Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

استخراج RNA سريع وفعال من حيث التكلفة من أنسجة البنكرياس الجرذ

Published: September 19, 2020 doi: 10.3791/61255
Automatic Translation
1,2, 3, 4, 1,5
1Department of Biochemistry, School of Medicine, Shiraz University of Medical Sciences, 2Endocrinology and Metabolism Research Center, Nemazee Hospital, Shiraz University of Medical Sciences, 3English Language Department, Faculty of Paramedical Sciences, Shiraz University of Medical Sciences, 4Department of e-Learning in Medical Sciences, Virtual School and Center of Excellence in e-Learning, Shiraz University of Medical Sciences, 5Autophagy Research Center, School of Medicine, Shiraz University of Medical Sciences

Summary

نقاء وسلامة الجيش الملكي النيبالي المعزول هو خطوة حيوية في اختبار الحمض النووي الريبي تعتمد. هنا، نقدم طريقة عملية وسريعة وغير مكلفة لاستخراج الحمض النووي الريبي من كمية صغيرة من أنسجة البنكرياس غير التالفة.

Abstract

بغض النظر عن طريقة الاستخراج، يتم استخراج الحمض النووي الريبي الأمثل من الأنسجة وخطوط الخلايا في أربع مراحل: 1) التجانس، 2) denaturation فعالة من البروتينات من الجيش الملكي النيبالي، 3) ريبونوكيليشنيشن، و 4) إزالة التلوث من الحمض النووي، والبروتينات، والكربوهيدرات. ومع ذلك، فمن شاق جدا للحفاظ على سلامة الجيش الملكي النيبالي عندما تكون هناك مستويات عالية من RNase في الأنسجة. التلقائي التلقائي يجعل من الصعب جداً استخراج الحمض النووي الريبي من أنسجة البنكرياس دون الإضرار به. وهكذا، هناك حاجة إلى طريقة عملية استخراج الحمض النووي الريبي للحفاظ على سلامة أنسجة البنكرياس أثناء عملية الاستخراج. أجريت دراسة تجريبية ومقارنة للبروتوكولات الموجودة عن طريق الحصول على 20-30 ملغ من أنسجة البنكرياس الفئران في أقل من 2 دقيقة واستخراج RNA. تم تقييم النتائج بواسطة الكهرباء. وأجريت التجارب ثلاث مرات لتعميم النتائج. غمر أنسجة البنكرياس في مُستفد تثبيت الحمض النووي الريبي في -80 درجة مئوية لـ 24 ساعة أثمرت RNA عالية النزاهة، عندما تم استخدام كاشف استخراج الحمض النووي الريبي كمكاد للكاشف. وكانت النتائج التي تم الحصول عليها مماثلة للنتائج التي تم الحصول عليها من مجموعات المواد التجارية مع ربط عمود الدوران.

Introduction

يمكن نسخ البيانات الجينية الهيكلية إلى منتج وظيفي من خلال التعبير الجيني. يستخدم تحليل الحمض النووي الريبي لاكتشاف الاختلافات في التعبير الجيني عبر ظروف مختلفة. هناك عدد من الطرق لاستخراج الأحماض النووية على النحو التالي: الثيوسيانات guanidinium، والاستخراج عن طريق الفينول- الكلوروفورم، والكرومات القائم على السليلوز، واستخراج بواسطة مصفوفات السيليكا، وتبادل الأنيون1،2.

ويتأثر الكشف السليم عن التعبير الجيني بسلامة الحمض النووي الريبي المعزول عن الأنسجة؛ ولذلك، فمن الأهمية بمكان لتقييم سلامة الحمض النووي الريبي معزولة عن الأنسجة قبل إجراء مزيد من الاختبارات لأن الاختبارات الجزيئية التكميلية على RNA منخفضة الجودة قد تعرض للخطر نتائج التطبيق التشخيصي. وهكذا، هناك حاجة إلى RNA سلامة عالية للاختبارات البيولوجية الجزيئية مع تطبيقات التشخيص المختلفة: كمية RT-PCR، صفائف صغيرة، مقايسة حماية ribonuclease، تحليل البقعة الشمالية، رسم خرائط الحمض النووي الريبي، وبناء مكتبة cDNA3،4.

RNA يصبح غير مستقر نوعا ما بعد أن يتم الاحتفاظ بها لفترة طويلة. شظايا مرنا طويلة أكثر من 10 كيلو بايت عرضة بشكل خاص للتدهور5،6. وبالتالي، يجب على الباحثين النظر في مختلف العوامل التي تؤثر على سلامة الحمض النووي الريبي المنقى. يجب حماية نقاء الحمض النووي الريبي ضد RNases والبروتينات والحمض النووي الجينومي والتلوث المثبط الأنزيمي. بالإضافة إلى ذلك، يجب أن تكون نسبة امتصاص أفضل ومقبولة من الحمض النووي الريبي إلى الأشعة فوق البنفسجية (260/280) ضمن نطاق 1.8-2.0 مع الحد الأدنى من التشظي على الكهرباء. وقد مكنت التقنيات المختبرية التي وضعت مؤخرا العلماء لتقييم سلامة عينة التحليل الجزيئي أكثر عمليا7،8.

ومن الصعب استخراج الحمض النووي الريبي غير التالفة من أنسجة البنكرياس من أنواع أخرى من الأنسجة بسبب كمية عالية من ريبونوكليس (RNases). ومع ذلك ، فإن طرق الاستخراج الحالية ، وهي القذف السريع للأنسجة البنكرياسية من تجويف البطن والتجانس في درجات حرارة منخفضة لإعاقة RNases ، أثبتت أنها غير فعالة7،8،9،10،11،12،13،14.

والغرض من هذه الدراسة التجريبية المقارنة هو تعديل ومقارنة الأساليب القائمة لتحديد أكثر الطرق كفاءة. وتحقيقا لتلك الغاية، تم تعديل بروتوكولات مختلفة لاستخراج الحمض النووي الريبي ومقارنتها. وكان الهدف منها على وجه التحديد هو تحديد الطريقة الأقل تكلفة التي تتطلب الحد الأدنى من أنسجة البنكرياس.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم الحصول على الموافقة الأخلاقية لهذه الدراسة من جامعة شيراز للعلوم الطبية (رقم الموافقة: 93-01-01-7178\03-07-2014).

ملاحظة: استخدام الذكور Sprague-Dawley الفئران وزنها 250 غرام. وضع القارورة التي تحتوي على شظية من أنسجة البنكرياس مغمورة في الحمض النووي الريبي استقرار الكاشف في خزان النيتروجين السائل في -80 درجة مئوية واستخدام محلول كاشف استخراج الحمض النووي الريبي للحفاظ على سلامة RNA.

1. إزالة أنسجة البنكرياس الفئران

  1. إعداد غرفة العمليات ووضع جميع المواد المطلوبة تحت غطاء محرك السيارة.
  2. تعقيم جميع الأدوات الجراحية (الملقط خلع الملابس، براون ادسون ملقط، مقص إيريس، ومقص ليتلر) في فرن لمدة 4 ح على الأقل في 240 درجة مئوية إلى تعطيل RNases15. تعقيم سطح مكان الجراحة مع 70٪ الكحول تحت غطاء محرك السيارة.
  3. حقن الكيتامين / xylazine intraperitoneally باستخدام حقنة الأنسولين [80/8 ملغ / كغ]. تحقق من عمق التخدير عن طريق قرص أصابع الجرذ لعدم وجود استجابة.
  4. إضافة 1 مل من مُكْشف تثبيت الحمض النووي الريبي في الأنابيب الدقيقة المناسبة (2 مل) لتثبيط تنشيط endonucleases في الأنسجة الختان.
  5. ضع الفأر على الفور على اللوحة الجراحية (رئيس بعيدا عن الجراح) لشق منتصف الخط.
  6. تعقيم كامل سطح البطن مع 70٪ من الكحول وإزالة شعر الفئران باستخدام مقص الشعر مع ريش #40.
  7. جعل شق على شكل V لفتح البطن من منطقة العانة إلى الساقين الأماميتين مع ملقط خلع الملابس، براون ادسون ملقط، مقص إيريس، ومقص ليتلر.
  8. اقلب أعضاء البطن إلى الجانب الأيسر لفضح البنكرياس. العثور بعناية على أنسجة البنكرياس, الذي ينتشر في تجويف البطن. حدد مكان المنطقة تحت الطحال للعثور على البنكرياس دون الخلط بينه وبين الأنسجة الدهنية.
  9. إزالة على الفور 20-30 ملغ من البنكرياس من تجويف البطن في أقل من 2 دقيقة. وضع الأنسجة التي تمت إزالتها في 2 مل microtube بسرعة وقطع عليه مع القاطع العقيمة لاختراق الأنسجة المنفصلة مع كاشف تثبيت الحمض النووي الريبي.
  10. وضع microtube في خزان النيتروجين لتجميد على الفور. الحفاظ على microtube في -80 درجة مئوية الفريزر لمدة 24 ساعة16.
  11. بعد 24 ساعة، نقل قطع صغيرة من أنسجة البنكرياس إلى حاوية الجليد.
  12. حقن كلوريد البوتاسيوم (KCl) intracardially للقتل الرحيم من الفئران بعد الجراحة.

