Summary
この手順は、脱分化を受けているマウス腸管上皮からの絨毛の分離を記述し、そのオルガノイド形成電位を決定する。
Abstract
腸上皮由来のオルガノイドのクロノジェニック性は、その中に幹細胞が存在することに起因する。マウスの小腸上皮は、陰窩および絨毛に区分される:茎および増殖細胞は、陰窩に閉じ込められるのに対し、絨毛上皮は分化した細胞のみを含む。したがって、正常な腸内窩は、絨毛ではなく、3D培養でオルガノイドを生じさせることができる。ここで説明する手順は、茎につながる脱分化を受けているvillus上皮にのみ適用可能である。記載された方法は、Smad4-機能喪失:β-カテニン機能の利得(Smad4KO:β-カテニンGOF)条件変異マウスを使用する。この突然変異は、腸内絨毛を分解し、絨毛内に幹細胞を生成させる。脱分化を受けた腸絨毛は、ガラススライドを使用して腸から掻き取られ、70μmのストレーナーに入れられ、BME-R1マトリックスでめっきする前に緩い細胞またはクリプトを濾過してオルガノイド形成の可能性を決定するために数回洗浄される。得られたオルガノイドが、3Dマトリックスでめっきする前後の両方で、単一の絨毛の欠如を確実にするために、分離された絨毛を顕微鏡的に評価し、絨毛からのオルガノイド発達の時間経過を監視する2つの主な基準を使用した。絨毛からのオルガノイド開始は、めっき後2〜5日後に起こり、不規則な形で現れるのに対し、同じ腸上皮由来の陰窩由来のオルガノイドはめっきの16時間以内に明らかであり、球状に見える。しかし、この方法の制限は、オルガノイドが形成される数、およびビリからのオルガノイド開始に要する時間が、脱分化の程度によって異なるためである。したがって、変異の特異性または脱分性を引き起こす侮辱に応じて、ビリがそれらのオルガノイド形成電位をアッセイするために収穫できる最適な段階は、経験的に決定されなければならない。
Introduction
腸内の納骨堂は絨毛ではなく、マトリゲルまたはBME-R1マトリックスで培養するとオルガノイドを形成する。これらのオルガノイドは自己組織化構造であり、生体内の腸上皮に存在する種々の分化系統、前駆細胞、および幹細胞の存在に起因してしばしば「ミニ腸」と呼ばれる。クリプトからオルガノイドを形成する可能性は、幹細胞1の存在に起因する。一方、腸内絨毛は分化した細胞のみで構成されており、オルガノイドを形成することはできません。しかし、突然変異2または絨毛上皮の脱分化を可能にする条件は、絨毛2、3の幹細胞を引き起こし得る。この絨毛上皮の幹形成をもたらすこの運命変化は、3Dマトリックスで脱分性性のヴィルス上皮をめっきし、絨毛上皮における脱ノボ茎の指標としてそのオルガノイド形成電位を決定することによって確認することができる。したがって、この手順の重要な側面は、暗号汚染の欠如を確実にすることです。
Smad4KO:β-カテニンGOF 条件突然変異は、絨毛における増殖および幹細胞マーカーの発現によって特徴づけられる腸上皮における脱分化を引き起こす、 そして最終的に異所性陰窩と呼ばれる絨毛の陰窩様構造の形成 これらの分化された絨毛は、異所性の陰窩(in vivo)における幹細胞マーカーの発現と、オルガノイドwhを形成する変異絨毛の能力によって決定されたエンメッキマトリゲル3.以下に挙げた手順は、Smad4KOにおける腸上皮の変性性を確認するために用いられる方法論を詳述する:β-カテニンGOF 変異マウス。絨毛を単離するためのこの方法論の主な特徴は、EDTAキレート法4とは対照的に、腸管腔の掻き取りの使用であった。EDTAキレート法とは異なり、掻き取りによる絨毛分離は、基礎となる間質の大部分を保持し、つながれた納骨堂なしで絨毛を生み出すために擦り傷の圧力を調整することを可能にする。削りの圧力はオペレータに主観的であるため、納骨堂なしで絨毛を生み出す最適な圧力は、オペレータによって経験的に決定されなければならない。この手順の重要な側面は、BME-R1マトリックスでめっき前後の絨毛の顕微鏡検査による暗号汚染の欠如を確実にすることです。
腸絨毛は、ガラススライドで腸内腔を削り取り、70μmのフィルターに入れ、PBSで洗浄して、BME-R1マトリックスでめっきする前に緩い細胞またはクリプトを取り除きます。この方法は、クリリが最も長い十二指腸の近位半分を収穫する絨毛を閉じ込め、b)絨毛を収穫するスクラップの数を最小限に抑え、c)6ウェル皿の中で一連のPBSを通して絨毛を含むフィルターを洗浄し、d)顕微鏡検査前およびRMEマトリックスの後にクリプト汚染の欠如を確認する。EDTAキレートではなく擦り傷によるVilli単離は、必要に応じて、絨毛上皮からのオルガノイド開始のためのニッチ信号5、6、7、8を提供し得る根底の間質の完全な損失を防ぐ。
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Protocol
子宮頸部脱臼によるタモキシフェンと安楽死の使用を含むすべてのマウス実験は、スティーブンスechnology研究所の制度的動物ケアおよび使用委員会の承認を得た。
1. マウス
メモ: Smad4f/fの生成;キャットンブ・ロクス(ex3)/+;ヴィリン・クレERT2 マウスは、以前に説明されている3.8~12週齢の成体雌マウスを使用した。
- Smad4KO:βカテニンGOF突然変異をSmad4f/fに誘導する。キャットンブ・ロクス(ex3)/+;4日間連続してトウモロコシ油中のタモキシフェンの腹腔内注射を伴うヴィリン・クレERT2.
- 最初のタモキシフェン注射の10日後にマウスを屠殺する子宮頸部脱臼。
- 腹部に70%エタノールを吹き付けて、マウスの毛皮が腹腔内に入るのを防ぎます。
- 腹腔を解剖はさみで開いて腸を露出させる。はさみと鉗子の助けを借りて腸を分離します。
注:腸上皮におけるβカテニンの機能変異 (Smad4KO;βカテニンGOF)の 利益と共にSmad4の付随的損失は、Smad4f / fを注入することによって達成された。キャットンブ・ロクス(ex3)/+;ビリン・クレERT2 マウスは、トウモロコシ油中の0.05 gタモキシフェン/kg体重で4日間連続して毎日マウスを使用しています。これらのマウスは、最初のタモキシフェン注射の10日後に収穫され、脱分化ビリ中の幹細胞関連マーカーを発現する細胞の存在を確実にする。
2. 十二指腸の分離と準備
- 十二指腸の近位半分を解剖する。
- 10 mL のシリンジで 5 mL の氷冷 PBS で十二指腸を洗い流し、発光の内容をクリアします。
- 斜めのはさみで縦方向に十二指腸を開き、十二指腸の内腔がオペレータに向いている氷の上に15cmのペトリプレートの上に平らに十二指腸を置きます。
3. スクレイピングによるヴィリの分離
- 削り始める前に、6ウェル組織培養プレートのウェルの1つに70 μmメッシュストレーナーを入れなさい。すべてのウェルを4 mLの1x PBSで満たし、6ウェル組織培養プレートを氷の上に置きます(図1)。
- 2つの顕微鏡的なガラススライドを使用して次のように絨毛を削る:1つは十二指腸を下に保持し、もう1つは擦り傷する(図1B1)。
- 十二指腸の明るい側を表面的に2回掻き取り、粘液を取り除く。このステップは粘液層を取り除くが、絨毛を除去しないように圧力をかける。
- もう一度十二指腸を削り取り、3..1と同じ圧力を加えて2回、その間に絨毛がスライド上に集まるのが見える(図1B2)。これは、納骨堂がつながれずに絨毛を生み出すために最適な圧力(オペレータによって経験的に決定されなければならない)です。
- PBSを含む1 mL転送ピペットを使用して、ステップ3.2.2からスライド上で収集された絨毛を、6ウェル皿に入れた70 μmメッシュストレーナーに移します。この絨毛は、このように、すべての擦り傷の後に収集される(図1B2)。
- 70 μmのストレーナー(ステップ3.3から)で採取した絨毛を、冷たいPBS(~4 mL/well)を含む6ウェル皿に一連のウェルを通して(絨毛付き)を通して移して洗います。これは、緩い納骨堂を取り除くためです。
- p1000パイプを使用して、70 μmストレーナーから氷上の新しい15 mLチューブにPBS(~3 mL)の絨毛懸濁液を移します。
- 0.1%BSAコーティングされた鈍い端のp200ピペット先端を使用して、絨毛懸濁液の50 μL体積をガラススライドに吸引します。4倍率の50μL液滴の絨毛数をカウントし、PBS懸濁液中の絨毛の濃度を決定します。例えば、50 μLの懸濁液に10絨毛が調べれば、絨毛濃度は0.2絨毛/μLです。これはまた、つながれた納骨堂の不在を確認する時です。
- BME-R1マトリックスの0.5絨毛/μLの濃度でプレートに必要な絨毛懸濁液の体積を計算します。余分な100 μLを追加して、ピペッティングエラーと、絨毛の純度を確保するために必要な顕微鏡検査に必要な体積を考慮します。
注意:最初の2つの擦り傷で使用される圧力は、粘液を取り除くが絨毛は除去せず、その後の擦れで使用され、その間にvilliが解放される。絨毛放出が最初に観察された後、ツー・フロスクレーピングの数を2に制限する。この措置は、納骨堂がつながれた絨毛の放出を回避する。テザード状の納骨堂の存在を確実にするためには、絨毛を顕微鏡的に評価することが不可欠である。
4. BME-R1マトリックス上の絨毛のめっき
- 0.1%BSAコーティングp200鈍エンドピペットチップを使用して、BME-R1マトリックスの12.5 μLでウェルあたり〜6絨毛の密度でプレートするために必要な絨毛の体積(ステップ3.6から)マイクロ遠心チューブに移します。この時点でBSAコーティングされた鈍い端の先端の使用は、尖った先端のために大きすぎる絨毛が、先端の側面にくっつくのからブロックされたり失われたりすることなく吸引されることを保証する。
- 冷蔵遠心分離機(4°C)で200xgで2分間ビリをスピンダウンし、上清を取り除きます。
- ステップ 4.2 を繰り返して残留 PBS を除去し、層流フードの下で次のステップに進みます。
- 氷の上に解凍した冷たいBME-R1の必要な量で、絨毛ペレットを穏やかに再懸濁します。
- p20ピペットを使用して、BME-R1マトリックスの絨毛のプレート12.5 μL/ウェルを、前温めの96ウェルU-底板で3Dで行います。
- BME-R1マトリックスを固化できるように、37°Cの組織培養インキュベーターでプレートを15分間インキュベートします。
- 125 μL/well の事前温められた ENR (上皮成長因子/ノギン/R-spondin1) メディア: 高度な DMEM F-12 メディア, 1xペニシリンを補う:ストレプトマイシン、10 mM HEPES、グルタマックス、50 ng/mL EGF、100 ng/mLノギン、HeK293-T細胞からの5%のコンディション培地R-Spondin1、1x N2、1x B27、1 mM N-aylcetse、0.mg5
- 5%CO2で37°Cに維持された組織培養インキュベーターにめっき絨毛をインキュベートし、1日おきに培地を交換する。
- 絨毛由来オルガノイドが予想される最も早い時点は2日後であるため、2日前にオルガノイドが現れる井戸は捨てる。
注:絨毛の半分または半分以上の長さを持つ絨毛は、1つのビラスとしてカウントされます。クリ由来オルガノイドとは異なり、絨毛由来のオルガノイドは、めっき後24時間以内には期待されません。オルガノイドを起用する絨毛は、オルガノイドの形成前に暗くなり、縮小しているように見える。したがって、メッキの1日以内に発生するオルガノイドを有する井戸は、もっともらしい暗号汚染に由来する妥当性を避けるために廃棄されるべきである。条件付きメディアの作成に使用される方法は、要求に応じて利用できます。
