Summary
La pureza e integridad del ARN aislado es un paso vital en los ensayos dependientes del ARN. Aquí, presentamos un método práctico, rápido y barato para extraer el ARN de una pequeña cantidad de tejido pancreático no dañado.
Abstract
Independientemente del método de extracción, la extracción optimizada de ARN de tejidos y líneas celulares se lleva a cabo en cuatro etapas: 1) homogeneización, 2) desnaturalización efectiva de proteínas de ARN, 3) inactivación de la ribonucleasa, y 4) eliminación de la contaminación del ADN, proteínas y carbohidratos. Sin embargo, es muy laborioso mantener la integridad del ARN cuando hay altos niveles de RNase en el tejido. La autolisis espontánea hace que sea muy difícil extraer ARN del tejido pancreático sin dañarlo. Por lo tanto, se necesita un método práctico de extracción de ARN para mantener la integridad de los tejidos pancreáticos durante el proceso de extracción. Se llevó a cabo un estudio experimental y comparativo de los protocolos existentes obteniendo 20-30 mg de tejidos pancreáticos de rata en menos de 2 minutos y extrayendo el ARN. Los resultados fueron evaluados por electroforesis. Los experimentos se llevaron a cabo tres veces para la generalización de los resultados. Sumergir el tejido pancreático en el reactivo de estabilización de ARN a -80 oC durante 24 horas produjo ARN de alta integridad, cuando se utilizó el reactivo de extracción de ARN como reactivo. Los resultados obtenidos fueron comparables a los resultados obtenidos de kits comerciales con fijaciones de columna de espín.
Introduction
Los datos genéticos estructurales se pueden transcribir a un producto funcional a través de la expresión génica. El análisis de ARN se utiliza para descubrir diferencias en la expresión génica en diferentes condiciones. Hay una serie de métodos para extraer ácidos nucleicos de la siguiente manera: guanidinio tiocianato, extracción a través de fenol-cloroformo, cromatografía a base de celulosa, extracción por matrices de sílice, y anión-intercambio1,2.
La detección adecuada de la expresión génica está influenciada por la integridad del ARN aislado de los tejidos; por lo tanto, es vital evaluar la integridad del ARN aislado de los tejidos antes de que se lleven a cabo nuevas pruebas, ya que las pruebas moleculares complementarias en ARN de baja calidad pueden poner en peligro los resultados de las aplicaciones diagnósticas. Por lo tanto, se necesita ARN de alta integridad para pruebas biológicas moleculares con diferentes aplicaciones de diagnóstico: RT-PCR cuantitativo, micro-arrays, ensayo de protección ribonucleasa, análisis de manchas del norte, mapeo de ARN y construcción de bibliotecas cDNA3,,4.
El ARN se vuelve bastante inestable después de ser mantenido durante mucho tiempo. Los fragmentos largos de ARNm de más de 10 kb son particularmente susceptibles a la degradación5,,6. Por lo tanto, los investigadores deben considerar varios factores que influyen en la integridad del ARN purificado. La pureza del ARN debe protegerse contra las arnés, las proteínas, el ADN genómico y la contaminación por inhibidores enzimáticos. Además, la mejor y aceptable relación de absorción de ARN a UV (260/280) debe estar dentro del rango de 1,8-2,0 con una fragmentación mínima sobre la electroforesis. Técnicas de laboratorio desarrolladas recientemente han permitido a los científicos evaluar la integridad de la muestra de análisis molecular más prácticamente7,8.
Es mucho más difícil extraer ARN no dañado del tejido pancreático que otros tipos de tejidos debido a la alta cantidad de ribonucleas (ARN). Sin embargo, los métodos de extracción existentes, a saber, la rápida expulsión del tejido pancreático de la cavidad abdominal y la homogeneización a bajas temperaturas para impedir las redes, han demostrado ser ineficaces7,8,9,10,11,12,13,14.
El propósito del presente estudio experimental comparativo es modificar y comparar los métodos existentes para determinar los métodos más eficientes. Con ese fin, se modificaron y compararon varios protocolos de extracción de ARN. Estaba dirigido específicamente a determinar el método menos costoso que requiere una cantidad mínima de tejido pancreático.
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Protocol
La aprobación ética para este estudio se obtuvo de la Universidad de Ciencias Médicas de Shiraz (Número de aprobación: 93-01-01-7178-03-07-2014).
