Summary
分离的RNA的纯度和完整性是RNA依赖性测定中的重要一步。在这里，我们提出了一个实用、快速和廉价的方法，从少量未受损的胰腺组织中提取RNA。
Abstract
无论提取方法如何，组织和细胞系的优化RNA提取分四个阶段进行：1） 均质化，2） RNA中蛋白质的有效变性，3） 核糖核糖核素灭活，以及 4） 去除DNA、蛋白质和碳水化合物中的污染。然而，当组织中有高水平的RNA时，保持RNA的完整性是非常费力的。自发的自解使得在不损害胰腺组织的情况下从胰腺组织中提取RNA变得非常困难。因此，在提取过程中需要一种实用的RNA提取方法来维持胰腺组织的完整性。通过在不到2分钟内获得20-30毫克大鼠胰腺组织并提取RNA，对现有方案进行了实验和比较研究。结果通过电泳评估。实验进行了三次，以概括结果。当RNA提取试剂用作试剂时，在-80°C下将胰腺组织浸入RNA稳定试剂中24小时，产生高完整性RNA。所得结果与具有自旋柱结合的商业套件所得结果相当。
Introduction
结构基因数据可以通过基因表达转录到功能产品。RNA分析用于发现不同条件下基因表达的差异。提取核酸的方法有很多，如下：硫化核酸，通过苯酚-氯仿提取，纤维素基色谱，二氧化硅基提取，和核子交换1，2。,2
正确检测基因表达受从组织分离的RNA的完整性影响;因此，在进行进一步测试之前，评估从组织分离的RNA的完整性至关重要，因为对低质量RNA的补充分子测试可能会危及诊断应用结果。因此，具有不同诊断应用的分子生物学测试需要高完整性RNA：定量RT-PCR、微阵列、核糖核酸酶保护测定、北方印迹分析、RNA映射和cDNA库结构3、4。,4
长期保存后，RNA变得相当不稳定。超过10 kb的长mRNA片段特别容易降解5,5，6。因此，研究人员必须考虑影响纯化RNA完整性的各种因素。RNA的纯度必须受到保护，防止RNA、蛋白质、基因组DNA和酶抑制剂污染。此外，RNA 与 UV （260/280） 的最佳和可接受的吸收比必须在 1.8-2.0 范围内，与电泳的碎片最小。最近开发的实验室技术使科学家能够更实际地评估分子分析样本的完整性,。
从胰腺组织中提取未受损的RNA比从其他类型的组织中提取未受损的RNA要困难得多，因为核糖核糖核酸（RNases）的量很高。然而，现有的提取方法，即胰腺组织从腹腔快速弹出和低温均质，以,阻碍RNases，已被证明是无效的7，8，9，10，11，12，13，14。89,10,11,12,13,14
本比较实验研究的目的是修改和比较现有方法，以确定最有效的方法。为此，对RNA提取的各种方案进行了修改和比较。它特别旨在确定最昂贵的方法，需要最低数量的胰腺组织。
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Protocol
这项研究 的 伦理 批准得到了 设拉子医科大学（批准编号：93-01-01-7178=03-07-2014）。
注：使用重达250克的雄性斯普拉格-道利大鼠。将含有胰腺组织片片的小瓶浸入RNA稳定试剂中，在-80°C处使用RNA提取试剂溶液保持RNA的完整性。
1. 切除大鼠胰腺组织
- 准备手术室，将所有所需材料放在机罩下。
- 在240°C下，将所有手术器械（修整钳子、棕色-Adson钳子、虹膜剪刀和利弗剪刀）消毒至少4小时，以灭活RNases15。用70%的酒精在手术场所的表面进行消毒。
- 使用胰岛素注射器[80/8毫克/千克]在单酮内注射氯胺酮。。通过捏住大鼠的手指趾，检查麻醉深度，以寻找缺乏反应。
- 在适当的微管（2 mL）中加入1 mL的RNA稳定试剂，以抑制切除组织内核糖的活化。
- 立即将大鼠放在手术板上（头部远离外科医生），进行中线切口。
- 用 70% 的酒精消毒整个腹部表面，并使用带一根带刀片的剪子#40去除#40毛。