2. RNA استخراج

  1. تعقيم السطح تحت غطاء محرك السيارة مع 70٪ الكحول.
  2. وضع 1 مل من مُكذِر استخراج الحمض النووي الريبي ، الذي يحتوي على thiocyanate guanidinium لمنع RNase ، في microtube العقيمة.
  3. نقل أنسجة البنكرياس المنفصلة إلى microtube. نقل microtube إلى النيتروجين السائل لتجميد على الفور.
  4. التجانس الأنسجة مع صوتنة مسبار تلميح صغير في 4 °C تعيين إلى مستوى 20 لمدة 60 ق على و 5 ق قبالة.
  5. احتضان كل عينة متجانسة لمدة 5 دقائق في 4 °C باستخدام الجليد المسحوق للسماح لمجمعات نووكلوبروتين أن تكون منفصلة تماما.
  6. إثراء العينات مع 0.2 مل من الكلوروفورم لكل 1 مل من مُكشف استخراج الحمض النووي الريبي. سقف الأنبوب بقوة ويهز بقوة لمدة 15 s.
  7. احتضان أنبوب لمدة 15 دقيقة على الجليد المسحوق (4 درجة مئوية) لفصل الكاشف في ثلاث مراحل.
  8. تشغيل جهاز الطرد المركزي في 12،000 س ز لمدة 15 دقيقة في +2 إلى +8 درجة مئوية. نقل مرحلة مائي عديم اللون إلى microtube جديدة.
  9. إضافة 0.5 مل من 100٪ isopropanol إلى المرحلة مائي. أغلق الأنبوب ثم عكسه 3 مرات على الأقل لخلط الحمض النووي الريبي بدقة.
  10. احتضان العينة لمدة 5-10 دقيقة على مربع الباردة (4 درجة مئوية) للسماح RNA هطول الأمطار.
  11. تشغيل جهاز الطرد المركزي في 12،000 س ز لمدة 15 دقيقة في +2 إلى +8 درجة مئوية. تجاهل المُندفع.
  12. إثراء كل من أنابيب الطرد المركزي مع 1 مل من 75٪ الإيثانول.
  13. غسل بيليه RNA عن طريق عكس الأنبوب 3 مرات على الأقل.
  14. تشغيل جهاز الطرد المركزي في 7500 س ز في +2 إلى +8 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تخلص من المابير لإزالة الإيثانول الزائد من بيليه الحمض النووي الريبي عن طريق تجفيف الهواء.
  15. إعادة تعليق بيليه RNA في diethylpyrocarbonate (DEPC) المعالجة RNase المياه الخالية من.
  16. تمرير الحل من خلال طرف ماصة عدة مرات إلى حل بيليه الجيش الملكي النيبالي. ثم، احتضان الحل لمدة 10-15 دقيقة في +65 درجة مئوية.