NOTA: Utilice ratas macho Sprague-Dawley que pesen 250 g. Coloque el vial que contiene una astilla de tejido pancreático sumergido en un reactivo estabilizador de ARN en un tanque de nitrógeno líquido a -80 oC y utilice la solución de reactivo de extracción de ARN para mantener la integridad del ARN.
1. Extirpación del tejido pancreático de rata
- Prepare el quirófano y coloque todos los materiales necesarios debajo del capó.
- Esterilice todos los instrumentos quirúrgicos (visos de vestir, fórceps Brown-Adson, tijeras de iris y tijeras Littler) en un horno durante al menos 4 horas a 240 oC para inactivar RNases15. Esterilice la superficie del lugar de la cirugía con 70% de alcohol bajo la capucha.
- Inyectar ketamina/xiazina por vía intraperitoneal utilizando una jeringa de insulina [80/8 mg/kg]. Compruebe la profundidad de la anestesia pellizcando los dedos de los dedos de la rata en busca de falta de respuesta.
- Añadir 1 ml de reactivo de estabilización de ARN en el microtubo adecuado (2 ml) para inhibir la activación de endonucleas en tejidos extirpados.
- Coloque inmediatamente la rata en la placa quirúrgica (cabeza lejos del cirujano) para una incisión de línea media.
- Esterilice toda la superficie abdominal con 70% de alcohol y elimine el pelo de rata usando un cortapelos con cuchillas #40.
- Haz una incisión en forma de V para abrir el abdomen desde el área púbica hasta las patas delanteras con fórceps, fórceps Brown-Adson, tijeras De iris y tijeras Littler.
- Voltear los órganos abdominales hacia el lado izquierdo para exponer el páncreas. Encuentra cuidadosamente el tejido pancreático, que se propaga en la cavidad abdominal. Localice el área debajo del bazo para encontrar el páncreas sin confundirse con el tejido graso.
- Retire inmediatamente 20-30 mg de páncreas de la cavidad abdominal en menos de 2 min. Coloque el tejido extraído en el microtubo de 2 ml rápidamente y córtelo con un cortador estéril para penetrar los tejidos separados con reactivo de estabilización de ARN.
- Coloque el microtubo en un tanque de nitrógeno para congelar inmediatamente. Conservar el microtubo en un congelador de -80 oC durante 24 h16.
- Después de 24 h, transfiera los pequeños trozos de tejidos pancreáticos a un recipiente de hielo.
- Inyectar cloruro de potasio (KCl) intracardially para la eutanasia de ratas después de la cirugía.
2. Extracción de ARN
- Esterilice la superficie bajo el capó con 70% de alcohol.
- Poner 1 ml del reactivo de extracción de ARN, que contiene guanidinio tiocianato para inhibir la RNase, en el microtubo estéril.
- Transfiera el tejido pancreático separado al microtubo. Transfiera el microtubo al nitrógeno líquido para congelar inmediatamente.
- Homogeneizar el tejido con el sonicador de sonda de micro punta a 4 oC ajustado al nivel 20 durante 60 s y 5 s apagado.
- Incubar cada muestra homogeneizada durante 5 min a 4oC utilizando hielo triturado para permitir que los complejos de nucleoproteína se disocian por completo.
- Enriquezca las muestras con 0,2 ml de cloroformo por cada 1 ml de reactivo de extracción de ARN. Tapa el tubo firmemente y agítalo con fuerza durante 15 s.
- Incubar el tubo durante 15 min sobre el hielo triturado (4oC) para separar el reactivo en tres fases.
- Ejecute la centrífuga a 12.000 x g durante 15 min a +2 a +8 oC. Transfiera la fase acuosa incolora a un nuevo microtubo.
- Añadir 0,5 ml de isopropanol 100% a la fase acuosa. Cierre el tubo y, a continuación, invierta al menos 3 veces para mezclar el ARN a fondo.
- Incubar la muestra durante 5-10 min en una caja fría (4oC) para permitir la precipitación de ARN.
- Ejecute la centrífuga a 12.000 x g durante 15 min a +2 a +8 oC. Deseche el sobrenadante.
- Enriquezca cada uno de los tubos centrífugos con 1 ml de etanol al 75%.
- Lave el pellet de ARN invirtiendo el tubo al menos 3 veces.
- Ejecuta la centrífuga a 7.500 x g a +2 a +8oC durante 5 min. Deseche el sobrenadante para eliminar el exceso de etanol del pellet de ARN por secado al aire.
- Vuelva a suspender el pellet de ARN en agua libre de RNase tratada con dietylpyrocarbonato (DEPC).
- Pasar la solución a través de una punta de pipeta varias veces para disolver el pellet de ARN. A continuación, incubar la solución durante 10-15 min a +65 oC.
3. Evaluación de la integridad del ARN con electroforesis de desnaturalización
- Preparar el tampón de funcionamiento del gel: 50 mM NaAc (tratado con DEPC) y 0,5 M EDTA (pH 8.0) en H2O tratado con DEPC.
- Preparar 5x tampón de gel de formaldehído (tampón de funcionamiento de MOPS): 0,1 M MOPS (pH 7,0), 40 mM NaAc, 5 mM EDTA (pH 8.0).
- Disolver 20,6 g de MOPS en 800 ml de acetato de sodio tratado con DEPC 50 mM. Ajuste el pH a 7.0 con 2 N NaOH. Añadir 10 ml de EDTA tratado con DEPC 0,5 M (pH 8.0). Ajuste el volumen de la solución a 1 L con agua tratada con DEPC.
- Filtrar la solución a través de un filtro de 0,2 m y mantenerla a temperatura ambiente lejos de la luz en aras de la esterilización. El búfer se vuelve amarillo con el tiempo si está expuesto a la luz o se autoclava. Un tampón de color pajizo funciona bien, pero los más oscuros no17.
- Preparar un gel de agarosa del1,5% 18. Para 50 ml, añadir 0,75 g de agarosa y 31 ml de H2O. Microonda la solución en el microondas durante 1 min. Agregue 9 ml de formaldehído y 10 ml de búfer de ejecución MOPS 5x.
- Prepare las muestras para el gel. Mezclar lo siguiente en un tubo de microfusión estéril:
ARN X (hasta 30 g)
2 l de tampón de carga de gel 5x
10 l de formamida
4 l de búfer de funcionamiento de MOPS
1 l de 0,1 mg/ml de EtBr
3 l de formaldehído de 5-x l de DEPC-H2O - Incubar las muestras a 65oC durante 15 min y enfriarlas sobre hielo. Centrifugar durante 5 s hasta que se deposite todo el líquido.
- Pre-ejecutar el gel a 5 V/cm durante 5 minutos.
- Cargue las muestras en los carriles del gel inmediatamente y luego sumerja el gel en un tampón de gel de formaldehído 1x. Correr a 3-4 V/cm19.
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Representative Results
Evaluación de la integridad del ARN en el reactivo de extracción de ARN de acuerdo con un protocolo quirúrgico rutinario y modificado sin reactivo de estabilización de ARN
Se observaron bandas inaceptables después de la extracción de ARN con el reactivo de extracción de ARN de un protocolo quirúrgico de rutina. El carril 1 muestra el ARN del hígado como control. El carril 2 muestra el estado degradado de las bandas de ARN 28S/18S en el ARN total obtenido de un protocolo quirúrgico de rutina. Cuando la cantidad de tejido pancreático se redujo a 50 mg (carril 3) o 20-30 mg (carril 4) y la cirugía se realizó inmediatamente (protocolo modificado) sin el reactivo de estabilización de ARN, la separación del ARN fue menos exitosa que en el control del tejido hepático y se observaron bandas inespecíficas.
Evaluación de la integridad de las muestras de ARN según un protocolo quirúrgico modificado inmerso en reactivo de estabilización de ARN
La integridad de los ARN producidos con el reactivo de extracción de ARN depende del tiempo de conservación y la temperatura (carril 5-8). En comparación con el tejido hepático de control, la separación del ARN no tuvo éxito cuando la cantidad de tejido pancreático fue de 50 mg (carril 5) o 20-30 mg (carril 6). El ARN se extrajo inmediatamente después de que el tejido se sumergiera en el reactivo de estabilización del ARN. No se observó ninguna banda específica cuando se sumergió 20-30 mg de tejido en reactivo de estabilización de ARN a -80 oC durante 48 h y se extrajo ARN según el protocolo. Según los resultados de la electroforesis, el ARN se degradó por completo (carril 7). Como se muestra en el carril 8, se observaron bandas aceptables (28S/18S rRNA) después de sumergir 20-30 mg de tejido pancreático en reactivo de estabilización de ARN a -80 oC durante 24 h, y luego se extrajo ARN.