- 做一个 V 形切口，用梳妆钳、棕色 - Adson 钳子、虹膜剪刀和利弗剪刀将腹部从区域打开到前腿。
- 翻转腹部器官到左侧暴露胰腺。仔细找到在腹腔中扩散的胰腺组织。找到脾脏下的区域，找到胰腺，而不会与脂肪组织混淆。
- 立即从腹腔中取出20-30毫克胰腺，不到2分钟。将去除的组织快速放入2 mL微管中，用无菌切割机切割，用RNA稳定试剂穿透分离的组织。
- 将微管放在氮气罐中，立即冻结。将微管放在-80°C冷冻室中24小时16分。
- 24小时后，将胰腺小片转移到冰容器中。
- 在手术后注射氯化钾（KCl）供大鼠安乐死。
2. RNA提取
- 用 70% 的酒精对发动机罩下的表面进行消毒。
- 将1 mL的RNA萃取试剂，其中含有硫化铀，以抑制RNase，在无菌微管。
- 将分离的胰腺组织转移到微管。将微管转移到液氮中立即冻结。
- 在 4 °C 下，与微型尖端探针声波器将组织均质化，设置为 20 级，60 秒，关闭 5 秒。
- 使用碎冰在4°C下孵育每个均质样品5分钟，使核蛋白复合物完全分离。
- 每1mLRNA提取试剂，用0.2 mL的氯仿丰富样品。用力盖住管子，用力摇动管子15 s。
- 在碎冰（4°C）上孵育管子15分钟，将试剂分三个阶段分离。
- 在 +2 至 +8 °C 下以 12，000 x g 运行离心机 15 分钟。 将无色水相转移到新的微管。
- 在水相中加入0.5 mL的100%异丙醇。关闭管，然后反转至少3次，彻底混合RNA。
- 在冷盒（4°C）上孵育样品5-10分钟，允许RNA沉淀。
- 在 +2 至 +8 °C 下以 12，000 x g 运行离心机 15 分钟。 丢弃上一杯。
- 使用 1 mL 的 75% 乙醇丰富每个离心管。
- 将管子反转3次，清洗RNA颗粒。
- 在 +2 至 +8 °C 下以 7，500 x g 运行离心机 5 分钟。丢弃上一液，通过风干从RNA颗粒中去除多余的乙醇。
- 将RNA颗粒重新悬浮在二乙基碳酸盐（DEPC）处理的无RNase水中。
- 通过移液器尖端多次传递溶液以溶解RNA颗粒。然后，在 +65 °C 下孵育溶液 10-15 分钟。
3. 用变性电泳评估RNA完整性
- 准备凝胶运行缓冲液：50 mM NaAc（DEPC处理）和0.5 M EDTA （pH 8.0）在DEPC处理H2O。
- 准备 5x 甲醛凝胶运行缓冲液（MOPS 运行缓冲液）：0.1 M MOPS （pH 7.0）、40 mM NaAc、5 mM EDTA （pH 8.0）。
- 溶解20.6克MS在800 mL的DEPC处理50mM醋酸钠。使用 2 N NaOH 将 pH 调整为 7.0。添加 10 mL 的 DEPC 处理 0.5 M EDTA （pH 8.0）。使用 DEPC 处理的水将溶液的体积调整为 1 L。
- 通过 0.2 μm 过滤器过滤溶液，并在室温下远离光线，以便进行灭菌。如果缓冲区暴露在光线下或被自动遮挡，则缓冲区会随着时间而变黄。稻草色的缓冲器效果很好，但较暗的缓冲器不能有效。
- 准备1.5%的加糖凝胶18。对于 50 mL，加入 0.75 g 的 agarose 和 31 mL 的 H2O. 微波在微波炉中加热 1 分钟。加入9 mL甲醛和10 mL的5x MOPS运行缓冲液。
- 为凝胶准备样品。在无菌微混管中混合以下：
X μL RNA （高达 30 μg）
2 μL 的 5x 凝胶加载缓冲液
10 μL 甲酰胺
4 μL 的 MOPS 运行缓冲器
1 μL 0.1毫克/mL EtBr
3 μL 甲醛 5-x μL 的 DEPC-H2O - 在65°C下孵育样品15分钟，并在冰上冷却。离心5 s，直到所有液体沉积。
- 以 5 V/cm 的速度预运行凝胶 5 分钟。
- 立即将样品装入凝胶的通道，然后将凝胶淹没在 1x 甲醛凝胶运行缓冲液中。运行在3-4 V/厘米19.
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Representative Results
根据常规且经过修改的不带RNA稳定试剂的手术方案评估RNA提取试剂中RNA的完整性
使用RNA提取试剂从常规手术方案提取RNA后，观察到不可接受的波段。车道1显示来自肝脏的RNA作为对照。车道2显示了从常规手术方案获得的28S/18S rRNA波段的退化状态。当胰腺组织的数量减少到50毫克（车道3）或20-30毫克（车道4），并在没有RNA稳定试剂的情况下立即进行手术（修改方案）时，RNA分离不如肝组织控制成功，观察到非特异性带。
根据浸入RNA稳定试剂的改良手术方案评估RNA样品的完整性
使用RNA提取试剂生产的RNA的完整性取决于保存时间和温度（通道5-8）。与控制性肝组织相比，当胰腺组织量为50毫克（车道5）或20-30毫克（车道6）时，RNA分离并不成功。组织浸入RNA稳定试剂后立即提取RNA。当20-30毫克的组织浸入RNA稳定试剂中48小时，48小时提取RNA时，未观察到特异性带。根据电泳结果，RNA完全降解（车道7）。如车道8所描述，在RNA稳定试剂中20-30mg胰腺组织中，在-80°C下潜20-30mg后，观察到可接受的波段（28S/18S rRNA），然后提取RNA。
图1：根据调查方案，评估使用RNA提取试剂从大鼠胰腺组织分离出的RNA的完整性。车道1描绘了从肝脏获得的RNA的完整性作为对照。车道 2 表示从常规手术方案获得的总 RNA 中的 28S/18S rRNA 波段的状态。Lane 3 表示从修改的手术方案获得的 RNA 总数中 28S/18S rRNA 波段的状态，以及 50 mg 的组织。Lane 4 代表从修改后的手术方案获得的 28S/18S rRNA 波段和 20-30 mg 组织的总 RNA 的状态。Lane 5 表示从修改的手术方案获得的总 RNA 中的 28S/18S rRNA 波段的状态，以及浸入 RNA 稳定试剂后立即提取的 50 mg 组织。Lane 6 显示了从 20-30 mg 胰腺组织中从经过修改的手术方案中获得的 RNA 的完整性，该手术方案在浸入 RNA 稳定试剂后立即提取。Lane 7 描述了在 -80 °C 的 RNA 稳定试剂中浸入 RNA 稳定试剂 48 小时后，从经过修改的手术方案中获得的 20-30 mg 组织获得的 RNA 的完整性。 Lane 8 描绘了在 -80 °C 的 RNA 稳定试剂中浸入 RNA 稳定试剂 24 小时后，从经过修改的手术规程中获得的 20-30 mg 组织获得的 RNA 的完整性 。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
在分子生物学中，获得高质量的RNA至关重要。核糖核酸酶在细胞和组织中的存在会迅速降解RNA，使提取变得复杂。RNases 是稳定的酶功能，没有任何共同因素。少量的RNase足以破坏RNA。当大鼠胰腺组织从腹腔中取出时，需要用强洗涤剂对手术器械进行消毒，彻底冲洗，并在240°C下将其放入烤箱至少4小时，在手术前灭活RNases。鉴于RNase水平在胰腺中非常高，手术地点用NaOH和轻度漂白剂进行灭菌，以停用RNase。当胰腺组织在解剖过程中被移除时，RNA会降解。为了提高效率，必须尽快完成20、21、22、23、24,21,22,23,的解剖工作。
胰腺是人体恒水机制的关键组织。因此，改进的胰腺RNA提取程序有助于研究人员更好地理解活性途径。本协议提出了一个高效、简单、优化的从胰腺中提取RNA的方法模型。评估了胰腺组织的不同常见RNA提取方法。它集中在冷冻储存和RNase抑制策略影响RNA质量的影响上。影响RNA完整性的两个最显著因素是手术持续时间和收集的胰腺组织数量。最近的研究表明，RNA降解与胰腺组织8、13、20,的量呈正相关。
在该协议中，在不到2分钟内从麻醉大鼠身上获得20-30毫克的胰腺组织。冗长的手术步骤可能导致胰腺内源性内皮细胞的激活，并迅速降低RNA。在这项研究中，从不同样品中分离出RNA，使用硫氰酸瓜基，苯酚-氯仿提取技术利用液氮来阻碍RNA活性。该方法实现了三个目标：RNA稳定试剂在胰腺组织中的快速渗透，细胞RNA的保护，以及增加保存时间。当含有RNA稳定试剂的样品在-80°C保持24小时时，结果最佳。
然而，当RNA稳定试剂被引入时，RNA完整性显著增加。此外，这个过程是可重复的。在麻醉大鼠的手术过程中，胰腺（20-30毫克）的一小部分被解剖，并在-80°C下浸入1 mL的RNA稳定试剂中，1-2天。如车道 8 中显示，24 小时存储是最佳时间。
上述方法允许少量RNA稳定试剂渗透到器官中。此外，由于解剖的碎片大小较小，降解过程在实验后不久就停止了。在此协议中，至关重要的步骤是尽快将RNA稳定试剂中的浸入组织切割成非常小的片段，直到它穿透细胞并抑制RNase的激活。在均质步骤中，防止RNA提取试剂中的气泡产生，并在4°C下执行所有步骤，这一点至关重要。 必须非常小心地分离水相（含RNA的相），以避免DNA污染。虽然自解和内源性RNA的存在损害了与大鼠胰腺的RNA分离，但RNA的完整性在提议的胰腺灌注方法中保持不变。因此，所建议的方法是一种简单、可重复和廉价的程序，需要比其它现有方法数量较少的RNA稳定试剂。
与任何研究一样，此协议也有一些限制。首先，获得RNA的完整性和产量低于使用整个胰腺组织，因为只使用20-30毫克的组织。其次，由于RNA提取和cDNA合成测试必须快速连续进行，以减少RNA降解，因此一天不能采集大量样品。第三，要对不同的大鼠群进行研究项目，必须从同一手术区中正好吸收20-30毫克的组织，以减少数据变异，因为大鼠胰腺组织完全扩散在腹腔中。
最后，在RNA稳定试剂灌注后使用RNA萃取试剂溶液是昂贵的、基于柱的RNA提取试剂盒的一个很好的替代品。
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Disclosures
未声明。
Acknowledgments
本研究由设拉子医科大学提供财政支持（第93-01-01-7178-03-07-2014号格兰特）。我们感谢设拉子医科大学医学电子学习系、虚拟学校和电子学习卓越中心的佐莫罗迪安和罗斯塔米先生编辑了视频。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Merck | 116801 | Germany |
| Atoclave | Teb Zaim | Iran | |
| Centrifuge | Sigma | Germany | |
| Chloroform | Merck | 107024 | Germany |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC)-treated water | Sigma | Germany | |
| EDTA | sigma | 60-00-4 | Germany |
| Electrophoresis tank | Payapajoohesh | Iran | |
| Eppendorf microTube | Extragene | Taiwan | |
| EtBr | sigma | E 8751 | Germany |
| Ethanol | Merck | 81870 | Germany |
| Falcon Tube | Extragene | Taiwan | |
| Formaldehyde | Merck | 344198 | Germany |
| Formamide | Merck | 344206 | Germany |
| Homogenizer-sunicator | Microson XL 2000 | USA | |
| Isopropanol | sigma | 19516 | Germany |
| Ketamine hydrochloride | sigma | 1867-66-9 | Germany |
| Laminar Flow Hood | Jal Tajhiz | Iran | |
| Mgnetic stirrer | Labrotechnik | USA | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | Germany | |
| Micropipette Tips | Extragene | Taiwan | |
| MOPS | sigma | 85022106 | Germany |
| Na AC | Merck | 567422 | Germany |
| NaOH | Merck | 109137 | Germany |
| Oven | Teb Zaim | Iran | |
| PH meter | Knick | Germany | |
| RNA Later/RNA stabilization reagent | Qiagen | 76104 | USA |
| Surgical instrument | Agn Thos | German made | |
| Syringes | AvaPezeshk | Iran | |
| TriPure reagent/RNA extraction reagent | Roche | 11667157001 | USA |
| Vortex | Labinco | Netherland | |
| Water bath | Memmert | Germany | |
| zylazine | sigma | 7361-61-7 | Germany |
References
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