Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

מיצוי RNA מהיר וחסכוני של רקמת הלבלב חולדה

Published: September 19, 2020 doi: 10.3791/61255
Automatic Translation
1,2, 3, 4, 1,5
1Department of Biochemistry, School of Medicine, Shiraz University of Medical Sciences, 2Endocrinology and Metabolism Research Center, Nemazee Hospital, Shiraz University of Medical Sciences, 3English Language Department, Faculty of Paramedical Sciences, Shiraz University of Medical Sciences, 4Department of e-Learning in Medical Sciences, Virtual School and Center of Excellence in e-Learning, Shiraz University of Medical Sciences, 5Autophagy Research Center, School of Medicine, Shiraz University of Medical Sciences

Summary

הטוהר והיושרה של ה-RNA המבודד הוא צעד חיוני בהתלות RNA. כאן, אנו מציגים שיטה מעשית, מהירה וזולה כדי לחלץ RNA מכמות קטנה של רקמת הלבלב שלא ניזוקה.

Abstract

ללא קשר לשיטת החילוץ, מיצוי RNA אופטימיזציה של רקמות וקווי תאים מתבצעים בארבעה שלבים: 1) הומוגניזציה, 2) denaturization יעיל של חלבונים מ RNA, 3) אי-הפעלה ריבונוקלאז, ו 4) הסרת זיהום מ-DNA, חלבונים, ופחמימות. עם זאת, זה מאוד מייגע כדי לשמור על שלמות RNA כאשר יש רמות גבוהות של RNase ברקמה. Autolysis ספונטני עושה את זה קשה מאוד לחלץ RNA מרקמות הלבלב מבלי לפגוע בו. לכן, שיטת מיצוי RNA מעשית יש צורך לשמור על שלמות של רקמות הלבלב במהלך תהליך החילוץ. מחקר ניסיוני והשוותי של פרוטוקולים קיימים בוצע על ידי קבלת 20-30 מ"ג של רקמות הלבלב חולדה בפחות מ 2 דקות וחילוץ RNA. התוצאות הוערכו על ידי אלקטרופורזה. הניסויים בוצעו שלוש פעמים להכללת התוצאות. טבילה רקמת הלבלב בריאגנט ייצוב RNA ב -80 ° C עבור 24 שעות הניב RNA שלמות גבוהה, כאשר ריאגנט מיצוי RNA שימש כמו reagent. התוצאות שהתקבלו היו דומות לתוצאות שהתקבלו ערכות מסחריות עם איגודי עמודות ספין.

Introduction

ניתן לתעתק נתוני גנים מבניים למוצר פונקציונלי באמצעות ביטוי גנים. ניתוח RNA משמש לגילוי הבדלים בביטוי גנים בתנאים שונים. ישנן מספר שיטות לחלץ חומצות גרעין כדלקמן: גאנידיניום thiocyanate, חילוץ באמצעות פנול-כלורופורם, כרומטוגרפיה מבוססת תאית, מיצוי על ידי מטריצות סיליקה, ואניון-exchange1,,2.

זיהוי נכון של ביטוי גנים מושפע על ידי שלמות RNA מבודד מרקמות; לכן, זה חיוני כדי להעריך את שלמות RNA מבודד מרקמות לפני בדיקות נוספות מתבצעות כי בדיקות מולקולריות משלימות על RNA באיכות נמוכה עלול לסכן את תוצאות יישום אבחון. לכן, RNA שלמות גבוהה נדרש עבור בדיקות ביולוגיות מולקולריות עם יישומי אבחון שונים: RT-PCR כמותי, מיקרו-מערכים, אחסון הגנת ribonuclease, ניתוח כתם צפוני, מיפוי RNA, ובניית ספריית cDNA3,4.

RNA הופך להיות לא יציב למדי לאחר שהוחזק במשך זמן רב. שברי mRNA ארוכים מעל 10 kb רגישים במיוחד להשפלה5,6. לפיכך, על החוקרים לשקול גורמים שונים המשפיעים על שלמות ה-RNA המטוהר. הטוהר של RNA חייב להיות מוגן מפני RNases, חלבונים, DNA גנומי, וזיהום מעכב אנזימטי. בנוסף, יחס הספיגה הטוב והמקובל של RNA ל-UV (260/280) חייב להיות בטווח של 1.8-2.0 עם פיצול מינימלי על פני אלקטרופורזה. טכניקות מעבדה שפותחו לאחרונה אפשרו למדענים להעריך את שלמות מדגם הניתוח המולקולרייותר כמעט 7,8.

זה הרבה יותר קשה לחלץ RNA לא ניזוק מרקמות הלבלב מאשר סוגים אחרים של רקמות בגלל הכמות הגבוהה של ribonucleases (RNases). עם זאת, שיטות החילוץ הקיימות, כלומר פליטה מהירה של רקמת הלבלב מחלל הבטן והומוגניזציה בטמפרטורות נמוכות כדי לסתור RNases,הוכחו כלא יעילים 7, 8,9,,10,11,12,,13,14.9

מטרת המחקר הניסיוני ההשוואתי הנוכחי היא לשנות ולהשוות שיטות קיימות כדי לקבוע את השיטות היעילות ביותר. כך שונו והשוו פרוטוקולים שונים של חילוץ RNA. זה היה מכוון במיוחד כדי לקבוע את השיטה הפחות יקרה הדורשת כמות מינימלית של רקמת הלבלב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

אישור אתי למחקר זה התקבל מאוניברסיטת שיראז למדעי הרפואה (מספר אישור: 93-01-01-7178\03-07-2014).

הערה: השתמש בחולדות ספראג-דאולי זכר במשקל 250 גרם. מניחים את הבקבוקון המכיל רסיס של רקמת הלבלב שקוע בריאגנט ייצוב RNA במיכל חנקן נוזלי ב -80 ° C ולהשתמש בתמיסת חילוץ RNA 7 כדי לשמור על שלמות RNA.

1. הסרת רקמת הלבלב חולדה

  1. הכינו את חדר הניתוח והניכו את כל החומרים הנדרשים מתחת למכסה המנוע.
  2. לחטא את כל כלי הניתוח (מפס ההלבשה, מפס בראון-Adson, מספריים איריס, ומספריים Littler) בתנור לפחות 4 שעות ב 240 מעלות צלזיוס כדי להשבית RNases15. לחטא את פני השטח של מקום הניתוח עם 70% אלכוהול מתחת למכסה המנוע.
  3. להזריק קטמין / xylazine תוך-אפרטינולי באמצעות מזרק אינסולין [80/8 מ"ג/ק"ג]. בדוק את עומק ההרדמה על ידי צביטת בהונות החולדה לחוסר תגובה.
  4. להוסיף 1 מ"ל של ריאגנט ייצוב RNA במיקרו-tube הנכון (2 מ"ל) כדי לעכב את ההפעלה של אנדונוקליז ברקמות excised.
  5. מיד מניחים את העכברוש על הלוח הכירורגי (ראש הרחק מהמנתח) לחתך באמצע הקו.
  6. לחטא את כל משטח הבטן עם 70% אלכוהול ולהסיר שיער חולדה באמצעות קוצץ שיער עם #40 דם.
  7. הפוך חתך בצורת V כדי לפתוח את הבטן אזור הערווה לרגליים הקדמיות עם מפסים הלבשה, מכריחים בראון-Adson, מספריים איריס, ומספריים Littler.
  8. הופכים את איברי הבטן לצד שמאל כדי לחשוף את הלבלב. בזהירות למצוא את רקמת הלבלב, אשר מתפשט בחלל הבטן. אתר את האזור מתחת הטחול כדי למצוא את הלבלב מבלי להתבלבל עם רקמת השומן.
  9. מיד להסיר 20-30 מ"ג של לבלב מן חלל הבטן בפחות מ 2 דקות. לשים את הרקמה הוסרה במיקרוtube 2 מ"ל במהירות לחתוך אותו עם חותך סטרילי לחדור את הרקמות המופרדות עם reagent ייצוב RNA.
  10. מניחים את המיקרו-טיוב במיכל חנקן כדי להקפיא מיד. שמור את המיקרו-טיוב במקפיא של -80°C למשך 24 שעותו-16.
  11. לאחר 24 שעות, להעביר את החלקים הזעירים של רקמות הלבלב למכל קרח.
  12. להזריק אשלגן כלורי (KCl) תוך לב עבור המתת חסד של חולדות לאחר הניתוח.

