Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

כמויות של וירוס כלבת במבני מוח שור שונים

Published: May 22, 2021 doi: 10.3791/61429
Automatic Translation
1, 2, 3, 1
1Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Microbiología Animal (CENID-MA), INIFAP, 2Campus Toluca, Universidad del Valle de México, 3Facultad de Ciencias Naturales, Universidad Autónoma de Querétaro

Summary

פרוטוקול זה מציג גישה מבוססת qRT-PCR לקביעת מספר עותק הגן נוקלאופרוטאין (N) של וירוס הכלבת בתוך מבנים אנטומיים שונים במוח שור באמצעות שעתוק במבחנה.

Abstract

כלבת משותקת שור (BPR) היא צורה של דלקת המוח נגיפית כי הוא בעל חשיבות כלכלית משמעותית ברחבי אמריקה הלטינית, שם הוא מהווה סיכון זואונוטי גדול. כאן, המטרה שלנו הייתה להשתמש בפרוטוקול מעבדה כדי לקבוע את מספר העותק היחסי של הגנום של נגיף הכלבת (RABV) במבנים אנטומיים שונים במוח שור באמצעות תגובת שרשרת פולימראז שעתוק הפוך כמותית בזמן אמת (qRT-PCR). qRT-PCR מכמת את המספר הספציפי של עותקי גנים הנמצאים במדגם המבוסס על פלואורסצנטיות הנפלטת לאחר הגברה שהיא פרופורציונלית ישירות לכמות חומצת גרעין היעד הקיימת במדגם. שיטה זו היא יתרון בשל משך הזמן הקצר שלה, סיכון מופחת לזיהום, ופוטנציאל לזהות חומצות גרעין ויראליות בדגימות שונות בקלות רבה יותר בהשוואה לטכניקות אחרות. מוחם של שישה בעלי חיים נגועים בכלבת חולק לשישה מבנים אנטומיים, כלומר קרן אמון, המוח הקטן, קליפת המוח, מדולה, פונס ותלמוס. כל המוחות זוהו כחיוביים לאנטיגנים של RABV בהתבסס על בדיקת כשל חיסוני ישירה. אותם מבנים אנטומיים ממוחות של ארבעה שור שלילי RABV הוערכו גם. RNA חולץ מכל מבנה ושימש qRT-PCR. בוצעה חקירה כדי לקבוע את מספרי העותקים של גנים RABV באמצעות גן נוקלאופרוטאין מועתק במבחנה. העקומה הסטנדרטית המשמשת לכימות RNA ויראלי הציגה יעילות של 100% וליניאריות של 0.99. ניתוח גילה כי קליפת המוח, medulla, ו תלמוס היו החלקים האידיאליים של מערכת העצבים המרכזית לשימוש בזיהוי RABV, בהתבסס על התצפית כי מבנים אלה היו בעלי הרמות הגבוהות ביותר של RABV. הספציפיות למבחן הייתה 100%. כל הדגימות היו חיוביות, לא זוהו תוצאות חיוביות שגויות. שיטה זו יכולה לשמש כדי לזהות RABV בדגימות המכילות רמות נמוכות של RABV במהלך אבחון של BPR.

Introduction

כלבת ניתן לאשר ante-mortem ולאחר המוות על ידי טכניקות שונות המאפשרות זיהוי של חומצות גרעין ויראלי במוח, בעור, בשתן, או רוק1. גילוי הגן נוקלאופרוטטין (N) של נגיף הכלבת משמש בעיקר לאבחון כלבת על ידי בדיקות מולקולריות. גן זה משמש גם עבור genotyping ויראלי. כלבת ניתן לאבחן בבעלי חיים באמצעות כל חלק של המוח המושפע; עם זאת, כדי לשלול את האפשרות של כלבת, רקמה משני אזורים לפחות במוח חייב להיבדק2. מספר שיטות אבחון קיימות לגילוי כלבת בבעלי חיים; עם זאת, מבחן כשל חיסוני ישיר נשאר טכניקת הייחוס הסטנדרטית3. בדיקות אחרות כוללות בדיקות ביולוגיות המשלבות חיסון עכבר, זיהום בתרבית הרקמות ותגובת שרשרת פולימראז (PCR)4. כל הטכניקות הללו מומלצות על ידי ארגון הבריאות העולמי (WHO) והארגון העולמי לבריאות בעלי חיים (OIE) לאבחון כלבת בבני אדם ובעלי חיים, בהתאמה5.

טכניקות לגילוי והגברה של חומצות גרעין חוללו מהפכה באבחון הכלבת בשנים האחרונות6 וטכניקות אלה ממלאות תפקיד חשוב באבחון ante mortem של כלבת אנושית. מספר בדיקות מבוססות PCR הוערכו כדי להשלים בדיקות קונבנציונליות עבור אנטה-נתיחה שלאחר המוות כלבת מאבחנת7,8,9,10. רוב בדיקות היעד כלבת גן נוקלאופרוטאין ויראלי להגברה שהוא האזור השמור ביותר בגנום הנגיפי1,11. ב-20 השנים האחרונות פותחו מבחנים מולקולריים שונים לאבחון RABV, וחלק מהמבחנים הללו שימשו לאפיון וירוסים. רוב הניסויים נועדו לזהות גנים שמורים בתוך הגנום הנגיפי, לרוב באמצעות תגובת שרשרת פולימראז קונבנציונלית או כמותית בזמן אמת (qRT-PCR) מבחנים12,13.