Figura 1: Evaluación de la integridad del ARN aislado de los tejidos pancreáticos de rata utilizando reactivo de extracción de ARN de acuerdo con los protocolos bajo la investigación. El carril 1 representa la integridad del ARN obtenido del hígado como un control. El carril 2 representa el estado de las bandas de RRNA 28S/18S en el ARN total obtenido a partir de un protocolo quirúrgico de rutina. El carril 3 representa el estado de las bandas de RRNA 28S/18S en el ARN total obtenido a partir de un protocolo quirúrgico modificado y 50 mg de tejido. El carril 4 representa el estado de las bandas de RRNA 28S/18S en el ARN total obtenido a partir de un protocolo quirúrgico modificado y 20-30 mg de tejido. El carril 5 representa el estado de las bandas de RRNA 28S/18S en el ARN total obtenido a partir de un protocolo quirúrgico modificado y 50 mg de tejido extraído inmediatamente después de sumergirse en el reactivo de estabilización de ARN. El carril 6 muestra la integridad del ARN obtenido a partir de 20-30 mg de tejido pancreático de un protocolo quirúrgico modificado extraído inmediatamente después de sumergirse en el reactivo de estabilización de ARN. El carril 7 representa la integridad del ARN obtenido a partir de 20-30 mg de tejido de un protocolo quirúrgico modificado después de 48 horas de inmersión en un reactivo de estabilización de ARN a -80 oC. El carril 8 representa la integridad del ARN obtenido a partir de 20-30 mg de tejido de un protocolo quirúrgico modificado después de 24 horas de inmersión en un reactivo de estabilización de ARN a -80 oC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En biología molecular es vital obtener ARN de alta calidad. La presencia de las enzimas ribonucleasa en células y tejidos degrada rápidamente el ARN y hace que la extracción sea compleja. Las ARN son enzimas estables que funcionan sin ningún cofactor. Pequeñas cantidades de ARN son adecuadas para destruir el ARN. Cuando el tejido pancreático de rata se extrae de la cavidad abdominal, es necesario desinfectar los instrumentos quirúrgicos con detergentes fuertes, enjuagarlos bien y ponerlos en un horno durante al menos 4 horas a 240 oC para inactivar las adnases antes de la cirugía. Dado el hecho de que el nivel de ARNa es extremadamente alto en el páncreas, el lugar de la cirugía se esteriliza con NaOH y lejía leve para desactivar las adnases. Mientras que el tejido pancreático se está extirpando durante la disección, el ARN se degradaría. Para aumentar la eficiencia, es necesario que la disección se complete lo más rápido posible20,21,22,23,24.
El páncreas es un tejido crítico para los mecanismos homeostáticos del cuerpo. Por lo tanto, la mejora de los procedimientos de extracción de ARN pancreático ayuda a los investigadores a entender mejor las vías activas. El presente protocolo propuso un modelo para un método eficiente, simple y optimizado para la extracción de ARN del páncreas. Se evaluaron diferentes métodos comunes de extracción de ARN del tejido pancreático. Se concentró en el efecto del almacenamiento congelado y las estrategias de inhibición de la RNase que influyen en la calidad del ARN. Los dos factores más significativos que influyen en la integridad del ARN son la duración de la cirugía y la cantidad de tejido pancreático recogido. Estudios recientes han revelado que existe una correlación positiva entre la degradación del ARN y la cantidad de tejido pancreático8,13,20.
En este protocolo, 20-30 mg de tejido pancreático se obtuvo en menos de 2 min de las ratas anestesiadas. Los largos pasos quirúrgicos pueden conducir a la activación de endonucleas endógenas en el páncreas y degradar el ARN rápidamente. En este estudio, el ARN se aisló de diferentes muestras con tiocianato de guanidinio, y las técnicas de extracción de fenol-cloroformo utilizaron nitrógeno líquido para impedir la actividad del ARN. El método logró tres objetivos: permeación rápida del reactivo de estabilización del ARN en los tejidos pancreáticos, protección del ARN celular y mayor tiempo de conservación. Los resultados fueron óptimos cuando las muestras que contenían reactivo de estabilización de ARN se mantuvieron a -80 oC durante 24 h.
Sin embargo, la integridad del ARN aumentó significativamente cuando se introdujo el reactivo de estabilización del ARN. Además, este proceso era reproducible. Una pequeña sección del páncreas (20-30 mg) fue diseccionada durante la cirugía de ratas anestesiadas y sumergida en 1 ml de reactivo de estabilización de ARN a -80oC durante 1-2 días. Como se ve en el carril 8, el almacenamiento durante 24 h fue el momento óptimo.
