanılabilir.
Abstract
Bir genin işlevinin açıklanması genellikle ilgi geninin bozulduğunu zinde tip suşların ve suşların fenotipik özelliklerinin karşılaştırılmasını içerir. Gen bozulmasından sonra fonksiyon kaybı, bozulan genin ürününün eksojen eklenmesiyle geri kazanılır. Bu genin işlevini belirlemek için yardımcı olur. Daha önce açıklanan bir yöntem gtfC gen sekteye uğrayan Streptococcus mutans suşu oluşturmayı içerir. Burada, gtfC gen ürününü gen bozulmasından sonra yeni üretilen S. mutans suşundan arındırmak için talepedilmeyen bir yöntem tanımlanmıştır. Bu immobilize metal afinite kromatografi kullanarak gen ürün basit saflaştırma sağlayan ilgi geninin 3 ' sonunda bir polihistidin kodlama dizisi nin eklenmesini içerir. Bu yöntemde genetik modifikasyon için PCR dışında enzimatik reaksiyonlara gerek yoktur. Gen bozulmasından sonra gen ürününün ekolarak restorasyonu, farklı türlere de adapte edilebilen gen fonksiyonunu belirlemek için etkili bir yöntemdir.
Introduction
Bir genin işlevinin analizi genellikle ilgi geninin bozulduğunu suşlar için yabani tip suşların fenotibik özelliklerinin karşılaştırılmasını içerir. Gen bozan suşu üretildikten sonra, gen ürününün eksojen eklenmesi fonksiyonel restorasyona olanak sağlar.
Sonraki restorasyon tahlilleri için gerekli saflaştırılmış gen ürünleri elde etmek için en yaygın yöntem Escherichia coli1heterolog ifade gerçekleştirerek gereğidir. Ancak, membran proteinleri veya yüksek moleküler kütleli proteinlerin ekspresyonu genellikle bu sistemi kullanarak zordur1. Bu gibi durumlarda, hedef protein genellikle doğal olarak gen ürün kaybına yol açabilir adımlar, karmaşık bir dizi yoluyla protein sentezler hücrelerden izole edilir. Bu sorunların üstesinden gelmek için, gen bozulma yöntemi2, PCR tabanlı DNA birleştirme yöntemi3 (belirlenen iki aşamalı füzyon PCR) ve genetik için elektroporasyon aşağıdaki gen ürün arınması için basit bir prosedür geliştirilmiştir Streptococcus mutansdönüşüm . Gen ürününün C-terminusuna bir polihistidin etiketi (His-tag) eklenmesi, immobilize metal afinite kromatografisi (IMAC) ile arınmasını kolaylaştırır.
O-tag-ifade suş izole etmek için, ilgi geninin tüm genomik DNA (bu Onun etiketi ifade gen-bozulmuş suş) bir antibiyotik dirençli marker geni ile değiştirilir. His-tag-ifade gerginlik üretmek için prosedür daha önce açıklandığı gibi bir gen bozulmuş gerginlik üretmek için hemen hemen aynıdır4,5. Bu nedenle, fonksiyonel analiz için seri deney olarak gen bozulması ve gen ürün izolasyonu yöntemleri yapılmalıdır.
Bu çalışmada, bir polihistidin kodlama dizisi gtfC 3 ' sonuna eklenir (GenBank çekirge etiketi SMU_1005) gen, kodlama glukozyltransferase-SI (GTF-SI) S. mutans6. Daha sonra streptokok türlerinde ekspresyon çalışmaları yapıldı. E. coli ile heterolog gtfC ekspresyonuna ulaşmak, gtf-SI'nin yüksek moleküler kütlesi nedeniyle zordur. Bu tür S. mutans His-gtfC olarak adlandırılır. GtfC ve spectinomisin direnç gen kasetinin organizasyonunu gösteren şematik bir illüstrasyon (spcr) yabani tip S. mutanlarda 7 loci (S. mutans WT) ve türevleri Şekil 1. GTF-SI, karojenik dişbiyofilminingelişimine katkıda bulunan bir salgı proteinidir 6. Sakaroz varlığı altında, bir yapışık biyofilm WT S. mutans zorlanma düz bir cam yüzey üzerinde gözlenir ama S. mutans gtfC-bozulmuş suşu (S. mutans ΔgtfC)2,5 . Biyofilm oluşumu rekombinant GTF-SI ekselansları üzerine S. mutans ΔgtfC'de geri yüklenir. Suşu, S. mutans His-gtfC , daha sonra rekombinant GTF-SI üretmek içinkullanılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Astar tasarımı
-
S. mutans His-gtfCinşaatı için astar hazırlayın.
NOT: Bu protokolde kullanılan astar dizileri Tablo 1'degösterilmiştir. S. mutans Üretimi için iki aşamalı füzyon PCR yöntemiHis-gtfC şematik Şekil 2'degösterilmiştir.- Tasarım astarları (gtfC-ters ve spcr-ileri) His-tag kodlama dizisinin eki için, gtfC geni ve spcr (Şekil 2A)arasında müdahale.
- GS bağlantı ve His-tag-kodlama dizisini gtfC-reverse ve spcr-forward astarlarına ekleyin, 5' bölgelerdeki 24 taban birbirini tamamlayıcı dır.
NOT: GS bağlayıcısı ve Onun-tag amino asit dizisi (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-His-His-His-His-His) gen çevirisi yoluyla GTF-SI C-terminus bağlı. - S. mutans WT genomunda gtfC genini hedeflemek için gtfC-ileri astar tasarla >1 kb genin aşağı akışı ve spcr-ters astar, spc r'nin aşağı yakan bölgesini hedeflemek için S. mutans içinde •gtfC. GTFC -forwardve spcr-reverse astarların erimesıcaklığını gtfC-ters ve spcrerime sıcaklıklarıile eşleşecek şekilde ayarlayın - ileri astarlar, sırasıyla.
- GS bağlantı ve His-tag-kodlama dizisini gtfC-reverse ve spcr-forward astarlarına ekleyin, 5' bölgelerdeki 24 taban birbirini tamamlayıcı dır.
- İkinci PCR(Şekil 2B)için iç içe astar (iç içe dönük ve iç içe dönük-ters) tasarla.
- Transformantın genomik DNA'sına özgü tasarım astarları(gtfC-ileri ve koloni-ters)(Şekil 2C; koloni PCR için astarlar kullanılır).
NOT: Amplicons gtfC ve spcrarasındaki sınır straddle . GTFC-forwardastarı ileri astar olarak uygulanabilir. - S. mutans His-gtfC (Şekil 2C;astarlar tarafından amplifiye PCR ürün DNA dizileme için kullanılır) üretimi son onay için tasarım astar (yukarı-ileri ve aşağı-ters).
- Tasarım astarları (gtfC-ters ve spcr-ileri) His-tag kodlama dizisinin eki için, gtfC geni ve spcr (Şekil 2A)arasında müdahale.
2. S. mutanlardan genomik DNA Çıkarma
NOT: Her S. mutans suşu anaerobik koşullarda 37 °C'de beyin kalp infüzyonu (BHI) orta kültüre olmalıdır. S. mutanların mutant suşları •gtfC ve S. mutans His-gtfC BHI 100 μg/mL spectinomycin ile desteklenmektedir.
- Streak S. mutans WT ve S. mutans •gtfC ayrı ayrı BHI agar plakaları her üzerine. 37 °C'de bir gecede kuluçkaya yatırın.
- S. mutans WT veya S. mutans • sterilize kürdan kullanarakgtfC tek kolonileri seçin ve BHI suyu 1,5 mL içine aşılamak. 37 °C'de bir gecede kuluçkaya yatırın.
NOT: Koloniler ilk PCR için şablon DNA kaynağı olarak kullanılabilir (adım 3.1). - Her bakteri kültürünün 1 mL'sini 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe aktarın. 15.000 x g1 dakika için kültür santrifüj .
- Süpernatant çıkarın ve hücre pelet yeniden askıya almak için Tris-EDTA tampon (pH 8.0) 1 mL ekleyin.
- 15.000 x g1 dakika için süspansiyon santrifüj . Supernatant çıkarın. Hücre peletini 50 μL Tris-EDTA tamponunda (pH 8.0) yeniden askıya alın.
- Süspansiyonu blok kuvöz kullanarak 95 °C'de 5 dakika ısıtın. Santrifüj süspansiyon için 5 dakika 15.000 x g.
- Supernatant'ı yeni bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe aktarın (supernatant ilk PCR için şablon DNA olarak hizmet verecektir).
3. PCR Amplifikasyon
NOT: Tablo 1, Tablo 2ve Tablo 3, sırasıyla PCR astarlarını, reaktifleri ve amplifikasyon döngülerini özetler.
- PCR şablonları olarak S. mutanve S. mutans •gtfC genomu kullanarak ilk PCR'yi gerçekleştirin. GTFC geninin aşağı kısmını barındıran bölgeleri ve adım 1.1.1.2'de tanımlanan astarları kullanarak spcr'yi barındıran bölgeleri güçlendirin(Şekil 2A).
- Her PCR ürününü %1 agarose jel üzerinde elektrofore edin. Yaklaşık 1.000 bp ve 2.000 bp. Silika membran bazlı jel çıkarma yöntemi kullanarak jellerden parçaları arındırmak için istenilen DNA parçaları excise.
NOT: PCR9,DNA jel elektroforezi10ve DNA arınması11 için temel prosedürler başka bir yerde ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. - İç içe ve iç içe dönük astarlarla PCR şablonları olarak ilk PCR (yaklaşık equimolar) ürünlerini kullanarak ikinci bir PCR gerçekleştirin(Şekil 2B).
- Agarose jel üzerinde PCR karışımının onda biri elektrofore. Yaklaşık 3.000 bp uygun amplicon üretimi onaylayın.
-
Kalan PCR ürüne çökeltin.
NOT: İkinci PCR tarafından üretilen spesifik olmayan amplikonlar homolog rekombinasyona müdahale etmediğinden, PCR ürününün saflaştırılması gerekli değildir.- PCR karışımına çekirdeksiz su ekleyin ve toplam hacmi 100°L'ye getirin ve ardından 0,1 hacim (10°L) 3 M sodyum asetat (pH 5,2) ve 2,5 hacim (250°L) mutlak etanol ekleyin. Karışımı oda sıcaklığında (RT) 10 dakika boyunca karıştırın ve saklayın.
- Numuneyi 4 °C'de 15.000 x g'de 20 dk santrifüj edin. Supernatant atın. DNA peletini yıkamak için %70 etanol1 mL ekleyin.
- Numuneyi 4 °C'de 15.000 x g'de 5 dk santrifüj edin. Supernatant atın. Hava kuruve 10 μL nükleaz içermeyen su ile DNA pelet eritin.
4. Hücre Dönüşümü
- Önceki yayında açıklanan adımları izleyerek ikinci PCR ürün tanıtmak için yetkili S. mutans WT hazırlayın5. Hücreleri -80 °C'de saklayın.
NOT: Bu deney için, yetkin S. mutans WT hücreleri zaten -80 °C'de S. mutans oluşturmakiçin korunmuştur . - Konsantre ikinci PCR ürününün 5 μL'sini daha önce dondurulmuş buz gibi donmuş 50 μL'lik buz gibi yetkin hücrelerle karıştırın. Elektroporasyon cuvettes içine karışımı ekleyin. Elektroporasyon cihazını kullanarak hücrelere tek bir elektrik darbesi (1,8 kV, 2,5 ms, 600 Ω, 10 μF) verin.
- BHI suyu 500 μL hücreleri resuspend. Hemen, spektinomisin içeren BHI agar plakaları üzerine süspansiyon 10-100 μL yayıldı. 37 °C'de 2-6 gün boyunca kolonyalar alınacak kadar büyüyüp, 2-6 gün kuluçkaya yatırın.
5. Genome Rekombinasyon ve Depolama Doğrulama
- Rekombinasyon için ekrangtfC ileri ve koloni-ters astar kullanarak koloni PCR gerçekleştirin. Elektroforse bir agarose jel üzerinde her koloni PCR ürün. Yaklaşık 1500 bp'lik DNA parçasını doğrulayın.
- Bir steril kürdan ve subculture kullanarak pozitif kolonilerden birini seçin bhi brop spectinomycin içeren 2 mL bir gecede hücreleri.
- 0,8 mL bakteri kültürünü 0,8 mL steril %50 gliserol ve -80 °C veya -20 °C'de stokla karıştırın.
- Kalan 1 mL hücre süspansiyonunu 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe aktarın. Genomik DNA'yı hücrelerden çıkarmak için 2.3-2.7 adımlarını tekrarlayın.
- Bir şablon olarak ileri ve aşağı-ters astarlar ve genomik DNA kullanarak PCR gerçekleştirin. Güçlendirilmiş DNA ürününü jellerden arındırmak için 3.2 adımını tekrarlayın.
- Saflaştırılmış amplikontenin DNA dizilimini DNA dizilimi ile belirleyin.
NOT: S. mutans His-gtfC'nin neslini DNA dizilimi ile doğruladıklarından emin olun.
6. Polihistidin arınması-etiketli GTF-SI
- Streak S. bir spectinomycin içeren BHI agar plaka üzerineHis-gtfC mutans. 37 °C'de bir gecede kuluçkaya yatırın.
- BHI suyu 3 mL sterilize kürdan ve alt kültür hücreleri kullanarak tek bir koloni pick up. Bir gecede 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
- Spectinomycin olmadan BHI suyu 1 L ile iki konik şişeleri hazırlayın. BHI suyu 1 L içine gece kültürü süspansiyon 1 mL aşılamak. Bir gecede 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
- Amonyum sülfat çökelti ile kültür supernatant konsantre proteinler.
NOT: Hedef protein hücre içi ise hücre cisimlerinden ayıklayın. Amonyum sülfat çökeltisi için temel prosedürler başka bir yerdeayrıntılı 12.- 4 °C'de 10.000 x g'de 20 dk için bakteri kültürü süspansiyonuna santrifüj edin. 3 L cam bir kabın içine kültür supernatant kurtarın.
- 1.122 g amonyum sülfat ekleyin 2 L supernatant (80% doygunluk) bir manyetik karıştırıcı kullanarak güçlü karıştırma ile. Çökeltinin 4 °C'de 4 saat veya daha fazla süreyle karıştırılarak oluşmasına izin verin.
NOT: Çökelti oluşumu bir gecede devam edilebilir. - 4 °C'de 20 dk için 15.000 x g amonyum sülfat çökelmiş çözeltiyi santrifüj edin. Süpernatant'ı decant.
- Bir spatula ile çökelti toplamak ve 200 mL cam kabıiçine aktarın. Bağlayıcı tamponun 35 mL'lik peletlerini yeniden askıya alın (50 mM NaH2PO4,300 mM NaCl, 5 mM imidazol, pH 8.0).
- 4 °C'de, yeniden üretilen selüloz diyaliz tüpü kullanılarak bağlayıcı tamponun 2.500 mL'lik süspansiyonu karıştırarak diyalize karşı diyalize titretin. 2 saat sonra diyaliz solüsyonu değiştirin ve bir gecede diyalize devam edin.
- Diyaliz solüsyonunu tekrar değiştirin. Ek bir 2 saat için diyaliz devam edin.
- 4 °C'de 10 dakika boyunca 20.000 x g'de diyaliz süspansiyonu santrifüj edin. Emme filtrasyon ekipmanı kullanarak süpernatant'ı bir membran filtreden geçirin. Filtrat'ı 75 cm2'lik bir şişeye aktarın.
- Immobilize metal afinite kromatografisi (IMAC) tarafından filtröz süspansiyondan polihistidin etiketli GTF-SI'yi fraksiyone alın.
- Ni yüklü IMAC reçine bulamacının 2 mL'sini (yaklaşık 1 mL reçine) çıkış çıkışı silikon bir tüpe monte edilmiş bir kromatografik kolona aktarın. Yerçekimi akışı ile depolama çözeltisi çıkarın.
DİkKAT: Resenin IMAC boyunca kurumasını izin verme. - Reçine yıkamak için sütuniçine distile su 3 mL ekleyin. Rezorsu dengelemek için bağlama arabelleği 5 mL ekleyin.
- Bir Hoffmann çimdik horoz ile akışı kapatın. Bulamaç yapmak için adım 6.5 filtreli süspansiyon 5 mL ekleyin.
- Kalan filtreli süspansiyon tüm bulamaç ekleyin. Karışımı 4 °C'de 30 dk hafifçe döndürün.
- Karışımı sütuna geri yükleyin. Yerçekimi akışı ile süspansiyon kaldırın. IMAC reçiyi 20 mL bağlayıcı arabellekle yıkayın.
NOT: Sonraki IMAC boyunca bir Hoffmann çimdik horoz ile yaklaşık 2 mL / dk akış hızı ayarlayın. - Elüsyon tamponunun 20 mL'si (50 mM NaH2PO4,300 mM NaCl, 500 mM imidazol, pH 8.0) rekombinant GTF-SI'yi eleştirmek.
NOT: Protokol burada duraklatılmış olabilir. Eluat 4 °C'de depolanmalıdır. IMAC reşini yeniden kullanılabilir. IMAC rezorinin talimatlarına bakın.
- Ni yüklü IMAC reçine bulamacının 2 mL'sini (yaklaşık 1 mL reçine) çıkış çıkışı silikon bir tüpe monte edilmiş bir kromatografik kolona aktarın. Yerçekimi akışı ile depolama çözeltisi çıkarın.
- Elüsyon tamponu depolama tamponu (50 mM fosfat tamponu, pH 6.5) ile değiştirin ve rekombinant GTF-SI çözeltisini santrifüj ultrafiltrasyon ünitesi kullanarak yaklaşık 1 mL'ye yoğunlaştırın. Rekombinant GTF-SI çözeltisini 4 °C'de saklayın.
NOT: SDS-PAGE13 ve batı lekeleme14 kullanarak polihistidin etiketli GTF-SI arınma doğrulayın bir horseradish peroksidaz-konjuge anti-polihistidin monoklonal antikor kullanarak. CHAPS ilavesi (son konsantrasyon, %0.1) eluent için hedef proteine bağlı olarak, birim nonspesifik adsorpsiyon önlemek için gerekli olabilir.
7. Rekombinant GTF-SI tarafından Fonksiyonel Restorasyon
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 3, ilk PCR(Şekil 3A)ve ikinci PCR(Şekil 3B)her bir amplicon boyutunu gösterir. Her amplicon boyutu Tablo 1'deaçıklandığı gibi, öngörülen boyutu ile karşılık gelir. Şekil 4A, ikinci PCR ürünü ile dönüştürülmüş ve spectinomisin içeren BHI agar plakaları üzerine kaplanmış S. mutans kolonilerini göstermektedir. Colony PCR ürünleri daha sonra agarose jel(Şekil 4B)üzerinde çalıştırıldı. Her amplicon, Tablo 1'deaçıklandığı gibi, öngörülen boyuttaydı. Şekil 5, SDS-PAGE ve western lekelerinin görüntülerini gösterir. IMAC ile saflaştırılmış protein SDS-PAGE(Şekil 5A)tarafından tek bant olarak gözlenmiştir. Batı lekesi, gözlenen bandın 160 kDa'nın beklenen polihistidin etiketli protein(Şekil 5B)olduğunu doğrulamak için anti-polihistidin antikor kullanılarak yapıldı. Şekil 6 her S. mutans suş suş sakaroz kaynaklı biyofilm şekillendirme yeteneğini gösterir. Sadece S. mutans WT ve S. mutans His-gtfC% 1 sakaroz varlığında tüp duvarında bir yapışık biyofilm oluşturabilir. Bu durum S. mutans ΔgtfC (Şekil 6A)olarak gözlenmemiştir. Ancak, rekombinant GTF-SI eklenmesi S. mutans ΔgtfC (Şekil 6B)yapışık biyofilm oluşum yeteneğini geri yüklemiştir.
Şekil 1: S. mutans UA159 genom ve türevlerinde gtfC ve spcr loci organizasyonu. GTFC ve spcrarasında His-tag şematik bir illüstrasyon . Genlerin ve boşlukların uzunlukları ölçeklendirilmeyecek. Gölgeli beşgen: SMU_1004; katı beşgen: SMU_1006. Bu rakam önceki bir yayından değiştirilmiştir2. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: İki aşamalı füzyon PCR için strateji. Sşematik bir illüstrasyon . mutanlar Onun-gtfC inşaat. Genlerin ve boşlukların uzunlukları ölçeklendirilmeyecek. Şablondaki astar bağlama siteleri desenlerle gösterilir. (A) S. mutans WT genomunda gtfC geninin bir kısmını barındıran ve S. mutans ΔgtfC genomunda spcr barındıran bölgeler ilk PCR kullanılarak güçlendirilmiştir. (B) İkinci PCR, ilk PCR tarafından şablon olarak yükseltilen iki parça kullanılarak iç içe açılan astarlarla yapıldı ve homolog rekombinasyon için bir DNA yapısı elde edildi. (C) Mutant suşu bakterilerde homolog rekombinasyon üzerine üretildi. Bu rakam önceki bir yayından değiştirilmiştir2. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Birinci ve ikinci PCR ürünlerinin agarose jel elektroforezi. (A) GTFC'nin bir bölümünün (gtfC; sol görüntü) ilk PCR'sinin ürünleri ve spcr (spcr; sağ görüntü) barındıran bölge gösterilir. Tek elektroforetik görüntü işaret bantları etiketlemek için ayrılmıştır. (B) İç içe astarlarla güçlendirilmiş ikinci PCR ürünleri gösterilir. Her ok ucu, her PCR ürününün öngörülen boyutunu gösterir. M = moleküler belirteç. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Koloni PCR S. mutans Onun ekran nesil-gtfC. (A) S. mutans kolonileri ikinci PCR ürünü tarafından dönüştürülür. Koloni kimliği daire içinde sayılarla gösterilir. (B) Koloni PCR ürünlerinin agarose jel elektroforezi gösterilir. Daire li şerit numarası Şekil 4A'dakikoloni kimliğine karşılık gelir. M = moleküler belirteç. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Polihistidin etiketli GTF-SI arınma onayı. (A) Temsilci SDS-PAGE görüntüsü gösterilir. (B) Temsili western blot görüntüsü gösterilir. GTF-SI'nin transfer edildiği bir nitroselüloz membran, horseradish peroksidaz konjuge anti-polihistidin monoklonal antikor ile incelendi. İmmünoreaktif bantlar kemilüminesans reaksiyonu kullanılarak görüntülendi. Ok uçları rekombinant GTF-SI'nin öngörülen boyutunu gösterir. M: moleküler belirteç; 1 = IMAC'den önce örnek; 2 = IMAC tarafından alınan örnek. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Rekombinant GTF-SI ilavesi ile fonksiyonel restorasyon. (A) Her S. mutan suşiçin sakaroz kaynaklı yapışık biyofilm oluşumu yeteneği gösterilmiştir. (B) Rekombinant GTF-SI (25 g) ilave edilerek S. mutans ΔgtfC'de yapışkan biyofilm oluşturma yeteneği geri kazanıldı. WT = S. mutans WT; ΔgtfC = S. mutanlar ΔgtfC; His-gtfC = S. mutans His-gtfC. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Astar çiftleri | Sıra (5' - 3′) | Beklenen bant boyutu (bp) | ||
| 1. PCR | ||||
|
gtfC-ileri gtfC-ters A,B |
TAAAGGTTATGTTATTCAACGAGTGGTAACC ATGATGATGATGATGACTACCACCACCTCC AAATCTAAAGAAATTGTCAA |
1,090 | ||
|
spcr-ileri A,C spcr-ters |
GGTGGTAGTCATCATCATCAT KEDI TAAATCGATTTTCGTTCGTGAAT TTAAGAGCAAGTTTAAGATAGAACATGTTACTCAC |
2,232 | ||
| 2. PCR | ||||
| İç içe-ileri İç içe-ters |
TGGTATTATTTCGATAATAACGGTTATATGGTCAC GCCATACTTAGAGAAATTTCTTGCTAAATTCTTG |
3,179 | ||
| Rekombinasyon doğrulama | ||||
| Koloni PCR | ||||
|
gtfC-ileri Koloni-ters |
TAAAGGTTATGTTATTCAACGAGTGGTAACC CCACTCTCAACTCCTGATCCAAACATGTAAGTACC |
1,482 | ||
| Son doğrulama | ||||
| İleriye dönük Ters-geri |
TACGGCCGTATCAGTTATTACGATGCTAACTCTGG TTGTCCACTTTGAAGTCAACGTCTTGCAAGGCATG |
6,173 | ||
Tablo 1: Protokolde kullanılan astarlar. A 'gtfC-reverse ve spcr-forward' altı çizili dizileri tamamlayıcıdır ve His-tag(gtfC-reverse; ATGATGATGATGATG, spcr-ileri; CATCATCATCATCATCAT) ve GS bağlantı (gtfC-ters; ACTACCACCACCTCC, spcr-ileri; GGTGGTAGT). B GTFC'nin DNA durdurma kodonu çıkarıldı. C Polihistidin kodlama dizilerinden hemen sonra bir DNA durdurma kodonu (TAA) eklenmiştir.
| Reaktif | Stok çözeltisinin konsantrasyonu | Birim | Son konsantrasyon |
| DNA polimeraz premixi | 2 x | 25 μL | 1 x |
| İleri astar | 5 μM | 2 μL | 0,2 μM |
| Ters astar | 5 μM | 2 μL | 0,2 μM |
| Şablon DNA | Değişken | Değişken | Değişken |
| Deiyonize su | - | 50 μL'ye kadar | - |
Tablo 2: PCR reaktifleri: İlk PCR için DNA şablonunun 2 μL'si eklendi. İkinci PCR için reaksiyon karışımına ilk PCR amplicon'dan 0.5-2 μL ilave edildi. Koloni PCR için, bakteri hücreleri doğrudan reaksiyon karışımı eklendi.
| Adım | Sıcaklık | Zaman | Döngü sayısı |
| İlk denatürasyon | 98 °C | 2 dk | 1 |
| Denatürasyon Tavlama Uzantısı |
98 °C 50 °C 72 °C |
10 s 5 s Amplicon bağımlı (1 dk/1 kbp) |
35 |
| Son uzatma | 72 °C | Amplicon bağımlı (1 dk/1 kbp) |
1 |
Tablo 3: PCR amplifikasyon döngüleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Astar tasarımı protokolün en kritik adımıdır. GTFC-reverse ve spcr-forward astarlarının dizileri, gtfC'nin 3' son bölgesi nin ve spcr'nin5' uç bölgesinin dizilerine göre otomatik olarak belirlenmiştir. Her astar, 5'bölgelerine bir GS bağlantı layıcısını kodlayan 24 tamamlayıcı temel ve His-tag-kodlama dizisini içerir. Yukarı yayılım bölgelerinde bulunan yerel düzenleyici dizilerin bozulması, 3' sonuna His-tag-kodlama dizilerinin eklenmesiyle önlenebilir. DNA stop kodonu gtfC-reverseastardan çıkarılmalı ve spcr-forward astarına eklenmelidir. Ayrıca, gtfC-ileri ve spcr-ters S. mutans WT genomhomolog rekombinasyon hedef bölgenin yaklaşık 1 kb yukarı ve aşağı kanat bölgelerini yükseltmek için tasarlanmalıdır, Sıra -sıyla. Uzun yan dizilerin eklenmesi homolog rekombinasyon verimliliğini artırır. İç içe geçen astarlar, bu protokoldeki en dışa astar çifti(gtfC-ileri ve spcr-reverse) yerine kullanılmak üzere tasarlanmıştır. İç içe astarların eklenmesi ikinci PCR için gereklidir, başka bir yerde ayrıntılı olarak5.
Elektroporasyon ile dönüşüm verimlidir 1 ve elektroporasyon öncesi yetkili hücre hazırlama prosedürleri de alternatif yöntemlere göre çok daha basittir16,17,18, bir elektroporasyon cihazı gerekli olmasına rağmen. Elektroporasyon sonrası plakada eksik koloniler olması durumunda yetkili S. mutan'ınWT'sini yeniden hazırlaması önemle tavsiye edilir. Elektroporasyondan birkaç saat sonra kuluçka dönüşüm verimliliğini artırsa da, ekstra kuluçka dönüşümün başarısını etkilemez. Günlük büyüme aşamasındaki hücreler, daha önce5olarak açıklandığı gibi, yetkili hücre hazırlanması için kullanılmalıdır.
Rekombinant protein miktarı genin doğal ekspresyonuna bağlı olduğundan, daha düşük ekspresyonlu proteinlerde ölçeklendirme kültürü gerekebilir. Burada sunulan yöntem fonksiyonel restorasyon tsanının uygulanması ile sınırlıdır. Hücre içi proteinlere ek olarak ilgi geni nin eklenmesi uygulanamaz. Ancak, geliştirilen yöntem, hücre dışı hedef protein ile çalışırken tesis, verimlilik ve maliyet (örneğin, PCR dışında enzimatik reaksiyonlar) açısından önemli avantajlar sunar. Ayrıca, rekombinant proteinin saflaştırılması ve gerçek gen ekspresyonunun teyidi Şekil 5'tegösterildiği gibi, sadece ortak His-tag uygulamaları kullanılarak gerçekleştirilebilir.
Gen bozulması ve gen ürün izolasyonu da dahil olmak üzere mevcut yöntem, ilgi bir genin fonksiyonel analizi için seri deneyler olarak diğer türlerde gelecekteki kullanım için uyarlanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Japonya Bilimi Destekleme Derneği (JSPS) (16K15860 ve 19K10471 ile T. M., 17K12032 to M. I., ve 18K09926 to N. H.) ve SECOM Bilim ve Teknoloji Vakfı (SECOM) (sayı hibe 2018.09.10 No. 10 10) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Nippon Genetics | NE-AG02 | For agarose gel electrophoresis |
| Anaeropack | Mitsubishi Gas Chemical | A-03 | Anaerobic culture system |
| Anti-His-Tag monoclonal antibody | MBL | D291-7 | HRP-conjugated |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | Measurement of protein concentration |
| Brain heart infusion broth | Becton, Dickinson | 237500 | Bacterial culture medium |
| CBB R-250 | Wako | 031-17922 | For biofilm staining |
| Centrifugal ultrafiltration unit | Sartorius | VS2032 | Buffer replacement and protein concentration |
| Centrifuge | Kubota | 7780II | |
| Chromatographic column | Bio-Rad | 7321010 | For IMAC |
| Dialysis membrane clamp | Fisher brand | 21-153-100 | |
| Dialysis tubing | As One | 2-316-06 | |
| DNA polymerase | Takara | R045A | High-fidelity DNA polymerase |
| DNA sequencing | Eurofins Genomics | ||
| ECL substrate | Bio-Rad | 170-5060 | For western blotting |
| EDTA (0.5 M pH 8.0) | Wako | 311-90075 | Tris-EDTA buffer preparation |
| Electroporation cuvette | Bio-Rad | 1652086 | 0.2 cm gap |
| Electroporator | Bio-Rad | 1652100 | |
| EtBr solution | Nippon Gene | 315-90051 | For agarose gel electrophoresis |
| Gel band cutter | Nippon Genetics | FG-830 | |
| Gel extraction kit | Nippon Genetics | FG-91202 | DNA extraction from agarose gel |
| Imager | GE Healthcare | 29083461 | For SDS-PAGE and western blotting |
| Imidazole | Wako | 095-00015 | Binding buffer and elution buffer preparation |
| Incubator | Nippon Medical & Chemical Instruments | EZ-022 | Temperature setting: 4 °C |
| Incubator | Nippon Medical & Chemical Instruments | LH-100-RDS | Temperature setting: 37 °C |
| Membrane filter | Merck Millipore | JGWP04700 | 0.2 µm diameter |
| Microcentrifuge | Kubota | 3740 | |
| NaCl | Wako | 191-01665 | Preparation of binding buffer and elution buffer |
| NaH2PO4·2H2O | Wako | 192-02815 | Preparation of binding buffer and elution buffer |
| NaOH | Wako | 198-13765 | Preparation of binding buffer and elution buffer |
| (NH4)2SO4 | Wako | 015-06737 | Ammonium sulfate precipitation |
| Ni-charged resin | Bio-Rad | 1560133 | For IMAC |
| PCR primers | Eurofins Genomics | Custom-ordered | |
| Protein standard | Bio-Rad | 161-0381 | For SDS-PAGE and western blotting |
| Solvent filtration apparatus | As One | FH-1G | |
| Spectinomycin | Wako | 195-11531 | Antibiotics; use at 100 μg/mL |
| Sterile syringe filter | Merckmillipore | SLGV004SL | 0.22 µm diameter |
| Streptococus mutans ΔgtfC | Stock strain in the lab. | gtfC replaced with spcr | |
| Streptococus mutans UA159 | Stock strain in the lab. | S. mutans ATCC 700610, Wild-type strain | |
| Sucrose | Wako | 196-00015 | For biofilm development |
| TAE (50 × ) | Nippon Gene | 313-90035 | For agarose gel electrophoresis |
| Thermal cycler | Bio-Rad | PTC-200 | |
| Tris-HCl (1 M, pH 8.0) | Wako | 314-90065 | Tris-EDTA buffer preparation |
References
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).
- Murata, T., Ishikawa, M., Shibuya, K., Hanada, N. Method for functional analysis of a gene of interest in Streptococcus mutans: gene disruption followed by purification of a polyhistidine-tagged gene product. Journal of Microbiological Methods. 155, 49-54 (2018).
- Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. Biotechniques. 54 (3), 129-133 (2013).
- Murata, T., Hanada, N. Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans. FEMS Microbiology Letters. 363 (11), 101 (2016).
- Murata, T., Okada, A., Matin, K., Hanada, N. Generation of a gene-disrupted Streptococcus mutans strain without gene cloning. Journal of Visualized Experiments. (128), (2017).
- Hanada, N., Kuramitsu, H. K. Isolation and characterization of the Streptococcus mutansgtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans. Infection and Immunity. 56 (8), 1999-2005 (1988).
- LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 35 (9), 1804-1810 (1991).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Database, J. S. E.
- Database, J. S. E.
- Database, J. S. E.
- Wingfield, P. T.
- Database, J. S. E.
- Database, J. S. E.
- Smith, P. K., et al.
- Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans. Infection and Immunology. 41 (2), 722-727 (1983).
- Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency. Journal of Microbiological Methods. 49 (2), 193-205 (2002).
- Ge, X., Xu, P. Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