3. تقييم سلامة RNA مع التكفيرات التكهّن

  1. تحضير الجل تشغيل العازلة: 50 mM NaAc (DEPC المعالجة) و 0.5 M EDTA (pH 8.0) في DEPC المعالجة H2O.
  2. تحضير 5x الفورمالديهايد هلام تشغيل العازلة (MOPS تشغيل العازلة): 0.1 M MOPS (pH 7.0)، 40 mM NaAc، 5 mM EDTA (pH 8.0).
    1. حل 20.6 غرام من MOPS في 800 مل من DEPC معالجة 50 mM خلات الصوديوم. ضبط درجة اله إلى 7.0 مع 2 N NaOH. إضافة 10 مل من DEPC المعالجة 0.5 M EDTA (pH 8.0). ضبط حجم المحلول إلى 1 لتر مع المياه المعالجة DEPC.
    2. تصفية الحل من خلال مرشح 0.2 μm والحفاظ عليه في درجة حرارة الغرفة بعيدا عن الضوء من أجل التعقيم. يصبح المخزن المؤقت أصفر مع الوقت إذا كان يتعرض للضوء أو يتم وضعها تلقائيًا. A القش الملونة العازلة يعمل بشكل جيد، ولكن أغمق منها لا17.
  3. إعداد 1.5٪ agarose هلام18. 50 مل، إضافة 0.75 غرام من agarose و 31 مل من H2O. الميكروويف الحل في الميكروويف لمدة 1 دقيقة. إضافة 9 مل من الفورمالديهايد و 10 مل من 5x 5X مخزن التشغيل.
  4. إعداد العينات للجل. اخلطي ما يلي في أنبوب ميكروفوج معقم:
    X μL RNA (حتى 30 ميكروغرام)
    2 ميكرولتر من 5x هلام تحميل العازلة
    10 ميكرولتر من الفورماميد
    4 ميكرولتر من مخزن التشغيل من MOPS
    1 ميكرولتر من 0.1 ملغم / مل EtBr
    3 ميكرولتر من الفورمالديهايد 5- x ميكرولتر من DEPC-H2O
  5. احتضان العينات في 65 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة وتبريدها على الجليد. جهاز طرد مركزي لمدة 5 s حتى يتم إيداع كل السوائل.
  6. تشغيل ما قبل هلام في 5 V/ سم لمدة 5 دقائق.
  7. تحميل العينات في الممرات من هلام على الفور ومن ثم غمر هلام في 1x الفورمالديهايد هلام تشغيل العازلة. تشغيل في 3-4 V/cm19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تقييم سلامة الجيش الملكي النيبالي في مُكشف استخراج الحمض النووي الريبي وفقا لبروتوكول روتيني وتعديلي جراحية دون كاشف تثبيت الحمض النووي الريبي
لوحظت عصابات غير مقبولة بعد استخراج الحمض النووي الريبي مع كاشف استخراج الحمض النووي الريبي من بروتوكول جراحية روتينية. لين 1 يظهر الجيش الملكي النيبالي من الكبد كتحكم. يُظهر لين 2 الحالة المتدهورة لعصابات 28S/18S rRNA في إجمالي الحمض النووي الريبي التي تم الحصول عليها من بروتوكول جراحي روتيني. عندما تم تخفيض كمية من أنسجة البنكرياس إلى 50 ملغ (حارة 3) أو 20-30 ملغ (حارة 4) وأجريت الجراحة على الفور (تعديل البروتوكول) دون كاشف تثبيت الحمض النووي الريبي، وكان الفصل الحمض النووي الريبي أقل نجاحا مما كانت عليه في السيطرة على أنسجة الكبد وعصابات غير محددة لوحظ.

تقييم سلامة عينات الحمض النووي الريبي وفقا لبروتوكول جراحية معدلة مغمورة في كاشف تثبيت الحمض النووي الريبي
تعتمد سلامة الحمض النووي الريبي المُنتجة مع كاشف استخراج الحمض النووي الريبي على وقت الحفظ ودرجة الحرارة (الممر 5-8). بالمقارنة مع أنسجة الكبد التحكم, لم يكن الفصل الحمض النووي الريبي ناجحة عندما كانت كمية أنسجة البنكرياس 50 ملغ (حارة 5) أو 20-30 ملغ (حارة 6). تم استخراج الحمض النووي الريبي مباشرة بعد أن كان مغمورا في الأنسجة في كاشف تثبيت الحمض النووي الريبي. لم يلاحظ أي نطاق محدد عندما 20-30 ملغ من الأنسجة كانت مغمورة في RNA الكاشف تثبيت في -80 درجة مئوية ل 48 ساعة و RNA تم استخراجها على أساس البروتوكول. وفقا لنتائج الكهرباء، كان الحمض النووي الريبي متدهورة تماما (حارة 7). كما هو مبين في حارة 8, وقد لوحظت عصابات مقبولة (28S/18S rRNA) بعد غمر 20-30 ملغ من أنسجة البنكرياس في مُكشف تثبيت RNA في -80 درجة مئوية ل 24 ساعة, ومن ثم تم استخراج RNA.

Figure 1
الشكل 1: تقييم سلامة الحمض النووي الريبي المعزول من أنسجة البنكرياس الفئران باستخدام كاشف استخراج الحمض النووي الريبي وفقا للبروتوكولات تحت التحقيق. يصور لين 1 سلامة الجيش الملكي النيبالي التي تم الحصول عليها من الكبد كتحكم. يمثل لين 2 حالة 28S/18S rRNA العصابات في مجموع الجيش الملكي النيبالي التي تم الحصول عليها من بروتوكول جراحية روتينية. يمثل لين 3 حالة 28S/18S rRNA العصابات في مجموع RNA التي تم الحصول عليها من بروتوكول جراحية معدلة و 50 ملغ من الأنسجة. يمثل لين 4 حالة 28S/18S rRNA العصابات في مجموع RNA تم الحصول عليها من بروتوكول جراحية معدلة و 20-30 ملغ من الأنسجة. لين 5 يمثل حالة 28S/18S عصابات RRNA في مجموع الحمض النووي الري تم الحصول عليها من بروتوكول جراحية معدلة و 50 ملغ من الأنسجة المستخرجة مباشرة بعد أن مغمورة في كاشف تثبيت الحمض النووي الريبي. لين 6 يظهر سلامة الجيش الملكي النيبالي التي تم الحصول عليها من 20-30 ملغ من أنسجة البنكرياس من بروتوكول جراحية معدلة استخراج مباشرة بعد أن مغمورة في كاشف تثبيت الحمض النووي الريبي. يصور لين 7 سلامة الحمض النووي الريبي التي تم الحصول عليها من 20-30 ملغ من الأنسجة من بروتوكول جراحية معدلة بعد 48 ساعة من الغمر في مُكشف تثبيت الحمض النووي الريبي عند -80 درجة مئوية. لين 8 يصور سلامة الجيش الملكي النيبالي التي تم الحصول عليها من 20-30 ملغ من الأنسجة من بروتوكول جراحية معدلة بعد 24 ح من الغمر في مُكشف تثبيت RNA في -80 درجة مئوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في البيولوجيا الجزيئية من المهم الحصول على RNA عالية الجودة. وجود الإنزيمات ريبونوكليز في الخلايا والأنسجة سرعان ما يتحلل الجيش الملكي النيبالي ويجعل عملية الاستخراج معقدة. RNases هي الإنزيمات مستقرة تعمل دون أي عوامل. كميات صغيرة من RNase كافية لتدمير الجيش الملكي النيبالي. عندما تتم إزالة أنسجة البنكرياس الفئران من تجويف البطن، فمن الضروري لتطهير الأدوات الجراحية عن طريق المنظفات القوية، وشطفها جيدا ووضعها في فرن لمدة 4 ساعات على الأقل في 240 درجة مئوية لوقف RNases قبل الجراحة. وبالنظر إلى حقيقة أن مستوى RNase مرتفع للغاية في البنكرياس ، يتم تعقيم مكان الجراحة مع NaOH والتبييض الخفيف لتعطيل RNases. بينما يتم إزالة أنسجة البنكرياس أثناء التشريح، فإن الحمض النووي الريبي يتحلل. لزيادة الكفاءة ، من الضروري أن يتم الانتهاء من تشريح في أسرع وقت ممكن20،21،22،23،24.

البنكرياس هو نسيج حاسم لآليات الجسم المثلية. وبالتالي، تحسين إجراءات استخراج الحمض النووي الريبي يساعد الباحثين على فهم أفضل للمسارات النشطة. واقترح هذا البروتوكول نموذجا لطريقة فعالة وبسيطة، والأمثل لاستخراج الحمض النووي الريبي من البنكرياس. تم تقييم أساليب استخراج الحمض النووي الريبي الشائعة المختلفة من أنسجة البنكرياس. وتركزت على تأثير التخزين المجمدة واستراتيجيات تثبيط RNase التي تؤثر على جودة الحمض النووي الريبي. أهم عاملين يؤثران على سلامة الحمض النووي الريبي هما مدة الجراحة وكمية أنسجة البنكرياس التي تم جمعها. وقد كشفت الدراسات الحديثة أن هناك علاقة إيجابية بين تدهور الحمض النووي الريبي وكمية من أنسجة البنكرياس8,13,20.

في هذا البروتوكول، تم الحصول على 20-30 ملغ من أنسجة البنكرياس في أقل من 2 دقيقة من الفئران المُجَذَّنَة. قد تؤدي الخطوات الجراحية الطويلة إلى تنشيط المُزالات الداخلية في البنكرياس وتُحط من الحمض النووي الريبي بسرعة. في هذه الدراسة، تم عزل الحمض النووي الريبي من عينات مختلفة مع thiocyanate غواندينيوم، وتستخدم تقنيات استخراج الفينول الكلوروفورم النيتروجين السائل لعرقلة نشاط الحمض النووي الريبي. حققت الطريقة ثلاثة أهداف: تغلغل سريع من مُكْشف تثبيت الحمض النووي الريبي في أنسجة البنكرياس، حماية الحمض النووي الريبي الخلوي، وزيادة وقت الحفظ. وكانت النتائج الأمثل عندما تم الاحتفاظ العينات التي تحتوي على كاشف تثبيت RNA في -80 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.

ومع ذلك، زادت سلامة RNA بشكل كبير عندما تم إدخال كاشف تثبيت الحمض النووي الريبي. وعلاوة على ذلك، كانت هذه العملية قابلة للاستنساخ. تم تشريح قسم صغير من البنكرياس (20-30 ملغ) أثناء الجراحة من الفئران المُضَنَّعة وغمرها في 1 مل من كاشف تثبيت الحمض النووي الريبي في -80 درجة مئوية لمدة 1-2 أيام. كما رأينا في حارة 8، كان التخزين ل 24 ساعة الوقت الأمثل.

الطرق المذكورة أعلاه سمحت كمية أصغر من كاشف تثبيت الحمض النووي الريبي لاختراق الجهاز. وعلاوة على ذلك، توقفت عملية التحلل بعد وقت قصير من التجارب لأن حجم القطع التي تم تشريحها كان صغيراً. في هذا البروتوكول، والخطوة الحيوية هي قطع الأنسجة مغمورة في كاشف تثبيت الحمض النووي الريبي إلى قطع صغيرة جدا في أقرب وقت ممكن حتى تخترق الخلايا ويقمع تفعيل RNase. في خطوة التجانس، فمن الأهمية بمكان لمنع إنتاج فقاعة في مُكشف استخراج الحمض النووي الريبي وأداء جميع الخطوات في 4 درجة مئوية. من المهم فصل المرحلة المائية (المرحلة التي تحتوي على الحمض النووي الريبي) بعناية فائقة لتجنب تلوث الحمض النووي. على الرغم من أن الانحلال الذاتي ووجود RNases الذاتية تسوية عزل الحمض النووي الريبي سليمة من البنكرياس الفئران, تم الحفاظ على سلامة RNA في طريقة ضخ البنكرياس المقترحة. وبالتالي، فإن الطريقة المقترحة هي إجراء مباشر، قابل للتكرار، وغير مكلف يتطلب كميات أقل من كاشف تثبيت الحمض النووي الريبي من الطرق الأخرى الموجودة.

مثل أي دراسة، هذا البروتوكول له بعض القيود. أولا, سلامة وغلة الحصول على RNA أقل من استخدام أنسجة البنكرياس بأكملها كما يستخدم فقط 20-30 ملغ من الأنسجة. ثانياً، لا يمكن أخذ عدد كبير من العينات في يوم واحد لأن استخراج الحمض النووي الريبي وكذلك اختبارات التوليف cDNA يجب أن يتم بسرعة وعلى التوالي لتقليل تحلل الحمض النووي الريبي. ثالثا، لتنفيذ مشاريع البحوث مع مجموعات الفئران المختلفة، فمن الضروري أن تأخذ بالضبط 20-30 ملغ من الأنسجة من نفس المنطقة الجراحية لتقليل الاختلاف من البيانات لأن أنسجة البنكرياس الفئران ينتشر تماما في تجويف البريتوني.

في الختام، باستخدام محلول كاشف استخراج الحمض النووي الريبي بعد RNA استفحل الاستقرار في الوريضة هو بديل جيد لأطقم استخراج الحمض النووي الريبي مكلفة والعمود القائم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

لم يُعلن أي منها.

Acknowledgments

وقد حظيت هذه الدراسة بدعم مالي من جامعة شيراز للعلوم الطبية (منحة رقم 93-01-01-7178\03-07-2014). نشكر السيد زوموروديان والسيد رستمي في قسم التعليم الإلكتروني في العلوم الطبية، والمدرسة الافتراضية ومركز التميز في التعليم الإلكتروني، جامعة شيراز للعلوم الطبية لتحرير الفيديو.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Merck 116801 Germany
Atoclave Teb Zaim Iran
Centrifuge Sigma Germany
Chloroform Merck 107024 Germany
Diethylpyrocarbonate (DEPC)-treated water Sigma Germany
EDTA sigma 60-00-4 Germany
Electrophoresis tank Payapajoohesh Iran
Eppendorf microTube Extragene Taiwan
EtBr sigma E 8751 Germany
Ethanol Merck 81870 Germany
Falcon Tube Extragene Taiwan
Formaldehyde Merck 344198 Germany
Formamide Merck 344206 Germany
Homogenizer-sunicator Microson XL 2000 USA
Isopropanol sigma 19516 Germany
Ketamine hydrochloride sigma 1867-66-9 Germany
Laminar Flow Hood Jal Tajhiz Iran
Mgnetic stirrer Labrotechnik USA
Microcentrifuge Eppendorf Germany
Micropipette Tips Extragene Taiwan
MOPS sigma 85022106 Germany
Na AC Merck 567422 Germany
NaOH Merck 109137 Germany
Oven Teb Zaim Iran
PH meter Knick Germany
RNA Later/RNA stabilization reagent Qiagen 76104 USA
Surgical instrument Agn Thos German made
Syringes AvaPezeshk Iran
TriPure reagent/RNA extraction reagent Roche 11667157001 USA
Vortex Labinco Netherland
Water bath Memmert Germany
zylazine sigma 7361-61-7 Germany

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McCarthy, B., Hoyer, B. Identity of DNA and diversity of messenger RNA molecules in normal mouse tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences. 52 (4), 915-922 (1964).
  2. Tan, S. C., Yiap, B. C. DNA, RNA, and protein extraction: the past and the present. BioMed Research International. 2009, (2009).
  3. Peirson, S. N., Butler, J. N. RNA extraction from mammalian tissues. Circadian Rhythms: Methods and Protocols. , 315-327 (2007).
  4. Skidmore, A. F., Beebee, T. J. Characterization and use of the potent ribonuclease inhibitor aurintricarboxylic acid for the isolation of RNA from animal tissues. Biochemical Journal. 263 (1), 73-80 (1989).
  5. Mukhopadhyay, T., Roth, J. A. Isolation of total RNA from tissues or cell lines: visualization in gel. RNA Isolation and Characterization Protocols. , 55-59 (1998).
  6. Raeymaekers, L. Quantitative PCR: theoretical considerations with practical implications. Analytical Biochemistry. 214 (2), 582-585 (1993).
  7. Sparmann, G., Jäschke, A., Loehr, M., Liebe, S., Emmrich, J. Tissue homogenization as a key step in extracting RNA from human and rat pancreatic tissue. Biotechniques. 22 (3), 408 (1997).
  8. Kiba, T., et al. High-quality RNA extraction from rat pancreas for microarray analysis. Pancreas. 35 (1), 98-100 (2007).
  9. Gill, S. S., Aubin, R. A., Bura, C. A., Curran, I. H., Matula, T. I. Ensuring recovery of intact RNA from rat pancreas. Molecular Biotechnology. 6 (3), 359-362 (1996).
  10. Hernandez, G. E., Mondala, T. S., Head, S. R. Assessing a novel room temperature RNA storage medium for compatibility in microarray gene expression analysis. Biotechniques. 47 (2), 667 (2009).
  11. Mullin, A. E., Soukatcheva, G., Verchere, C. B., Chantler, J. K. Application of in situ ductal perfusion to facilitate isolation of high-quality RNA from mouse pancreas. Biotechniques. 40 (5), 617 (2006).
  12. Li, D., et al. A modified method using TRIzol reagent and liquid nitrogen produces high-quality RNA from rat pancreas. Applied Biochemistry and Biotechnology. 158 (2), 253-261 (2009).
  13. Griffin, M., Abu-El-Haija, M., Abu-El-Haija, M., Rokhlina, T., Uc, A. A simplified and versatile method for obtaining high quality rna from pancreas. Biotechniques. 52 (5), 332 (2012).
  14. Jun, E., et al. Method optimization for extracting high-quality RNA from the human pancreas tissue. Translation Oncology. 11 (3), 800-807 (2018).
  15. Green, M. R., Sambrook, J. J. How to win the battle with RNase. Cold Spring Harbor Protocols. (2), 101857 (2019).
  16. Li, D. -S., Yuan, Y. -H., Tu, H. -J., Dai, L. -j A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nature Protocols. 4 (11), 1649 (2009).
  17. Armstrong, J. A., Schulz, J. R. J. Agarose gel electrophoresis. Current Protocol: Essential Laboratory Techniques. (1), 1-20 (2008).
  18. Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. Bleach gel: a simple agarose gel for analyzing RNA quality. Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).
  19. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold spring harbor laboratory press. , (1989).
  20. Potenza, N., et al. Hybridase activity of human ribonuclease-1 revealed by a real-time fluorometric assay. Nucleic Acids Research. 34 (10), 2906-2913 (2006).
  21. Jackson, D., Lewis, F., Taylor, G., Boylston, A., Quirke, P. Tissue extraction of DNA and RNA and analysis by the polymerase chain reaction. Journal of Clinical Pathology. 43 (6), 499-504 (1990).
  22. Quesada, I., Tudurí, E., Ripoll, C., Nadal, Á Physiology of the pancreatic α-cell and glucagon secretion: role in glucose homeostasis and diabetes. Journal of Endocrinology. 199 (1), 5-19 (2008).
  23. Quertinmont, E., Nicaise, C., Gustot, T., Deviere, J. Tissue Homogenization with the MagNA Lyser Instrument for Total RNA Extraction Using the TriPure Reagent. Liver (mg). 100 (100), 100 (2004).
  24. Dastgheib, S., Irajie, C., Assaei, R., Koohpeima, F., Mokarram, P. Optimization of RNA extraction from rat pancreatic tissue. Iranian Journal of Medical Sciences. 39 (3), 282 (2014).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 163، النقاء، استخراج، الجيش الملكي النيبالي، البنكرياس، الانحلال الذاتي، فعالة من حيث التكلفة
استخراج RNA سريع وفعال من حيث التكلفة من أنسجة البنكرياس الجرذ
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dastghaib, S., Shahsavar, Z.,… More

Dastghaib, S., Shahsavar, Z., Karimian, Z., Mokarram, P. Rapid and Cost-Effective RNA Extraction of Rat Pancreatic Tissue. J. Vis. Exp. (163), e61255, doi:10.3791/61255 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter