Summary
単離されたRNAの純度と完全性は、RNA依存アッセイにおいて重要なステップです。ここでは、少量の損傷を受けていない膵臓組織からRNAを抽出する実用的で迅速かつ安価な方法を提示する。
Abstract
抽出方法に関係なく、組織および細胞株の最適化されたRNA抽出は、1)均質化、2)RNAからのタンパク質の有効な変性、3)リボヌクレアーゼ不活性化、および4)DNA、タンパク質、および炭水化物からの汚染の除去の4つの段階で行われます。しかし、組織に高レベルのRNaseがある場合、RNAの完全性を維持することは非常に面倒です。自発的な自己分解は、それを損傷することなく、膵臓組織からRNAを抽出することは非常に困難になります。したがって、抽出プロセス中に膵臓組織の完全性を維持するために実用的なRNA抽出方法が必要です。既存のプロトコルの実験的および比較研究は、2分未満で20〜30mgのラット膵臓組織を得てRNAを抽出することによって行われた。結果は電気泳動によって評価された。実験は、結果の一般化のために3回行った。24時間に対して−80°CでのRNA安定化試薬に膵臓組織を浸漬すると、RNA抽出試薬を試薬として用いた場合に高い完全性RNAが生じ、。得られた結果は、スピンカラム結合を有する市販キットから得られた結果と同等であった。
Introduction
構造遺伝子データは、遺伝子発現を通じて機能産物に転写することができる。RNA解析は、異なる条件間で遺伝子発現の違いを発見するために使用されます。核酸を抽出する方法は数多くあります:グアニジニウム・チオシアネート、フェノールクロロホルムによる抽出、セルロース系クロマトグラフィー、シリカマトリックスによる抽出、およびアニオン交換11,2。2
遺伝子発現の適切な検出は、組織から分離されたRNAの完全性の影響を受けます。したがって、低品質RNAの補完的な分子試験は診断アプリケーションの結果を危険にさらす可能性があるため、さらなる試験を行う前に、組織から分離されたRNAの完全性を評価することが重要です。したがって、定量的RT-PCR、マイクロアレイ、リボヌクレアーゼ保護アッセイ、ノーザンブロット分析、RNAマッピング、およびcDNAライブラリ構築33、44など、さまざまな診断アプリケーションを用いた分子生物学的試験には高い完全性RNAが必要です。
RNAは、長期間保持された後、かなり不安定になります。10 kb 以上の長い mRNA フラグメントは、特に分解の影響を受けやすい5,,6。したがって、研究者は、精製されたRNAの完全性に影響を与える様々な要因を考慮する必要があります。RNAの純度は、RNases、タンパク質、ゲノムDNA、および酵素阻害剤汚染から保護されなければならない。さらに、RNAとUVの吸収率(260/280)は、電気泳動に対する最小の断片化で1.8~2.0の範囲内でなければなりません。最近開発された実験室の技術は、科学者がより実質的に7、8の分子分析7サンプルの完全性を評価することを可能にしました。
リボヌクレアーゼ(RNases)の量が多いため、他のタイプの組織よりも膵臓組織から損傷を受けていないRNAを抽出することははるかに困難です。しかし、既存の抽出方法、すなわち、RNasesを妨げる低温での腹腔および均質化からの膵臓組織の急速な放出は、有効でない787、8、9、10、11、12、13、14,13,14を証明している。11,12,9,10,,
本比較実験研究の目的は、既存の方法を修正し、比較して最も効率的な方法を決定することです。そのために、RNA抽出の様々なプロトコルを改変し、比較した。これは、膵臓組織の最小量を必要とする最も安価な方法を決定することを特に目的とした。
