Summary
בדיקה זו היא שיטה פשוטה לכמת תאים hematopoietic בפיתוח זברה עוברית. תאי דם של דגי זברה מנותקים נתונים לניתוח ציטומטריה זרימה. זה מאפשר גילוי של מומים בדם בבעלי חיים מוטנטים ולאחר שינוי גנטי.
Abstract
המגוון של שושלת התאים המרכיבים דם בוגר בבעלי חוליות נובע מההבחנה בין תאי גזע וחולי אב מהמטופויטיים (HSPCs). זהו תהליך קריטי המתרחש לאורך תוחלת החיים של אורגניזמים, ושיבוש המסלולים המולקולריים המעורבים במהלך עובר יכול להיות בעל השלכות קטסטרופליות לטווח ארוך. מסיבות רבות, דג זברה (דניו rerio) הפך אורגניזם מודל ללמוד hematopoiesis. עוברי זברה מתפתחים מבחוץ, ובמשך 7 ימים לאחר ההפרה (dpf) יצרו את רוב תת-הסוגים של תאי דם סופיים שיימשכו לאורך חייהם. בדיקות להערכת מספר התאים ההמטופיאטיים פותחו, בעיקר תוך שימוש בכתמים היסטולוגיים ספציפיים, בטכניקות הכלאה במקום, ובמיקרוסקופיה של בעלי חיים מהונדסים המשתמשים ביחצנים ספציפיים לתאי הדם המניעים את הביטוי של חלבונים פלואורסצנטיים. עם זאת, רוב מבחני הכתמים ובטכניקות הכלאה באתרו אינם מכמתים במדויק את מספר תאי הדם הקיימים; ניתן לראות בקלות רק הבדלים גדולים במספרי התאים. שימוש בבעלי חיים מהונדסים וניתוח אנשים עם מיקרוסקופיה פלואורסצנטית או confocal ניתן לבצע, אבל הכמות של מבחנים אלה מסתמך על ספירה ידנית או ניצול תוכנת הדמיה יקרה, שניהם יכולים לעשות טעויות. פיתוח שיטות נוספות להערכת מספרי תאי הדם יהיה חסכוני, מהיר יותר, ואף יכול להיות אוטומטי כדי להעריך במהירות את ההשפעה של שינוי גנטי בתיווך CRISPR, הפחתת תעתיק בתיווך מורפולינו, ואת ההשפעה של תרכובות סמים המשפיעים hematopoiesis בקנה מידה גדול. זה מבחנים חדשניים כדי לכמת תאי דם מבוצעת על ידי ניתוק עוברי זברה שלמים וניתוח כמות תאי הדם שכותרתו פלואורסצנטית נוכח. מבחנים אלה צריכים לאפשר הבהרות של מסלולים מולקולריים האחראים על ייצור תאי הדם, התרחבות ורגולציה במהלך העובר, אשר יאפשר לחוקרים לגלות עוד יותר גורמים חדשניים ששונו במהלך מחלות דם, כמו גם מסלולים חיוניים במהלך האבולוציה של hematopoiesis בעלי חוליות.
Introduction
ייצור דם (hematopoiesis) הוא תהליך התפתחותי חיוני שמתחיל לראשונה בעובר המוקדם. תהליך זה מתחיל על ידי יצירת תאי דם אדומים פרימיטיביים מקרופאגים ישירות mesoderm, ומאוחר יותר נע לעבר הייצור של גזע hematopoietic ותאי אב (HSPCs). תאי גזע אלה, שהם רב-פוטנטיים, מייצרים את כל הזנים של תאי דם בוגרים באורגניזם. המערכת, המסוגלת לחדש את עצמה, מתחדשת ללא הרף באמצעות HSPCs אלה. בעוד תהליך זה מתחיל בשלב מוקדם בפיתוח, hematopoiesis ממשיך בחייו של החיה, מתן היכולת להעביר חמצן לאתרים רחוקים של הגוף, להפסיק דימום לאחר פציעה, כדי להגן על הגוף מפני זיהום. ההתפתחות של מערכת מורכבת זו נשלטת זמנית וספטילית במהלך הפיתוח וכל הפרעה בייצור תאי הדם יכולה להיות קטסטרופלית עבור האורגניזם, וכתוצאה מכך אנמיה, תרומבוציטופניה, לויקופניה ולוקמיה.
מודל חיה פופולרי המשמש למחקר hematopoietic הוא דג הזברה (דניו rerio) כי יש להם התפתחות דם דומה בהשוואה לבני אדם. למעשה, רבים מהגנים והמסלולים המולקולריים המשמשים במהלך hematopoiesis נשמרים לאורך האבולוציה החולייתנית, ומאפשרים לנו ללמוד על הגנים האנושיים על ידי לימוד זברה. חשוב לציין, עוברי זברה מתפתחים מחוץ לגוף ובתוך 7 ימים יצרו את סוגי תאי הדם הבוגרים ביותר, המאפשרים הדמיה ישירה של המערכת hematopoietic בתוך זמן קצר. דגי זברה הם גם פוריים ביותר, מה שמאפשר לחוקרים להתבונן במספר גדול יותר של דגימות במסגרת זמן קצרה, שחשובה גם ליצירת נתונים הניתנים לשחזור. זמן הדור הקצר של הזברה ופיתוח חיצוני מספק מניפולציה קלה יותר והתבוננות במהלך מחקרי mutagenesis1,2,3,4,5 ו סינון סמים6,7,8,9,10. זה מאפשר פאנל של תרכובות טיפוליות מבטיחות עבור הפרעות דם אנושי להיבדק במהירות וביעילות.
חשוב לציין, דגי זברה הם גם נוחים מבחינה גנטית, ואת הגנום הוא רצף ביאורים. אחיזה זו מאפשרת לבצע טכניקות גנטיקה הפוכה כגון הפלה בתיווך מורפולינו (MO-) ואבלציה גנטית בתיווך CRISPR. דגי זברה הוכיחו גם את התועלת שלהם כמודל לביצוע מסכים גנטיים קדמיים; גנים ומסלולים חיוניים רבים המעורבים בהיווצרות דם בעלי חוליות התגלו באופן זה. שיטות רבות של התבוננות בתאי דם פותחו גם זברה. בעוד טכניקות כתמים היסטולוגיות מסורתיות קיימות, ניתן גם לבצע במקום הכלאה עבור תעתיקים ספציפיים לדם. חשוב לציין, קווים מהונדסים רבים של דגים קיימים גם לפיה חלבונים פלואורסצנטיים באים לידי ביטוי על ידי מקדמים ספציפיים לשושלת, המאפשר תיוג של תאי דם ספציפיים עם חלבונים פלואורסצנטיים11. זה מאפשר לחוקרים לבצע תצפית עדכנית של בראשית תאי הדם, התרחבות ורגולציה באורגניזם חי לאורך זמן.
בסך הכל, שימור המערכת hematopoietic, נוכחות ופיתוח קל של קווים מהונדסים, הדמיה קלה, וזמן הדור הקצר הפך את דג הזברה מודל חסכוני, מהיר, הסתגלות של hematopoiesis. כדי לשפר את ארגז הכלים של טכניקות הזמינות לחוקרי זברה, פיתחנו את ההסמכה הזו כדי לכמת באופן חזק את מספר תאי הדם בעוברים. השיטה כוללת עיכול בעלי חיים מהונדסים וביצוע ציטומטריית זרימה לתאי דם פלואורסצנטיים. בדרך זו, תאי דם מבעלי חיים מוטנטים, ההשפעה של שינוי MO ו CRISPR, ואת ההשפעה של מולקולות קטנות ניתן לנתח כמותית באופן מהיר לשחזור. מבחנים אלה הם דרכים ידידותיות למשתמש וחסכוניות לספירת תאי דם, המאפשרות בדיקה של הדור שלהם, התפשטות, ותחזוקה לאורך זמן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הוועדה המייעצת לטיפול ושימוש בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) באוניברסיטת קליפורניה סטייט, צ'יקו, אישרה את כל השיטות המתוארות להלן.
הערה: מומלץ לטפל בעוברים עם 1-פניל 2-תיוריאה (PTU; טבלה 1) ב 24 שעות לאחר ההפרה (hpf) כדי למנוע פיגמנטציה אשר משפיע לרעה על אפליה פלואורסצנטית על ידי cytometry זרימה. כל ההליכים המפורטים להלן מקובלים עבור ציטומטריית זרימה ומיון תאים המופעל על-ידי פלואורסצנטיות (FACS). עם זאת, אם המטרה של האדם היא תרבות התאים hematopoietic לאחר FACS, ואז לדבוק בשיטות סטריליות בעת עיבוד דגימות. הפרוטוקול להלבנה והכנת דגימות עובר בצורה סטרילית תואר בעבר12.
1. דקורציה של 48 כ"ס עוברי זברה
- עם עוברים (לפחות 5, אבל לא יותר מ 200 עוברים) בצלחת פטרי פלסטיק 10 ס"מ, להטות את המנה, כך העוברים לשקוע לקצה התחתון.
הערה: קל להטות את המנה על ידי הסרת המכסה שלה והנחת המכסה מתחת לקצה אחד של צלחת פטרי. - הסר והשליך כמה שיותר E3 בינוני(טבלה 1)ככל האפשר ולהוסיף 500 μL של פרוטאז dechorionation (10 מ"ג / מ"ל). דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
- לאחר 5 דקות, להרים את צלחת פטרי (שמירה על כל העוברים בקצה התחתון של הצלחת), בעדינות הקש על הצד של צלחת פטרי, המאפשר לעוברים לשפשף בעדינות נגד החלק התחתון של הצלחת כדי להסיר לחלוטין chorions.
- עם בקבוק לסחוט, להוסיף ~ 20 מ"ל של E3 בינוני כדי לדלל פרוטאז. אפשר לעוברים להתיישב ולהסיר את המדיום E3 על ידי decanting.
- חזור על שלב 1.4 3x כדי להסיר את כל העקבות של פרוטאז dechorionation.
הערה: עבור כל מדגם בודד לנתח, לפחות 5 עוברים נדרשים. הליך dechorionation זה יכול להכיל עד 200 עוברים לכל צלחת פטרי. ניתן לקבץ דגימות בשלב זה ולהפרידן מאוחר יותר אם תרצה בכך. לחלופין, dechorionation ידני יכול להתבצע על ידי קרע בעדינות את chorions עם מלקחיים של שען. זה יתרון כאשר יש מספר קטן של עוברים. בדרך כלל זברה-פיש יבקעו מהמקהלות שלהם ב-72 כ"ס. עוברים בעלי מבנה פגום קשות לא, עם זאת, וידרשו dechorionation (ידני או כימי) לאחר מכן.
2. הכנת דגימות עובר לניתוק
- באמצעות פיפטה P1000, מקום 5-10 עוברים לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה אחד 1.5 מ"ל.
- הסר E3 בינוני עם פיפטה ולהשליך.
התראה: פיפטה בזהירות כמו עוברים ניתן להשליך בקלות במהלך השלבים הבאים. - הוסף 1 מ"ל של 10 מ"מ dithiothreitol (DTT) במדיום E3 כדי להסיר את ציפוי ריר המקיף את זברה עוברי11,12,13,14. מניחים את צינור microcentrifuge אופקית, ואת הדגירה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.
3. ניתוק עוברים
- לשטוף את העוברים 3x עם 1 מ"ל של מלוחים אגירה פוספט של Dulbecco (DPBS) עם Ca2 + ו מ"ג2 + כדי להסיר עקבות של DTT. לאחר הכביסה האחרונה להוסיף 500 μL של DPBS עם Ca2 + ו מ"ג2 + ו 5 μL של 5 מ"ג / מ"ל (26 U / mL) פרוטאז דיסוציאציה.
הערה: ניתן להשתמש בפתרונות איזוטוניים אחרים עם אגירה, אך עליהם להכיל Ca2+ ו- Mg2+ כדי שהאנזים דיסוציאציה יפעל כראוי. - דגימות דגירה ב 37 °C (67 °F) על שייקר מסלולי אופקי ב 185 סל"ד במשך 60 דקות. יש לתהפוך עוברים עם פיפט P1000 עד שהדגימות נותקות לחלוטין.
התראה: יש להיזהר לא לעיכול יתר של העוברים; כמה רקמה מוצקה צריכה להיות נוכחת, וזה לא צריך להיות הומוגני לחלוטין. ניתן לעיכול יתר על המידה, מה שישמיד את תאי הדם של המטרה כדי שניתן יהיה לצפות בהם בציטומטר הזרימה(איור משלים 1).
הערה: הליך זה פועל בצורה הטובה ביותר עבור 48-72 עוברי hpf. שלבים מאוחרים יותר עשויים לדרוש דגירה ארוכה יותר עם פרוטאז דיסוציאציה. תזמון לשלבים שונים חייב להיקבע באופן אמפירי. ישנן שיטות חלופיות מהירות יותר לניתוק רקמה עוברית, אך נמצא אמפירית כי שיטה זו, למרות שהיא לוקחת 60 דקות, היא עדינה ויסודית מספיק כדי לאפשר בידוד יעיל של תאים hematopoietic חיים.
4. הכנת עוברים מנותקים לציטומטריית זרימה
- פיפטה 5 עוברים מנותקים על המאגר העליון של צינור 5 מ"ל פוליסטירן עגול התחתון עם כובע מסננת תאים μmM 35.
- יש לשטוף את התאים על ידי הוספת 4 מ"ל של מלוחים עם אגירת פוספט (PBS) ללא Ca2+ או Mg2+ למכסה המסננת של צינור פוליסטירן של 5 מ"ל המכיל את התאים המסוננים.
הערה: ניתן להשתמש גם בפתרונות אחרים עם אגירה איזוטונית, אך הם צריכים להיות חסרים Ca2+ או Mg2+ כדי לדלל ולעבד את אנזים הדיסוציאציה ללא יעיל. - צינורות צנטריפוגה ב 4 מעלות צלזיוס ו 300 x g במשך 5 דקות כדי גלולות התאים. עם פיפטה, להסיר ולהשליך supernatant. התחדשו בתאים ב 500 μL של PBS (ללא Ca2 + או Mg2 +).
5. ציטומטריית זרימה
- בעדינות מערבולת השעיית התא ולהוסיף 1:1,000 כתם תא מת אדום(שולחן החומרים).
הערה: כתם התא המת האדום הוא צבע חדיר לתא המאפשר הדרה של תאים מתים ופסולת מתאי היעד והוא בחירה מצוינת של צבע לאפליה של תאים מתים, מכיוון שהוא מתרגש מהלייזר 633 ננומטר, השונה מהלייזר של 488 ננומטר המשמש לרגש פלואורופורים נפוצים כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) ו- DsRed. בדרך זו, אין חפיפה ספקטרלית מתאים מתים ותאי דם מהונדסים. Propidium יודיד (PI) ב 1 מ"ג / מ"ל היא חלופה זולה כתם התא המת האדום, אבל הקפד להזמין כמה דגימות מוכתם רק עם PI, כמו גם דגימות רק עם פלואור של עניין כדי להגדיר את פיצוי המכשיר. אחרת, האותות של PI ופלואורופורים כגון GFP יחפפו, וכתוצאה מכך תוצאות חיוביות כוזבות. אם ציטומטר הזרימה יש גם לייזר 405 ננומטר, צבעים אחרים כגון כתם תא אבא כחול הם גם בחירה מצוינת.
התראה: בעת ניתוח תאי דם, שים לב כי לאחר 30 דקות סוגי תאים מסוימים יתחילו phagocytose כתם התא המת האדום. שמור על התאים מוגנים מפני אור על הקרח עד ניתוח ולבצע cytometry זרימה בתוך 30 דקות של הוספת הצבע. - ניתוח ציטומטריית זרימה
הערה: כל סיטומטר זרימה הוא קצת שונה, אבל השלבים הבאים יסייעו בהכנת דגימות לניתוח על רוב המכונות. עבור משתמשים חדשים לזרום cytometry, לחפש את עצתו של מישהו שהוא מומחה על פיסת ציוד מסוים. ההוראות הבאות נוגעות לסיטומטר זרימת היתוך FACSAria BD.- הפעל את ציטומטר ולאפשר לייזרים להתחמם במשך 20 דקות. מיכל פסולת ריק, למלא מיכל נדן עם הפתרון המתאים (משתנה בהתאם ציטומטר זרימה) ולהתחיל את מערכת fluidics.
הערה: בדרך כלל יש הליך הפעלה מסוים עבור כל סוג של ציטומטר זרימה; בצע הליך אתחול זה בזהירות. - בתוכנת הניתוח, צייר חמש חלקות (איור 1A).
- תמדוד את הנקודה הראשונה של פיזור קדימה (FSC) על ציר x ופיזור צדדי (SSC) על ציר y. הגדר את FSC כליניארי ואת SSC כיומן רישום.
הערה: FSC הוא מדידה של גודל התא, ו- SSC הוא מדידה של צפיפות; זה יאפשר אפליה של תאים מהריסות. אוכלוסיות תאי הדם של הזברה העוברית אינן נפרדות לפי גודל וצפיפות באותו אופן כמו תאי דם של דגי זברה בוגרים שתוארו קודם לכן15. במקום זאת הם יופיעו באותה אוכלוסייה עם כל התאים העובריים המתעכלים האחרים. - הגדר את ההתוויה השניה כדי לבחון את גובה FSC (H) לעומת רוחב FSC (W). הגדר את התוויה השלישית למדידת SSC (H) לעומת SSC (W).
הערה: שלב זה משמש כדי לא לכלול כפולים (תאים תקועים יחד כאשר הם עוברים דרך הלייזר). - הגדר את התוויית הנקודה הרביעית כדי למדוד את כתם התא המת האדום על ציר x (בהתאם לציטומטר זה בדרך כלל שווה ערך למסנן המשמש עבור allophycocyanin [APC]) ו SSC על ציר y. זה יאפשר אפליה של תאים חיים מתאים מתים.
הערה: ערכות מסננים של כל ציטומטר יכולות להיות שונות. הקפד להשתמש במסנן הזיהוי הנכון עבור צבע אפליה של תאים מתים. - העלילה החמישית מודדת את הפלואורופור המועדף. דמיינו זאת כהיסטוגרמה של הפלואורופור (איור 1) או השתמשו בעלילת נקודה(איור משלים 2).
הערה: כאשר בוחנים יותר מפלואורופור אחד באותה חיה, מומלץ להשתמש בעליית נקודה כדי להציג את שני הפרמטרים בו זמנית. אם יש סיכוי כלשהו שלפלואורופורים יש חפיפה ספקטרלית זה עם זה(איור משלים 2),מומלץ גם על חלקת נקודה. השתמש בהגדרות Area (A) כדי לחשב את האזור מתחת לעקומה שנוצר על-ידי פעימת הלייזר של הסייטומטר עבור כל הפרמטרים, מכיוון שהם מדויקים יותר.
- תמדוד את הנקודה הראשונה של פיזור קדימה (FSC) על ציר x ופיזור צדדי (SSC) על ציר y. הגדר את FSC כליניארי ואת SSC כיומן רישום.
- טען את הדגימה והקטן את קצב הזרימה כך שהדגימה לא תיגמר במהירות. התאם את הגדרות FSC ו- SSC כך שניתן יהיה לראות בבירור את רוב אוכלוסיית התאים (איור 1A).
- צייר שער סביב אוכלוסיית התאים ותייג אותו תאים. בדיקה שהתוויה של הנקודה השניה מגודרת בתאים, אל תכלול זוגות על-ידי תחילה גטינג ב- FSC ולאחר מכן בסינגלים של SSC.
- בחלקה הרביעית להתאים את הגדרות כתם התא המת האדום כך שיש בבירור אוכלוסייה שלילית. צייר שער סביב תאים אלה, ותתייג אותם תאים חיים. בחלקה החמישית, שער על תאים חיים ולבחון תאים שליליים וחיוביים פלואורופור. צייר שער סביב התאים החיוביים.
הערה: אסטרטגיית גטינג היררכית זו בוחנת פלואורופור יחיד+ תאים השוכנים בשער התאים החיים, המתגוררים גם בשער התא. היזהר להציב שערים כראוי. שערים אלה ניתנים להתאמה אישית בהתאם לניסוי. - הפעל כל דגימה, איסוף לפחות 25,000 אירועים סלולריים חיים.
- בצע את הליך הכיבוי כדי לכבות את Fluidics. למלא מיכל נדן ולרוקן את מיכל האשפה.
הערה: לעתים קרובות קשה לדמיין תאים פלואורופור+ כאשר ביטוי החלבון נמוך, או אוכלוסיית התא היא נדירה. כדי להבטיח שהפרמטרים מוגדרים כראוי, יש להכין את העוברים האחים לצד ציור נכוןשל שערים והתאמת מתחי לייזר(איור 2 משלים). אם אוכלוסיית תאי היעד נדירה, אסוף יותר מ-25,000 אירועים. עם 5-10 בעלי חיים מעוכלים, אחד צריך להיות מסוגל לאסוף מיליוני אירועים. המספר הכולל של תאים פלואורופור+ ניתן להשיג גם עם נתונים אלה. כל שעליך לעשות הוא לספור את המספר הכולל של תאים במדגם עם hemocytometer ולהכפיל את אחוז פלואורופור+ תאים כדי לקבל את המספר המוחלט של פלואורופור+ תאים לכל דג.
- הפעל את ציטומטר ולאפשר לייזרים להתחמם במשך 20 דקות. מיכל פסולת ריק, למלא מיכל נדן עם הפתרון המתאים (משתנה בהתאם ציטומטר זרימה) ולהתחיל את מערכת fluidics.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי למנות תאי דם אדומים בזברה עוברית, lcr:GFP16 עוברים הוזרקו בשלב אחד עם PBS, 7.0 ng/nL ism1 MO, או 7.0 ng/nL ism1 MO עם 7.0 ng ism1 mRNA12. ב 48 hpf הם התעכלו ונתנו ניתוח cytometry זרימה. לאחר ניתוח אחוז GFP+ כדוריות דם אדומות מכל מדגם (כל מדגם הוא 5 עוברים שנבחרו באופן אקראי; איור 1A), הממוצע של כל קבוצת הביקורת חושב. ממוצע זה הוגדר כ- 1, וכל האחוזים חושבו מנקודת התייחסות זו. נתונים אלה מצביעים על כך שהפחתת תעתיק ism1 עם MO ספציפי הפחיתה את מספר תאי הדם האדומים של GFP+ הקיימים בעובר 48 hpf. בנוסף, הצלת ירידה זו ברמות ism1 עם mRNA אקסוגני החזיר את מספר תאי הדם האדומים לנורמלי.
איור 1: ism1 MO מפחית את מספר תאי הדם האדומים המיוצרים במהלך העובר. (A) lcr: GFP16 עוברים הוזרקו עם PBS ונתון לניתוח cytometry זרימה. ראשית, נקבעו גודל וצפיפות, ושער צויר סביב אוכלוסיית התאים המעניינת(תאים,פאנל שמאלי). לאחר מכן, FSC H ו- FSC W הוערך כדי לחסל תאים תקועים יחד (סינגלים FSC). SSC H ו- W הוערך גם כדי להפחית את האפשרות של הערכת תאים תקועים יחד (סינגלים SSC). פלואורסצנטיות אדומה נבדקה לאחר מכן כדי לקבוע תאים חיים (תאים חיים). לבסוף, תאים חיים נבדקו עבור פלואורסצנטיות GFP (פאנל ימני). (B) lcr:GFP12 עוברים הוזרקו PBS (שליטה, עיגולים), ism1 MO (ism1 MO, ריבועים), או ism1 MO + ism1 mRNA12 (הצלה, משולשים) בשלב אחד של התפתחות. לאחר 48 שעות, הם נאספו, מתעכלים, ונתון cytometry זרימה כפי שמוצג בלוח A. כל נקודה מייצגת חמישה עוברים בודדים שנבחרו באקראי. שינוי קיפול מחושב על-ידי לקיחת האחוז הממוצע של GFP+ תאים של מדגם הפקד והגדרתו כ- 1. כל הדגימות האחרות מושוות לממוצע הזה. *p < 0.005, ו- N.S. = לא משמעותי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| פתרון | מרכיבים | הערות |
| בינוני E3 (50x) | 14.61 גרם של NaCl, 0.63 גרם של KCI, 1.99 גרם של MgSO4·7H2O, 1.83 גרם של CaCl2·2H2O | לצילינדר בוגר 2 L, מוסיפים את החומרים ומספיק מים מזוקקים כדי להביא את הנפח הכולל ל 1 L. |
| בינוני E3 (1x) | 40 מ"ל של 50x E3 | לצילינדר בוגר 2 L, הוסיפו מספיק מים מזוקקים כדי להביא את הנפח הכולל ל-2 ליטר. |
| 1-פניל-2-תיוריאה (PTU) במדיום E3 | 40 מ"ל של 50x E3 בבקבוק 2 L, 40 מ"ג של PTU | לצילינדר בוגר 2 L, הוסיפו מספיק מים מזוקקים כדי להביא את הנפח הכולל ל-2 ליטר. מערבבים לפחות 2 ימים כדי להמיס לחלוטין PTU. |
טבלה 1: מתכונים לפתרונות.
איור משלים 1: עיכול עוברים עם פרוטאז דיסוציאציה. תמונות של 10 עוברים לא מתעכל כראוי (שמאל; לא מעוכל), לאחר עיכול נאות (באמצע; מתעכל), ואחרי עיכול עודף (ימין; מעוכל יתר על המיד). אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה.
איור משלים 2: הערכה של שני פלואורים ב-5 עוברי dpf. שערים צוירו כדי להעריךFSC ו- SSC כדי לקבוע את אוכלוסיית התאים של עניין (תאים, עמודה שמאלית), כדי להעריך סינגלים (לא מוצג), כדי לקבוע תאים חיים(חי,עמודה אמצעית), וביטוי פלואורופור (mpx:GFP17 ו gata1:D SRed15). ראשית, שערים נקבעו על בעל חיים שאין בו פלואורופורים (שורה עליונה). לאחר מכן הוערכובעלי חיים :GFP+ (ללא gata1:D sRed) כדי לקבוע את השערים ואת הפיצוי עבור GFP (שורה שנייה). gata1:D sRed+ (ללא mpx:GFP) בעלי חיים הוערכו כדי להגדיר את השערים ופיצוי עבור DsRed (שורה שלישית). לבסוף, ניתן להעריך את שני הצבעים בבעלי חיים חיוביים כפולים שהם mpx:GFP+ ו gata1:D SRed+. אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
דגי זברה הם מערכת מודל מצוינת לחקר המטופוזיס פרימיטיבי ומוחלט של בעלי חוליות. במהלך העשורים האחרונים פותחו ושוכללו מבחנים מרובים, המאפשרים לדגי זברה להפוך למודל מהיר וחסכוני לבדיקת תרופות, יצירה ובדיקה של מוטנטים גנטיים, ובסך הכל מאפשרים לחוקרים לנתח מסלולים מולקולריים החיוניים להמטופויזיס. פרוטוקול זה משתמש בזברה עוברית המאפשרת איסוף נתונים מהיר, שימוש בחלל פיזי פחות מבעלי חיים בוגרים ושימוש בפחות תרופות למסכים כימיים בקנה מידה גדול. זה גם מאפשר כמותיות לאחר overexpression של mRNA, הדור של מוטציות CRISPR, והפחתת תעתיק MO-induced לשנות מסלולים גנטיים ספציפיים המתרחשים במהלך התפתחות עוברית מוקדמת. חשוב לציין, היא מאפשרת כמות רגישה וחזקה של תאי דם, אשר קשה לעשות עם הכלאה situ או טכניקות הכתמה היסטולוגית.
מבחנים אלה גמישים וניתן לשנותם כדי לענות על שאלות מחקר רבות. שינוי אחד של פרוטוקול זה יכול להתבצע לפיה השלב ההתפתחותי של החיה הוא מניפולציה כדי לכמת סוגים שונים של תאי דם. לדוגמה, תאי דם אדומים מתעוררים בשלב מוקדם בהתפתחות דגי זברה, ועם בעלי חיים מהונדסים כגון lcr:GFP16 קו מהונדס ניתן לזהות כבר בשלב 16-סומיט. אם אחד מעוניין ללמוד תרומבוציטים, עם זאת, itga2b:GFP18 (הידוע גם בשם cd41:GFP) קו מהונדס מתחיל להביע GFP ב 48 hpf, עם תרומבוציטים במחזור בוגר נצפה ב 72 hpf. אם אחד רוצה לכמת תאי B עם מבחנים אלה אז זה יכול להתבצע עם ighm:EGFP19 בעלי חיים מהונדסים קרוב יותר 20 dpf. חשוב לציין, זה assay יכול לשמש גם כדי לעקוב אחר תאי הדם לאורך זמן. לדוגמה, על ידי ניתוח המספרים של lcr:GFP+ תאים ב 24 hpf, 48 hpf, 72 hpf, אפשר לקבוע אם שינוי גנטי (או תרופה) הוא ויסות התחזוקה של כדוריות דם אדומות לעומת רק הדור שלהם.
מבחנים אלה מאפשרים לחוקרים להפחית את ביטוי הגנים עם CRISPR או MOs או ביטוי גנים overexpress על ידי הזרקת mRNA בשלב אחד של התפתחות תא אחד ולהשוות במדויק את מספר תאי הדם המיוצרים בעוברים אלה שונה. תמיד יש לנקוט זהירות כדי לבצע בקרות נאותות עבור ניסויים אלה באותו זמן על ידי הזרקת בעלי חיים אחים עם מדריך לא ספציפי RNAs או MOs תואמים ובדיקת הדם שלהם לצד קבוצות הניסוי. השלב ההתפתחותי הוא קריטי; שינויים של שעות ספורות בלבד במהלך ההתפתחות יכולים להראות מספר שונה בהרבה של תאי דם הנמצאים בעובר. במילים אחרות, הקפד לעקוב בקפידה אחר שעות ההתפתחות בעת השוואת עוברים. כדי להבטיח שהעוברים יתאימו לגילם, יש להשתמש ברמזים מורפולוגיים. בעוברים מוקדמים, שקול לספור סומיטיות להתאמת גיל. מאוחר יותר בפיתוח, סמנים אחרים כגון תחילת פעימות הלב, גודל של vesicle otic, או אורך הגוף יכול לשמש כדי להתאים את השלבים של דגים שונה לשלוט דגים. יתר על כן, ניתן למספר את המספרים של תאים כוללים מעוברים מתעכלים כדי להבטיח את אותו מספר תאים נמצאים בבעלי חיים ניסיוניים ושליטה. בנוסף לשימוש מבחנים אלה כדי לבחון שינוי גנטי, מבחנים אלה יכולים גם להיות שונה כדי לבצע מסכי סמים בקנה מידה גדול. עוברים יכולים להיחשף לריכוזים שונים של תרכובות באופן זמני במהלך הפיתוח כדי לראות אם הכימיקלים המדוברים יש השפעה כלשהי על hematopoiesis. אם הניסוי נועד לבחון את ההשפעה של תרופה מסוימת, אז בעלי חיים שטופלו ברכב בלבד צריך להיכלל גם כפקד. בדרכים אלה, חוקרים יכולים לקבוע אם רווח או אובדן תפקוד של גנים ספציפיים או מסלולי איתות לשחק תפקיד חיוני hematopoiesis.
זה חיוני כי בעת בחינת transgenes שונים כי מספר בעלי החיים מתעכלים לכל מדגם הוא אופטימיזציה; מעט מדי בעלי חיים עלולים ליצור פלואורסצנטיות מועטה או ללא פלואורסצנטיות. הדבר נכון במיוחד בעת בחינת HSPCs שאינם בשפע בנקודת זמן מסוימת. זה גם קריטי כאשר בוחנים מהונדסים שיש להם מקדמים חלשים המניעים פלואורסצנטיות. כדי לנטרל נושאים אלה יותר בעלי חיים (ומכאן, יותר תאים) נדרשים לספירה מדויקת. בעת שינוי שלבים התפתחותיים, זה גם קריטי כדי לייעל את זמן העיכול. פרוטוקול זה מותאם ל-5 עוברים בודדים של 48 כ"ס לצינור. עיכול עוברים בוגרים יותר ידרוש ככל הנראה זמן רב יותר.
כמה בעיות פוטנציאליות יכולות להתעורר במהלך ההליך. אם אין פלואורסצנטיות שנצפתה, יכולה להיות בעיה טכנית עם הסייטומטר שצריך לפתור. מסיבה זו, חיוני לוודא כי העוברים הם פלואורסצנטיים לפני תחילת ההליך על ידי בדיקה מהירה אותם תחת מיקרוסקופ. בעיה נפוצה נוספת היא עיכול יתר של העוברים, אשר הורס את התאים. לטפל בשלב העיכול ולשנות את התזמון אם יותר מדי תאים מתים נצפו.
מבחנים אלה יש כמה מגבלות. הבעיה הגדולה ביותר היא כי מבחנים אלה מסתמכים על הביטוי של סמן מהונדס. פוטנציאל השינוי של הביטוי של הסמן מהונדס לא יכול לשקף את הביולוגיה של מה שקורה בעובר. בנוסף, cytometry זרימה לא יכול להיות השיטה הטובה ביותר כדי לכמת תאים אם אוכלוסיית תא היעד הוא נמוך מאוד. כדי להתמודד עם אפשרויות אלה, מבחנים אחרים כגון באתרו או טכניקות הכתמה היסטולוגית יכול להיות מנוצל. אם קיימים נוגדנים ספציפיים לסוג התא של אימונוהיסטוכימיה עניין יכול להתבצע גם. עוברים יכולים גם להיות כפופים qRT-PCR כדי למדוד גנים ספציפיים שושלת, ואם מבחנים אלה מבוצעים על מכונת FACS, התאים יכולים להיות מבודדים ונחקרים בנפרד עם שיטות רגישות עוד יותר. למעט בעיות אלה, זו cytometry זרימה כמותית מבחני יכול ליצור הרבה מידע שימושי עבור החוקרים.
עם מבחנים אלה, חוקרים יכולים בקלות להתבונן פגמים hematopoietic בבעלי חיים בעלי חוליות. שינוי מסלולים גנטיים עם MOs או CRISPR ולאחר מכן ביצוע cytometry זרימה כדי להבהיר אם הגן ממלא תפקיד hematopoiesis יכול להיעשות במהירות והוא כמותי. בנוסף, ניתן לבצע מסכים גנטיים קדמיים (כל עוד לבעלי החיים יש תג פלואורסצנטי) ולהעריך פגמים. Zebrafish הפכו גם מודל מצוין עבור מסכי סמים בקנה מידה גדול6,7,8,9,10, המאפשר בדיקות סינון סמים יעיל על אורגניזמים חיים כדי לבחון אם התרופות יעילות ואם יש להם השפעות שליליות על פיתוח / הישרדות. צימוד בדיקה זו עם טכנולוגיית cytometry זרימה אוטומטית משופרת על ידי רובוטיקה יעשה את זה אפילו יותר יעיל20,21,22, המאפשר ניתוח בקנה מידה גדול באמת סינון של מסלולים חשובים בראשית תאי הדם, צמיחה, ורגולציה שנותרו מעורפלים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
D.L.S. הוא יועץ מדעי וקיבל פיצוי ממזונות Finless, Inc. ו Xytogen ביוטק, Inc. K.F.R. מצהיר על שום אינטרסים מתחרים.
Acknowledgments
המימון ניתן על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH: R15 DK114732-01 ל- D.L.S.), הקרן הלאומית למדע (NSF: MRI 1626406 ל- D.L.S.), ומתוכנית הכבוד באוניברסיטת קליפורניה צ'יקו (ל- K.F.R.). המחברים מודים לבטסי טמיאטי על ניהול המעבדה וקתי ג'ונס על הסיוע האדמיניסטרטיבי.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml MCF tube | FisherBrand | 05-408-129 | |
| 10 mm Polystyrene easygrip Petri dish | Corning Falcon | 351008 | |
| 5 ml Polystyrene round bottom tube with cell strainer cap | Corning Falcon | 352235 | |
| BD FACSAria Fusion flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Dithiolthreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 | |
| DPBS (10x) with Ca2+ and Mg2+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| FBS 500 mL | Gemini Bio-Products | 100-108 | |
| HyClone PBS (1x) | GE Healthcare Life Sciences | sh30256.01 | |
| Librease | Roche Sigma-Aldrich | 5401119001 | dissociation protease |
| Pronase | Roche Sigma-Aldrich | 11459643001 | dechorionation protease |
| SYTOX Red Dead Cell Stain | Invitrogen | S34859 |
References
- Driever, W., et al. A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish. Development. 123, 37-46 (1996).
- Weinstein, B. M., et al.
- Ransom, D. G., et al. Characterization of zebrafish mutants with defects in embryonic hematopoiesis. Development. 123, 311-319 (1996).
- Amsterdam, A., et al. A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish. Genes & Development. 13, 2713-2724 (1999).
- Gaiano, N., et al. Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish. Nature. 383, 829-832 (1996).
- Yeh, J. R., et al. Discovering chemical modifiers of oncogene-regulated hematopoietic differentiation. Nature Chemical Biology. 5, 236-243 (2009).
- Paik, E. J., de Jong, J. L., Pugach, E., Opara, P., Zon, L. I. A chemical genetic screen in zebrafish for pathways interacting with cdx4 in primitive hematopoiesis. Zebrafish. 7, 61-68 (2010).
- Ridges, S., et al. Zebrafish screen identifies novel compound with selective toxicity against leukemia. Blood. 119, 5621-5631 (2012).
- North, T. E., et al. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447, 1007-1011 (2007).
- Astuti, Y., et al. A Functional Bioluminescent Zebrafish Screen for Enhancing Hematopoietic Cell Homing. Stem Cell Reports. 8, 177-190 (2017).
- Stachura, D. L., Traver, D.
- Berrun, A. C., Stachura, D. L. Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos. Journal of Visualized Experiments. (129), e56836 (2017).
- Westerfield, M., Zon, L. I., Detrich, H. W. III Essential Zebrafish Methods: Cell and Developmental Biology. , Academic Press. Cambridge, MA. (2009).
- Drummond, I. A., Davidson, A. J. Zebrafish Kidney Development. The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part A. Detrich, H. W. III, Westerfield, M., Zon, L. I. 100, Elsevier. Boston, MA. 233-260 (2010).
- Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nature Immunology. 4, 1238-1246 (2003).
- Ganis, J. J., et al. Zebrafish globin switching occurs in two developmental stages and is controlled by the LCR. Developmental Biology. 366, 185-194 (2012).
- Renshaw, S. A., et al. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108, 3976-3978 (2006).
- Lin, H. F., et al. Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish. Blood. 106, 3803-3810 (2005).
- Page, D. M., et al. An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish. Blood. 122, e1-e11 (2013).
- Ding, M., et al. Application of High-Throughput Flow Cytometry in Early Drug Discovery: An AstraZeneca Perspective. SLAS Discovery. 23, 719-731 (2018).
- Ding, M., Kaspersson, K., Murray, D., Bardelle, C. High-throughput flow cytometry for drug discovery: principles, applications, and case studies. Drug Discovery Today. 22, 1844-1850 (2017).
- Joslin, J., et al. A Fully Automated High-Throughput Flow Cytometry Screening System Enabling Phenotypic Drug Discovery. SLAS Discovery. 23, 697-707 (2018).