Los métodos antes mencionados permitieron que una menor cantidad de reactivo de estabilización de ARN penetre en el órgano. Además, el proceso de degradación se interrumpió poco después de los experimentos porque el tamaño de las piezas diseccionadas era pequeño. En este protocolo, el paso vital es cortar el tejido sumergido en el reactivo de estabilización de ARN a piezas muy pequeñas tan pronto como sea posible hasta que penetre en las células y suprima la activación de la RNase. En el paso de homogeneización, es muy crucial evitar la producción de burbujas en el reactivo de extracción de ARN y realizar todos los pasos a 4 oC. Es crucial separar la fase acuática (la fase que contiene el ARN) con mucho cuidado para evitar la contaminación del ADN. Aunque la autolisis y la presencia de ARN endógenos comprometen el aislamiento intacto del ARN del páncreas de rata, la integridad del ARN se mantuvo en el método de perfusión de páncreas propuesto. Por lo tanto, el método propuesto es un procedimiento sencillo, reproducible y económico que requiere cantidades más pequeñas de reactivo de estabilización de ARN que los otros métodos existentes.
Como cualquier estudio, este protocolo tiene algunas limitaciones. En primer lugar, la integridad y el rendimiento del ARN obtenido es menor que el uso de tejido pancreático entero, ya que sólo se utilizan 20-30 mg de tejido. En segundo lugar, un gran número de muestras no se pueden tomar en un día porque la extracción de ARN y también las pruebas de síntesis de ADNn. se deben hacer rápidamente y consecutivamente para disminuir la degradación del ARN. En tercer lugar, para realizar proyectos de investigación con diferentes grupos de ratas, es esencial tomar exactamente 20-30 mg de tejido de la misma área quirúrgica para disminuir la variación de los datos porque el tejido pancreático de rata se difunde completamente en la cavidad peritoneal.
Para concluir, el uso de la solución de reactivo de extracción de ARN después de la perfusión de reactivos de estabilización de ARN es una buena alternativa a los kits de extracción de ARN costosos y basados en columnas.
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Disclosures
Ninguno declarado.
Acknowledgments
El presente estudio fue apoyado financieramente por la Universidad de Ciencias Médicas de Shiraz (Grant No. 93-01-01-7178-03-07-2014). Agradecemos al Sr. Zomorodian y al Sr. Rostami en el Departamento de e-Learning en Ciencias Médicas, Escuela Virtual y Centro de Excelencia en e-Learning, Universidad de Ciencias Médicas de Shiraz por editar el video.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Merck | 116801 | Germany |
| Atoclave | Teb Zaim | Iran | |
| Centrifuge | Sigma | Germany | |
| Chloroform | Merck | 107024 | Germany |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC)-treated water | Sigma | Germany | |
| EDTA | sigma | 60-00-4 | Germany |
| Electrophoresis tank | Payapajoohesh | Iran | |
| Eppendorf microTube | Extragene | Taiwan | |
| EtBr | sigma | E 8751 | Germany |
| Ethanol | Merck | 81870 | Germany |
| Falcon Tube | Extragene | Taiwan | |
| Formaldehyde | Merck | 344198 | Germany |
| Formamide | Merck | 344206 | Germany |
| Homogenizer-sunicator | Microson XL 2000 | USA | |
| Isopropanol | sigma | 19516 | Germany |
| Ketamine hydrochloride | sigma | 1867-66-9 | Germany |
| Laminar Flow Hood | Jal Tajhiz | Iran | |
| Mgnetic stirrer | Labrotechnik | USA | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | Germany | |
| Micropipette Tips | Extragene | Taiwan | |
| MOPS | sigma | 85022106 | Germany |
| Na AC | Merck | 567422 | Germany |
| NaOH | Merck | 109137 | Germany |
| Oven | Teb Zaim | Iran | |
| PH meter | Knick | Germany | |
| RNA Later/RNA stabilization reagent | Qiagen | 76104 | USA |
| Surgical instrument | Agn Thos | German made | |
| Syringes | AvaPezeshk | Iran | |
| TriPure reagent/RNA extraction reagent | Roche | 11667157001 | USA |
| Vortex | Labinco | Netherland | |
| Water bath | Memmert | Germany | |
| zylazine | sigma | 7361-61-7 | Germany |
References
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