Summary
Renheden og integriteten af det isolerede RNA er et afgørende skridt i RNA-afhængige analyser. Her præsenterer vi en praktisk, hurtig og billig metode til at udtrække RNA fra en lille mængde ubeskadiget pancreas væv.
Abstract
Uanset ekstraktionsmetoden udføres optimeret RNA-ekstraktion af væv og cellelinjer i fire faser: 1) homogenisering, 2) effektiv denaturering af proteiner fra RNA, 3) ribonuclease inaktivering og 4) fjernelse af forurening fra DNA, proteiner og kulhydrater. Men det er meget besværligt at opretholde integriteten af RNA, når der er høje niveauer af RNase i vævet. Spontan autolyse gør det meget vanskeligt at udtrække RNA fra pancreas væv uden at beskadige det. Således, en praktisk RNA ekstraktion metode er nødvendig for at opretholde integriteten af pancreas væv under ekstraktionsprocessen. En eksperimentel og sammenlignende undersøgelse af eksisterende protokoller blev udført ved at opnå 20-30 mg rotte pancreas væv i mindre end 2 minutter og udvinde RNA. Resultaterne blev vurderet ved elektroforese. Forsøgene blev udført tre gange med hensyn til generalisering af resultaterne. Nedsænkning pancreas væv i RNA stabilisering reagens ved -80 °C i 24 h gav høj integritet RNA, når RNA ekstraktion reagens blev brugt som reagens. De opnåede resultater var sammenlignelige med resultaterne fra kommercielle kits med spin kolonne bindinger.
Introduction
Strukturelle gendata kan transskriberes til et funktionelt produkt gennem genekspression. RNA-analyse bruges til at opdage forskelle i genekspression på tværs af forskellige forhold. Der findes en række metoder til ekstraktion af nukleinsyrer som følger: guanidinium thiocyanat, ekstraktion via phenol-chloroform, cellulosebaseret kromatografi, ekstraktion af silicamatrater og anionudveksling1,2.
Korrekt påvisning af genekspression påvirkes af RNA's integritet isoleret fra væv; Derfor er det vigtigt at evaluere integriteten af RNA isoleret fra væv, før yderligere test udføres, fordi supplerende molekylære test på lav kvalitet RNA kan bringe diagnostiske applikationsresultater. Således høj integritet RNA er nødvendig for molekylære biologiske tests med forskellige diagnostiske anvendelser: kvantitative RT-PCR, mikro-arrays, ribonuclease beskyttelse assay, nordlige blot analyse, RNA kortlægning, og cDNA bibliotek konstruktion3,4.
RNA bliver temmelig ustabil efter at være blevet holdt i lang tid. Lange mRNA-fragmenter over 10 kb er særligt modtagelige fornedbrydning 5,6. Således, forskere skal overveje forskellige faktorer, der påvirker integriteten af renset RNA. Renheden af RNA skal beskyttes mod RNases, proteiner, genomisk DNA og enzymatisk inhibitorforurening. Desuden skal det bedste og acceptable absorptionsforhold RNA til UV (260/280) være inden for intervallet 1,8-2,0 med minimal fragmentering over elektroforese. Nyligt udviklede laboratorieteknikker har gjort det muligt for forskerne at vurdere integriteten af den molekylære analyseprøve merepraktisk 7,8.
Det er meget vanskeligere at udtrække ubeskadiget RNA fra pancreas væv end andre typer af væv på grund af den høje mængde af ribonukleaser (RNases). Men, eksisterende ekstraktionsmetoder, nemlig den hurtige udslyngning af bugspytkirtlen væv fra bughulen og homogenisering ved lave temperaturer for at hindre RNases, har vist sigineffektiv 7,8,,9,,10,11,12,13,14.
Formålet med denne sammenlignende forsøgsundersøgelse er at ændre og sammenligne eksisterende metoder til bestemmelse af de mest effektive metoder. Med henblik herpå blev forskellige protokoller for RNA-ekstraktion ændret og sammenlignet. Det var specifikt rettet mod bestemmelse af den billigste metode, der kræver et minimum af pancreas væv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etisk godkendelse af denne undersøgelse blev indhentet fra Shiraz University of Medical Sciences (Godkendelsesnummer: 93-01-01-7178\03-07-2014). approval
BEMÆRK: Brug mandlige Sprague-Dawley rotter vejer 250 g. Hætteglassen, der indeholder en splint af pancreas væv nedsænket i RNA stabilisere reagens i en flydende nitrogentank ved -80 °C og bruge RNA ekstraktion reagens opløsning til at opretholde integriteten af RNA.
1. Fjernelse af rotte pancreas væv
- Gør operationsstuen klar og læg alle nødvendige materialer under kølerhjelmen.
- Steriliser alle de kirurgiske instrumenter (Dressing scer, Brown-Adson scer, Iris saks, og Littler saks) i en ovn i mindst 4 timer ved 240 °C for at inaktivere RNases15. Steriliser overfladen af operationen sted med 70% alkohol under kølerhjelmen.
- Injicer ketamin/xylazin intraperitoneally med en insulinsprøjte [80/8 mg/kg]. Kontroller dybden af anæstesi ved at klemme rottens tæer for manglende respons.
- Der tilsættes 1 ml RNA-stabiliseringsgense i den korrekte mikrorør (2 ml) for at hæmme aktiveringen af endonucleaser i fjernet væv.
- Straks placere rotten på det kirurgiske bord (hovedet væk fra kirurgen) for en mid-line snit.
- Steriliser hele bughulen med 70% alkohol og fjern rottehår ved hjælp af en hårklipper med #40 knive.
- Lav en V-form snit til at åbne maven fra skambenet til forbenene med Dressing kraftang, Brown-Adson scelinnter, Iris saks, og Littler saks.
- Flip abdominale organer til venstre side for at udsætte bugspytkirtlen. Omhyggeligt finde bugspytkirtlen væv, som breder sig i bughulen. Find området under milten for at finde bugspytkirtlen uden at blive forvekslet med fedtvævet.
- Fjern straks 20-30 mg bugspytkirtel fra bughulen på mindre end 2 min. Læg det fjernede væv i 2 ml mikrorør hurtigt og skær det med en steril fræser for at trænge ind i det adskilte væv med RNA-stabiliseringsgenser.
- Anstøn dig for at få mikrorøret i en nitrogentank til at fryse med det samme. Mikrorøret opbevares i en -80 °C fryser i 24 timer16.
- Efter 24 timer, overføre de små stykker af pancreas væv til en is beholder.
- Injicer kaliumchlorid (KCl) intrakardiisk for dødshjælp af rotter efter operationen.
2. RNA-udvinding
- Steriliser overfladen under kølerhjelmen med 70% alkohol.
- Sæt 1 ml af RNA ekstraktion reagens, som indeholder guanidinium thiocyanat at hæmme RNase, i den sterile mikrotube.
- Overfør det separerede bugspytkirtelvæv til mikrorøret. Overfør mikrorøret til det flydende kvælstof for at fryse med det samme.
- Homogeniser vævet med mikrospidssonden sonikator ved 4 °C sat til niveau 20 for 60 s på og 5 s off.
- Hver homogeniseret prøve inkuberes i 5 min ved 4 °C ved hjælp af knust is, så nukleoproteinkomplekserne kan adskilles fuldstændigt.
- Proeverne beriges med 0,2 ml chloroform for hvert 1 ml RNA-ekstraktionsreagens. Hætten fast og ryst det kraftigt i 15 s.
- Rør i 15 minutter inkuberes på den knuste is (4 °C) for at adskille reagenset i tre faser.
- Centrifugen køres ved 12.000 x g i 15 min. ved +2 til +8 °C. Overfør den farveløse vandige fase til en ny mikrorør.
- Der tilsættes 0,5 ml 100% isopropanol til den vandige fase. Luk røret og vend det derefter mindst 3 gange for at blande RNA grundigt.
- Prøven inkuberes i 5-10 min. på en kølekasse (4 °C) for at tillade RNA-udfældning.
- Centrifugen køres ved 12.000 x g i 15 min. ved +2 til +8 °C. Kassér supernatanten.
- Berig hver af centrifugerørene med 1 ml ethanol på 75%.
- RNA-pelletet vaskes ved at vende røret mindst 3 gange.
- Centrifugen køres ved 7.500 x g ved +2 til +8 °C i 5 min. Kassér supernatanten for at fjerne den overskydende ethanol fra RNA-pellets ved lufttørring.
- RNA-pelletet skal suspenderes igen i diethylpyrocarbonat (DEPC)-behandlet RNase-frit vand.
