Summary
이 분석법은 배아 제브라피시를 개발하는 데 혈토포이성 세포를 양수화하는 간단한 방법입니다. 해리된 제브라피시로부터의 혈액세포는 혈류 세포측정 분석을 받게 된다. 이것은 돌연변이 동물및 유전 수정 후에 혈액 결점의 검출을 허용합니다.
Abstract
척추 동물에서 성숙한 혈액을 포함하는 세포 혈통의 다양성은 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC)의 분화에서 발생합니다. 이것은 유기체의 수명 내내 생기는 중요한 프로세스이고, 배아 발생 도중 관련시킨 분자 통로의 중단은 치명적인 장기 결과를 가질 수 있습니다. 여러 가지 이유로, 제브라피쉬(다리오레리오)는조혈을 연구하는 모델 유기체가 되었습니다. Zebrafish 배아는 외부적으로 발전하고, 7일 후에 풍부하게함 (dpf)까지 그들의 일생을 위해 지속될 결정적인 혈액 세포의 대부분의 특수형을 생성했습니다. 조혈 세포의 수를 평가하는 분석이 개발되었으며, 주로 특정 조직학적 얼룩, 시상 혼성화 기술 및 형광 단백질의 발현을 유도하는 혈액 세포 별 프로모터를 활용하는 형질 세포 특이적 프로모터를 활용하는 형질 동물의 현미경 검사를 활용하고 있다. 그러나, 대부분의 염색 된 애법과 현장에서 혼성화 기술은 정확하게 존재하는 혈액 세포의 수를 양량하지 않습니다; 셀 수의 큰 차이만 쉽게 시각화할 수 있습니다. 형질 또는 공초점 현미경 검사를 가진 개별을 분석하는 것은 수행될 수 있습니다, 그러나 이 분석의 양은 수동으로 계산하거나 고가의 화상 진찰 소프트웨어를 이용에 의존합니다, 둘 다 오류를 만들 수 있습니다. 혈액 세포 수를 평가하는 추가 방법의 개발은 경제적일 것이고, 더 빨리, 심지어 CRISPR 매개 유전자 수정의 효력, 모르폴리노 중재한 성적증명서 감소 및 대규모에 조혈증에 영향을 미치는 약 화합물의 효력을 신속하게 평가하기 위하여 자동화될 수 있었습니다. 혈액 세포를 양화하는 이 새로운 분석은 전체 제브라피시 배아를 해리하고 존재하는 형광표 혈액 세포의 양을 분석해서 수행됩니다. 이 분석서는 혈액 세포 생성, 확장 및 태아 발생 도중 규칙에 책임 있는 분자 통로의 elucidation를 허용해야 합니다, 이는 연구원이 혈액 질병 도중 변경된 새로운 요인을 추가로 발견할 수 있을 것입니다, 뿐만 아니라 척추 동물 조혈의 진화 도중 필수적인 통로.
Introduction
혈액 생산 (혈종)은 초기 배아에서 처음 시작되는 필수적인 발달 과정입니다. 이 과정은 원시적 적혈구와 대식세포를 중구로부터 직접 생성하여 시작하여 나중에 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC)의 생산으로 전환합니다. 다능성 인 이 줄기 세포는 유기체에서 성숙한 혈액 세포의 모든 종류를 생성합니다. 자체 갱신이 가능한 이 시스템은 이러한 HSPC를 통해 지속적으로 보충됩니다. 이 과정은 개발 초기에 시작되는 동안, 혈액 조혈은 동물의 생명을 위해 계속, 신체의 먼 사이트에 산소를 수송 하는 기능을 제공, 부상 후 출혈을 중지, 감염에서 시체를 보호. 이 복잡한 시스템의 발달은 발달 도중 시간적으로 그리고 공간적으로 통제되고 혈액 세포 생산에 있는 어떤 동요든지 유기체를 위한 치명적일 수 있습니다, 빈혈, 혈소판감소증, 백혈병 및 백혈병의 결과로.
