Generierung von Mosaik-Mammary-Organoiden durch Differential-Trypsinisierung

Stefany Rubio; Oscar Cazares; Hector Macias; Lindsay Hinck

doi:10.3791/60742

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Methodenartikel

Generierung von Mosaik-Mammary-Organoiden durch Differential-Trypsinisierung

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DOI:

10.3791/60742

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11. März 2020

Stefany Rubio¹ , Oscar Cazares¹ , Hector Macias¹ , Lindsay Hinck¹

¹Department of Molecular, Cell and Developmental Biology, University of California, Santa Cruz

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Brustdrüse ist eine zweischichtige Struktur, die äußere myoepitheliale und innere luminale Epithelzellen umfasst. Präsentiert ist ein Protokoll zur Vorbereitung von Organoiden mit Differential-Trypsinisierung. Diese effiziente Methode ermöglicht es Forschern, diese beiden Zelltypen getrennt zu manipulieren, um Fragen über ihre Rolle in der Form und Funktion der Brustdrüse zu untersuchen.

Zusammenfassung

Organoide bieten selbstorganisierende, dreidimensionale Gewebestrukturen, die physiologische Prozesse in der Bequemlichkeit einer Schale rekapitulieren. Die murine Brustdrüse besteht aus zwei unterschiedlichen Epithelzellfächern, die verschiedene Funktionen erfüllen: das äußere, kontraktile myoepitheliale Fach und das innere, sekretorische Luminalfach. Hier beschreiben wir eine Methode, mit der die Zellen, die diese Kompartimente bilden, isoliert und dann kombiniert werden, um ihre individuellen Abstammungsbeiträge zur Brustdrüsenmorphogenese und Differenzierung zu untersuchen. Die Methode ist einfach und effizient und erfordert keine ausgeklügelten Trenntechnologien wie die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung. Stattdessen ernten und verdauen wir das Gewebe enzymatisch, säen das Epithel auf anhaftenden Gewebekulturgerichten und verwenden dann die Differential-Trypsinisierung, um Myoepithel von Leuchtzellen mit einer Reinheit von 90 % zu trennen. Die Zellen werden dann in einer extrazellulären Matrix plattiert, wo sie sich in zweischichtige, dreidimensionale (3D) Organoide organisieren, die differenziert werden können, um Milch nach 10 Tagen in der Kultur zu produzieren. Um die Auswirkungen genetischer Mutationen zu testen, können Zellen aus Wildtyp- oder gentechnisch veränderten Mausmodellen geerntet oder vor der 3D-Kultur genetisch manipuliert werden. Diese Technik kann verwendet werden, um Mosaik-Organoide zu erzeugen, die die Untersuchung der Genfunktion speziell im Luminal- oder Myoepithelfach ermöglichen.

Einleitung

Die Brustdrüse (MG) ist eine baumartige, röhrenförmige Epithelstruktur, die in eine adipozytenreiche Stroma eingebettet ist. Das zweischichtige duktale Epithel besteht aus einer äußeren, basalen Schicht aus kontraktilen, myoepithelialen Zellen (MyoECs) und einer inneren Schicht aus luminalen, sekretorischen Epithelzellen (LECs), die ein zentrales Lumen^{umschließen 1}. Während der Stillzeit, wenn sich die äußeren MyoECs zusammenschließen, um Milch aus den inneren alveolarLECs zu pressen, erfährt das MG zahlreiche Veränderungen, die unter der Kontrolle von Wachstumsfaktoren (z. B. EGF und FGF) und Hormonen (z. B. Progesteron, Insulin und Prolaktin)....