- Opløsningen overføres flere gange gennem en pipettespids for at opløse RNA-pelletsen. Derefter inkuberes opløsningen i 10-15 min. ved +65 °C.
3. Evaluering af RNA-integritet med denatureringsellektroforese
- Forbered gelløbsbuffer: 50 mM NaAc (DEPC behandlet) og 0,5 M EDTA (pH 8.0) i DEPC-behandlet H2O.
- Forbered 5x formaldehyd gel-løbebuffer (MOPS løbebuffer): 0,1 M MOPS (pH 7,0), 40 mM NaAc, 5 mM EDTA (pH 8.0).
- 20,6 g MOPS opløses i 800 ml DEPC behandlet 50 mM natriumacetat. PH-værdien justeres til 7,0 med 2 N NaOH. Der tilsættes 10 ml DEPC-behandlet 0,5 M EDTA (pH 8.0). Opløsningens volumen justeres til 1 L med DEPC-behandlet vand.
- Opløsningen filtreres gennem et 0,2 μm filter, og den opbevares ved stuetemperatur væk fra lys af steriliseringens skyld. Bufferen bliver gul med tiden, hvis den udsættes for lys eller er autoklaveret. En halm-farvet buffer fungerer godt, men mørkere dem ikke17.
- Forbered en 1,5% agarose gel18. For 50 ml tilsættes 0,75 g agarose og 31 ml H2O. Mikrobølgeovn opløsningen i mikrobølgeovnen i 1 min. Tilsæt 9 ml formaldehyd og 10 ml 5x MOPS løbebuffer.
- Forbered prøverne til gelen. Bland følgende i et sterilt mikrofugerør:
X μL RNA (op til 30 μg)
2 μL 5x gel-loading buffer
10 μL formamid
4 μL MOPS løbebuffer
1 μL af 0,1 mg/ml etbr
3 μL formaldehyd 5-x μL DEPC-H2O - Prøverne inkuberes ved 65 °C i 15 minutter og afkøles på is. Centrifuge for 5 s indtil al væsken er deponeret.
- For-kør gelen ved 5 V/cm i 5 minutter.
- Læg prøverne i gelens baner med det samme, og nedsænk derefter gelen i 1x formaldehydgel-løbebuffer. Kør ved 3-4 V/cm19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vurdering af RNA's integritet i RNA-ekstraktionsgenren i henhold til en rutinemæssig og modificeret kirurgisk protokol uden RNA-stabiliseringsgense
Der blev observeret uacceptable bånd efter ekstraktion af RNA med RNA-ekstraktionsreagesen fra en rutinemæssig kirurgisk protokol. Vognbane 1 viser RNA fra leveren som en kontrol. Vognbane 2 viser den forringede status for 28S/18S rRNA-bånd i total RNA fra en rutinemæssig kirurgisk protokol. Når mængden af pancreas væv blev reduceret til 50 mg (lane 3) eller 20-30 mg (lane 4), og operationen blev udført straks (modificeret protokol) uden RNA stabilisering reagens, RNA adskillelse var mindre vellykket end i levervæv kontrol og uspecifik bånd blev observeret.
Vurdering af RNA-prøvers integritet i henhold til en modificeret kirurgisk protokol nedsænket i RNA-stabiliseringsgense
Integriteten af RNA'er, der produceres med RNA-ekstraktionsreagesage, afhænger af konserveringstiden og -temperaturen (vognbane 5-8). I sammenligning med kontrollevervæv, RNA adskillelse var ikke vellykket, når mængden af pancreas væv var 50 mg (lane 5) eller 20-30 mg (lane 6). RNA blev udvundet umiddelbart efter, at vævet blev nedsænket i reagensen af RNA-stabilisering. Der blev ikke observeret noget specifikt bånd, når 20-30 mg væv blev nedsænket i RNA-stabiliseringsgenser ved -80 °C i 48 timer, og RNA blev udvundet baseret på protokollen. Ifølge elektroforeseresultaterne blev RNA fuldstændig nedbrudt (vognbane 7). Som afbildet i vognbane 8 blev acceptable bånd (28S/18S rRNA) observeret efter nedsænkning 20-30 mg pancreas væv i RNA stabilisering reagens ved -80 °C i 24 timer, og derefter RNA blev udvundet.
Figur 1: Vurdering af integriteten af RNA isoleret fra rotte pancreas væv ved hjælp af RNA ekstraktion reagens i henhold til de protokoller, der er omfattet af undersøgelsen. Lane 1 viser integriteten af RNA opnået fra leveren som en kontrol. Bane 2 repræsenterer status for 28S/18S rRNA-bånd i alt RNA fra en rutinemæssig kirurgisk protokol. Bane 3 repræsenterer status for 28S/18S rRNA-bånd i alt RNA fremstillet af en modificeret kirurgisk protokol og 50 mg væv. Bane 4 repræsenterer status for 28S/18S rRNA-bånd i alt RNA fremstillet af en modificeret kirurgisk protokol og 20-30 mg væv. Vognbane 5 repræsenterer status for 28S/18S rRNA-bånd i alt RNA fra en modificeret kirurgisk protokol og 50 mg væv, der udvindes umiddelbart efter at være blevet nedsænket i RNA-stabiliseringsgenaget. Lane 6 viser integriteten af RNA opnået fra 20-30 mg pancreas væv fra en modificeret kirurgisk protokol ekstraheret umiddelbart efter at være blevet nedsænket i RNA stabilisering reagens. Vognbane 7 viser integriteten af RNA opnået fra 20-30 mg væv fra en modificeret kirurgisk protokol efter 48 timers nedsænkning i et RNA-stabiliseringsgenser ved -80 °C. Vognbane 8 viser integriteten af RNA opnået fra 20-30 mg væv fra en modificeret kirurgisk protokol efter 24 timers nedsænkning i et RNA-stabiliseringsgenser ved -80 °C. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I molekylærbiologi er det vigtigt at opnå RNA af høj kvalitet. Tilstedeværelsen af ribonucleaseenzymer i celler og væv nedbryder hurtigt RNA og gør ekstraktionskomplekset. RNases er stabile enzymer, der fungerer uden co-faktorer. Små mængder RNase er tilstrækkelige til at ødelægge RNA. Når rotte pancreas væv fjernes fra bughulen, er det nødvendigt at desinficere de kirurgiske instrumenter ved stærke rengøringsmidler, skylle dem grundigt og læg dem i en ovn i mindst 4 timer ved 240 °C for at inaktivere RNases før operationen. I betragtning af, at RNase niveau er ekstremt højt i bugspytkirtlen, er det sted, kirurgi steriliseret med NaOH og mild blegemiddel til at deaktivere RNases. Mens pancreas væv bliver fjernet under dissektion, RNA ville nedbrydes. For at øge effektiviteten er det nødvendigt , at dissektionen gennemføres så hurtigt sommuligt 20,21,22,23,24.
Bugspytkirtlen er et kritisk væv til kroppens homøostatiske mekanismer. Derfor, forbedret pancreas RNA ekstraktion procedurer hjælpe forskere bedre at forstå aktive veje. Den nuværende protokol foreslog en model for en effektiv, enkel og optimeret metode til RNA-ekstraktion fra bugspytkirtlen. Forskellige almindelige RNA ekstraktionsmetoder fra pancreas væv blev evalueret. Det var koncentreret om effekten af frosne opbevaring og RNase hæmning strategier påvirker RNA kvalitet. De to vigtigste faktorer, der påvirker integriteten af RNA er kirurgi varighed og mængden af indsamlede pancreas væv. Nylige undersøgelser har vist, at der er en positiv sammenhæng mellem RNA nedbrydning og mængden af pancreas væv8,13,,20.
I denne protokol, 20-30 mg pancreas væv blev opnået i mindre end 2 min fra bedøvet rotter. Langvarige kirurgiske trin kan føre til aktivering af endogene endonucleaser i bugspytkirtlen og nedbryde RNA hurtigt. I denne undersøgelse blev RNA isoleret fra forskellige prøver med guanidinium thiocyanat, og phenol-chloroform ekstraktionsteknikker brugte flydende nitrogen til at hæmme RNA-aktiviteten. Metoden opnåede tre mål: hurtig gennemtrængning af RNA stabilisering reagens i pancreas væv, beskyttelse af cellulære RNA, og øget konservering tid. Resultaterne var optimale, når prøverne med RNA-stabiliseringsgensegens blev opbevaret ved -80 °C i 24 timer.
RNA-integriteten steg dog betydeligt, da RNA-stabiliseringsgenser blev introduceret. Desuden var denne proces reproducerbar. En lille del af bugspytkirtlen (20-30 mg) blev dissekeret under operation fra bedøvede rotter og nedsænket i 1 ml RNA stabilisering reagens ved -80 ° C i 1-2 dage. Som det ses i vognbane 8, opbevaring i 24 timer var den optimale tid.
De førnævnte metoder gjorde det muligt for en mindre mængde RNA-stabiliseringsgenser trænge ind i orglet. Desuden ophørte nedbrydningsprocessen kort efter forsøgene, fordi størrelsen af de dissekerede stykker var lille. I denne protokol, det afgørende skridt er at skære nedsænket væv i RNA stabilisering reagens til meget små stykker så hurtigt som muligt, indtil det trænger ind i cellerne og undertrykker aktivering af RNase. I homogeniseringstrinnet er det meget vigtigt at forhindre bobleproduktion i RNA-ekstraktionsgense og udføre alle trin ved 4 °C. Det er afgørende at adskille aqua fase (den fase, der indeholder RNA) meget omhyggeligt for at undgå DNA-kontaminering. Selv om autolyse og tilstedeværelsen af endogene RNases kompromittere intakt RNA isolering fra rotte bugspytkirtlen, integriteten af RNA blev opretholdt i den foreslåede bugspytkirtel perfusion metode. Således er den foreslåede metode en enkel, reproducerbar og billig procedure, der kræver mindre mængder RNA stabilisering reagens end de andre eksisterende metoder.
Som enhver undersøgelse, denne protokol har nogle begrænsninger. For det første, integritet og udbytte af opnåede RNA er mindre end at bruge hele pancreas væv som kun 20-30 mg væv anvendes. For det andet kan et stort antal prøver ikke tages på én dag, fordi RNA-ekstraktion og også cDNA syntesetest skal udføres hurtigt og fortløbende for at mindske RNA-nedbrydningen. For det tredje, at udføre forskningsprojekter med forskellige rotte grupper, Det er vigtigt at tage præcis 20-30 mg væv fra samme kirurgiske område for at mindske variationen af data, fordi rotte pancreas væv diffunders helt i bughulen.
Afslutningsvis vil jeg sige, at brug af RNA-ekstraktionsgenoperopløsning efter RNA-stabiliseringsgenoper perfusion er et godt alternativ til dyre og søjlebaserede RNA-ekstraktionssæt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen erklæret.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet økonomisk af Shiraz University of Medical Sciences (Grant No. 93-01-01-7178\03-07-2014). Vi takker Mr. Zomorodian og Mr. Rostami på Institut for e-Learning i Medical Sciences, Virtual School og Center of Excellence i e-Learning, Shiraz University of Medical Sciences for redigering af videoen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Merck | 116801 | Germany |
| Atoclave | Teb Zaim | Iran | |
| Centrifuge | Sigma | Germany | |
| Chloroform | Merck | 107024 | Germany |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC)-treated water | Sigma | Germany | |
| EDTA | sigma | 60-00-4 | Germany |
| Electrophoresis tank | Payapajoohesh | Iran | |
| Eppendorf microTube | Extragene | Taiwan | |
| EtBr | sigma | E 8751 | Germany |
| Ethanol | Merck | 81870 | Germany |
| Falcon Tube | Extragene | Taiwan | |
| Formaldehyde | Merck | 344198 | Germany |
| Formamide | Merck | 344206 | Germany |
| Homogenizer-sunicator | Microson XL 2000 | USA | |
| Isopropanol | sigma | 19516 | Germany |
| Ketamine hydrochloride | sigma | 1867-66-9 | Germany |
| Laminar Flow Hood | Jal Tajhiz | Iran | |
| Mgnetic stirrer | Labrotechnik | USA | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | Germany | |
| Micropipette Tips | Extragene | Taiwan | |
| MOPS | sigma | 85022106 | Germany |
| Na AC | Merck | 567422 | Germany |
| NaOH | Merck | 109137 | Germany |
| Oven | Teb Zaim | Iran | |
| PH meter | Knick | Germany | |
| RNA Later/RNA stabilization reagent | Qiagen | 76104 | USA |
| Surgical instrument | Agn Thos | German made | |
| Syringes | AvaPezeshk | Iran | |
| TriPure reagent/RNA extraction reagent | Roche | 11667157001 | USA |
| Vortex | Labinco | Netherland | |
| Water bath | Memmert | Germany | |
| zylazine | sigma | 7361-61-7 | Germany |
References
- McCarthy, B., Hoyer, B. Identity of DNA and diversity of messenger RNA molecules in normal mouse tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences. 52 (4), 915-922 (1964).
- Tan, S. C., Yiap, B. C. DNA, RNA, and protein extraction: the past and the present. BioMed Research International. 2009, (2009).
- Peirson, S. N., Butler, J. N. RNA extraction from mammalian tissues. Circadian Rhythms: Methods and Protocols. , 315-327 (2007).
- Skidmore, A. F., Beebee, T. J. Characterization and use of the potent ribonuclease inhibitor aurintricarboxylic acid for the isolation of RNA from animal tissues. Biochemical Journal. 263 (1), 73-80 (1989).
- Mukhopadhyay, T., Roth, J. A. Isolation of total RNA from tissues or cell lines: visualization in gel. RNA Isolation and Characterization Protocols. , 55-59 (1998).
- Raeymaekers, L. Quantitative PCR: theoretical considerations with practical implications. Analytical Biochemistry. 214 (2), 582-585 (1993).
- Sparmann, G., Jäschke, A., Loehr, M., Liebe, S., Emmrich, J. Tissue homogenization as a key step in extracting RNA from human and rat pancreatic tissue. Biotechniques. 22 (3), 408 (1997).
- Kiba, T., et al. High-quality RNA extraction from rat pancreas for microarray analysis. Pancreas. 35 (1), 98-100 (2007).
- Gill, S. S., Aubin, R. A., Bura, C. A., Curran, I. H., Matula, T. I. Ensuring recovery of intact RNA from rat pancreas. Molecular Biotechnology. 6 (3), 359-362 (1996).
- Hernandez, G. E., Mondala, T. S., Head, S. R. Assessing a novel room temperature RNA storage medium for compatibility in microarray gene expression analysis. Biotechniques. 47 (2), 667 (2009).
- Mullin, A. E., Soukatcheva, G., Verchere, C. B., Chantler, J. K. Application of in situ ductal perfusion to facilitate isolation of high-quality RNA from mouse pancreas. Biotechniques. 40 (5), 617 (2006).
- Li, D., et al. A modified method using TRIzol reagent and liquid nitrogen produces high-quality RNA from rat pancreas. Applied Biochemistry and Biotechnology. 158 (2), 253-261 (2009).
- Griffin, M., Abu-El-Haija, M., Abu-El-Haija, M., Rokhlina, T., Uc, A. A simplified and versatile method for obtaining high quality rna from pancreas. Biotechniques. 52 (5), 332 (2012).
- Jun, E., et al. Method optimization for extracting high-quality RNA from the human pancreas tissue. Translation Oncology. 11 (3), 800-807 (2018).
- Green, M. R., Sambrook, J. J. How to win the battle with RNase. Cold Spring Harbor Protocols. (2), 101857 (2019).
- Li, D. -S., Yuan, Y. -H., Tu, H. -J., Dai, L. -j A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nature Protocols. 4 (11), 1649 (2009).
- Armstrong, J. A., Schulz, J. R. J. Agarose gel electrophoresis. Current Protocol: Essential Laboratory Techniques. (1), 1-20 (2008).
- Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. Bleach gel: a simple agarose gel for analyzing RNA quality. Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold spring harbor laboratory press. , (1989).
- Potenza, N., et al. Hybridase activity of human ribonuclease-1 revealed by a real-time fluorometric assay. Nucleic Acids Research. 34 (10), 2906-2913 (2006).
- Jackson, D., Lewis, F., Taylor, G., Boylston, A., Quirke, P. Tissue extraction of DNA and RNA and analysis by the polymerase chain reaction. Journal of Clinical Pathology. 43 (6), 499-504 (1990).
- Quesada, I., Tudurí, E., Ripoll, C., Nadal, Á Physiology of the pancreatic α-cell and glucagon secretion: role in glucose homeostasis and diabetes. Journal of Endocrinology. 199 (1), 5-19 (2008).
- Quertinmont, E., Nicaise, C., Gustot, T., Deviere, J. Tissue Homogenization with the MagNA Lyser Instrument for Total RNA Extraction Using the TriPure Reagent. Liver (mg). 100 (100), 100 (2004).
- Dastgheib, S., Irajie, C., Assaei, R., Koohpeima, F., Mokarram, P. Optimization of RNA extraction from rat pancreatic tissue. Iranian Journal of Medical Sciences. 39 (3), 282 (2014).