조혈 연구에 사용되는 인기있는 동물 모델은 인간과 비교할 때 혈액 발달이 유사하기 때문에 제브라피시(Danio rerio)입니다. 사실, 조혈 중에 사용된 많은 유전자와 분자 통로는 척추 동물 진화 전반에 걸쳐 보존되어 제브라피시를 연구하여 인간 유전자에 대해 배울 수 있게 합니다. 중요한 것은, 제브라피시 배아는 바디 외부에서 발전하고 7 일 안에 가장 성숙한 혈액 세포 모형을 생성했습니다, 짧은 시간에 조혈 계통의 직접적인 가시화를 허용하. Zebrafish는 또한 매우 fecund, 이는 연구원이 재현 가능한 데이터를 생성하는 데 중요한 짧은 시간 프레임에서 샘플의 더 많은 수를 관찰 할 수 있습니다. 제브라피쉬의 짧은 생성 시간 및 외부 발달은 돌연변이 발생 연구1,2,3,4,5 및 약물 스크리닝6,7,8,9,10동안 보다 쉽게 조작 및 관찰을 제공한다. 이것은 인간 혈액 무질서를 위한 유망한 치료 화합물의 패널이 신속하고 능명하게 시험될 수 있게 합니다.
중요한 것은, 제브라피쉬는 또한 유전적으로 순종하며, 게놈은 순서와 부가된다. 이 기관성은 모르폴리노와 같은 역유전학 기술을 허용합니다-(MO-) 중재된 녹다운 및 CRISPR 매개 유전 절제술이 수행될 수 있습니다. Zebrafish는 또한 앞으로 유전 스크린을 수행하는 모델로 자신의 유틸리티를 입증했다; 척추 동물 혈액 형성에 관련 된 많은 필수 유전자와 경로이러한 방식으로 발견 되었습니다. 혈액 세포를 관찰하는 수많은 방법은 또한 제브라피시에서 개발되었습니다. 전통적인 조직학적 염색 기술이 존재하지만 혈액 특이적 성적증명서에 대한 시투 혼성화에서도 수행할 수 있습니다. 중요한 것은, 수많은 형질전환선도 존재하여 형광 단백질이 계보 특이적 프로모터에 의해 발현되어 형광단백질(11)을가진 특정 혈액 세포의 라벨링을 허용한다. 이것은 연구원이 시간이 지남에 따라 살아있는 유기체에 있는 혈액 세포 창세기, 확장 및 규정의 상시 관측을 능력을 발휘할 수 있습니다.
전반적으로, 조혈 시스템의 보존, 형질 대사의 존재와 쉬운 개발, 쉬운 시각화, 짧은 세대 시간은 제브라피쉬가 패혈증의 경제적이고 빠르며 적응 가능한 모델로 만들었습니다. Zebrafish 연구원을 위해 사용할 수 있는 기술의 도구 상자를 개선하기 위해, 우리는 태아에 있는 혈액 세포의 수를 강력하게 양을 하기 위하여 이 분석법을 개발했습니다. 이 방법은 형질전환 동물을 소화하고 형광 혈액 세포를 위한 유동 세포측정을 능력을 발휘하는 관련시킵니다. 이러한 방식으로, 돌연변이 동물로부터의 혈액 세포, MO 및 CRISPR 수정의 효과 및 소분자의 효과는 빠르고 재현 가능한 방식으로 정량적으로 분석될 수 있다. 이러한 소는 시간이 지남에 따라 그들의 세대, 증식 및 유지 보수의 검사를 허용, 혈액 세포를 열거 하는 사용자 친화적 이고 경제적인 방법.
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Protocol
캘리포니아 주립 대학 치코의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 자문위원회는 아래에 설명 된 모든 방법을 승인했습니다.
참고: 1페닐 2-티오레아(PTU)로 배아를 치료하는 것이 좋습니다. 표 1) 24시간 후유증(hpf)에서 유동 세포측정에 의한 형광 차별에 부정적인 영향을 미치는 색소 침착을 방지한다. 아래에 나열된 모든 절차는 유동 세포 측정 및 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 허용됩니다. 그러나 FACS 후 조혈 세포를 배양하는 것이 목표라면 샘플을 처리 할 때 멸균 관행을 준수하십시오. 멸균 방식으로 배아 샘플을 표백 및 준비하기 위한 프로토콜은 이전에12에기술되었다.
1. 48 hpf 제브라피시 배아의 반향
- 10cm 플라스틱 페트리 접시에 배아(최소 5개, 배아 200개 이상)를 사용하면 배아가 바닥 가장자리로 가라앉도록 접시를 기울입니다.
참고 : 뚜껑을 제거하고 페트리 접시의 한 가장자리 아래에 뚜껑을 배치하여 접시를 기울이기 쉽습니다. - 제거 및 가능한 한 많은 E3 매체(표 1)를폐기하고 불반향 protease (10 mg / mL)의 500 μL을 추가합니다. 실온에서 5분 동안 배양하십시오.
- 5분 후, 페트리 접시(모든 배아를 접시 의 하단 가장자리에 유지)를 집어 들고 페트리 접시의 측면을 부드럽게 탭하여 배아가 접시 바닥에 부드럽게 문질러 서 채온을 완전히 제거합니다.
- 스퀴즈 병으로 E3 배지 ~20mL를 추가하여 프로테아지를 희석시보냅니다. 배아가 해독하여 E3 배지를 정착시키고 제거할 수 있도록 합니다.
- 단계 1.4 3x를 반복하여 반향 프로테아제의 모든 흔적을 제거합니다.
참고: 각 개별 샘플을 분석하려면 적어도 5개의 배아가 필요합니다. 이 불반향 절차는 페트리 접시 당 최대 200 개의 배아를 수용 할 수 있습니다. 샘플은 이 단계에서 그룹화하고 원하는 경우 나중에 분리할 수 있습니다. 또는, 수동 비반향은 시계 제작자의 집게로 부드럽게 chorions를 찢어서 수행 할 수 있습니다. 이것은 태아의 작은 숫자가 있을 때 유리합니다. 일반적으로 제브라피쉬는 72hpf로 그들의 chorions에서 부화합니다. 그러나 심하게 기형된 배아는 그렇지 않을 수 있으며, 그 시간 이후에는 비반향(수동 또는 화학 물질)이 필요할 것입니다.
2. 해리를 위한 배아 샘플 준비
- P1000 파이펫을 사용하여 5-10 개의 배아를 단일 1.5 mL 마이크로 센심 분리기 튜브에 놓습니다.
- 파이펫으로 E3 매체를 제거하고 폐기합니다.
주의: 배아가 다음 단계에서 쉽게 버릴 수 있기 때문에 주의하는 파이펫. - 10mM 디티오트리톨(DTT)의 1mL를 E3 배지에 추가하여 배아 제브라피시(11,12,13,14)를둘러싼 점액코팅을제거한다. 마이크로센트심분리기 튜브를 수평으로 놓고 실온에서 30분 동안 배양합니다.
3. 배아 해리
- DTT의 흔적을 제거하기 위해 Ca2+ 및 Mg 2+로 덜벡코의 인산완충식염(DPBS)의 1mL로 배아 3배를 세척합니다. 마지막 세척 후 Ca2+ 및 Mg2+ 및 5 μL5 mg/mL (26 U/mL) 해리 프로테아이즈와 DPBS의 500 μL을 추가합니다.
참고: 다른 동소완충액이 사용될 수 있지만 해리 효소가 제대로 작동하려면 Ca2+ 및 Mg2+를 포함해야 합니다. - 60 분 동안 185 rpm에서 수평 궤도 셰이커에 37 °C에서 샘플을 배양합니다. 샘플이 완전히 해리 될 때까지 P1000 파이펫으로 배아를 삼각합니다.
주의: 배아를 과소화하지 않도록 주의하십시오. 일부 고체 조직이 존재해야하며 완전히 균일해서는 안됩니다. 과다 소화가 가능하며, 이는 혈류 세포계(보충도 1)에서관찰되는 표적 혈액 세포를 파괴할 것이다.
참고 : 이 절차는 48-72 hpf 배아에 가장 적합합니다. 이후 단계는 해리 프로테아제와 더 긴 잠복이 필요할 수 있습니다. 다른 단계에 대한 타이밍은 경험적으로 결정해야합니다. 배아 조직을 해리하는 더 빠른 대체 방법이 있지만, 이 방법은 60 분이 걸리지만 살아있는 조혈 세포의 효율적인 격리를 허용 할 만큼 부드럽고 철저하다는 것을 경험적으로 발견됩니다.
4. 유동 세포종에 대한 해리된 배아의 준비
- 파이펫 5 해리 배아는 35 μmM 세포 스트레이너 캡을 가진 5mL 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브의 상단 저수지에 분리된 배아.
- 여과된 세포를 포함하는 5mL 폴리스티렌 튜브의 스트레이너 캡에 Ca2+ 또는 Mg2+가 없는 4mL의 인산염 완충식식염(PBS)을 첨가하여 세포를 헹구는 세포를 헹구는 세포를 헹구는 다.
참고: 다른 동소완충액도 사용될 수 있지만, 해리 효소를 희석하고 비효율적이게 만들기 위해 Ca2+ 또는 Mg2+가 부족해야 합니다. - 원심분리기 튜브는 4°C, 300 x g에서 5분 동안 세포를 펠릿합니다. 파이펫으로 상체를 제거하고 폐기합니다. PBS의 500 μL에서 세포를 다시 일시 중지합니다 (Ca2+ 또는 Mg2 +없음).
5. 유동 세포측정
- 셀 현탁액을 부드럽게 소용돌이쳐 1:1,000 개의 붉은 죽은 세포 얼룩(재료 표)을추가합니다.
참고: 적색 세포 얼룩은 표적 세포로부터 죽은 세포와 이물질을 배제할 수 있는 세포 투과성 염료이며, 633nm 레이저에 의해 흥분되기 때문에, 녹색 형광 단백질(GFP) 및 DRed와 같은 일반적인 형광을 자극하는 데 사용되는 488 nm 레이저와 는 다른 것으로 나타났습니다. 이런 식으로, 죽은 세포와 형질 전환 혈액 세포에서 스펙트럼 중복이 없습니다. 1 mg/mL에서 프로피듐 요오드 (PI)는 붉은 죽은 세포 얼룩에 대한 저렴한 대안이지만, 피의 플루오로포어만으로 PI로 얼룩진 일부 샘플을 예약해야합니다. 그렇지 않으면 GFP와 같은 PI 및 형광구의 신호가 겹쳐져 거짓 양성 결과가 발생합니다. 유동 세포계에도 405nm 레이저가 있는 경우, 블루 아빠 세포 얼룩과 같은 다른 염료도 탁월한 선택입니다.
주의: 혈액 세포를 분석할 때, 30 분 후에 특정 세포 모형이 빨간 죽은 세포 얼룩을 phagocytose 하기 시작할 것이라는 점을 주의하십시오. 분석될 때까지 빛과 얼음에서 세포를 보호하고 염료를 첨가한 지 30분 이내에 유동 세포측정을 수행합니다. - 유동 세포측정 분석
참고: 모든 흐름 사이토미터는 약간 다르지만 다음 단계는 대부분의 컴퓨터에서 분석을 위한 샘플을 준비하는 데 도움이 됩니다. 세포측정을 유동하는 사용자를 위해 특정 장비에 대한 전문가인 사람의 조언을 구하십시오. 다음 지침은 BD FACSAria 융합 흐름 세포계에 관련이 있습니다.- 사이토미터를 켜고 레이저가 20분 동안 따뜻해집니다. 빈 폐기물 탱크, 적절한 솔루션 (흐름 세포계에 따라 다름)와 칼집 탱크를 채우고 유체 시스템을 시작합니다.
참고: 일반적으로 각 유형의 유동 세포계에 대한 특정 시작 절차가 있습니다. 해당 시작 절차를 신중하게 따르십시오. - 분석 소프트웨어에서 5개의플롯(그림 1A)을그립니다.
- y 축의 x 축 및 측면 분산(SSC)에 대한 첫 번째 점 플롯 측정 전방 분산(FSC)을 갖습니다. FSC를 선형으로 설정하고 SSC를 로그로 설정합니다.
참고: FSC는 셀 크기의 측정이며, SSC는 세분성의 측정이다; 이것은 파편에서 세포의 차별을 허용할 것입니다. 배아 제브라피쉬 혈액세포는 이전에 설명된 성인 제브라피시 혈액세포와 동일한 방식으로 크기 및 세분성에 의해 분리되지않는다. 대신 그(것)들은 그밖 모든 소화한 배아 세포를 가진 동일 인구에서 나타날 것입니다. - 두 번째 플롯을 설정하여 FSC 높이(H)와 FSC 너비(W)를 검사합니다. SSC(H)와 SSC(W)를 측정하기 위해 세 번째 플롯을 설정합니다.
참고: 이 단계는 이중(레이저를 통과할 때 함께 붙어 있는 셀)을 제외하는 데 사용됩니다. - x 축의 적색 죽은 세포 얼룩을 측정하기 위해 네 번째 점 플롯을 설정합니다 (사이토미터에 따라 이는 일반적으로 동종 코시아니닌 [APC]에 사용되는 필터와 동일합니다) 및 y 축의 SSC. 이것은 죽은 세포에서 살아있는 세포의 차별을 허용할 것입니다.
참고: 각 사이토미터의 필터 세트는 다를 수 있습니다. 죽은 세포 차별 염료에 올바른 검출 필터를 사용해야 합니다. - 다섯 번째 플롯은 선택의 불소를 측정합니다. 이를 형광소(도1)의히스토그램으로 시각화하거나 점도플롯(보충도 2)을사용한다.