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Protocol
この研究の倫理的承認は、シラーズ医科大学(承認番号:93-01-01-7178\03-07-2014)から得られました。
注:雄のスプレイグ-ドーリーラットの体重250グラムを使用してください。80°Cの液体窒素タンクにRNA安定化試薬に浸漬した膵臓組織のスライバーを含むバイアルを置き、RNA抽出試薬溶液を使用してRNAの完全性を維持します。
1. ラット膵臓組織の除去
- 手術室を準備し、フードの下にすべての必要な材料を配置します。
- RNases15を不活性化するために、240°Cで少なくとも4時間オーブンですべての手術器具(ドレッシング鉗子、ブラウン・アドソン鉗子、アイリスはさみ、およびリトルハサミ)を殺菌する。フードの下に70%アルコールで手術場所の表面を殺菌します。
- インスリン注射器を使用して腹腔内にケタミン/キシラジンを注入する [80/8 mg/kg].反応の欠如のためにラットのつまみで麻酔の深さを確認してください。
- 適切なマイクロチューブ(2 mL)にRNA安定化試薬を1 mL添加して、切除組織におけるエンドヌクレアーゼの活性化を阻害します。
- すぐに中間線の切開のために外科用板(外科医から離れて頭)にラットを置きます。
- 70%アルコールで腹部の表面全体を殺菌し、#40刃の毛のクリッパーを使用してラットの毛を除去します。
- V字型の切開を行い、陰部から前脚までの腹部をドレッシング鉗子、ブラウン・アドソン鉗子、アイリスはさみ、リトルハサミで開きます。
- 腹部の器官を左側にひっくり返して膵臓を露出させます。慎重に腹腔に広がる膵臓組織を見つける。脂肪組織と混同されることなく膵臓を見つけるために脾臓の下の領域を見つけます。
- すぐに20〜30mgの膵臓を腹腔から2分以内に取り除く。取り出した組織を2mLマイクロチューブに素早く入れ、滅菌カッターで切断し、RNA安定化試薬で分離した組織を貫通させます。
- マイクロチューブを窒素タンクに入れ、すぐに凍結します。マイクロチューブを-80°C冷凍庫に24時間16時間保管してください。
- 24時間後、膵臓組織の小片を氷容器に移します。
- 手術後のラットの安楽死のために、塩化カリウム(KCl)を心内に注入する。
2. RNA抽出
- 70%アルコールでボンネットの下の表面を殺菌します。
- RNA抽出試薬の1 mLを入れて、これは、滅菌マイクロチューブに、RNaseを阻害するためにチオシアネートグアニジニウムを含有する。
- 分離した膵臓組織をマイクロチューブに移します。マイクロチューブを液体窒素に移し、すぐに凍結します。
- 4 °Cのマイクロチッププローブ超音波処理器で組織を均質化し、60 s onと5 s offのレベル20に設定します。
- 砕氷を用いて4°Cで均質化したサンプルを5分間インキュベートし、核タンパク質複合体を完全に解光することができます。
- RNA抽出試薬の各1 mLに対して0.2 mLのクロロホルムでサンプルを濃縮します。チューブをしっかりとキャップし、15 sの間強く振ります。
- 破砕した氷(4°C)上でチューブを15分間インキュベートし、試薬を3段階で分離します。
- 遠心分離機を+2~+8°Cで15分間12,000 x g で実行します。 無色水相を新しいマイクロチューブに移します。
- 水相に100%イソプロパノールの0.5mLを加えます。チューブを閉じ、それを少なくとも3回反転してRNAを完全に混合します。
- 冷たい箱(4°C)に5〜10分間サンプルをインキュベートして、RNA沈殿を可能にします。
- 遠心分離機を+2~+8°Cで15分間12,000 x g で実行します。 上清を捨てます。
- 75%エタノールの1 mLで遠心分離管のそれぞれを豊かにします。
- RNAペレットを、チューブを3回以上反転させて洗浄します。
- 7,500 x g で+2 ~ +8 °C で 5 分間遠心分離機を実行します。上清を捨てて、空気乾燥によりRNAペレットから余分なエタノールを除去する。
- ジエチルピロカーボネート(DEPC)処理したRNaseフリー水中のRNAペレットを再懸濁する。
- 溶液をピペットチップを通して数回通過し、RNAペレットを溶解します。その後、溶液を+65°Cで10〜15分間インキュベートします。
3. 変性電気泳動によるRNAインテグリティの評価
- ゲルランニングバッファを準備する:DEPC処理H2Oで50 mM NaAc(DEPC処理)および0.5 M EDTA(pH 8.0)。
- 5xホルムアルデヒドゲルランニングバッファ(MOPSランニングバッファ):0.1 M MOPS(pH 7.0)、40 mM NaAc、5 mM EDTA(pH 8.0)
- 50 mM酢酸ナトリウムを処理したDEPCの800 mLに20.6 gのMOPSを溶解する。2 N NaOH で pH を 7.0 に調整します。10 mLの DEPC 処理 0.5 M EDTA (pH 8.0) を加えます。DEPC処理水で溶液の体積を1 Lに調整します。
- 0.2 μmフィルターで溶液をフィルターし、滅菌のために光から離れて室温に保ちます。バッファーは、光にさらされるか、オートクレーブされている場合、時間とともに黄色になります。ストロー色のバッファはうまく機能しますが、暗いバッファは17ではありません。
- 1.5%アガロースゲル18を準備します。50 mL の場合、0.75 gのアガロースと 31 mL の H2O. マイクロ波に1分間マイクロ波に溶液を加えます。ホルムアルデヒド9 mLと5x MOPSランニングバッファの10 mLを加えます。
- ゲル用のサンプルを準備します。滅菌マイクロフュージチューブに以下を混ぜます:
X μL RNA(最大30μg)
5xゲルローディングバッファの2 μL
10 μL のフォルムアミド
4 μL の MOPS 実行バッファ
1 μL 0.1 mg/mL EtBr
3 μL の ホルムアルデヒド 5-x μL の DEPC-H2O - サンプルを65°Cで15分間インキュベートし、氷の上で冷却します。すべての流体が堆積するまで5 sの遠心分離機。
- ゲルを5V/cmで5分間前走します。
- すぐにゲルのレーンにサンプルをロードし、1xホルムアルデヒドゲルランニングバッファーにゲルを沈めます。3-4 V/cm19で実行します。
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Representative Results
RNA安定化試薬を使用しないルーチンおよび修飾された外科プロトコルによるRNA抽出試薬におけるRNAの完全性の評価
受け入れられないバンドは、定期的な外科プロトコルからRNA抽出試薬を用いたRNAの抽出後に観察された。レーン1は、肝臓からのRNAをコントロールとして示す。レーン2は、ルーチンの外科プロトコルから得られた総RNAにおける28S/18S rRNAバンドの劣化状態を示す。膵組織の量を50mg(レーン3)または20〜30mg(レーン4)に減少させ、RNA安定化試薬なしで手術を直ちに行った(改質プロトコル)場合、RNA分離は肝臓組織制御に比べて成功が少なく、非特異的バンドが観察された。
RNA安定化試薬に浸漬された改変外科プロトコルによるRNAサンプルの完全性の評価
RNA抽出試薬で生成されるRNAの完全性は、保存時間と温度(レーン5-8)に依存します。対照肝組織と比較して、膵組織の量が50mg(レーン5)または20〜30mg(レーン6)であった場合、RNA分離は成功しなかった。RNAは、組織の直後にRNA安定化試薬に浸漬して抽出した。20~30mgの組織を-80°Cで48時間のRNA安定化試薬に沈め、プロトコルに基づいてRNAを抽出した場合、特異的バンドは認められなかった。電気泳動結果によれば、RNAは完全に分解された(レーン7)。レーン8に示されるように、RNA安定化試薬に20〜30mgの膵組織を24時間用いた状態で20〜30mgの膵臓組織を浸液させた後に許容可能なバンド(28S/18S rRNA)を観察し、次いでRNAを抽出した。
図1:調査のプロトコルに従ってRNA抽出試薬を用いてラット膵臓組織から単離されたRNAの完全性の評価。レーン1は、肝臓から得られたRNAの完全性を対照として描写している。レーン2は、ルーチンの外科プロトコルから得られた総RNAにおける28S/18S rRNAバンドの状態を表す。レーン3は、修飾された外科プロトコルおよび50mgの組織から得られた総RNAにおける28S/18S rRNAバンドの状態を表す。レーン4は、修飾された外科プロトコルおよび20〜30mgの組織から得られた全RNAにおける28S/18S rRNAバンドの状態を表す。レーン5は、RNA安定化試薬に浸漬した直後に、修飾された外科プロトコルから得られたRNAおよび50mgの組織の全RNAの28S/18S rRNAバンドの状態を表す。レーン6は、RNA安定化試薬に浸漬された直後に抽出された改変手術プロトコルから20〜30mgの膵臓組織から得られたRNAの完全性を示す。レーン7は、RNA安定化試薬に48時間浸漬した後の修飾された外科プロトコルから20〜30mgの組織から得られたRNAの完全性を-80°Cで示している。 Lane 8は、RNA安定化試薬に24時間浸漬した後の修飾された外科プロトコルから20〜30mgの組織から得られたRNAの完全性を-80°Cで 示し、この図のより大きなバージョンを見るにはここをクリックしてください。
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Discussion
分子生物学では、高品質のRNAを得ることが不可欠です。細胞および組織におけるリボヌクレアーゼ酵素の存在は、RNAを迅速に分解し、抽出を複雑にします。RNasesは共因子なしで機能する安定した酵素である。少量のRNaseはRNAを破壊するのに十分です。ラット膵臓組織が腹腔から取り出されるとき、強い洗剤によって外科器具を消毒し、十分に洗い流し、手術前にRNasesを不活性化するために240°Cで少なくとも4時間オーブンに入れる必要がある。RNaseレベルが膵臓で非常に高いという事実を考えると、手術の場所はNaOHと軽度の漂白剤で殺菌され、RNasesを非アクティブ化する。膵臓組織が解剖中に除去されている間、RNAは分解するであろう。効率を高めるためには、解剖をできるだけ早く20、21、22、23、24にする必要があります。20,21,22,23,24
膵臓は、体の恒動性機構にとって重要な組織です。したがって、改善された膵臓RNA抽出手順は、研究者が活性経路をよりよく理解するのに役立ちます。本プロトコルは、膵臓からのRNA抽出のための効率的でシンプルで最適化された方法のモデルを提案した。膵組織からの異なる共通RNA抽出方法を評価した。これは、RNA品質に影響を与える凍結貯蔵およびRNase阻害戦略の効果に集中した。RNAの完全性に影響を与える2つの最も重要な要因は、手術期間および採取された膵臓組織の量である。最近の研究では、RNA分解と膵組織の量との間に正の相関関係があることが明らかとなっている 8,,13,,20.
このプロトコルでは、麻酔下ラットから20〜30mgの膵臓組織が2分未満で得られた。長い外科的ステップは膵臓の内因性エンドヌクレアーゼの活性化をもたらし、RNAを迅速に分解する。本研究では、RNAをグアニジニウム・チオシアネートを用いて異なるサンプルから単離し、フェノール・クロロホルム抽出技術を用いて液体窒素を使用してRNA活性を阻害した。この方法は、膵臓組織におけるRNA安定化試薬の迅速な浸透、細胞RNAの保護、保存時間の増加という3つの目的を達成しました。RNA安定化試薬を含むサンプルを-80°Cで24時間保持した場合、結果は最適であった。
しかし、RNA安定化試薬を導入すると、RNAの完全性が著しく向上しました。また、このプロセスは再現可能であった。麻酔ラットから手術中に膵臓の小さな部分(20〜30mg)を解剖し、1-80°CでRNA安定化試薬の1mLに1〜2日間水没させた。レーン8に見られるように、24時間の貯蔵が最適な時間であった。
上記の方法により、より少量のRNA安定化試薬が器官に浸透することができた。さらに、解剖した破片の大きさが小さいため、実験直後に分解処理が中止された。このプロトコルでは、細胞に浸透してRNaseの活性化を抑制するまで、極めて小さな部分にRNA安定化試薬に浸漬した組織をできるだけ早く切断することが重要なステップです。均質化工程では、RNA抽出試薬での気泡の発生を防ぎ、4°Cで全工程を行うことが非常に重要です。 DNA汚染を避けるために、水相(RNAを含む相)を非常に慎重に分離することが重要です。自己融解および内因性RNasesの存在は、ラット膵臓からのRNAの完全な分離を損なうが、RNAの完全性は、提案された膵臓灌流法において維持された。したがって、提案された方法は、他の既存の方法よりも少量のRNA安定化試薬を必要とする、簡単で再現性の高い安価な手順です。
他の研究と同様に、このプロトコルにはいくつかの制限があります。まず、得られたRNAの完全性および収率は、わずか20〜30mgの組織が使用されるので、全体の膵臓組織を使用するよりも少ない。第二に、RNA抽出とcDNA合成試験を迅速かつ連続的に行い、RNA分解を減らすため、1日で多数のサンプルを採取することはできません。第三に、異なるラット群で研究プロジェクトを行うためには、ラット膵臓組織が腹腔内に完全に拡散するため、データの変動を減少させるために、同じ外科的領域から正確に20〜30mgの組織を取ることが不可欠である。
結論として、RNA安定化試薬灌流後のRNA抽出試薬溶液を使用することは、高価でカラムベースのRNA抽出キットに代わる良い選択肢です。
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Disclosures
宣言されていません。
Acknowledgments
本研究は、シラーズ医科大学(グラント93-01-01-7178\03-07-2014)によって財政的に支援されました。私たちは、ビデオを編集するためのサイラズ医科大学、医学、バーチャルスクール、eラーニングの卓越性センターの医学部のゾモロディアン氏とロスタミ氏に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Merck | 116801 | Germany |
| Atoclave | Teb Zaim | Iran | |
| Centrifuge | Sigma | Germany | |
| Chloroform | Merck | 107024 | Germany |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC)-treated water | Sigma | Germany | |
| EDTA | sigma | 60-00-4 | Germany |
| Electrophoresis tank | Payapajoohesh | Iran | |
| Eppendorf microTube | Extragene | Taiwan | |
| EtBr | sigma | E 8751 | Germany |
| Ethanol | Merck | 81870 | Germany |
| Falcon Tube | Extragene | Taiwan | |
| Formaldehyde | Merck | 344198 | Germany |
| Formamide | Merck | 344206 | Germany |
| Homogenizer-sunicator | Microson XL 2000 | USA | |
| Isopropanol | sigma | 19516 | Germany |
| Ketamine hydrochloride | sigma | 1867-66-9 | Germany |
| Laminar Flow Hood | Jal Tajhiz | Iran | |
| Mgnetic stirrer | Labrotechnik | USA | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | Germany | |
| Micropipette Tips | Extragene | Taiwan | |
| MOPS | sigma | 85022106 | Germany |
| Na AC | Merck | 567422 | Germany |
| NaOH | Merck | 109137 | Germany |
| Oven | Teb Zaim | Iran | |
| PH meter | Knick | Germany | |
| RNA Later/RNA stabilization reagent | Qiagen | 76104 | USA |
| Surgical instrument | Agn Thos | German made | |
| Syringes | AvaPezeshk | Iran | |
| TriPure reagent/RNA extraction reagent | Roche | 11667157001 | USA |
| Vortex | Labinco | Netherland | |
| Water bath | Memmert | Germany | |
| zylazine | sigma | 7361-61-7 | Germany |
References
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