2. חילוץ RNA

  1. לחטא את פני השטח מתחת למכסה המנוע עם 70% אלכוהול.
  2. לשים 1 מ"ל של ריאגנט מיצוי RNA, אשר מכיל גאנידיניום thiocyanate לעכב RNase, במיקרו-tube סטרילי.
  3. מעבירים את רקמת הלבלב המופרדת למיקרו-טיוב. מעבירים את המיקרו-טיוב לחנקן הנוזלי כדי להקפיא מיד.
  4. המגן את הרקמה עם sonicator בדיקה קצה מיקרו ב 4 מעלות C להגדיר לרמה 20 עבור 60 s על ו 5 s כבוי.
  5. דגירה כל מדגם הומוגני במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס באמצעות קרח כתוש כדי לאפשר את תסביכות nucleoprotein להיות מנותק לחלוטין.
  6. להעשיר את הדגימות עם 0.2 מ"ל של כלורופורם עבור כל 1 מ"ל של ריאגנט חילוץ RNA. מכסים את הצינור בחוזקה ומנערים אותו בכוח במשך 15 שניות.
  7. דגירה הצינור במשך 15 דקות על הקרח כתוש (4 ° C) כדי להפריד את ריאגנט בשלושה שלבים.
  8. הפעל את הצנטריפוגה ב- 12,000 x g במשך 15 דקות ב- +2 עד +8 °C. העבר את שלב המים חסר הצבע למיקרו-טיוב חדש.
  9. להוסיף 0.5 מ"ל של 100% isopropanol לשלב המיווס. סגור את הצינור ולאחר מכן להפוך אותו לפחות 3 פעמים כדי לערבב את RNA ביסודיות.
  10. דגירה הדגימה במשך 5-10 דקות על קופסה קרה (4 °C) כדי לאפשר משקעים RNA.
  11. הפעל את הצנטריפוגה ב- 12,000 x g במשך 15 דקות ב- +2 עד +8 °C. זרוק את הסופרנטנט.
  12. להעשיר כל אחד מצינורות הצנטריפוגה עם 1 מ"ל של 75% אתנול.
  13. לשטוף את גלולת RNA על ידי היפוך הצינור לפחות 3 פעמים.
  14. הפעל את הצנטריפוגה ב- 7,500 x g ב- +2 עד +8 °C למשך 5 דקות. השליכו את הסופרנטנט כדי להסיר את האתנול העודף מנות ה-RNA על ידי ייבוש אוויר.
  15. להשעות מחדש את גלולת RNA ב diethylpyrocarbonate (DEPC)-מטופלים RNase מים ללא.
  16. להעביר את הפתרון דרך קצה פיפטה מספר פעמים כדי להמיס את גלולת RNA. לאחר מכן, דגירה את הפתרון במשך 10-15 דקות ב + 65 °C.

3. הערכת תקינות RNA עם אלקטרופורזה denaturation

  1. הכן מאגר פועל ג'ל: 50 mM NaAc (DEPC מטופל) ו 0.5 M EDTA (pH 8.0) ב- H2O שטופלו DEPC.
  2. הכן מאגר פועל ג'ל פורמלדהיד 5x (מאגר פועל MOPS): 0.1 M MOPS (pH 7.0), 40 mM NaAc, 5 mM EDTA (pH 8.0).
    1. להמיס 20.6 גר ' של MOPS ב 800 מ"ל של DEPC מטופל 50 mM נתרן אצטט. כוונן את ה-pH ל- 7.0 עם 2 N NaOH. הוסף 10 מ"ל של DEPC שטופלו 0.5 M EDTA (pH 8.0). כוונן את נפח הפתרון ל- 1 L עם מים שטופלו ב- DEPC.
    2. לסנן את הפתרון באמצעות מסנן 0.2 μm ולשמור אותו בטמפרטורת החדר הרחק מהאור למען עיקור. המאגר הופך לצהוב עם הזמן אם הוא נחשף לאור או משועבד אוטומטית. מאגר בצבע קש עובד היטב, אבל אלה כהים יותר לא17.
  3. הכן 1.5% ג'ל agarose18. עבור 50 מ"ל, להוסיף 0.75 גרם של agarose ו 31 מ"ל של H2O. מיקרוגל הפתרון במיקרוגל במשך 1 דקות. הוסף 9 מ"ל של פורמלדהיד ו-10 מ"ל של מאגר 5x MOPS פועל.
  4. הכן את הדגימות לג'ל. ערבב את הפעולות הבאות בצינור מיקרופוג סטרילי:
    X μL RNA (עד 30 μg)
    2 μL של מאגר טעינת ג'ל 5x
    10 μL של צורה
    4 μL של מאגר פועל של MOPS
    1 μL של 0.1 מ"ג /מ"ל EtBr
    3 μL של פורמלדהיד 5-x μL של DEPC-H2O
  5. מדגרים את הדגימות ב-65 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות ומצננים אותן על קרח. צנטריפוגה ל-5 שניות עד שכל הנוזלים מופקדים.
  6. הפעל מראש את הג'ל ב-5 V/cm למשך 5 דקות.
  7. טען את הדגימות לתוך הנתיבים של הג'ל מיד ולאחר מכן להשתיג את הג'ל 1x פורמלדהיד ג'ל פועל חוצץ. הפעל ב- 3-4 V/cm19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הערכה של תקינות RNA בריגנט חילוץ RNA על פי פרוטוקול כירורגי שגרתי ושונה ללא ריגרציה ייצוב RNA
להקות לא מקובלות נצפו לאחר החילוץ של RNA עם reagent החילוץ RNA מפרוטוקול כירורגי שגרתי. נתיב 1 מראה RNA מהכבד כשליטה. נתיב 2 מראה את המצב המשפיל של 28S/18S rRNA להקות בסך הכל RNA שהושג פרוטוקול כירורגי שגרתי. כאשר כמות רקמת הלבלב צומצמה ל 50 מ ג (ליין 3) או 20-30 מ ג (ליין 4) והניתוח בוצע באופן מיידי (פרוטוקול שונה) ללא reagent ייצוב RNA, הפרדת RNA היה פחות מוצלח מאשר בפיקוח רקמת הכבד ולהקות לא ספציפיות נצפו.