참고: 동일한 동물에서 둘 이상의 플루오로포어를 검사할 때 점 플롯을 사용하여 두 매개 변수를 동시에 보는 것이 좋습니다. 형광이 서로 스펙트럼 중복될 가능성이 있는경우(보조도 2),점도 도표도 추천합니다. 영역(A) 설정을 사용하여 모든 매개 변수에 대해 사이토미터의 레이저 펄스에 의해 생성된 곡선 아래 영역을 계산합니다.
- y 축의 x 축 및 측면 분산(SSC)에 대한 첫 번째 점 플롯 측정 전방 분산(FSC)을 갖습니다. FSC를 선형으로 설정하고 SSC를 로그로 설정합니다.
- 샘플을 로드하고 샘플이 빠르게 실행되지 않도록 유량을 줄입니다. 세포 집단의 대부분을 명확하게 볼 수 있도록 FSC 및 SSC 설정을 조정합니다(그림1A).
- 세포 인구 주위에 게이트를 그리고 그것을 세포를 레이블. 두 번째 점 플롯이 셀에 게이트되어 있는지 확인하고, FSC에서 첫 번째 게이팅을 한 다음 SSC 싱글t에서 더블을 제외합니다.
- 네 번째 플롯에서 빨간색 죽은 세포 얼룩 설정을 조정하여 분명히 부정적인 집단이 있습니다. 이 세포 주위에 게이트를 그리고 그(것)들을 살아있는 세포에 레이블을 지정합니다. 다섯 번째 플롯에서, 살아있는 세포에 게이트와 형광소 음성 및 양성 세포를 검사. 양수 세포 주위에 게이트를 그립니다.
참고: 이 계층적 게이팅 전략은 세포 게이트에 있는 살아있는 세포 게이트에 있는 단 하나 형광구+ 세포를 검사합니다. 게이트를 올바르게 설정하십시오. 이러한 게이트는 실험에 따라 사용자 지정할 수 있습니다. - 각 샘플을 실행하여 적어도 25,000개의 라이브 셀 이벤트를 수집합니다.
- 종료 절차를 따라 유체를 끕니다. 칼집 탱크를 리필하고 폐기물 탱크를 비웁니다.
참고: 단백질 발현이 낮거나 세포 집단이 드물때 형광+ 세포를 시각화하는 것은 종종 어렵습니다. 파라미터가 제대로 설정되도록 하기 위해, 플루오로포레- 형제 배아는 제대로 게이트를 그리고 레이저 전압을 조정하기 위하여 함께 준비되어야 합니다(보충 도 2). 대상 세포 집단이 드문 경우 25,000개 이상의 이벤트를 수집합니다. 5-10 소화 된 동물, 하나는 이벤트의 수백만을 수집 할 수 있어야합니다. 불소공포증+ 세포의 총 수는 또한 이 데이터로 얻을 수 있다. 단순히 혈류계와 샘플에서 세포의 총 수를 계산하고 물고기 당 형광요법+ 세포의 절대 수를 얻기 위해 형광 + 세포의 비율을 곱합니다.
- 사이토미터를 켜고 레이저가 20분 동안 따뜻해집니다. 빈 폐기물 탱크, 적절한 솔루션 (흐름 세포계에 따라 다름)와 칼집 탱크를 채우고 유체 시스템을 시작합니다.
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Representative Results
배아 제브라피시에서 적혈구를 열거하기 위해 lcr:GFP16 배아는 PBS, 7.0 ng/nL ism1 MO, 또는 7.0 ng/nL ism1 MO를 가진 1세포 단계에서 7.0 ng ism1 mRNA12를주입하였다. 48 hpf에서 그들은 소화되었고 혈류 세포 측정 분석을 실시하였다. 각 샘플에서 GFP+ 적혈구의 백분율을 분석한 후(각 샘플은 5개의 무작위로 선택된 배아; 도 1A)모든 대조군의 평균이 계산되었다. 이 평균은 1로설정되었으며 모든 백분율은 해당 참조점에서 계산되었습니다. 이러한 데이터는 특정 MO를 사용하여 ism1 성적증명서를 감소시켜 48hpf 배아에 존재하는 GFP+ 적혈구의 수를 감소시킨 것을 나타낸다. 추가적으로, 외인성 mRNA를 가진 ism1 수준에 있는 이 감소를 구출하는 것은 정상으로 적혈구의 수를 반환했습니다.
도 1: ism1 MO는 배아 발생 시 생성된 적혈구의 수를 감소시킨다. (A) lcr:GFP16 배아는 PBS로 주입되어 혈류 세포측정 분석을 실시하였다. 첫째, 크기와 세분성이 결정되었고, 관심있는 세포집단(세포,좌판)을 중심으로 게이트가 그려졌다. 이어서, FSC H와 FSC W는 함께 붙어 있는 세포를 제거하기 위해 평가되었다(단일FSC). SSC H와 W는 또한 함께 붙어 세포를 평가의 가능성을 줄이기 위해 평가되었다(단일 SSC). 적색형은 살아있는세포(살아있는 세포)를결정하기 위하여 그 때 검토되었다. 마지막으로, 살아있는 세포는 GFP 형광을 위해 검사되었습니다 (오른쪽 패널). (B) lcr:GFP12 배아는 개발의 한 세포 단계에서 PBS(대조군, 원), ism1 MO(ism1 MO, squares), 또는 ism1 MO + ism1 mRNA12(구조, 삼각형)로 주입되었다. 48h 후, 그들은 수집, 소화, 패널 A에 도시된 바와 같이 혈류 세포측정을 실시하였다. 각 점은 무작위로 선택된 5개의 개별 배아를 나타냅니다. 접이식 변화는 대조군 샘플의 GFP+ 셀의 평균 백분율을 1로설정하여 계산됩니다. 다른 모든 샘플은 해당 평균과 비교됩니다. *p&0.005, N.S. = 중요하지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 용액 | 재료 | 노트 |
| E3 배지(50x) | 14.61 g 의 NaCl, KCI 0.63 g, MgSO4·7H2O, 1.83 g의 CaCl2·2H2O | 2L 졸업 실린더에 재료와 충분한 증류수를 추가하여 총 부피를 1 L로 가져옵니다. |
| E3 배지(1배) | 50x E3의 40mL | 2L 의 졸업 실린더에, 2 L에 총 볼륨을 가지고 충분한 증류수를 추가합니다. |
| E3 배지의 1-페닐-2-티오레아(PTU) | 40 mL 50 x E3 에 a 2 L 병, 40 PTU의 mg | 2L 의 졸업 실린더에, 2 L에 총 볼륨을 가지고 충분한 증류수를 추가합니다. PTU를 완전히 녹이려면 적어도 2 일 동안 저어줍니다. |
표 1: 해결책을 위한 레시피.
보충 도 1: 해리 프로테아제와 배아의 소화. 10개의 배아의 이미지가 제대로 소화되지 않음(왼쪽; 소화되지 않음), 적절한 소화 후(중간; 소화), 과도한 소화 후(오른쪽, 소화불량). 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 2: 5 dpf 배아에서 두 개의 형광의 평가. 게이츠는FSC 및 SSC를 평가하여 관심있는 세포 집단(세포,왼쪽 열)을 결정하고, 싱글을 평가하여(도시되지 않음), 살아있는세포(live,middle column) 및 플루오로포어 발현(mpx:GFP17 및 gata1:D red15)을결정하였다. 첫째, 형광이 없는 동물(위 쪽 행)에 게이트가 설치되었습니다. 그런 다음 mpx:GFP+ (gata1:D red 없음) 동물은 GFP (두 번째 행)에 대한 게이트 및 보상을 설정하는 것으로 평가되었다. 가타1:D레드 +(mpx:GFP 없음) 동물은 DsRed(3열)에 대한 게이트 및 보상을 설정하도록 평가하였다. 마지막으로, 두 가지 색상은 mpx:GFP+ 및 가타1:D+ 이중양성 동물로 평가 할 수 있습니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
Zebrafish는 원시적이고 확실한 척추동물 조혈을 연구하기위한 훌륭한 모델 시스템입니다. 지난 수십 년 동안 여러 분석이 개발되고 정제되어 제브라피쉬가 약물 검사, 유전 돌연변이 생성 및 테스트, 전체적으로 조혈에 필수적인 분자 경로를 분석할 수 있도록 하는 빠르고 경제적인 모델이 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 빠른 데이터 수집, 성인 동물보다 적은 물리적 공간의 사용, 대규모 화학 스크린에 대한 적은 약물의 사용을 허용하는 배아 얼룩말 피시를 사용합니다. 또한 mRNA의 과발현, CRISPR 돌연변이체 생성 및 MO 유도 된 성적 증명서 감소 후 의 양을 허용하여 초기 배아 발달 중에 발생하는 특정 유전 경로를 변경합니다. 중요한 것은, 그것은 현장 혼성화 또는 조직학적 염색 기술에서 할 어려운 혈액 세포의 민감하고 강력한 양을 허용합니다.
이 분석은 유연하며 많은 연구 질문에 대답하도록 수정할 수 있습니다. 이 프로토콜의 1개의 수정은 동물의 발달 단계가 다른 혈액 세포 모형을 양으로 조작하는 때 수행될 수 있다. 예를 들어, 적혈구는 제브라피시 발달 초기에 발생하며 lcr:GFP16 형질전환선과 같은 형질전환 동물과 함께 16-somite 단계부터 조기에 검출될 수 있다. 혈전세포 연구에 관심이 있는 경우, 그러나, itga2b:GFP18 (cd41:GFP라고도 함) 형질선은 48 hpf에서 GFP를 발현하기 시작하고, 성숙한 순환 혈전세포는 72hpf에서 관찰됩니다. 이 분석으로 B 세포를 양수화하고자 하는 경우 ighm:EGFP19 형질전환 동물20 dpf에 가깝게 수행 될 수 있습니다. 중요 한 것은, 이 분석 또한 시간이 지남에 혈액 세포를 따라 사용할 수 있습니다. 예를 들어, lcr의수를 분석하여 :GFP+ 세포24hpf, 48 hpf, 72 hpf, 유전자 변형 (또는 약물)이 단지 자신의 세대에 비해 적혈구의 유지 를 규제하는지 여부를 결정할 수 있습니다.
이 assays는 연구원이 CRISPR 또는 MOs를 가진 유전자 발현을 감소시키거나 개발의 1 세포 단계에서 mRNA를 주입하고 정확하게 이 수정한 태아에서 생성된 혈액 세포의 수를 비교하여 유전자 발현을 과발현하는 것을 허용합니다. 비특이적 가이드 RNA 또는 일치하지 않는 MOs로 형제 동물을 주입하고 실험 그룹과 함께 혈액을 검사하여 이러한 실험에 대한 적절한 제어를 수행하기 위해 항상주의를 기울여야합니다. 발달 단계는 매우 중요합니다. 개발 도중 단지 몇 시간의 변경은 태아에 존재하는 혈액 세포의 엄청나게 다른 수를 보여줄 수 있었습니다. 즉, 배아를 비교할 때 개발 시간을 주의 깊게 모니터링하십시오. 태아가 연령과 일치하도록 하기 위해 형태학적 단서를 활용해야 합니다. 초기 배아에서는 소미트를 연령 일치에 세는 것이 좋습니다. 나중에 개발, 심장 박동의 시작과 같은 다른 마커, 오틱 소포의 크기, 또는 신체의 길이는 물고기를 제어하기 위해 수정 된 물고기의 단계에 맞게 사용할 수 있습니다. 더욱이, 총 세포의 수는 실험 및 대조동물에 존재하는 세포의 동일한 수를 보장하기 위해 소화 된 배아에서 열거 될 수있다. 이러한 아세서를 사용하여 유전자 변형을 검사하는 것 외에도 이러한 저필은 대규모 약물 화면을 수행하기 위해 수정될 수 있습니다. 배아는 문제의 화학 물질이 조혈에 어떤 영향을 미치는지 확인하기 위해 개발 중에 화합물의 다른 농도에 일시적으로 노출 될 수 있습니다. 실험이 특정 약물의 효과를 테스트하도록 설계된 경우, 차량으로 만 치료 된 동물은 제어로 포함되어야한다. 이러한 방법으로, 연구원은 특정 유전자 또는 신호 경로의 게인 또는 기능상실이 조혈에 필수적인 역할을 하는지 결정할 수 있습니다.
다른 전염을 검사할 때 샘플당 소화되는 동물의 수가 최적화되는 것이 필수적입니다. 너무 적은 동물은 거의 또는 전혀 형광을 생성 할 수 있습니다. 특히 특정 시점에서 풍부하지 않은 HSPC를 검사할 때 특히 그렇습니다. 형광을 유발하는 약한 발기인이 있는 형질 전환증을 검사할 때도 중요합니다. 이러한 문제를 중화하기 위해 더 많은 동물 (따라서, 더 많은 세포)이 정확한 수에 필요합니다. 발달 단계를 변경할 때 소화 시간을 최적화하는 것도 중요합니다. 이 프로토콜은 튜브 당 5 개의 개별 48 hpf 배아에 최적화되어 있습니다. 더 성숙한 태아를 소화하는 것은 아마 더 긴 시간이 필요합니다.
몇 가지 잠재적인 문제는 절차 중에 발생할 수 있습니다. 형광이 관찰되지 않으면 해결해야 하는 사이토미터에 기술적 문제가 있을 수 있습니다. 이러한 이유로, 배아가 현미경으로 신속하게 검사하여 절차를 시작하기 전에 형광인지 확인하는 것이 필수적입니다. 또 다른 일반적인 문제는 세포를 파괴하는 배아를 과도하게 소화하는 것입니다. 소화 단계에주의하고 너무 많은 죽은 세포가 관찰되는 경우 타이밍을 변경합니다.
이러한 분석에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 가장 큰 문제는 이러한 소가 형질형 마커의 표현에 의존하고 있다는 것입니다. 잠재적으로 형질 전환 마커의 표현의 변화는 배아에서 발생하는 것의 생물학을 반영하지 않을 수 있습니다. 또한, 유동 세포측정은 표적 세포 집단이 극히 낮은 경우 세포를 양수하는 가장 좋은 방법이 아닐 수 있다. 이러한 가능성을 다루기 위해, 시투 또는 조직학적 염색 기술과 같은 다른 소법을 활용할 수 있었다. 특정 항체가 관심있는 세포 유형에 대해 존재하는 경우 면역 히토화학도 수행 될 수있다. 배아는 또한 계보 특정 유전자를 측정하기 위하여 qRT-PCR를 복종할 수 있고, 이 분석이 FACS 기계에서 수행되는 경우에, 세포는 격리되고 더 민감한 방법으로 개별적으로 공부될 수 있었습니다. 이러한 문제를 제외, 이 정량적 흐름 세포 분석 연구원에 대 한 유용한 정보를 많이 생성할 수 있습니다.
이 분석으로, 연구원은 척추 동물에 있는 조혈 결점을 쉽게 관찰할 수 있습니다. MOs 또는 CRISPR로 유전 경로를 수정한 다음 유전자가 혈토포에이션에 있는 역할을 하는 경우에 해명하기 위하여 유동 세포측정을 능력을 발휘하는 것은 빨리 행해질 수 있고 정량적입니다. 추가적으로, 앞으로 유전 스크린 (동물이 형광 표이 있는 한) 수행될 수 있고 결함을 평가할 수 있습니다. Zebrafish는 또한 대규모 약물 스크린6,7,8,9,10에대한 우수한 모델이되어 살아있는 유기체에 대한 효율적인 약물 스크리닝 분석이 약물이 효과적인지 관찰할 수 있으며 개발/생존에 부정적인 영향을 미치는지 관찰할 수 있습니다. 로봇 공학에 의해 강화 된 자동화 된 흐름 세포 측정 기술과이 분석을 결합하면 훨씬 더 효율적으로 만들 것입니다20,21,22,진정으로 대규모 분석 및 혈액 세포 창세기에서 중요한 경로의 검사를 허용, 성장, 그리고 모호한 남아 규제.
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Disclosures
D.L.S.는 과학 컨설턴트이며 핀리스 푸드, Inc.와 Xytogen 생명 공학, Inc.K.F.R.로부터 보상을 받았습니다.
Acknowledgments
기금은 국립 보건원 (NIH: R15 DK14732-01에서 D.L.S.), 국립 과학 재단 (NSF: MRI 1626406에서 D.L.S.까지), 캘리포니아 주립 대학 치코 (K.F.R.에)의 명예 프로그램에서 제공되었습니다. 저자는 실험실 관리에 대한 벳시 타미에티와 행정 지원을 캐시 존스 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml MCF tube | FisherBrand | 05-408-129 | |
| 10 mm Polystyrene easygrip Petri dish | Corning Falcon | 351008 | |
| 5 ml Polystyrene round bottom tube with cell strainer cap | Corning Falcon | 352235 | |
| BD FACSAria Fusion flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Dithiolthreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 | |
| DPBS (10x) with Ca2+ and Mg2+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| FBS 500 mL | Gemini Bio-Products | 100-108 | |
| HyClone PBS (1x) | GE Healthcare Life Sciences | sh30256.01 | |
| Librease | Roche Sigma-Aldrich | 5401119001 | dissociation protease |
| Pronase | Roche Sigma-Aldrich | 11459643001 | dechorionation protease |
| SYTOX Red Dead Cell Stain | Invitrogen | S34859 |
References
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