PCR היא טכניקת אבחון רגישה מאוד שיכולה לזהות את הגנום של פתוגן נתון בתוך רקמות, גם כאשר רקמות אלה מפורקים. באמצעות גישות מבוססות PCR, כמויות מינימליות של סוכן זיהומיות ניתן לזהות במדגם קליני באמצעות הגברה סלקטיבית וחוזרת על עצמו של רצף נוקלאוטידים DNA14. qRT-PCR המשלב בדיקות פלואורסצנטיות (למשל, TaqMan) או צבעי מחייב DNA (למשל, SYBR גרין) שימש בניסויים כדי לאבחן RABV הן אנטה- ואחרי- נתיחה שלאחר המוות עם רגישות גבוהה; עם זאת, גישה כזו דורשת ציוד מיוחד. כדי להתגבר על מגבלה זו, הוצעה הגברה איסותרמית בתיווך לולאת שעתוק הפוכה (RT-LAMP), בהתבסס על העלות הנמוכה, הפשטות והמאפיינים הרצויים לגילוי RABV. זה assay חשוב במיוחד כפי שהוא יכול לשמש במדינות מתפתחות15.

qRT-PCR מבוסס על זיהוי וכימות של מולקולה, שבו עליות אות פלואורסצנטי הן ביחס ישיר לכמות של מוצר PCR בתגובה אחת. ככל שמספר העותקים של מטרת חומצת הגרעין גדל, כך גם הפלואורסצנטיות. צבעים בין-ציריים לא ספציפיים כגון צבע מחייב DNA של SYBR Green או בדיקות אוליגונוקלאוטיד ספציפיות לרצף הנושאות פלואורופור ומרווה משמשים בדרך כלל כדי לספק את הקריאה הפלואורסצנטית ב- qRT-PCR. בדיקה זו מציעה יתרונות על פני RT-PCR קונבנציונלי הכולל זמן בדיקה קצר יותר (2-4 שעות), סיכון מופחת לזיהום עקב מערכת הצינור הסגור (חוסר מניפולציה שלאחר PCR של מוצרים מוגברים), ואת היכולת לזהות מטרות שונות בו זמנית16. qRT-PCR יכול לשמש כדי לאבחן כלבת ante-mortem מן הרוק ודגימות אחרות. בדיקה זו יכולה לשמש גם כמבחן אוניברסלי בזמן אמת לגילוי מינים שונים של Lyssavirus או שושלת של RABV15. בגישה משולבת זו RT-PCR, שתי תגובות משמשות. הראשון מזהה שושלת גנטית שונה של RABV, והשני מזהה את המין Lyssavirus. שני השלבים כוללים מבחני qRT-PCR, שבהם הראשון משתמש בבדיקות הכלאה והשני משתמש בצבעים15. בשל מספר רב של בדיקות שהוכיחו גילוי מולקולרי מוצלח של RABV באמצעות טכניקה זו, המדריך היבשתי הנוכחי OIE (2018) ממליץ על שימוש PCR לגילוי מולקולרי של RABV17.

מקסיקו היא מדינה עם פוטנציאל בעלי חיים ניכר. המדינות עם ייצור בעלי החיים הגבוה ביותר מכילות הן אזורים טרופיים לחים והן אזורים יבשים הנמצאים בסיכון להתפרצויות כלבת בשל נוכחותו של עטלף הערפד דמודוס רוטונדוס, המשדר העיקרי של כלבת. לכן, חיוני לפתח כלים נוספים למניעה ושליטה של כלבת משותקת שור (BPR) ב México. בהתבסס על כך, מטרת המחקר הייתה להשתמש qRT-PCR כמותי כדי לקבוע את מספר החלקיקים הנגיפיים במבנים אנטומיים שונים של מוחות שור לאחר המוות עקב זיהום כלבת.

שישה מוחות שהתקבלו שור רב"ו חיובי נתרמו על ידי מעבדה חיצונית לשימוש בפיתוח פרוטוקול qRT-PCR המתואר להלן. דגימות מבנה המוח שור הועברו שרשרת קרה אל INIFAP CENID-MA מעבדה BSL-2 מתקן מאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס עד השימוש. המוחות הושגו מבעלי חיים ממדינות קמפצ'ה, יוקטן וקוורטארו. לפני הקבלה, מבנים שונים נותחו מהמוח. מבנים אלה כללו את קרן אמון, המוח הקטן, קליפת המוח, מדולה, פונס ותלמוס18,19. חומר גנטי חולץ כמתואר להלן. אבחון RABV אושר באמצעות נוגדנים פלואורסצנטיים ישירים (DFA)20. כשליטה חיובית, מוחות עכבר שחסנו עם RABV21 שימשו. בנוסף, ארבעה מוחות בקר שליליים RABV (כפי שנקבע על ידי DFA) שימשו פקדים שליליים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

מחקר זה אושר ונערך בהתאם להמלצות לשימוש בבעלי חיים המסופקים על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של סנטרו נאסיונאל דה Investigación משמעת en Microbiología Animal (CENID-MA).

1. דוגמאות

  1. השתמש באזורים שונים של המוח מנותח מ 6 מוחות שור שונים כלבת חיובית לניתוח RT-PCR.

2. נוגדנים פלואורסצנטיים ישירים (DFAs) לאישור כלבת

הערה: זיהוי אנטיגן כלבת על ידי DFA היא שיטה איכותית כדי לקבוע את נוכחותו של נוקלאופרוטיין כלבת באמצעות נוגדנים שכותרתו פלואורסצנטיים. הבדיקה בוצעה באמצעות הפרוטוקול שסופק על ידי דין ואח ' (1966)20, כמתואר להלן.

  1. לעשות שני רשמים מכל רקמה מנותח ממבני מוח שונים על שקופית סטרילית של כ 15 מ"מ קוטר. השתמש אפליקטור עץ למרוח כ 3 מ"מ3 חלק של הרקמה על המגלשה סטרילית. כדי ליצור את ההכפשה, לחץ בעדינות על אפליקטור העץ כנגד השקופית באופן ידני.
  2. תקן את שקופיות מריחת הדגימה על-ידי שקיעת השקופיות ב- 100% אצטון למשך שעה אחת ב- -20 °C (69 °F). לאחר הדגירה, יבש את המגלשות על מטלית יבשה ב 21 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
  3. הוסף 50 μL של נוגדן אנטי נוקלאופרוטאין שכותרתו פלואורסצנטין לכל מריחת מוח בדילול 1:10 על ידי מחלק דרך מזרק.
  4. דגירה את המגלשות עם המצומד בתא לח ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1 שעות.
  5. לאחר הדגירה, לשטוף את המגלשות פעמיים עם מים עם PBS כדי למנוע מצוות עודף. אפשר לשקופיות להתייבש ב-21°C. כתם בזהירות כדי להסיר נוזל עודף ולאחר מכן לזמן קצר אוויר יבש לפני ההרכבה.
  6. מוסיפים טיפה של 50% גליצרין פוספט כדי לכסות את פני השטח של החלק, ולאחר מכן לכסות עם coverlip. שים לב לחלקים תחת מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי בהגדלה של פי 40.
    1. מעבדים ומתבוננים בבקרות החיוביות והשליליות (שליטה חיובית: מוחות עכברים מחוסנים עם RABV; בקרות שליליות: מוחות שור שליליים של RABV) באותו אופן כמו הדגימות.

3. יצירת שליטה חיובית עבור RT-PCR

  1. השג תאי BHK-21 מבנק החיידקים. השתמש בתאים עד הקטע ה-70 כדי לשכפל את זן RABV אוולין-רוקיטניקי-אבלסט (ERA) באמצעות מעבר 2.
  2. לשמור ולהפיץ תאים BHK-21 בבקבוקים המכילים מינימום בינוני חיוני (MEM) בתוספת 10% סרום עגל עוברי (FCS) ב 37 °C (70 °F) בנוכחות CO2 (5%) ובתנאים לחים. לגדל את התאים 25 ס"מ2 צלושי תרבות עד שהם מגיעים 80% מפגש ולאחר מכן תת תרבות.
  3. מוציאים את מדיום התרבות מהתאים ושוטפים את הבקבוק עם מלוחים עם אגירת פוספט (PBS). לחסן את התרבות עם 105 TCID / mL של ERA זן RABV. דגירה inoculum ויראלי במשך 2 שעות תחת טלטול מתמיד ב 37 °C (69 °F) בנוכחות CO2 (5%) ובתנאים לחים.
  4. הסר את מדיום הזיהום והוסף MEM בתוספת 5% (שור עוברי בסרום) SFB. דגירה עבור 72 שעות ב 37 °C (69 °F) בנוכחות CO2 (5%) בתנאי לחות.
  5. קציר RABV 3 ימים לאחר החיסון כאשר התאים להפגין השפעות ציטופתיות. להקפיא את התאים הנגועים ולאחר מכן להפשיר אותם ב 4 מעלות צלזיוס כדי lyse התאים. לאסוף את המדיום מהבקבוק, ולאחר מכן למקם את התאים לתוך צינור צנטריפוגה עבור צנטריפוגה ב 1,050 x g במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
  6. אחסן את supernatants מ RABV ב -80 °C (60 °F), ולהכין aliquots עובד לאחסון ב -70 °C (70 °F).
  7. Intracerebrally לחסן את הנגיף המתקבל בשלב הקודם לתוך 21 יום נקבה CD1 עכברים. השתמש מזרק 1 מ"ל לחסן 50 μL של פתרונות המכילים 106 MICLD50 (מינון קטלני תרבות זיהומית העכבר 50%) מינונים לעכברים22.

4. מיצוי RNA

הערה: סך הכל RNA הוצא ישירות ממוחות שור באמצעות שיטת מיצוי אורגנית על פי הפרוטוקול הבא.

  1. השתמש 100 מ ג של רקמת המוח מכל מבנה אנטומי כדי לחלץ RNA הכולל באמצעות ריאגנט זמין מסחרית המכיל guanidium isothiocyanate.
  2. באופן ידני הומוגניזציה סך של 100 מ"ג של רקמה מכל מבנה ב 1 מ"ל של מגיב guanidium isothiocyanate על ידי מערבולת באמצעות homogenizer Dounce עם עלה קטן בתוך microtube עבור 15 s במהירות המרבית.
  3. דגירה את הדגימות על הקרח במשך 5 דקות, ולאחר מכן להוסיף 200 μL של כלורופורם. מערבבים את הדגימות במרץ במשך 15 s, דגירה על קרח במשך 2 עד 3 דקות, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 12,000 x גרם במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
  4. מעבירים את השלב המים לצינור נקי ומוסיפים 500 μL של אלכוהול איזופרופיל. דגירה את הדגימות במשך 15 דקות ב 21 מעלות צלזיוס.
  5. צנטריפוגה הדגימות ב 12,000 x g במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לשאוף את העל-טבעי המים על-ידי צנרת. הרנ"א המבודד יהיה נוכח ככדור בצינור.
  6. לאחר מכן, לשטוף את גלולת RNA עם 1 מ"ל של 75% אתנול על ידי pipetting, וצנטריפוגה ב 7500 x g במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
  7. גינו את גלולת ה-RNA על-טבעית ויבשה את האוויר בטמפרטורת החדר (21°C). לאחר מכן, לדלל את גלולה ב 50 μL של מים ללא גרעין.
  8. לקבוע את ריכוז RNA ואיכות ב 260 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר. יש לאחסן את ה-RNA ב-80°C עד לשימוש.
  9. הסר DNA מדגימות RNA על ידי עיכול עם DNase I. הוסף 2 U של DNase אני לכל 1 מיקרוגרם של RNA שחולצו בשלב הקודם. לאחר מכן, להוסיף 5 μL של חיץ תגובה 10x ולאחר מכן דגירה ב 37 °C (69 °F) במשך 30 דקות. להשבית את DNase אני על ידי הוספת 1 μL של EDTA לתערובת ואחריו דגירה במשך 10 דקות ב 65 מעלות צלזיוס.

5. סינתזת cDNA ו- PCR

  1. לסנתז cDNA גדיל ראשון באמצעות oligo dT ותעתיק הפוך. עבור כל 1 מיקרוגרם של RNA, להוסיף 1 μL של oligo DT (500 מיקרוגרם / מ"ל), 1 μL של 10 מ"מ תערובת dNTP, ומים מזוקקים ללא גרעין לנפח סופי של 12 μL. דגירה את התערובת ב 65 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
  2. מצננים את תערובת התגובה ל-4 מעלות צלזיוס. צנטריפוגה הצינור במשך 30 s ב 1,050 x g, ולאחר מכן להוסיף 4 μL של מאגר תגובה, 2 μL 0.1 M DTT, ו 1 μL של מעכב ריבונוקלאאז (40 U / μL).
  3. דגירה תערובת התגובה ב 37 °C (69 °F) במשך 2 דקות, ולאחר מכן להוסיף 1 μL של שעתוק הפוך (200 U). לאחר מכן, להדגיר את תערובת התגובה במשך 50 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להשבית את התגובה ב 70 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
  4. אחסן את ה- cDNA ב- -20 °C (60 °F) לפני השימוש.
    הערה: כדי לאמת את איכות cDNA מסונתז, לבצע את ההגברה של שבר 761 bp של הגן RABV N לפני ביצוע הסינתזה במבחנה. השתמש בפרוטוקול המתואר על ידי Loza-Rubio ואח '11 כמתואר בשלב 5.5 להלן.
  5. בצע PCR באמצעות פולימראז DNA Taq בתנאים הבאים. בצע את הגדרת התגובה באופן הבא: 10x מאגר Taq המכיל 20 mM MgCl2, 0.2 mM dNTPs, 1 U Taq פולימראז, 10 מיקרומטר של כל פריימר (SuEli+: 5′ cgtrgaycaatatgagataca 3′ ו SuEli-: 5′ caggctcraacatcttctta 3′), 2.5 μL של cDNA, ומים אולטרה-סגולים לנפח סופי של 50 μL.
  6. בצע את ההגברה בתרמוציקלר באמצעות תנאי הרכיבה הבאים: 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות; 35 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, ו-72 מעלות צלזיוס למשך דקה; מחזור אחד של 72 מעלות צלזיוס במשך 7 דקות.
  7. להעריך את נוכחותם של 761 bp מוצרי PCR באמצעות 1% ג'ל agarose.

6. תעתיק במבחנה

הערה: שעתוק במבחנה יוצר mRNA של גן היעד. השתמש בזוג פריימרים המגבר את הגן המלא RABV N וכזה המשמש כפקד חיובי עבור בדיקת qRT-PCR. פריימרים אלה נועדו להגביר את הגן המלא RABV N ולהוסיף מקדם שמכיר פולימראז T7 (TAATACGACTCACTATAG).

  1. כדי להגביר את כל הגן N RABV, השתמש פריימרים טרנס-Nrab קדימה (5ʹ 3ʹ gatgatcactcgaatattctt) ולהפוך (5ʹ caataatacgactactactataggtggatggaccgacaagatt 3ʹ) וערכת PCR נאמנות גבוהה.
    1. עבור כל תגובה, להכין שילוב PCR הראשי על ידי הוספת מאגר תגובה נקי PCR צינור 10x, 2 מ"מ DMSO, 25 mM MgCl2, 10 מ"מ dNTPs, 10 מיקרומטר של כל פריימר, 0.5 U של פולימראז נאמנות גבוהה, 1.5 μL של cDNA (מוכן בשלב 5), ומים אולטרה לנפח הסופי של 50 μL.
    2. השתמש thermocycler להגדיר את התנאים הבאים להגברה: 94 °C (69 °F) במשך 1 דקות; 4 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס למשך דקה, 40 מעלות צלזיוס למשך דקה ו-72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות; 35 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס למשך דקה, 60 מעלות צלזיוס למשך דקה ו-72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות; הארכה סופית של 72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות.
  2. כדי להשתמש במוצר PCR כתבנית לסינתזת במבחנה ולהסיר רכיבים של התגובה האנזימטית משלב 6.1.2, לטהר את מוצר ה- PCR באמצעות ערכת קונצנטרית מבוססת עמודה בהתאם להוראות היצרן, ולאחר מכן לכמת באמצעות ספקטרופוטומטר.
  3. עבור סינתזת RNA, השתמש בערכת שעתוק במבחנה עם תערובת התגובה הבאה: 5 μL T7 שעתוק 5x חיץ, 1.9 μL של כל נוקלאוטיד טריפוספט, 10 מיקרוגרם של דנ"א רבו N DNA מטוהר VP2, ו 2.5 μL של תערובת האנזים. לאחר מכן, דגירה את התערובת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות. לאחר מכן, להוסיף 1 μL של 1 U / מיקרוגרם RNase ללא DNase לתערובת התגובה דגירה במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס כדי למנוע זיהום DNA.
  4. לטהר את ה- RNA המעתיק במבחנה ולאחר מכן לרכז אותו באמצעות פנול:כלורופורם:אלכוהול isoamyl (25:24:1).
  5. התחדש גלולת RNA מטוהרת לתוך 70 μL של מאגר TE, ולאחר מכן לאחסן ב -80 מעלות צלזיוס עד השימוש.
  6. חזור על פרוטוקול PCR משלב 6.1 עד כ 5 מיקרוגרם של מוצר PCR מתקבל. לאחר טיהור וריכוז, mRNA גנים N מעתיק במבחנה יהיה נוכח בריכוז של 4.711 מיקרוגרם / μL.
  7. אשר כי mRNA מועתק במבחנה תואם את הגן N בעקבות שלב 5 של פרוטוקול זה ולהשתמש בזה כפקד חיובי עבור תגובת שרשרת פולימראז שעתוק הפוך בזמן אמת (qRT-PCR).

7. תגובת שרשרת פולימראז שעתוק הפוך בזמן אמת (qRT-PCR)

  1. עבור qRT-PCR, השתמש בתעתיק mRNA במבחנה המקודד את הגן N המלא כפקד חיובי יחד עם ערכת qRT-PCR מסחרית חד-שלבית באמצעות בדיקות הכלאה בהתאם להוראות היצרן. השתמש בדיקה פריימרים המתוארים על ידי קרניירו ואח '.(2010)23 כדי לזהות אזור שמור של הגן RABV N (BRDesrot-Rev: 5′ aaactcaagagagaggccaacca 3′, BRDesrot-Fwd: 5′ cgtactgatgtggaagggaattg 3′, ו BRDesrot-בדיקה: 5′-FAM-acaagggactacttacttcagagcatgc-3′-BHQ).
  2. השתמש בתנאי רכיבה תרמית הבאים: 1 מחזור של 50 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ו 95 מעלות צלזיוס במשך 2 דקות; 40 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס ל-15 שניות ו-50 מעלות צלזיוס ל-30 שניות.

8. עקומת כיול או עקומה סטנדרטית

  1. בצע דילול סדרתי של mRNA תעתיק במבחנה על ידי צינור סדרתי 1 מיקרוגרם / μL של mRNA לתוך צינורות עד שישה דילול decuple מתקבלים. הכינו צינורות בנפח של 100 μL משולש לשימוש ביצירת העקומה הסטנדרטית. בצע qRT-PCR כמתואר בשלב 7.
  2. בצע qRT-PCR בתרמוציקלר עם רוטור על-ידי עיבוד דגימות המוח השונות בו-זמנית עם התגובות הפועלות ליצירת העקומה הסטנדרטית ושימוש בפקדים חיוביים, פקדים שליליים ו- supernatants המבודדים מתרבות התאים.
  3. כדי להעריך את מגבלת הזיהוי, יעילות הבדיקה ורגישות הבדיקה, השתמש בעקומה סטנדרטית המשולשת באותם תנאים.

9. qRT-PCR של דגימות ביולוגיות

  1. לגילוי של גן RABV N, להשתמש RNA מדגימות שדה, פקדים חיוביים, פקדים שליליים, supernatants תרבות התא לבצע qRT-PCR באמצעות ערכת PCR המתואר בשלב 7.
  2. כדי לקבוע את מספר העותקים של הגנום RABV הנמצא בדגימות המוח בקר, להשיג נתוני Ct מן העקומה הסטנדרטית ודגימות ביולוגיות ואלה interpolated משוואת עקומת הכיול.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תוצאות DFA הראו 100%, 100%, 83.3%, 66%, ו 50% חיוביות עבור RABV בקליפת המוח, התלמוס, medulla, pons, וקרן, בהתאמה. תוצאות אלו אישרו את התוצאות הקודמות, ולפחות שלושה מהמבנים שניתחו מכל מוח היו חיוביים עבור RABV. באיור 1מוצגת צביעה חיובית מייצגת של חיל האוויר.

איור 2 מראה את ההגברה של שבר של הגן RABV N (שלב 5.5) עם ראשונים שדווחו על ידי Loza-Rubio et al.11. זה הראה כי החומר המתקבל לשמש הגברה היה באיכות טובה.

גודל הקטע שהוגבר על-ידי PCR מוצג באיור 3. המשוואה של העקומה הסטנדרטית מראה את הקשר בין כמות התוכן הגנטי RABV במדגם לבין גודל הקטע המוגבר של PCR. כמות התוכן הגנטי RABV (ב ng) הוסק על ידי אינטרפולציה של ערכי Ct בעקומת הכיול באמצעות המשוואה המוצגת באיור 4. באמצעות משוואה זו, מגבלת הגילוי של 1 x 105 מיקרוגרם / μL של RNA ויראלי נמצאה תואמת 36 עותקים של הגנום RABV. תוצאות אלו מראות כי הבדיקה רגישה וניתן להשתמש בה כדי לזהות את הנגיף בדגימות המכילות מספר נמוך של עותקים גן RABV N. היעילות של ההסתעפות חושבה באמצעות השיפוע של העקומה הסטנדרטית, אשר היה -3.28. הדגימות המשמשות qRT-PCR הראו הגברה של הגן RABV N.

כדי לקבוע את מספר העותק הנגיפי הקיים, ערכי ה- Ct עבור כל דגימה התערבבו באמצעות משוואת עקומת הכיול. התוצאה שהתקבלה (בננוגרם) הוחלף בנוסחה המתוארת להלן מתוך השופט הבא.24:

מספר עותקים RABV N גן = (מדגם ng * 6.022 x 1023) / (104 bp (אורך מוצר PCR) * 1 x 109 * 650).

באופן יחסי, התוצאות של מבחני qRT-PCR היו עולות בקנה אחד עם אלה שהושגו באמצעות DFA. על פי התוצאות שהתקבלו במבחן qRT-PCR במקרים C ו- D (טבלה 1), התלמוס הוא המבנה בעל המספר הגבוה ביותר של עותקים של הגן RABV N. זה מרמז כי זיהום מוקדם של נוירונים היפותלמיים ותלמיים חשוב בהתפתחות המחלה, בהתחשב בכך נוירונים אלה לשלוט על הפונקציות הצמחיות של בעל חיים. מספרי ההעתקה של הגן RABV N שזוהו בכל מבנה של כל דגימה מוצגים בטבלה 1. הרגישות והספציפיות של בדיקת qRT-PCR היו שניהם 100%, כמו כל הדגימות היו חיוביות. תוצאה זו עולה בקנה אחד עם האבחנות הראשוניות של הדגימות.

Figure 1
איור 1: רקמות מוח שור מראה כתמים חיוביים על פי בדיקת כשל חיסוני ישירה המזהה חלבון וירוס כלבת N ברקמות נגועות. צבע ירוק תפוח נצפה על כתמים, שבו הנוגדן נקשר אנטיגן כלבת. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: 1.5% ג'ל אגרוז המציג את מוצרי ההגברה. הגברה של שבר 761 bp של הגן RABV N כדי להדגים את הנוכחות והאיכות של cDNA לשמש שעתוק במבחנה. נתיב 1 מכיל סמן משקל מולקולרי, קו 2: הגברה של שליטה חיובית; נתיב 3: שליטה שלילית (מדגם שאינו נגוע); קו 4: הגברה של cDNA המשמש לתעתיק במבחנה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: 1.5% ג'ל אגרוז המציג את מוצרי ההגברה. הגברה של הגן N המלא מוצגת בנתיב 2. נתיב 1 מכיל סמן משקל מולקולרי, ונתיב 3 מכיל את בקרת ההגברה השלילית. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: עקומה סטנדרטית של qRT-PCR באמצעות mRNA של גנים מסוג N בתעתיק במבחנה כדי לכמת את מספר העותקים של הגן RABV N. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

מוח מזהה מבנה חיל-האוויר מספר עותקים (x109)
א הצופר של אמון + 0.261
המוח הקטן + 0.0663
קורטקס + 0.02
מדולה (שם שלי) + 0.146
פונס + 30.7
התלמוס (תלמוס) + 108
B , תואר שני הצופר של אמון - 0.0251
המוח הקטן + 4.64
קורטקס + 12.4
מדולה (שם שלי) + 0.175
פונס \u2012 0.0721
התלמוס (תלמוס) + 121
ג הצופר של אמון \u2012 0.168
המוח הקטן + 0.0239
קורטקס + 21.5
מדולה (שם שלי) + 17.2
פונס + 1.32
התלמוס (תלמוס) + 102
ד הצופר של אמון + 11.8
המוח הקטן + 0.0239
קורטקס + 8.72
מדולה (שם שלי) + 1.25
פונס \u2012 0.0165
התלמוס (תלמוס) + 33.4
אי הצופר של אמון + 4.15
המוח הקטן + 6.78
קורטקס + 1.53
מדולה (שם שלי) + 1.41
פונס + 0.025
התלמוס (תלמוס) + 95
פ הצופר של אמון + 0.0221
המוח הקטן \u2012 0.00023
קורטקס + 4.95
מדולה (שם שלי) \u2012 0.000556
פונס + 1.02
התלמוס (תלמוס) + 89

טבלה 1: קביעת מספר העותקים של הגן RABV N בתוך כל מבנה מוח. התוצאות התקבלו משישה מבנים אנטומיים של מוחות שור חיוביים RABV שאובחנו באמצעות DFA. המילים המודגשות באותיות מודגשות מציינות את המבנים עם מספר העותקים הרב ביותר. התוצאות באו לידי ביטוי כמספר עותקים של הגן N למיליגרם של רקמה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מחקרים קודמים הראו כי DFA יכול לזהות RABV רק בתוך שבעה ימים של המדגם להיות מאוחסן בטמפרטורת החדר (21 °C (70 °F)14. לעומת זאת, עבודה זו הוכיחה כי הרגישות של RT-PCR מתחילה לרדת לאחר הדגימות נחשפו לטמפרטורת החדר במשך 12 ימים. לכן, הגנום RABV יכול להיות מזוהה על ידי qRT-PCR בדגימות חשופות לטמפרטורת החדר עד 23 ימים. זה מדגים כי הרגישות של qRT-PCR הוא גבוה יחסית עבור דגימות מפורקים יותר. עם זאת, עדיין יש צורך לפתח שיטות פשוטות יותר שאינן מתפשרות על ספציפיות25. המחקר הנוכחי הדגים מבחנה מולקולרית בעלת רגישות גבוהה יותר מאשר DFA, בהתבסס על התצפית כי היא הצליחה לזהות את הגנום הנגיפי ללא קשר למבנה המוח הספציפי.

היתרונות של טכניקת RT-PCR לשימוש באיתור סוכנים זיהומיות הודגשו במספר מחקרים מדעיים. עם זאת, טכניקה זו יכולה להפגין כמה חסרונות, כגון עלות הביצוע, כפי שהוא דורש ציוד מיוחד. אנשי צוות מיומנים נדרשים לטפל בהסתעפויות ביולוגיות מולקולריות. בנוסף, יש לציין כי כטכניקה רגישה מאוד, חלק מהשלבים הם קריטיים כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר. אחד מאלה הוא הטיפול הנכון של דגימות עבור מיצוי RNA. שלב זה הוא קריטי, כמו RNA הוא מושפל בקלות, ואת התוצאות יכול, אם כן, להיות מושפע. שקול לשמור על המדגם בתנאים קרים (כ 4 מעלות צלזיוס) במהלך התהליך. בנוסף, שקול כי מספר סבבים של יישום PCR מתבצעים כאמור בשלב 6.1 כדי ליצור את התמליל במבחנה. הסיבה לכך היא כי כמות גדולה של חומר גנטי יש צורך התגובה להניב משמעותי (יותר ממיליגרם) כמויות של DNA. היבט מכריע נוסף של בדיקה זו הוא הדרישה לטיהור החומר הגנטי בעמודים, שכן DNA עלול ללכת לאיבוד גם בשלב זה.

qRT-PCR ידוע להיות ספציפי כמו מבחן DFA, שהוא המבחן הסטנדרטי שאושר על ידי WHO ו OIE. עם זאת, מבחנים מולקולריים המעסיקים RT-qPCR הוכחו כבעלי רגישות גבוהה יותר ובכך לאפשר ניתוח של דגימות עם רמה גבוהה יותר של ריקבון כדי להקל על זיהוי של מספר קטן יחסית של עותקים של הגנום הנגיפי. זה גם הרבה יותר מהר, מפחית את הסיכון לזיהום, וניתן להשתמש בו ante-mortem26,27.

בינגהאם ואן דר מרווה (2002)28 ערכו מחקר באמצעות DFA כדי לקבוע אילו מבני מוח היו בעלי ריכוזים גבוהים יותר של הגן RABV N. בסך הכל הוערכו 252 מבני מוח ממספר מינים. התלמוס, הפון והמדולה היו מבני המוח הרלוונטיים ביותר, שכן הם היו חיוביים בכל דגימות המוח המוערכות. תוצאות אלו מסכימות עם התוצאות שהוצגו כאן, אשר היו עולות בקנה אחד עם תוצאות DFA במבנים הבאים: קליפת המוח ותלמוס, 100%; מדולה, 83.3%; פונס, 66%; וקרן, 50%. לעומת זאת, מחקרים קודמים לא דיווחו על תשלילים כוזבים. בעבודה זו, כמה תוצאות שליליות זוהו במבני מוח שלמים שאובחנו בעבר כחיוביים. ייתכן שה הסיבה לכך היא שחלק המדגם ששימש לבדיקה לא הכיל חלקיקים נגיפיים שזוהו על ידי הנוגדן או הבדיקה המולקולרית הרגישה יותר. הסבר אפשרי נוסף הוא שהדגימות לא הועברו או אוחסנו כראוי לפני הקבלה במעבדה.

בדיקת qRT-PCR שנערך במחקר זה יכול לזהות כמה 36.3 עותקים של הגן N RABV לכל מיליגרם של רקמה. מבני המוח המתאימים ביותר עבור qRT-PCR כללו את קליפת המוח ואת התלמוס. זה מבוסס על תצפיות כי ריכוזים גבוהים יותר של הגן RABV N זוהו במבנים אלה וכי הם נמצאו גם חיוביים באמצעות בדיקת התייחסות RABV. הבדיקה הצליחה לזהות ריכוזים נמוכים מאוד (0.00023 x 109 עותקים) של הנגיף בדגימות שונות. בנוסף לכימות החלקיקים הנגיפיים במדגם, נראה כי הבדיקה מספקת כלי אבחון ומחקר חלופי טוב לגילוי RABV.

עם התוצאות המתקבלות באמצעות פרוטוקול זיהוי הגנום הנגיפי של נגיף הכלבת המוצג כאן, צפוי כי טכניקה זו ניתן ליישם עבור האבחנה המולקולרית של הנגיף בסוגים שונים של דגימות, כפי שהוא מסוגל לזהות כמויות מינימליות של הגנום הנגיפי. היתרון הגדול ביותר שלה על פני שיטות אחרות כגון DFA הוא שזה רגיש יותר והוא יכול לשמש ante-mortem, כפי שהוצע על ידי מחברים אחרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לחקלאות, יערנות וחקר בעלי חיים (INIFAP). אנו מודים לג'רזאין פראוסטרו אסקיבל על שיתוף הפעולה בפיתוח הסרטון המשויך למסמך זה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chloroform SIGMA C7559 Facilitates recovery of the aqueous phase of PCRs which have been overlaid with mineral oil.
DNA Clean & Concentrator-500 Zimo D4031 The DNA Clean & Concentrator-500 (DCC-500) is designed for the rapid, large format purification and concentration of up to 500 µg of high quality DNA from samples including large-scale restriction endonuclease digestions and impure DNA preparations.
Ethanol Amresco 193-500 Purification of nucleic acids
FastStart High Fidelity PCR System kit, dNTPack Roche 3553400001 High fidelity enzyme for the amplification of PCR products avoiding random base changes
GelDoc XR BioRad XR+ Analyzes larger protein and DNA gels
GelRed Biotium 41003 A new generation of nucleic acid gel stains, they possess novel chemical features designed to minimize the chance for the dyes to interact with nucleic acids in living cells.
iCycler Thermal Cycler Gradient BioRad 582BR Temperature can be monitored and controlled by instrument algorithm, in-sample probe, or sample block modes
iTaq Universal Probes One-Step Kit BioRad 1725141 Reaction mixture to carry out PCR reactions in real time using TaqMan type hybridization probes
Isopropyl alcohol Amresco 0918-500 Precipitation of nucleic acids
QIAquick gel extraction kit Qiagen 28706 QIAquick Kits contain a silica membrane assembly for binding of DNA in high-salt buffer and elution with low-salt buffer or water. The purification procedure removes primers, nucleotides, enzymes, mineral oil, salts, agarose, ethidium bromide, and other impurities from DNA samples
M-MLV Reverse Transcriptase Invitrogen 28025-021 Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase (M-MLV RT) uses singlestranded RNA or DNA in the presence of a primer to synthesize a complementary
DNA strand.
NanoDrop 2000 Thermo-Scientific ND2000 Microvolume Spectrophotometer
Oligo(dT)18 primer Invitrogen SO132 The oligo (dT)18 primer is a synthetic single-stranded 18-mer oligonucleotide with 5'- and 3'-hydroxyl ends.
RiboMAX Large Scale RNA Production Systems kit SP6 and T7 Promega P1300 In vitro transcription reactions are used to synthesize microgram amounts of RNA probes from recombinant DNA templates. Most transcription reactions designed to generate RNA probes are optimized to maximize incorporation of radiolabeled ribonucleotides rather than to produce large amounts of RNA
Taq DNA Polymerase Invitrogen #EP0402 Taq DNA Polymerase is a highly thermostable DNA polymerase of the thermophilic bacterium Thermus aquaticus. The enzyme catalyzes 5’ and 3’ synthesis of DNA
 
TRIzol reagent Invitrogen 15596026 The TRIzol reagent is a complete, ready-to-use reagent, designed for the isolation of high quality total RNA or the simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from a variety of biological samples.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Subramaniam, M. R., Madhusudana, S. Laboratory diagnosis of human rabies: recent advances. ScientificWorld Journal. 2013 (569712), 1-10 (2013).
  2. CDC. , Available from: https://www.cdc.gov/rabies/diagnosis/animals-humans.html (2019).
  3. Dean, D. J., Abelseth, M. K., Atanasiu, W. The fluorescent antibody technique in rabies. Laboratory techniques in rabies. Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Koprowski, H. , WHO. Switzerland. (1996).
  4. Prabhu, K. N., et al. Application and comparative evaluation of fluorescent antibody, immunohistochemistry, and reverse transcription polymerase chain reaction tests for the detection of rabies virus antigen or nucleic acid in brain samples of animals suspected of rabies in India. Veterinary Science. 5 (1), 24 (2018).
  5. Woldehiwet, Z. Clinical laboratory advances in the detection of rabies virus. Clinica Chimica Acta. 351 (1-2), 49-63 (2005).
  6. Singh, R., et al. Rabies - epidemiology, pathogenesis, public health concerns and advances in diagnosis and control: a comprehensive review. Veterinary Quarterly. 37 (1), 212-251 (2017).
  7. David, D. Role of the RT-PCR method in ante-mortem & post-mortem rabies diagnosis. Indian Journal of Medical Research. 135 (6), 809-811 (2012).
  8. Biswal, M., Ratho, R. K., Mishra, B. Role of reverse transcriptase polymerase chain reaction for the diagnosis of human rabies. Indian Journal of Medical Research. 135, 837-842 (2012).
  9. Wacharapluesadee, S., et al. Comparative detection of rabies RNA by NASBA, real-time PCR and conventional PCR. Journal of Virological Methods. 175 (2), 278-282 (2011).
  10. Mani, R. S., et al. Utility of real-time Taqman PCR for ante mortem and post-mortem diagnosis of human rabies. Journal of Medical Virology. 86 (10), 1804-1812 (2014).
  11. Loza-Rubio, E., Rojas-Anaya, E., Banda-Ruiz, V. M., Nadin-Davis, S. A., Cortez-Garcia, B. Detection of multiple strains of rabies virus RNA using primers designed to target Mexican vampire bat variants. Epidemiology and Infection. 133 (5), 927-934 (2005).
  12. Dedkov, V. G., et al. Development and evaluation of a RT-qPCR assay for fast and sensitive rabies diagnosis. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 90, 18-25 (2018).
  13. Boldbaatar, B., et al. Rapid detection of rabies virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification. Japanese Journal Infectious Diseases. 62, 187-191 (2009).
  14. Rojas Anaya, E., Loza Rubio, E., Banda Ruiz, V., Hernández-Baumgarten, E. Use of reverse transcription-polymerase chain reaction to determine the stability of rabies virus genome in brains kept at room temperature. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 18 (1), 98-101 (2006).
  15. Dacheux, L. Dual combined Real-Time reverse transcription polymerase chain reaction assay for the diagnosis of Lyssavirus infection. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (7), 004812 (2016).
  16. Tamay De Dios, L., Ibarra, C., Velasquillo, C. Fundamentos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y de la PCR en tiempo real. Investigigación en Discapacidad. 2 (2), 70-78 (2013).
  17. Chapter 2.1.17. Rabies (infection with rabies virus and other Lyssaviruses. OIE. , Available from: https://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.01.17_RABIES.p (2018).
  18. Wacharapluesadee, S., Hemchudha, T. Ante-and post-mortem diagnosis of rabies using nucleic acid-amplification tests. Expert Reviews of Molecular Diagnostics. 10 (2), 207-218 (2010).
  19. Protocol for Postmortem Diagnosis of Rabies in Animals by Direct Fluorescent Antibody Testing. CDC. , Available from: https://www.cdc.gov/rabies/pdf/rabiesdfaspv2.pdf (2017).
  20. Dean, D. J., Abelseth, M. K., Atanasiu, W. The fluorescent antibody technique in rabies. Laboratory techniques in rabies. Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Koprowski, H. , WHO. Switzerland. (1996).
  21. Cuevas-Romero, S., Colmenares, V. G., Batalla, C. D., Hernández, B. E. Selección de un virus rábico de origen vampiro para utilizarse como cepa de desafío en bovino. Veterinaria México. 20, 271-275 (1989).
  22. Mendez-Ojeda, M. L., et al. Detection of rabies virus in organs unrelated to the central nervous system of experimentally inoculated vampire bats. Revista Méxicana de Ciencias Pecuarias. 9 (3), 435-450 (2018).
  23. Carneiro, A. J., et al. Rabies virus RNA in naturally infected vampire bats, Northeastern Brazil. Emerging Infectious Diseases. 16, 2004-2006 (2010).
  24. Andrew, S. Calculator for determining the number of copies of a template. URI Genomics & Sequencing. , Available from: http://cels.uri.edu/gsc/cdna.html (2020).
  25. Beltran, F. J., Dohmen, F. G., Del Pietro, H., Cisterna, D. M. Diagnosis and molecular typing of rabies virus in samples stored in inadequate conditions. The Journal of Infection in Developing Countries. 13 (8), 1016-1021 (2018).
  26. Finke, S., Cox, J. H. Differential transcription attenuation of rabies virus genes by intergenic regions: generation of recombinant viruses overexpressing the polymerase gene. Journal of Virology. 74 (16), 7261-7269 (2000).
  27. Fooks, A. R., et al. Rabies. 3, Macmillan Publishing Limited. 1-18 (2017).
  28. Bingham, J., Van Der, M. M. Distribution of rabies antigen in infected brain material: determining the reliability of different regions of the brain for the rabies fluorescent antibody test. Journal Virological Methods. 101 (1-2), 85-94 (2002).

Tags

אימונולוגיה וזיהום בעיה 171 וירוס כלבת משותקת שור qRT-PCR אבחון זונוזה מוח
כמויות של וירוס כלבת במבני מוח שור שונים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rojas-Anaya, E., Anaya-Razo, D.,… More

Rojas-Anaya, E., Anaya-Razo, D., Bárcenas-Reyes, I., Loza-Rubio, E. Quantitation of Rabies Virus in Various Bovine Brain Structures. J. Vis. Exp. (171), e61429, doi:10.3791/61429 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter