Methodenartikel

Analyse der Seitenpopulation in soliden Tumorzelllinien

DOI:

10.3791/60658

⸱

23. Februar 2021

 ,  ,  ,  , 
1School of Medicine, Nankai University, 2Tianjin Key Laboratory of Tumour Microenvironment and Neurovascular Regulation, 3Collaborative Innovation Center for Biotherapy, Nankai University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vorgestellt wird eine komfortable, schnelle und kostengünstige Methode zur Messung des Anteils von Seitenpopulationszellen in soliden Tumorzelllinien.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Krebsstammzellen (CSCs) sind eine wichtige Ursache für Tumorwachstum, Metastasierung und Rezidiv. Die Isolierung und Identifizierung von CSCs sind für die Tumorforschung von großer Bedeutung. Derzeit werden verschiedene Techniken zur Identifizierung und Reinigung von CSCs aus Tumorgeweben und Tumorzelllinien eingesetzt. Die Trennung und Analyse von Side Population (SP)-Zellen sind zwei der am häufigsten verwendeten Methoden. Die Methoden basieren auf der Fähigkeit von CSCs, fluoreszierende Farbstoffe wie Hoechst 33342 schnell auszustoßen. Der Ausfluss des Farbstoffs ist mit den ATP-bindenden Kassettentransportern (ABC) assoziiert und kann durch ABC-Transporter-Inhibitoren gehemmt werden. Es werden Methoden zur Färbung kultivierter Tumorzellen mit Hoechst 33342 und zur Analyse des Anteils ihrer SP-Zellen mittels Durchflusszytometrie beschrieben. Dieser Assay ist bequem, schnell und kostengünstig. Die in diesem Assay generierten Daten können zu einem besseren Verständnis der Wirkung von Genen oder anderen extrazellulären und intrazellulären Signalen auf die Stammeigenschaften von Tumorzellen beitragen.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Krebsstammzellen (CSCs) sind Untergruppen von Zellen mit Selbsterneuerungsfähigkeit und multiplem Differenzierungspotenzial, die eine wichtige Rolle beim Tumorwachstum, der Metastasierung und dem Wiederauftreten spielen1,2. Derzeit wurden CSCs in einer Vielzahl von bösartigen Tumoren identifiziert, einschließlich Lungen-, Gehirn-, Bauchspeicheldrüsen-, Prostata-, Brust- und Leberkrebs3,4,5, 6,7,8,9. Die Identifizierung von CSCs in diesen Tumoren basiert hauptsächlich auf dem Vorhandensein von Oberflächenmarkerproteinen, wie z. B. hoher und / oder niedriger Expression von CD44, CD24, CD133 und Sca-19,10, aber ein einzigartiger Marker, der CSCs von Nicht-CSCs unterscheiden kann, wurde bisher nicht berichtet. Derzeit werden verschiedene Techniken verwendet, um CSCs in Tumorgewebe oder Tumorzelllinien zu identifizieren und zu reinigen. Diese Techniken basieren auf den spezifischen Eigenschaften von CSCs. Unter ihnen sind Assays und Sortierung von Side Population (SP) Zellen zwei der am häufigsten verwendeten Methoden.

SP-Zellen wurden ursprünglich von Goodell et al.11entdeckt, als sie hämatopoetische Stammzellen in Knochenmarkzellen von Mäusen charakterisierten. Als die Knochenmarkzellen der Maus mit dem fluoreszierenden Farbstoff Hoechst 33342 markiert wurden, erschien eine kleine Gruppe von Hoechst 33342 schwach gefärbten Zellen im zweidimensionalen Punktdiagramm eines Durchflusszytometrie-Assays. Hoechst 33342 ist ein DNA-bindender Farbstoff und hat mindestens zwei Bindungsmodi, die zu unterschiedlichen spektralen Eigenschaften führen. Bei gleichzeitiger Betrachtung der Fluoreszenzemission bei zwei Wellenlängen können mehrere Populationen aufgedeckt werden12. In ihrem Assay wurde der Hoechst 33342 bei 350 nm angeregt und die Fluoreszenz mit dem 450/20 nm Bandpassfilter (BP) und dem 675 nm Kantenfilter Long-Pass (EFLP)11gemessen. Im Vergleich zur gesamten Population von Knochenmarkzellen wurde diese Gruppe von Zellen mit hämatopoetischen Stammzellen angereichert, die SP-Zellen genannt werden11. SP-Zellen sind in der Lage, Hoechst 33342 schnell auszustoßen. Der Ausfluss dieses Farbstoffs ist mit ATP-bindenden Kassettentransportern (ABC)13verwandt, die durch einige Mittel wie FumitremorginC14,Verapamil und Reserpin15,16gehemmt werden können. Danach wurden unterschiedliche Anteile von SP-Zellen in einer Vielzahl von Geweben, Organen, Tumorgeweben und Tumorzelllinien17,18,19nachgewiesen. Diese SP-Zellen haben viele Eigenschaften von Stammzellen17,19.

Dieses Manuskript beschreibt die Hoechst 33342-Markierung und Färbung von kultivierten Tumorzellen und die Analyse von SP-Zellen mittels Durchflusszytometrie. Darüber hinaus werden die Optimierung der Hoechst 33342-Konzentration und die richtige Blockerauswahl für eine bestimmte Tumorzelllinie mit diesem Ansatz gezeigt. Abschließend werden die Auswirkungen von Stängelförder- oder Hemmungssignalen auf den Sp-Anteil in Tumorzellen nachgewiesen. Die experimentellen Beispiele zeigen, dass die Analyse von SP verwendet werden kann, um die Auswirkungen verschiedener Signale wie Genexpression, kleine Inhibitoren, Aktivatoren, Zytokine und Chemokine auf die Tumorstammhaftigkeit zu untersuchen. Im Vergleich zu anderen Methoden zur Isolierung und Reinigung von CSCs, wie z. B. Sortierung von CD44+/ CD24- Population, Aldehyddehydrogenase (ALDH) -Analyse und Tumorsphärenbildungsassays, ist diese Methode einfacher zu manipulieren und kostengünstig.

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Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Zellvorbereitung

  1. Zellverdauung und Neutralisation
    1. Samen Sie Tumorzellen (wie MDA-MB-231-Zellen) in einer 6-Well-Platte und kulturieren Sie sie in einem 37 °C-Inkubator, der mit 5% CO2versorgt wird.
    2. Ernten Sie Zellen, wenn ihre Dichte etwa 90% erreicht. Das Kulturmedium gründlich absaugen und die Zellen 2x mit 3 mL phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) waschen.
      HINWEIS: Um die Auswirkungen von Signalweginhibitoren (z. B. FRA1-Inhibitor) oder Aktivatoren (z. B. STAT3-Aktivator) auf die Stammmerkmale von Tumorzellen zu untersuchen, werden Tumorzellen in einer 6-Well-Platte ausgesät und vor der Ernte für eine bestimmte Zeit mit Inhibitoren oder Aktivatoren vorbehandelt.
    3. Fügen Sie 500 μL 0,25% Trypsin-EDTA zu jeder Vertiefung der 6-Well-Platte hinzu, legen Sie die Platte für 1-3 Minuten (min) in einen Inkubator bei 37 °C und klopfen Sie vorsichtig auf die Platte, um die Zellen zu lösen.
      HINWEIS: Eine längere Verdauung wirkt sich auf das SP-Profil aufgrund von Veränderungen der Zelllebensfähigkeit aus.
    4. Fügen Sie 3 ml PBS, ergänzt mit 2% fetalem Rinderserum (FBS), zu jeder Vertiefung der 6-Well-Platte hinzu, um die Verdauung zu beenden, und pipetieren Sie die Zellen sanft 3-5x auf und ab, um die Zellklumpen zu dispergieren.
    5. Fügen Sie 0,5 ml Zellsuspension zu einer Vertiefung einer neuen 6-Well-Platte hinzu und untersuchen Sie sie unter einem Mikroskop. Wenn Zellklumpen beobachtet werden, leiten Sie die Zellsuspension durch ein 70 μM Zellsieb.
      HINWEIS: Dies ist ein optionaler Schritt.
    6. Die Zellen werden in ein 15 mL Zentrifugenröhrchen überführen. Zentrifugenzellen bei 200 x g für 5 min zu Pelletzellen. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie ihn in 3 ml PBS, ergänzt mit 2% FBS. Pipetetten Sie die Zellen 3-5x auf und ab, um sie gründlich zu mischen.
  2. Anzahl der Zellen
    1. 50 μL der Zellsuspension in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen geben und mit 50 μL trypanblauer Lösung mischen. Pipetten Sie 10 μL der Mischung, um die Anzahl der lebenden Zellen mit einer Standardmethode wie einem Hämozytometer zu zählen.
    2. Verdünnen Sie die Zellen in PBS, ergänzt mit 2% FBS, auf eine Endkonzentration von 1 x 106 Zellen/ml. 1 ml der Zellsuspension in ein 5 ml Polystyrol-Rundboden-Reagenzglas geben und zwei Probenröhrchen vorbereiten.

2. Zellfärbung mit Hoechst 33342

  1. Hoechst 33342 in ein Röhrchen geben, um eine entsprechende Endkonzentration zu erreichen.
    HINWEIS: Beispielsweise beträgt die geeignete Konzentration von Hoechst 33342 3 μg/ml für MDA-MB-231-Zellen.
  2. Fügen Sie einen Blocker (z. B. Fumitremorgin C, Verapamil oder Reserpin) in ein anderes Röhrchen in einer geeigneten Endkonzentration ein und inkubieren Sie das Röhrchen bei 37 °C für 30 minuten, bevor Sie die gleiche Konzentration von Hoechst 33342 wie in Schritt 2.1 beschrieben hinzufügen.
    HINWEIS: Für MDA-MB-231-Zellen ist der geeignete Blocker Reserpine (40 μM). Reserpine wird als blockierendes Steuerelement verwendet, um das Fehlen von Zellen im geschlossenen SP-Bereich zu überprüfen.
  3. Bereiten Sie mehrere Röhrchen mit Zellen vor und fügen Sie Hoechst 33342 verschiedenen Konzentrationsgradienten hinzu. Wählen Sie nach einem Durchflusszytometrie-Assay die richtige Konzentration entsprechend dem Profil und dem Anteil des SP.
    HINWEIS: Dies ist ein optionaler Schritt, um die richtige Konzentration von Hoechst 33342 zu definieren.
  4. Mehrere Röhrchen mit Zellen vorbereiten, den Blocker verschiedenen Konzentrationsgradienten zuordnen, die Röhrchen 30 min lang bei 37 °C inkubieren und dann Hoechst 33342 in einer entsprechenden Konzentration hinzufügen. Wählen Sie nach dem Durchflusszytometrie-Assay die richtige Konzentration entsprechend dem Fehlen von Zellen im gated SP-Bereich.
    HINWEIS: Dies ist ein optionaler Schritt, um die richtige Konzentration des Blockers zu definieren.
  5. Legen Sie die Röhrchen in einen 37 °C-Inkubator und inkubieren Sie sie für 60 Minuten, wobei die Röhrchen alle 10 Minuten geschüttelt werden.
    HINWEIS: Das gründliche Schütteln von Röhrchen ist wichtig für die Färbung, da es einen vollständigen Kontakt zwischen den Zellen und dem Farbstoff für bessere Färbeergebnisse gewährleistet.
  6. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 x g,4 °C für 5 min und saugen den Überstand vorsichtig an, da die Zellen sehr lose und instabile Pellets bilden.
  7. Resuspend Zellen jeder Röhre in 1 ml eiskaltem PBS, ergänzt mit 2% FBS und Pipette die Zellen 3-5x auf und ab pipetten, um gründlich zu mischen. Fügen Sie 1 μL 1 mg / ml Propidiiumiodid (PI) zur Suspension jedes Röhrchens hinzu, um tote Zellen zu identifizieren.
    HINWEIS: Alle Verfahren in diesem Schritt sollten bei 4 °C durchgeführt werden, um den Ausfluss von Hoechst 33342 aus den Tumorzellen zu hemmen. Die Röhren sollten vor direkter Lichteinwirkung geschützt werden.

3. Analyse mittels Durchflusszytometrie

HINWEIS: Anweisungen zur Verwendung der Durchflusszytometer-Software (siehe Materialtabelle)sind in diesem Abschnitt und den ergänzenden Abbildungen 1–10beschrieben.

  1. Klicken Sie in der Durchflusszytometer-Software auf die Schaltfläche ORDNER. Klicken Sie auf die Schaltfläche Experiment und dann auf Neues Experiment ( Ergänzende Abbildung1A,B).
  2. Klicken Sie auf die Schaltfläche OK. "Experiment_001" wird unter dem FOLDER angezeigt (Ergänzende Abbildung 2A,B).
  3. Klicken Sie auf die Schaltfläche Experiment_001, um den Ordnernamen in einen bestimmten Namen zu ändern (z. B. "20191118-SP"). Klicken Sie auf Enter. Der neue Name ("20191118-SP") wird unter FOLDER (Ergänzende Abbildung 3A, B )angezeigt.
  4. Klicken Sie auf die Schaltfläche Neue Probe, um dem neuen Experimentordner ("20191118-SP") eine Probe hinzuzufügen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Neue Tube, um der Probe eine Tube hinzuzufügen. Klicken Sie auf die Pfeilspitzenschaltfläche (Ergänzende Abbildung 4A-C).
  5. Klicken Sie auf die Schaltfläche Parameter und richten Sie die Parameter des Durchflusszytometers ein (Ergänzende Abbildung 5).
    1. Verwenden Sie einen dichroitischen Spiegelkurzepass (DMSP) von 610 nm, um die Emissionswellenlängen zu trennen. Verwenden Sie einen 450/20 nm BP-Filter, um die blaue Fluoreszenz zu sammeln, und einen 675 nm EFLP, um die rote Fluoreszenz zu sammeln.
      HINWEIS: Hoechst 33342 wird mit einem UV-Laser bei 355 nm und PI bei 488 nm angeregt.
  6. Führen Sie die Zellproben auf dem Durchflusszytometer aus.
    HINWEIS: SP-Zellen können durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) unter sterilen Bedingungen sortiert werden. Insgesamt sollten 100.000–500.000 Zellen für die Folgeexperimente gesammelt werden.
    1. Führen Sie mit Hoechst 33342 gefärbte Zellen auf dem Durchflusszytometer aus.
      1. Legen Sie Röhrchen mit mit Hoechst 33342 gefärbten Zellen auf das Zytometer.
      2. Klicken Sie auf die Schaltfläche Punktdiagramm, um das Punktdiagramm anzuzeigen, klicken Sie dann auf die X-Achse und legen Sie sie auf "FSC-A" fest. Klicken Sie auf die Y-Achse und setzen Sie sie auf "PI-A". Zeigen Sie das Punktdiagramm des Vorwärtsstreupulsbereichs (FSC-A, X-Achse auf linearen Modus eingestellt) im Vergleich zur PI-Fluoreszenz (Y-Achse auf logarithmische Skala eingestellt) an. Passen Sie die Spannungen so an, dass die lebenden Zellen auf der rechten Seite und die nicht lebenden Zellen, die hell mit PI gefärbt sind, in der oberen linken Ecke angezeigt werden. Richten Sie dann ein Polygon-Gate ein, um tote Zellen und Zelltrümmer auszuschließen (Abbildung 1A), indem Sie auf die Schaltfläche Polygon-Gate klicken, um die P1-Teilmenge, auch bekannt als FSC-A, PI-A-Teilmenge, zu gaten (Ergänzende Abbildung 6A,B).
      3. Klicken Sie auf die Schaltfläche Punktdiagramm, um das Punktdiagramm anzuzeigen, klicken Sie auf die X-Achse und setzen Sie sie auf "FSC-A"; Klicken Sie auf die Y-Achse und setzen Sie sie auf "FSC-W". Zeigen Sie das Punktdiagramm von FSC-A (X-Achse) im Vergleich zur Vorwärtsstreuimpulsbreite (FSC-W, Y-Achse) an. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Punktdiagramm, und klicken Sie auf die Schaltfläche P1 unter der Schaltfläche Populationen anzeigen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Rechteckiges Tor, um ein rechteckiges Tor zum Gate der P2-Teilmenge (auch als FSC-A, FSC-W-Teilmenge bezeichnet) zu erstellen. Dadurch werden Zellen mit großen Volumina ausgeschlossen (Ergänzende Abbildung 7A-C und Abbildung 1A).
      4. Klicken Sie auf die Schaltfläche Punktdiagramm, um das Punktdiagramm anzuzeigen, klicken Sie auf die X-Achse und setzen Sie sie auf "SSC-A"; Klicken Sie auf die Y-Achse und setzen Sie sie auf "SSC-W". Zeigen Sie das Punktdiagramm des seitlichen Streuimpulsbereichs (SSC-A, X-Achse) im Vergleich zur seitlichen Streuimpulsbreite (SSC-W, Y-Achse) an. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Punktdiagramm, und klicken Sie unter Der Schaltfläche Populationen anzeigen auf die Schaltfläche P2. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Rechteckiges Tor, um ein rechteckiges Tor zu erstellen, um die P3-Teilmenge (auch als SSC-A, SSC-W-Teilmenge bezeichnet) zu unterteilen. Dadurch erhält man eine Zellpopulation mit einheitlicher Granularität (Ergänzende Abbildung 8A-C und Abbildung 1A).
      5. Klicken Sie auf die Schaltfläche Punktdiagramm, um das Punktdiagramm anzuzeigen, klicken Sie auf die X-Achse und setzen Sie sie auf "Hoechst Red-A"; Klicken Sie auf die Y-Achse und setzen Sie sie auf "Hoechst Blue-A". Zeigen Sie das Punktdiagramm von Hoechst Red-A (X-Achse) und Hoechst Blue-A (Y-Achse) an. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Punktdiagramm, und klicken Sie auf die Schaltfläche P3 unter der Schaltfläche Populationen anzeigen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Polygon-Gate, um ein Polygon-Gate für die P4-Teilmenge (auch bekannt als Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A-Teilmenge) zu erstellen. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Punktdiagramm, und klicken Sie auf die Schaltfläche Bevölkerungshierarchie anzeigen, um die Populationshierarchie anzuzeigen.
        HINWEIS: Das Punktdiagramm zeigt drei verschiedene Populationen: 1) eine G0-G1-Phasenpopulation in der Nähe der Mitte des Diagramms; 2) eine S-G2/M-Phasenpopulation in der Nähe der oberen rechten Ecke; 3) die SP. Der SP wird dann für weitere Analysen eingezäunt (Ergänzende Abbildung 9A-D und Abbildung 1A). Wenn das Punktdiagramm von Hoechst Red-A versus Hoechst Blue-A kein SP-Profil ähnlich dem in Abbildung 1Azeigt, sollten die Spannungen angepasst werden, bis ein ähnliches Profil zu sehen ist. Passen Sie in der Zwischenzeit alle oben genannten Tore entsprechend an.
      6. Nachdem Sie den Gate-Bereich der SP-Zellen bestimmt haben, klicken Sie auf Daten erfassen, um 20.000 bis 100.000 Ereignisse aus jeder Probe zu sammeln, um den Prozentsatz der SP-Zellen zu analysieren (Ergänzende Abbildung 10).
    2. Führen Sie die mit Blocker behandelten Hoechst 33342-gefärbten Zellen auf dem Durchflusszytometer aus.
      1. Legen Sie Röhren mit Blocker auf das Zytometer und führen Sie Zellen mit den gleichen Spannungen und Gattern aus, um weiter zu überprüfen, ob die Spannungen und Gatter entsprechend ausgewählt sind.
        HINWEIS: Im Vergleich zur Hoechst 33342-Färbung allein sollte nur ein sehr kleiner Teil der Zellen, falls vorhanden, im geschlossenen Bereich des SP erscheinen (Abbildung 1B).
      2. Sammeln Sie 20.000 bis 100.000 Ereignisse aus jeder Probe, um den Prozentsatz der SP-Zellen zu analysieren.

4. Datenanalyse

HINWEIS: Anweisungen für die Verwendung der Durchflusszytometrie-Analysesoftware (siehe Materialtabelle)sind in diesem Abschnitt und den ergänzenden Abbildungen 11–16 beschrieben.

  1. Kopieren Sie die Dateien im fcs-Format auf einen Computer, öffnen Sie die Durchflusszytometrie-Analysesoftware und ziehen Sie eine Beispieldatei in die Software (Ergänzende Abbildung 11A,B).
  2. Gate-Zellen und erhalten Sie den Prozentsatz der SP-Zellen.
    1. Doppelklicken Sie auf diese Beispieldatei,klicken Sie auf die X-Achse und setzen Sie sie auf "FSC-A"; Klicken Sie auf die Y-Achse und setzen Sie sie auf "PI-A". Erstellen Sie dann ein Polygon-Gate und klicken Sie auf die Schaltfläche OK, um die FSC-A, PI-A-Teilmenge abzulegen (Ergänzende Abbildung 12A-E).
    2. Doppelklicken Sie auf die Teilmengendatei FSC-A, PI-A,klicken Sie auf die X-Achse und setzen Sie sie auf "FSC-A"; Klicken Sie auf die Y-Achse und setzen Sie sie auf "FSC-W". Erstellen Sie dann ein rechteckiges Tor und klicken Sie auf die Schaltfläche OK, um die Teilmenge FSC-A, FSC-W abzulegen (Ergänzende Abbildung 13A-E).
    3. Doppelklicken Sie auf die Teilmengendatei FSC-A, FSC-W,klicken Sie auf die X-Achse und setzen Sie sie auf "SSC-A"; Klicken Sie auf die Y-Achse und setzen Sie sie auf "SSC-W". Erstellen Sie dann ein rechteckiges Tor und klicken Sie auf die Schaltfläche OK, um die Teilmenge SSC-A, SSC-W zu erhalten (Ergänzende Abbildung 14A-E).
    4. Doppelklicken Sie auf die Teilmengendatei SSC-A, SSC-W,klicken Sie auf die X-Achse und setzen Sie sie auf "Hoechst Red-A"; Klicken Sie auf die Y-Achse und setzen Sie sie auf "Hoechst Blue-A". Erstellen Sie dann ein Polygon-Gate und klicken Sie auf die Schaltfläche OK, um die Teilmenge Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A abzulegen (Ergänzende Abbildung 15A-E).
    5. Öffnen Sie den Layout-Editor, indem Sie auf die Schaltfläche Layout-Editor öffnen klicken. Ziehen Sie die Teilmengendatei SSC-A, SSC-W in den Layout-Editor, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Klicken, um das Fenster Layout in Datei zu speichern, um die Bildergebnisse zu speichern (Ergänzende Abbildung 16A-C).
  3. Speichern Sie den Arbeitsbereich, um die Gating-Informationen beim Schließen der Software beizubehalten.
  4. Führen Sie T-Test-Analysen mit statistischer Analysesoftware durch, um den Unterschied zwischen zwei Gruppen zu vergleichen. Ein Wert von P < 0,05 wurde als statistisch signifikant definiert.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vier experimentelle SP-Analysen wurden nach dieser Methode durchgeführt. In der ersten haben wir den Anteil der SP-Zellen in MDA-MB-231, einer dreifach negativen menschlichen Brustkrebszelllinie, unter normalen Bedingungen nachgewiesen. Nach der Zellzählung wurde Hoechst 33342 in ein Röhrchen mit 1 x 106 Zellen in einer Endkonzentration von 3 μg/ml gegeben. Reserpin und Hoechst 33342 wurden einem anderen Röhrchen in Endkonzentrationen von 40 μM bzw. 3 μg/ml zugesetzt. PI wurde zu beiden Röhren hinzugefügt. Das...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Es gibt mehrere wichtige Punkte, die für den SP-Assay zu beachten sind. Die erste ist die Auswahl eines geeigneten Blockers, wie Verapamil oder Reserpine, für jede Zelllinie, da die "Gate" -Position der SP-Zellen nach der Position bestimmt wird, an der eine große Anzahl von SP-Zellen nach der Zugabe des Blockers verschwindet. Für die Zelllinie MDA-MB-231 funktioniert Reserpine gut. Für andere Zelllinien könnten jedoch verschiedene Blocker besser funktionieren.

Die zweite ist die Konzentration ...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde von der Natural Science Foundation of China 81572599, 81773124 und 81972787 finanziert; Naturwissenschaftliche Stiftung der Stadt Tianjin (China) 19JCYBJC27300; Tianjin People's Hospital & Nankai University Collaborative Research Grant 2016rmnk005; Grundlagenforschungsfonds für die Zentralen Universitäten, Nankai University 63191153.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
6-Well-ZellkulturplatteCORNING35169,5 cm2 (ca.)
ColivelinMCEHY-P1061ASer-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro
Fötales Rinderserum (FBS)Biological Industries (BIOIND)04-001-1ACS
DurchflusszytometerBD BiosciencesBD LSRFortessa
Software für DurchflusszytometerBD BiosciencesFACSDiva
Software für die Durchflusszytometrie-AnalyseBD BiosciencesFlowJo
Hoechst 33342Sigma-AldrichB2261bisBenzimid H 33342 Trihydrochlorid
Polystyrol Reagenzglas mit rundem BodenCORNING35205412 x 75 mm, 5 mL
Propidium iodid (PI)Sigma-AldrichP41703,8-Diamino-5-[3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-phenylphenanthridiniumdiiodid
ReserpinSigma-Aldrich83580(3β, 16β, 17α, 18β, 20α)-11,17-Dimethoxy-18-[(3,4,5-trimethoxybenzoyl)oxy]yohimban-16-carbonsäuremethylester
SKLB816bereitgestellt von Dr. Shengyong Yang, Sichuan University
Trypsin-EDTA (0,25%), PhenolrotGibco25200072
VerapamilhydrochloridSigma-AldrichV46295-[N-(3,4-Dimethoxyphenylethyl)methylamino] -2-(3,4-dimethoxyphenyl)-2-isopropylvaleronitrilhydrochlorid

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Side Population AnalyseKrebsstammzellenHoechst 33342 F rbungDurchflusszytometrieABC TransporterZellisolationStammzelleneigenschaftenBlocker KontrollePropidiumjodid

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