הערכה של שלמות דגימות RNA על פי פרוטוקול כירורגי שונה שקוע רייאגנט ייצוב RNA
השלמות של RNAs המיוצר עם reagent מיצוי RNA תלוי זמן שימור וטמפרטורה (נתיב 5-8). בהשוואה לפיקוח על רקמת הכבד, הפרדת RNA לא הצליחה כאשר כמות רקמת הלבלב הייתה 50 מ"ג (נתיב 5) או 20-30 מ"ג (נתיב 6). RNA חולץ מיד לאחר הרקמה היה שקוע בריאגנט ייצוב RNA. אף להקה ספציפית לא נצפתה כאשר 20-30 מ"ג של רקמה היה שקוע בריאגנט ייצוב RNA ב -80 ° C עבור 48 שעות ו RNA חולץ בהתבסס על הפרוטוקול. על פי תוצאות האלקטרופורזה, ה-RNA היה מושפל לחלוטין (נתיב 7). כפי שמתואר בנתיב 8, להקות מקובלות (28S/18S rRNA) נצפו לאחר שקוע 20-30 מ"ג של רקמת הלבלב ב ריאגנט ייצוב RNA ב -80 ° C עבור 24 שעות, ולאחר מכן RNA חולץ.

Figure 1
איור 1: הערכת שלמות ה-RNA המבודדת מרקמות הלבלב של חולדות באמצעות ריאגנט מיצוי RNA בהתאם לפרוטוקולים במסגרת החקירה. נתיב 1 מתאר את היושרה של RNA שהושג מהכבד כשליטה. נתיב 2 מייצג את המצב של 28S/18S rRNA להקות בסך הכל RNA שהושג פרוטוקול כירורגי שגרתי. ליין 3 מייצג את המצב של 28S/18S rRNA להקות בסך הכל RNA שהושג פרוטוקול כירורגי שונה 50 מ"ג של רקמה. ליין 4 מייצג את המצב של 28S/18S rRNA להקות RNA הכולל שהושג פרוטוקול כירורגי שונה 20-30 מ"ג של רקמה. ליין 5 מייצג את המצב של 28S/18S rRNA להקות בסך הכל RNA שהושג פרוטוקול כירורגי שונה 50 מ"ג של רקמה שחולצו מיד לאחר ששקע ריאגנט ייצוב RNA. ליין 6 מראה את היושרה של RNA שהושג מ 20-30 מ"ג של רקמת הלבלב מפרוטוקול כירורגי שונה שחולץ מיד לאחר ששקע בריאגנט ייצוב RNA. ליין 7 מתאר את שלמות RNA שהתקבלה מ 20-30 מ"ג של רקמה פרוטוקול כירורגי שונה לאחר 48 שעות של טבילה בריאגנט ייצוב RNA ב -80 °C. ליין 8 מתאר את שלמות RNA שהתקבלה מ 20-30 מ"ג של רקמה פרוטוקול כירורגי שונה לאחר 24 שעות של טבילה בריאגנט ייצוב RNA ב -80 °C. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בביולוגיה מולקולרית חיוני להשיג RNA באיכות גבוהה. הנוכחות של אנזימי ribonuclease בתאים ורקמות במהירות משפיל RNA והופך את החילוץ מורכב. RNases הם אנזימים יציבים מתפקדים ללא כל גורמים שונים. כמויות קטנות של RNase מספיקות כדי להרוס RNA. כאשר רקמת הלבלב חולדה מוסרת מחלל הבטן, יש צורך לחטא את כלי הניתוח על ידי חומרי ניקוי חזקים, לשטוף אותם ביסודיות ולשים אותם בתנור לפחות 4 שעות ב 240 מעלות צלזיוס כדי להשבית RNases לפני הניתוח. בהתחשב בעובדה כי רמת RNase הוא גבוה מאוד בלבלב, מקום הניתוח הוא עיקור עם NaOH ואקונומיקה קלה כדי לנטרל את RNases. בעוד רקמת הלבלב מוסרת במהלך הפירוק, RNA יהיה לבזות. כדי להגביר את היעילות, יש להשלים את הבדיקהבמהירות האפשרית 20,21,22,,23,,24.,

הלבלב הוא רקמה קריטית למנגנונים ההמואוסטטיים של הגוף. לפיכך, הליכי מיצוי RNA הלבלב משופרים לעזור לחוקרים להבין טוב יותר מסלולים פעילים. הפרוטוקול הנוכחי הציע מודל לשיטה יעילה, פשוטה וממוטבת לחילוץ RNA מהלבלב. שיטות חילוץ RNA נפוצות שונות מרקמות הלבלב הוערכו. זה היה מרוכז על ההשפעה של אחסון קפוא ואסטרטגיות עיכוב RNase המשפיעים על איכות RNA. שני הגורמים המשמעותיים ביותר המשפיעים על שלמות ה-RNA הם משך הניתוח ואת כמות רקמת הלבלב שנאספו. מחקרים שנעשו לאחרונה גילו כי יש מתאם חיובי בין השפלה RNA ואת כמות רקמתהלבלב 8,13,20.

בפרוטוקול זה, 20-30 מ"ג של רקמת הלבלב הושגה בפחות מ 2 דקות מן החולדות המהותנות. צעדים כירורגיים ממושכים עלולים להוביל להפעלה של אנדונוקליאות אנדוגנית בלבלב ולהשפיל את ה-RNA במהירות. במחקר זה, RNA היה מבודד מדגימות שונות עם גאנידיניום thiocyanate, וטכניקות מיצוי פנול-כלורופורם השתמשו חנקן נוזלי כדי לסכל את פעילות RNA. השיטה השיגה שלוש מטרות: חריגה מהירה של רייאגנט ייצוב RNA ברקמות הלבלב, הגנה על RNA התא, וזמן שימור מוגבר. התוצאות היו אופטימליות כאשר הדגימות המכילות רייגנט ייצוב RNA נשמרו ב -80 °C במשך 24 שעות.

עם זאת, תקינות RNA גדל באופן משמעותי כאשר ריאגנט ייצוב RNA הוצג. יתר על כן, תהליך זה היה לשחזור. קטע קטן של הלבלב (20-30 מ ג) נותח במהלך ניתוח חולדות מלדמה ושקוע 1 מ"ל של ריאטנט ייצוב RNA ב -80 מעלות צלזיוס במשך 1-2 ימים. כפי שניתן לראות בנתיב 8, אחסון עבור 24 שעות היה הזמן האופטימלי.

השיטות הנ"ל אפשרו כמות קטנה יותר של ריאגנט ייצוב RNA לחדור לתוך האיבר. יתר על כן, תהליך ההשפלה הופסק זמן קצר לאחר הניסויים כי גודל החלקים נותח היה קטן. בפרוטוקול זה, הצעד החיוני הוא חיתוך הרקמה שקועה ריאגנט ייצוב RNA לחתיכות קטנות מאוד בהקדם האפשרי עד שהוא חודר את התאים ומדכא את ההפעלה של RNase. בשלב homogenizing, זה חיוני מאוד כדי למנוע ייצור בועה בריגנט חילוץ RNA ולבצע את כל השלבים ב 4 ° C. זה חיוני להפריד את שלב המים (השלב המכיל RNA) בזהירות רבה כדי למנוע זיהום DNA. למרות autolysis והנוכחות של RNases אנדוגני להתפשר בידוד RNA שלם מן הלבלב חולדה, שלמות RNA נשמר בשיטת הלבלב המוצע. לפיכך, השיטה המוצעת היא הליך פשוט, לשחזור ולא יקר הדורש כמויות קטנות יותר של ריאגנט ייצוב RNA מאשר השיטות הקיימות האחרות.

כמו כל מחקר, לפרוטוקול הזה יש כמה מגבלות. ראשית, שלמות ותפוקה של RNA שהושג הוא פחות משימוש ברקמת הלבלב שלם כמו רק 20-30 מ"ג של רקמה משמש. שנית, מספר גדול של דגימות לא ניתן לקחת ביום אחד כי חילוץ RNA וגם בדיקות סינתזה cDNA חייב להיעשות מהר ובעקבות כדי להקטין את השפלה RNA. שלישית, כדי לבצע פרויקטים מחקר עם קבוצות חולדות שונות, זה חיוני לקחת בדיוק 20-30 מ"ג של רקמה מאותו אזור כירורגי כדי להקטין וריאציה של נתונים כי רקמת הלבלב חולדה מפוזרת לחלוטין בחלל צפק.

לסיכום, באמצעות תמיסת חילוץ RNA ריאגנט לאחר RNA ייצוב ריאגנט ריבציה היא חלופה טובה יקר וערכות מיצוי RNA מבוסס עמודה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אף אחד לא הוכרז.

Acknowledgments

המחקר הנוכחי נתמך כספית על ידי אוניברסיטת שיראז למדעי הרפואה (גרנט מס' 93-01-01-7178/03-07-2014). אנו מודים למר זומורודיאן ולמר רוסתמי במחלקה ללמידה אלקטרונית במדעי הרפואה, בית הספר הווירטואלי והמרכז למצוינות בלמידה אלקטרונית, אוניברסיטת שיראז למדעי הרפואה על עריכת הסרטון.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Merck 116801 Germany
Atoclave Teb Zaim Iran
Centrifuge Sigma Germany
Chloroform Merck 107024 Germany
Diethylpyrocarbonate (DEPC)-treated water Sigma Germany
EDTA sigma 60-00-4 Germany
Electrophoresis tank Payapajoohesh Iran
Eppendorf microTube Extragene Taiwan
EtBr sigma E 8751 Germany
Ethanol Merck 81870 Germany
Falcon Tube Extragene Taiwan
Formaldehyde Merck 344198 Germany
Formamide Merck 344206 Germany
Homogenizer-sunicator Microson XL 2000 USA
Isopropanol sigma 19516 Germany
Ketamine hydrochloride sigma 1867-66-9 Germany
Laminar Flow Hood Jal Tajhiz Iran
Mgnetic stirrer Labrotechnik USA
Microcentrifuge Eppendorf Germany
Micropipette Tips Extragene Taiwan
MOPS sigma 85022106 Germany
Na AC Merck 567422 Germany
NaOH Merck 109137 Germany
Oven Teb Zaim Iran
PH meter Knick Germany
RNA Later/RNA stabilization reagent Qiagen 76104 USA
Surgical instrument Agn Thos German made
Syringes AvaPezeshk Iran
TriPure reagent/RNA extraction reagent Roche 11667157001 USA
Vortex Labinco Netherland
Water bath Memmert Germany
zylazine sigma 7361-61-7 Germany

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McCarthy, B., Hoyer, B. Identity of DNA and diversity of messenger RNA molecules in normal mouse tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences. 52 (4), 915-922 (1964).
  2. Tan, S. C., Yiap, B. C. DNA, RNA, and protein extraction: the past and the present. BioMed Research International. 2009, (2009).
  3. Peirson, S. N., Butler, J. N. RNA extraction from mammalian tissues. Circadian Rhythms: Methods and Protocols. , 315-327 (2007).
  4. Skidmore, A. F., Beebee, T. J. Characterization and use of the potent ribonuclease inhibitor aurintricarboxylic acid for the isolation of RNA from animal tissues. Biochemical Journal. 263 (1), 73-80 (1989).
  5. Mukhopadhyay, T., Roth, J. A. Isolation of total RNA from tissues or cell lines: visualization in gel. RNA Isolation and Characterization Protocols. , 55-59 (1998).
  6. Raeymaekers, L. Quantitative PCR: theoretical considerations with practical implications. Analytical Biochemistry. 214 (2), 582-585 (1993).
  7. Sparmann, G., Jäschke, A., Loehr, M., Liebe, S., Emmrich, J. Tissue homogenization as a key step in extracting RNA from human and rat pancreatic tissue. Biotechniques. 22 (3), 408 (1997).
  8. Kiba, T., et al. High-quality RNA extraction from rat pancreas for microarray analysis. Pancreas. 35 (1), 98-100 (2007).
  9. Gill, S. S., Aubin, R. A., Bura, C. A., Curran, I. H., Matula, T. I. Ensuring recovery of intact RNA from rat pancreas. Molecular Biotechnology. 6 (3), 359-362 (1996).
  10. Hernandez, G. E., Mondala, T. S., Head, S. R. Assessing a novel room temperature RNA storage medium for compatibility in microarray gene expression analysis. Biotechniques. 47 (2), 667 (2009).
  11. Mullin, A. E., Soukatcheva, G., Verchere, C. B., Chantler, J. K. Application of in situ ductal perfusion to facilitate isolation of high-quality RNA from mouse pancreas. Biotechniques. 40 (5), 617 (2006).
  12. Li, D., et al. A modified method using TRIzol reagent and liquid nitrogen produces high-quality RNA from rat pancreas. Applied Biochemistry and Biotechnology. 158 (2), 253-261 (2009).
  13. Griffin, M., Abu-El-Haija, M., Abu-El-Haija, M., Rokhlina, T., Uc, A. A simplified and versatile method for obtaining high quality rna from pancreas. Biotechniques. 52 (5), 332 (2012).
  14. Jun, E., et al. Method optimization for extracting high-quality RNA from the human pancreas tissue. Translation Oncology. 11 (3), 800-807 (2018).
  15. Green, M. R., Sambrook, J. J. How to win the battle with RNase. Cold Spring Harbor Protocols. (2), 101857 (2019).
  16. Li, D. -S., Yuan, Y. -H., Tu, H. -J., Dai, L. -j A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nature Protocols. 4 (11), 1649 (2009).
  17. Armstrong, J. A., Schulz, J. R. J. Agarose gel electrophoresis. Current Protocol: Essential Laboratory Techniques. (1), 1-20 (2008).
  18. Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. Bleach gel: a simple agarose gel for analyzing RNA quality. Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).
  19. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold spring harbor laboratory press. , (1989).
  20. Potenza, N., et al. Hybridase activity of human ribonuclease-1 revealed by a real-time fluorometric assay. Nucleic Acids Research. 34 (10), 2906-2913 (2006).
  21. Jackson, D., Lewis, F., Taylor, G., Boylston, A., Quirke, P. Tissue extraction of DNA and RNA and analysis by the polymerase chain reaction. Journal of Clinical Pathology. 43 (6), 499-504 (1990).
  22. Quesada, I., Tudurí, E., Ripoll, C., Nadal, Á Physiology of the pancreatic α-cell and glucagon secretion: role in glucose homeostasis and diabetes. Journal of Endocrinology. 199 (1), 5-19 (2008).
  23. Quertinmont, E., Nicaise, C., Gustot, T., Deviere, J. Tissue Homogenization with the MagNA Lyser Instrument for Total RNA Extraction Using the TriPure Reagent. Liver (mg). 100 (100), 100 (2004).
  24. Dastgheib, S., Irajie, C., Assaei, R., Koohpeima, F., Mokarram, P. Optimization of RNA extraction from rat pancreatic tissue. Iranian Journal of Medical Sciences. 39 (3), 282 (2014).

Tags

ביוכימיה גיליון 163 טוהר חילוץ RNA לבלב Autolysis עלות-יעילה
מיצוי RNA מהיר וחסכוני של רקמת הלבלב חולדה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dastghaib, S., Shahsavar, Z.,… More

Dastghaib, S., Shahsavar, Z., Karimian, Z., Mokarram, P. Rapid and Cost-Effective RNA Extraction of Rat Pancreatic Tissue. J. Vis. Exp. (163), e61255, doi:10.3791/61255 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter