Generierung von Mosaik-Mammary-Organoiden durch Differential-Trypsinisierung

Die Brustdrüse (MG) ist eine baumartige, röhrenförmige Epithelstruktur, die in eine adipozytenreiche Stroma eingebettet ist. Das zweischichtige duktale Epithel besteht aus einer äußeren, basalen Schicht aus kontraktilen, myoepithelialen Zellen (MyoECs) und einer inneren Schicht aus luminalen, sekretorischen Epithelzellen (LECs), die ein zentrales Lumen^{umschließen 1}. Während der Stillzeit, wenn sich die äußeren MyoECs zusammenschließen, um Milch aus den inneren alveolarLECs zu pressen, erfährt das MG zahlreiche Veränderungen, die unter der Kontrolle von Wachstumsfaktoren (z. B. EGF und FGF) und Hormonen (z. B. Progesteron, Insulin und Prolaktin) stehen. Diese Veränderungen verursachen die Differenzierung von spezialisierten Strukturen, Alveolen, die Milch während der Laktation¹synthetisieren und absondern. Die Brustepithelie kann experimentell mit Techniken manipuliert werden, bei denen entweder Epithelgewebefragmente, Zellen oder sogar eine einzelne Basalzelle in Brustfettpolster transplantiert, von endogenem Brustparenchym vorgereinigt und auswachsen lassen, um einen ganzen, funktionellen Epithelbaum^2,3,4,5zu rekonstruieren. Transplantation ist eine leistungsfähige Technik, aber es ist zeitaufwändig und unmöglich, wenn eine Mutation zu einer frühen embryonalen Letalität (vor E14) führt, die die Rettung von transplantierbaren Brustanlagen verhindert. Darüber hinaus möchten die Forscher häufig die Rollen der beiden verschiedenen Kompartimente erforschen, die aus linienbeschränkten Vorläuferzellen abgeleitet sind. Während die Cre-lox-Technologie die differenzielle genetische Manipulation von MyoECs und LECs ermöglicht, ist dies auch ein zeitaufwändiges und teures Unterfangen. So haben die Forscher seit den 1950er Jahren In-vitro-Mammariide als relativ einfache und effiziente Möglichkeit verwendet, Um Fragen zur Brustgewebestruktur und -funktion^6,7zu beantworten.

In frühen Protokollen, die die Isolierung und Kultur der primären Epithelzellen der Brust beschreiben, fanden die Forscher heraus, dass eine Kellermembranmatrix (BME), bestehend aus einem Plasmagerinnsel und Einem Hühnerembryonalextrakt, für MG-Fragmente erforderlich war, die auf einer Schale⁶angebaut wurden. In den folgenden Jahrzehnten wurden extrazelluläre Matrizen (ECMs, Kollagen und geleeartige Proteinmatrix, die von Engelbreth-Holm-Swarm-Murine-Sarkomzellen sezerniert wurden) entwickelt, um die 3D-Kultur zu erleichtern und die in vivo-Umgebung^7,8,9,10" besser nachzuahmen. Culturing Zellen in 3D-Matrizen durch mehrere Kriterien (Morphologie, Genexpression und Hormonreaktion) offenbart, dass eine solche Mikroumgebung besser Modelle in vivo physiologische Prozesse^9,10,11,12. Die Forschung mit primären murinen Zellen identifizierte wichtige Wachstumsfaktoren und Morphogene, die für die erweiterte Erhaltung und Differenzierung von Organoiden notwendig sind¹³. Diese Studien haben die Voraussetzungen für das hier vorgestellte Protokoll und für die Kultur menschlicher Brustzellen als 3D-Organoide bereitet, die heute ein modernes klinisches Werkzeug ist, das die Entdeckung von Arzneimitteln und Arzneimitteltests an Patientenproben^{ermöglicht 14}. Insgesamt hebt die organoide Kultivierung die Selbstorganisationskapazitäten von Primärzellen und ihre Beiträge zur Morphogenese und Differenzierung hervor.

Präsentiert hier ist ein Protokoll zu Kultur murin epithelia, die in Milch produzierenden Acini unterschieden werden kann. Eine differenzielle Trypsinisierungstechnik wird verwendet, um die MyoECs und LECs zu isolieren, aus denen die beiden unterschiedlichen MG-Zellkompartimente bestehen. Diese getrennten Zellfraktionen können dann genetisch manipuliert werden, um die Genfunktion zu überexpressen oder zu klopfen. Da die Linienintrinsinin, die Selbstorganisation eine angeborene Eigenschaft der Epithelzellen der Brust^15,16,17ist, ermöglicht die Rekombination dieser Zellfraktionen den Forschern, bilayerierte Mosaik-Organoide zu erzeugen. Wir beginnen damit, das Fettgewebe enzymatisch zu verdauen und dann die Brustfragmente auf einer Gewebekulturschale für 24 h zu inkubieren (Abbildung 1). Die Gewebefragmente setzen sich auf Polystyrolschalen als zweischichtige Fragmente mit ihrer In-vivo-Organisation ab: äußere myoepitheliale Schicht, die innere Luminalschichten umgibt. Diese zelluläre Organisation ermöglicht die Isolierung der äußeren MyoECs durch Trypsin-EDTA (0,05%) Behandlung für 3-6 min gefolgt von einer zweiten Runde Trypsin-EDTA (0,05%) Behandlung, die die verbleibenden inneren LECs löst (Abbildung 2). Somit werden diese Zelltypen mit unterschiedlicher Trypsinempfindlichkeit isoliert und können anschließend in ECM gemischt und plattiert werden (Abbildung 3). Die Zellen durchlaufen eine Selbstorganisation, um zweischichtige Kugeln zu bilden, die eine äußere Schicht von MyoECs umgeben, die innere LECs umgeben. Lumenbildung tritt auf, wenn die Zellen in einem Medium wachsen, das einen Cocktail von Wachstumsfaktoren enthält (siehe Rezepte für Growth Medium)¹³. Nach 5 Tagen können Organoide durch Umschalten auf Alveologenese Medium (siehe Rezepte und Abbildung 3F)in milchproduzierende Acini differenziert und für weitere 5 Tage inkubiert werden. Alternativ werden Organoide für mindestens 10 Tage weiter expandieren und in Growth Medium verzweigen. Organoide können mit Immunfluoreszenz (Abbildung 3D-F) analysiert oder aus dem ECM mit einer Wiederherstellungslösung freigesetzt werden (siehe Materialtabelle) und mit anderen Methoden (z. B. Immunoblot, RT-qPCR) analysiert werden.

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of California, Santa Cruz, genehmigt.

1. Tag 1: Brustdrüsenverdauung

1. Bereiten Sie sich darauf vor, die MGs von reifen weiblichen Mäusen im Alter von 10-14 Wochen zu ernten.
   1. Führen Sie die Ernte auf einer offenen Bank unter aseptischen Bedingungen durch.
   2. Sterilisieren Sie alle chirurgischen Vorräte, Korkbretter und Stifte durch Autoklavieren und Einweichen in 70% Alkohol für 20 min vor der Operation.
   3. Anästhesisieren Sie Tiere mit Natriumpentobarbital (2X Anästhesiedosis von 0,06 mg/g Körpergewicht), die über intraperitoneale Injektion mit einer 0,5 ml Insulinspritze abgegeben werden.
   4. Überwachen Sie den Grad der Anästhesie, indem Sie die Zehen des Tieres kneifen, um eine Reflexreaktion zu überprüfen, und beginnen Sie das Protokoll erst, nachdem das Tier vollständig beästhetisiert ist.
   5. Legen Sie das Tier auf den Rücken, heften Sie seine Anhänge an das Korkbrett und wischen Sie den Bauch und die Brust mit Ethanol ab.
2. Um die #2, 3, 4 und 5 MGs von einer Maus (d.h. 8 MGs, Abbildung 1A) zu ernten, identifizieren Sie die Mittellinie zwischen den beiden Hinterbeinen und machen Sie einen kleinen Schnitt (1 cm) auf der Bauchhaut mit scharfer Schere, dann verlängern Sie den Schnitt bis zum Hals¹⁸.
3. Folgen Sie, indem Sie kleine Schnitte seitlich in Richtung der Beine und Arme machen, um die Freisetzung der Haut mit einem Wattestäbchen zu ermöglichen. Ziehen Sie die Haut weg und strecken Sie sie fest, bevor Sie sie auf einer Seite festanheften(Abbildung 1B, Schritt 1)¹⁸. Entfernen Sie die MGs, indem Sie unter sie schneiden, und entfernen Sie die Lymphknoten aus den #4 Drüsen (Abbildung 1B, Schritte 2, 3)¹⁸. Wiederholen Sie den Vorgang auf der anderen Seite des Körpers.
4. Sammeln Sie das MG-Gewebe in 50 ml von 4 °C Dulbecco es Modified Eagle es Media (DMEM)/Nutrient Mixture F12 (F12) ergänzt mit 5% fetalem Rinderserum (FBS) und 1X Antimycotic (Anti-Anti)¹⁸.
5. Hacken Sie die Drüsen in einer 35-mm-Schale oder auf einer Keramikplatte mit einer Rasierklinge oder einem Tissue-Chopper. Drehen Sie die Platte alle fünf manuellen Koteletts oder jede Runde auf dem Gewebe-Chopper, bis die Gewebestücke durch eine 1 ml Mikropipette-Spitze mit Leichtigkeit passen können (0,1 mm/Fragment, Abbildung 1C).
6. Verdauen Sie die MGs in Digestion Medium (siehe Tabelle 1) für 14 h in einer 6 gut niedrigen Haftschale bei 37 °C, 5%_CO2.

2. Tag 2: Isolierung von Brustepithelgewebefragmenten

1. Nach 14 h Verdauung, sanft mischen, indem Sie das verdaute Gewebe 10X mit einer 1 ml Mikropipette, um alle verbleibenden Stroma oder Fettgewebe zu brechen, um sicherzustellen, dass weder Blasen noch überschüssige mechanische Kraft erzeugt werden.
   HINWEIS: Wenn es eine unvollständige Verdauung nach 14 h gibt, könnte dies auf die Anhäufung von geergelten DNA zurückzuführen sein. Fügen Sie in diesem Fall 1 l von 1 mg/ml Desoxyribonuklease I (DNase I) pro 2 ml Verdauungsmedium hinzu. Weitere 30 min bei 37 °C, 5%_CO2inkubieren.
2. Sammeln Sie Gewebe in einem 15 ml Rohr und spülen Sie den brunnen für die Verdauung verwendeten mit 2-3 ml Gewebekultur Grad 1X Dulbecco Phosphat gepufferte Saline (DPBS) frei von Ca²⁺ und Mg²⁺. Zentrifuge bei 600 x g für 10 min.
3. Evakuieren Sie den Überstand, der die Lipidschicht und das Medium enthält, und setzen Sie das Pellet dann in 5 ml DPBS wieder auf und wechseln Sie zu einem neuen 15 ml Rohr. Zentrifuge bei 600 x g für 10 min.
4. Während der Zentrifugation ein 70 m Nylon-Zellsieb in ein 50 ml-Rohr legen und das Sieb mit 10 ml 37 °C DMEM/F12 vornässt.
5. Resuspend Gewebefragmente aus Protokollschritt 2.4 mit 5 ml DPBS und übergeben Sie die Suspension durch ein vornasses 70'm Nylon-Zellsieb, um Stromalzellen und einzelzellen zu entfernen (Abbildung 1D).
6. Sammeln Sie die Gewebefragmente auf dem Zellsieb. 4X mit 10 ml von 37 °C DMEM/F12 abspülen (Abbildung 1D).
   VORSICHT: Eine unvollständige Spülung führt zu Kulturen, die mit nichtepitheliaalen Zellen kontaminiert sind.
7. Lösen Sie die Gewebefragmente, indem Sie die Sieblasche mit den Handschuhen halten, das Sieb über eine 60 mm Gewebekulturschale umkehren und 1 ml Aliquots von Maintenance Medium (siehe Tabelle 1) durch den Boden des Siebs 4X (Abbildung 1E) passieren.
8. Überprüfen Sie das Sieb auf Gewebefragmentreste, die mit bloßem Auge sichtbar sind, und spülen Sie das Sieb 1X mehr mit 1 ml Maintenance Medium, wenn Fragmente noch am Sieb haften. Die vorspülenden Gewebefragmente sollten nun frei von Stromalzellen sein.
9. Untersuchen Sie schnell die 60-mm-Schale mit den MG-Fragmenten aus Protokollschritt 2.9 unter einem invertierten Mikroskop (4X oder 10X Objektiv, Abbildung 1F). Eine typische Vorbereitung von acht MGs ergibt 500 Fragmente. Suchen Sie nach einzelzellen oder Fetttröpfchen und ob es kontaminierende Zellen gibt.
   HINWEIS: Wenn es kontaminierende Zellen gibt, wiederholen Sie den Filtrationsschritt, indem Sie das Medium und die Fragmente aus der 60-mm-Schale mit einer 5 ml Pipette sammeln und das Fragment erneut durch ein frisches 70-m-Sieb filtern, wobei sich die Protokollschritte 2.6, 2.8-2.10 wiederholen.
10. Inkubieren 24 h bei 37 °C, 5%_CO2, so dass das Gewebefragment haften und zweischichtige Fragmente erzeugen kann (Abbildung 2A).
    HINWEIS:Wenn sich die Fragmente nicht um 24 h gelegt haben, tauchen Sie fort, bis sie eingehalten wurden. Wenn die Fragmente nicht gut haften, funktioniert die Trennung der Zellfächer nicht. Wenn Forscher über die Haftung besorgt sind, können die Gewebekulturplatten behandelt werden, um die Fragmentanhaftung zu fördern (z. B. Poly-L-Lysin).

3. Tag 3: Differential-Trypsinisierung von myoepithelialen und luminalen Epithelzellen

1. Um MyoECs von LECs zu trennen, entleeren Sie die Medien von der Schale, spülen Sie 1x mit 1 ml DPBS und fügen Sie 1 ml frisches Trypsin-EDTA (0,05 %) hinzu und überwachen Sie sorgfältig die Verdauung unter einem invertierten Mikroskop (10X oder 20X Objektiv, Abbildung 2B,C,F). Die Ablösung der äußeren MyoEC-Schicht erfordert 3-6 min, abhängig von Trypsin-EDTA (0,05%) Stärke.
   HINWEIS: Repräsentative Bilder, die diesen Prozess zeigen, finden Sie in Abbildung 2. Bei heller Ausleuchtung erscheinen die MyoECs abgerundet und haben ein helleres Aussehen im Vergleich zu den LECs, die in der Mitte haften bleiben und dunkler erscheinen.
2. Sammeln Sie den MyoEC-Anteil in einem 15 ml-Rohr, das 2 ml 10% FBS/DPBS enthält. Ohne die LECs zu stören, spülen Sie die 60-mm-Schale vorsichtig mit 2 ml DPBS ab und entsorgen Sie dann die DPBS (Abbildung 2H-I).
   HINWEIS: Die übliche Wiederherstellung für MyoECs liegt in einem Bereich von (3,5 x 10⁶-1,5 x 10⁶) je nach Größe der MGs.
3. Um die LEC-Fraktion zu entfernen, fügen Sie 1 ml Trypsin-EDTA hinzu (0,05%) wieder auf die Schale und inkubieren 7-15 min, Überwachung sorgfältig, um Überverdauung zu verhindern. Trypsin-EDTA auslöschen (0,05%) auf der Schale mit 2 ml von 10% FBS/DPBS. Sammeln Sie den LEC-Anteil in einem neuen 15 ml Rohr.
   ANMERKUNG: Die übliche Erholung für LECs liegt in einem Bereich (2 x 10⁶-4,2 x 10⁶) abhängig von der Größe der MGs. Routinemäßig liegt die Reinheit beider Fraktionen, wie sie von der Immunhistochemie untersucht werden, bei 90 %¹⁹ (Abbildung 2E).
4. Zentrifugieren Sie jede Fraktion für 5 min bei 300 x g, um die Trypsin-EDTA (0,05%) zu entfernen. Setzen Sie das Pellet in 250 l Wartungsmedium aus und zählen Sie jede Zellpopulation mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler. Legen Sie die Zellen während der Zählung auf Eis.
   HINWEIS: Wenn eine genetische Manipulation der Zellfraktionen gewünscht ist, können Primärzellen auf Gerichten mit geringer Haftung angebaut und mit dem Lentivirus²⁰infiziert werden.

4. Tag 3: Kombinieren und Einbetten von Zellfraktionen in eine extrazelluläre Matrix

HINWEIS: Sobald die MyoEC- und LEC-Fraktionen gesammelt und gezählt wurden, können sie kombiniert werden. Das typische MyoEC/LEC-Verhältnis ist 1:3 (Abbildung 3A)¹⁹. Es können verschiedene Studien durchgeführt werden. Um beispielsweise Mosaikstudien durchzuführen, können Brüche von Wildtyp-Mäusen (WT) und mutierten (Mut) Mäusen erzeugt und kombiniert (MyoEC/LEC: WT/WT; WT/Mut; Mut/WT; Mut/Mut)²¹, oder Brüche können mit unterschiedlichen Verhältnissen von MyoECs/LECs¹⁹kombiniert werden.

1. Berechnen Sie anhand der Zellzahl die Anzahl der Brunnen (8 Brunnenkammer, siehe Materialtabelle),die für 12.000 Zellen/Well (z. B. 3.000 MyoECs:9.000 LECs) vorbereitet werden müssen.
2. Legen Sie die Basisschicht für die 3D-Kultur fest, indem Sie jedem Brunnen 90 L 50 % ECM (50 % ECM/50 % DMEM/F12, ohne Phenolrot - siehe Materialtabelle)hinzufügen. Stellen Sie sicher, dass es keine Blasen gibt und die Brunnen gleichmäßig beschichtet sind. Um die Basisschicht zu erstarren, bebrüten Sie die Dias bei 37 °C, 5%_CO2 für 30 min.
   HINWEIS: Das ECM muss bis zu diesem Schritt eiskalt bleiben, sonst polymerisiert es vorzeitig und führt zu einer ungleichmäßigen Grundbeschichtung und Polymerisation. Die Verwendung einer Basis-ECM verbessert das organoide Wachstum in einer einzelnen Ebene, was die Bildaufnahme unterstützt. Dies erhält auch schnelleres organoides Wachstum und verbraucht weniger ECM²².
3. Während der Polymerisation die Zellmischungen vorbereiten. Pellet die MyoEC- und LEC-Fraktionen bei 300 x g für 5 min und resuspendieren Sie jede Zellfraktion in 10% ECM/90% Wachstumsmedium, so dass jeder Brunnen 100 l hat (siehe Tabelle 1, wie man Wachstum Medium macht).
   HINWEIS: Für eine einfache Vorbereitung, replizieren Brunnen mit den gleichen Zellmischungen. Diese können in einem Rohr kombiniert und hergestellt werden (z.B. können vier Bohrungen desselben Zellmixes in 400 l mit 10% ECM/90% Wachstumsmedium hergestellt werden).
4. Fügen Sie 100 l jeder Zellmischung in 10% ECM/90% Wachstumsmedium zu jedem Brunnen hinzu und lassen Sie Organoide sich für 20 min bei 37 °C, 5%_CO2,begleichen.
5. Sobald sich die Zellen abgesetzt haben, fügen Sie vorsichtig 100 L Wachstumsmedium hinzu, indem Sie sanft die Kammerwand jedes Brunnens herunterpfeifen. Inkubieren Sie die Dias bei 37 °C, 5%_CO2 (siehe Abbildung 3A für die Gesamtzusammensetzung jedes Bohrbrunnens).
   HINWEIS: Der Rho Kinase-Inhibitor, R-Spondin, und Nrg1 sind Faktoren, die als wichtig für die langfristige Kultur der Organoide identifiziert wurden, die sowohl aus primären murinen Brustzellen als auch aus menschlichen Brustkrebszellen^13,14. Darüber hinaus verlängern die Stammzellfaktoren B27 und N2 die Zeit, in der Organoide kultiviert werden können.
6. Bildzellen alle 24 h, um ihr Wachstum zu verfolgen und das Wachstumsmedium alle 2-3 Tage mit 100 l/well sanft zu erneuern (Abbildung 3B-E).
   HINWEIS: Verwenden Sie extreme Vorsicht bei der Erneuerung des Mediums. Neigen Sie die Kammerrutschen, um das Medium an einer Ecke der Brunnen zu sammeln. Entfernen Sie das Medium mit 100 L, und füllen Sie es vorsichtig auf, um die ECM-Schicht ungestört zu lassen.
7. Wenn Forscher an der Untersuchung der Laktation/Alveologenese interessiert sind, wechseln Sie am 5. Tag zu Alveologenese Medium (siehe Tabelle 1) und erneuern Sie das Medium weiterhin alle 2-3 Tage bis zum Tag 10 (Abbildung 3F) oder darüber hinaus durch Passieren mit Rückgewinnungslösung (siehe Tabelle der Materialien)¹³.
   HINWEIS: An dieser Stelle können Organoide vom ECM isoliert werden, indem bei 4 °C in 400 l 4 °C-Wiederherstellungslösung inkubiert wird (siehe Tabelle der Materialien für Protokoll- und Reagenzinformationen).

5. Tag 5 oder 10: Fixieren und Immunflecken von Organoiden

1. Entfernen Sie das Medium vorsichtig, indem Sie das Medium vorsichtig abpfeifen (eine Glühbirne pipette funktioniert am besten). Spülen Sie jeden Brunnen mit 200 l von 1x Dulbecco Phosphat gepufferte Saline (DPBS, siehe Rezepte).
2. Fixieren Sie die Organoide mit kaltem (4 °C) 4% (w/v) Paraformaldehyd (PFA, siehe Rezepte) für 10 min bei Raumtemperatur.
   VORSICHT: PFA ist gefährlich. Tragen Sie persönliche Schutzausrüstung (Labormantel, Handschuhe und Schutzbrille). Dieser Schritt sollte in einer Dunstabzugshaube durchgeführt werden.
   HINWEIS: Das ECM wird durch die PFA-Behandlung aufgelöst. Unvollständige ECM-Entfernung kann zu Hintergrundfärbung führen, wenn die Organoide durch Immunfluoreszenz analysiert werden.
3. Entfernen Sie die 4% PFA und fügen Sie 200 l von 0,2% (w/v) Glycin/DPBS (siehe Tabelle 1) zu jedem Brunnen hinzu. Inkubieren Sie die Dias bei Raumtemperatur für 30 min oder 4 °C über Nacht auf einer Schaukelfläche, die auf eine langsame Einstellung eingestellt ist.
   HINWEIS: Die Organoide können vor dem nächsten Schritt 1-3 Tage lang in DPBS bei 4 °C gelagert werden.
4. Permeabilisieren Sie die Organoide mit DPBS + 0,25% Triton X-100 (PBST, siehe Tabelle 1) für 10 min bei Raumtemperatur.
5. Blockieren Sie die Organoide mit 5% Eselserum (DS) (oder einem anderen Serum, das der Art des sekundären Antikörpers entspricht) in DPBS für 1 h auf einer Schaukelfläche.
   HINWEIS: Dieser Schritt kann über Nacht bei 4 °C auf einer Schaukelfläche durchgeführt werden.
6. Bereiten Sie primäre Antikörper in 1% DS/DPBS vor. Verwenden Sie 125-200 l für jeden Brunnen. Führen Sie die Immunostainierung durch Inkubation der Organoide in Primärantikörpern über Nacht bei 4 °C auf einer Schaukelfläche durch.

6. Tag 11: Vollständige Immunfluoreszenz

1. Waschen Sie jeden Brunnen 2X mit 200 l PBST für 5 min. Fügen Sie sekundären Antikörper in 1% DS/DPBS mit 125-200 l für jeden Brunnen hinzu. 45 min bei Raumtemperatur auf einer Schaukelfläche inkubieren.
2. Waschen Sie jeden Brunnen 2X mit 200 L PBST pro Brunnen.
3. Färben Sie die Kerne mit Hoechst DNA-Farbstoff in DPBS (1:2.000 in DPBS) für 5 min bei Raumtemperatur.
4. Entfernen Sie alle Flüssigkeit, die auf dem Brunnen übrig bleibt, indem Sie sanft mit einem Vakuum absaugen.
5. Entfernen Sie vorsichtig die Kammern und Dichtungen, legen Sie einen Tropfen (ca. 30 l) der Montagemedien (siehe Tabelle der Materialien) auf jedem Brunnen und Abdeckungsfolie, wobei Darauf zu achten ist, Blasen zu entfernen. Lassen Sie die Folie in einem dunklen Raum für 1-2 Tage trocknen. Siegel mit klarem Nagellack. Bild die Organoide auf einem konfokalen Mikroskop (Abbildung 3E-F).

Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt eine Methode zur Untersuchung spezifischer Abstammungsbeiträge von Brustepithelzellen durch die Verwendung von Mosaikorganoiden. Um primäre murine Zellen für Organoide zu erhalten, muss das Brustdrüsenepithel zuerst aus dem umgebenden Adipozyten-reichen Stroma isoliert werden (Abbildung 1). Dieser Prozess wird hier kurz beschrieben und auch in einer zuvor veröffentlichten Studie18beschrieben. Um genügend Zellen zu erhalten, wird empfohlen, #2, 3, 4 und 5 MGs zu entfernen (Abbildung 1A). Ein wichtiger Schritt zur Isolierung einer reinen Population von Epithelzellen ist die Entfernung der Lymphknoten aus den #4 MGs, die reich an Immunzellen sind, die das Präparat kontaminieren werden (Abbildung 1A,B). Die MGs wurden gehackt, um Fragmente mit einer Größe von 0,1 mm zu erzeugen(Abbildung 1B). Die Gewebefragmente wurden dann enzymatisch verdaut, ein Prozess, der in Gegenwart von Kollagenase auftritt, um Epithelien aus Stroma freizusetzen, und in Ermangelung von Trypsin, um die Verdauung von Proteinen wie Cadherinen zu verhindern, die Zell-Zell-Kontakte pflegen. Das verdaute Gewebe wurde dann zentrifugiert, um Lipide zu entfernen und durch ein Zellsieb gefiltert und gewaschen (Abbildung 1C). Epithelfragmente, die am Sieb haften, wurden durch Invertieren des Filters und Waschen der Membran freigesetzt, die die Epithelfragmente auf eine Polystyrolschale übertrugen(Abbildung 1D). Diese Fragmente erschienen als kleine, verzweigte Strukturen (Abbildung 1E).

Die gereinigten Epithelfragmente wurden für 24 h inkubiert. Sie setzten sich auf die Schale und haften, bilden flache, pfannkuchenartige Strukturen mit einer äußeren Schicht von MyoECs, die innere LECs umgibt (Abbildung 2A-B). Abbildung 2C zeigt den Rand einer solchen Pfannkuchen-ähnlichen Struktur von einem Wildtier. Die Trypsin-Behandlung löste die MyoECs, die sich zuerst lösten und als helle, abgerundete Zellen auftauchten, die den Kern der verbleibenden quaderförmigen LECs umschlossen (Abbildung 2C,F). Die Ablösung der MyoECs wurde sorgfältig mit Hilfe der Hellfeldmikroskopie überwacht und erfolgte innerhalb von 3-6 min. Nach der Erfassung der MECs wurden die LECs anschließend durch eine zweite, längere Trypsin-Behandlung von 7-15 min abgelöst. Die für die Zellablösung benötigte Zeit hängt von der Trypsinkonzentration und Frische ab. Die Gesamtreinheit der beiden Zellkompartimente betrug 90 %, wie durch Zählen von Zellen, die KRT14-positiv und E-Cadherin (CDH1)-negativ in der MyoEC-Fraktion waren, und Zellen, die KRT14-negativ und E-Cadherin-positiv in der LEC-Fraktion waren (Abbildung 2D-E)19. Wir entdeckten, dass einige der MyoECs von der Oberseite der Pfannkuchen-ähnlichen Struktur sowie von den äußeren Rändern entfernt wurden. Dies wurde beobachtet, indem Gewebefragmente verwendet wurden, die von Mäusen gesammelt wurden, die mit einem induzierbaren, fluoreszierenden Basalmarker (Cytokeratin 14 (KRT14)-CreERT1; R26RYFP/+) und 5 Tage vor der Ernte mit 75 mg/kg Tamoxifen injiziert. In Abbildung 2F,G ist die Ablösung von MyoECs um die Ränder der Pfannkuchenstruktur leicht erkennbar. Dies geschah innerhalb der ersten 2 min der Trypsin-Behandlung (Abbildung 2F). Darüber hinaus wurden YFP-KRT14-positive Zellen auf der Struktur beobachtet, wo sie nach der Trypsin-Behandlung aufgerundet und durch den Spül-/Entnahmeschritt entfernt wurden (Abbildung 2G). Der unbeschriftete Kern der LECs (Abbildung 2H), die nur wenige oder keine YFP-KRT14-positiven Zellen enthielten (Abbildung 2I), löste sich anschließend in der zweiten Runde der Trypsin-Behandlung.

Die MyoEC- und LEC-Fraktionen wurden gesammelt, kombiniert und in 10% ECM-Platte auf einer 50%-ECM-Basis eingebettet. Dies ermöglichte eine bessere optische Auflösung der Organoide, die hauptsächlich entlang der Basisschicht wuchsen (Abbildung 3A). Nach 24 h wurden die Zellen zu aggregierten Strukturen zusammengesetzt, denen weitgehend ein Lumen fehlte (Abbildung 3B). Nach 48 h bildeten sich aufkeimende Organoide, als die zentralen Lumen ausgehöhlt wurden und als hellerer Innenraum erschienen(Abbildung 3C). Nach 10 Tagen waren die Organoide große, verzweigte Strukturen mit gut entwickelten Lumen. Mosaik-Organoide, die aus MyoECs von Wildtypmäusen und LECs von ACTb-EGFP-Mäusen geerntet wurden, wurden in situ fixiert, mit einem Antikörper gegen den Basalmarker alpha-glatter Muskelakt (SMA) immungefärbt und mit dem Hoechst DNA-Fleck gefärbt, um die Kerne zu zeigen. In den Abbildungen zeigen die oberen und Abschnittsansichten verschiedene Bildersätze, die als Z-Stack gesammelt und in einer 3D-Ansicht rekonstruiert wurden (Abbildung 3D). Die obere Ansicht zeigt die verzweigte Morphologie der Organoide (Abbildung 3E'). Die Schnittansicht zeigt die zweischichtige Epithelstruktur und das offene Lumen dieser Organoide (Abbildung 3E''). Diese Organoide können auch an Tag 5 mit Alveologenese Medium differenziert und für weitere 5 Tage inkubiert werden (Abbildung 3F). Die Organoide wurden größer, hatten mehr Zweige und enthielten Milch. Wie oben beschrieben, wurden differenzierte Organoide erzeugt und mit einem Antikörper gegen den Milchmarker, Molkensäureprotein (WAP, Abbildung 3F), immungefärbt. WAP ist ein lösliches Protein, das in Milch abgesondert wird. Ein Großteil dieser Flüssigkeit ging verloren, als die Zellen in situ fixiert und immunstainiert wurden. Daher ist die WAP-Färbung in den oberen und Abschnittsansichten intrazellulär in sezernierenden Zellen und extrazellulär in Milch sichtbar, die während der Fixierung an der Zelloberfläche gefangen war (Abbildung 3F), obwohl in der Schnittansicht ein kleines Organoid flüssige Milch zu enthalten scheint (Abbildung 3F'' boxed overlay).

Abbildung 1: Isolierung von Brustfragmenten. (A) Beschriftete Schaltplan der 5 MGs einer Maus mit unbeschrifteten, kontralateral gepaarten MGs. (B) Bilder von Maus-MGs mit dem #4 MG geboxt und vergrößert, um zu zeigen, wie der Lymphknoten zur Entfernung identifiziert wird. (C) Bild von gehackten MGs in einer 6 gut niedrigen Haftplatte mit einem Lineal, das die Größe der Gewebestücke anzeigt (jeweils 0,1 mm). (D-E) Schematische Veranschaulichung der Protokollschritte 2.7-2.9. (D) MG-Fragmente wurden durch ein 70-m-Sieb gefiltert und 4X vorgerinnent. (E) Das Sieb wurde dann über eine 60 mm Polystyrol-Gewebekulturschale umgedreht und Fragmente wurden in die Schale freigesetzt. (F) Bild mit den gefilterten Gewebefragmenten, die auf einer 60-mm-Schale gesammelt wurden, die frei von Stroma sind. Die Pfeile zeigen auf die kleinsten Fragmente, die auf dem 70-m-Sieb gesammelt werden. Maßstabsleiste = 100 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Differentialtrypsinisierung. (A) Hellfeldbild, das ein Gewebefragment zeigt, das auf einer Polystyrolschale haftet und eine Pfannkuchen-ähnliche Struktur bildet. (B-C) Der erste Differential-Trypsinisierungsschritt löste MyoECs, die nach 3 Min. als helle, abgerundete Zellen deutlich sichtbar sind. (D) Immunfluoreszenzbilder von MyoECs (unten) und LECs (oben) mit dem Cytokeratin 14 (KRT14) Zellmarker für MyoECs und E-Cadherin (CDH1) Zellmarker für LECs. (E) Die Expression von KRT14 und CDH1 wurde verwendet, um die Ausbeute und Reinheit der differenziell trypsinisierten Zellfraktionen zu quantifizieren. (F-I). Repräsentative Phasenkontrast- und Fluoreszenzbilder (YFP) von Gewebefragmenten aus Cytokeratin 14 (KRT14)-CreERT1; R26RYFP/+ MGs. Mäuse wurden 5 Tage vor der Ernte mit 75 mg/kg Tamoxifen injiziert. (F) Lösen von MyoECs (Pfeile) während der ersten Trypsin-EDTA (0,05%) 2 min nach der Inkubation. (G) Eine Berieselung von KRT14-YFP-MyoECs (Pfeile) auf einem Pfannkuchen unbeschrifteter LECs. (H) Hellfeldbild von LECs nach anfänglicher Trypsinisierung und MyoEC-Ablösung. (I) Nach der MyoEC-Ablösung sind KRT14-YFP-MyoECs nicht mehr sichtbar, wie das Fehlen des YFP-Ausdrucks zeigt. Skalenbalken = 30 m (A, Hellfeld) 100 m (F, Hellfeld), 50 m (G, Fluoreszenz), 100 m (H,I). Die Panels A-E dieser Figur werden von Macias et al.19modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Dreidimensionale organoide Kultur. (A) Schematische Darstellung einzelner Zellen, eingebettet in 10% ECM/90% Wachstumsmedium und auf einer 50% ECM/50% DMEM-Basisschicht angebaut (Protokollschritt 4.5). (B-C) Abbildungen und Phasenkontrastbilder, die die schnellen selbstorganisierenden Kapazitäten von Mammariiden zeigen, die aus differenziell trypsinisierten und rekombinierten MyoECs und LECs bei 24 h (B) und 48 h (C) erzeugt werden. Bilder, die mit einem digitalen Weitfeldmikroskop (D) Schematische Darstellung gesammelt wurden, die die oberen (links) oder Abschnittsansichten (rechts) veranschaulicht, die in E-F verwendet werden, um immunbefleckte Organoide zu zeigen. (E) Schematische Darstellung eines einzelnen Brunnens einer 8-Wellkammer-Rutsche mit Brustorganoiden, die 5-10 Tage lang in Growth Medium angebaut werden. (E'-E") Ansicht von Top- (E') und Schnittansicht (E") von immunbefleckten Organoiden am 10. Tag des Wachstums. MyoECs sind mit glatten Actin-Muskeln (SMA) in Pseudocolor Magenta gekennzeichnet. Die LECs stammen von ACTb-EGFP-Mäusen und werden in Pseudofarbe grün dargestellt. Nuclei wurden mit Hoechst Farbstoff gefärbt. (F) Schematische Darstellung eines einzelnen Brunnens einer 8-Wellkammer-Rutsche mit Brustorganoiden, die 5 Tage lang in Growth Medium und 5 Tage in Alveologenese Medium angebaut wurden. (F'-F"). Ansicht von Top- (F') und Schnittansicht (F") von immunbefleckten Organoiden am 10. Tag des Wachstums. Die MyoECs sind nicht gekennzeichnet. Die LECs von ACTb-EGFP-Mäusen werden in Pseudofarbe grün dargestellt. Das Milchprotein, Molkensäureprotein (WAP), wird in Pseudofarbe gelb in den LECs dargestellt und überzieht das Innere der Lumen der Organoide. Nuclei wurden mit Hoechst Farbstoff gefärbt. Bilder, die mit einem konfokalen Mikroskop der Spinnscheibe gesammelt und in 3D mit Imaris (E', E') oder unterem Abschnitt 30 Scheiben(F', F") rekonstruiert wurden. Skalenstäbe = 100 m (C), 20 m (E), 40 m (F). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Lösungsrezepte.

Die Autoren haben nichts zu verraten.