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Representative Results
手順の成功の決定要因は、暗号汚染を防ぐことです。ビリ(および汚染された納骨堂からではない)からのオルガノイドの開発は、4つの主要な基準を確認することによって保証される:1)BME-R1で絨毛をめっきする前後の顕微鏡検査によって収穫された絨毛の純度を確保する、2)すべてのメッキ絨毛を個別に視覚化できるように、十分に限られた数の絨毛をめっきするタイムコースの画像は、絨毛(図3)および4)からオルガノイドの発達を示し、絨毛から発育するオルガノイドの運動と形態学的外観を示す。絨毛から開始するオルガノイドは、最初は不規則な形で現れ、暗号由来のオルガノイド(EDTA/PBSキレート法1,4)を用いて隔離された暗号を分離して培養し、4倍の倍率で見られるまでに2~5日かけて、一晩で明確に定義された境界を持つ球状の構造として現れる(図2)。
絨毛のオルガノイド形成電位をテストするためのマウスを犠牲にするための最適な時期は、不分化した絨毛上皮が幹細胞マーカーを発現し、生体内の絨毛における異所性陰窩の開発を開始した後である(Smad4f/fのタモキシフェン注射の約10日後;キャットンブ・ロクス(ex3)/+;ヴィリン・クレERT2マウス)。これらのマウスはタモキシフェンとのβカテニン活性化と共にSmad4損失を伴うタモキシフェン誘導性のクレビナーゼを有する。異所性陰窩は突然変異の誘導から2週間以内に完全に発達し、ヴィーロでの突然変異の誘導後1週間以内に絨皮上皮の幹細胞が現れる。マトリゲルでめっきしたときオルガノイドを形成する絨毛の数は、2%〜12%3の間で変化すると報告されている。幹細胞が存在する頃(クレリコンビナーゼ誘導後約1週間)に絨毛をメッキするための変異マウスを収穫すると、絨毛由来オルガノイドの出現に必要な時間が長くなり、火葬誘導後10日以上に収穫を遅らせることは汚染のリスクを増大させる。
図1:腸上皮からの実験的セットアップと絨毛の掻き取り A) PBS でチューブとフィルター (Fltr) を持つ PBS で詰められた注射器 (syrg) .B)ビリ分離 (B1) をスクレイピングし、フィルタに転送する (B2)矢印は、スライド上に収集された絨毛を示しています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:同じマウス腸からデ分化絨毛上皮と陰窩から出現するオルガノイドの外観の区別:A) 絨毛と陰窩を示す漫画。 B)スクレイピング(上部パネル)とEDTAキレート(下部パネル)によって調製されたクリ(トップパネル)とクリプトの全体マウント(PBS)。 C)ビリ由来(上パネル)およびBME-R1の同じマウス腸管上皮由来の陰窩由来(下パネル)オルガノイド(スケールバー、500um)。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3: 変性ビリからのオルガノイド形成の経時経過 2つの異なる絨毛からのオルガノイド開始が示されている(箱入り領域は中央および下部のパネルで拡大される)。オルガノイド形成電位を有する絨毛は、おそらく基礎となる間質の保持のために、緻密に見える。絨毛膜からのオルガノイド開始は、ビリ(境界が壊れたボックス)の1つから2日目(固体矢印)で明らかであり、他方のvillus(固体境界を持つボックス)ではオルガノイドが4日目(矢印)に現れる。6日目パネルの上部ボックスは、開発された絨毛由来オルガノイドを示しています。スケールバー、100 μm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
この方法は、生体内で幹細胞マーカーを取得する不分化ビリ上皮の自己再生能力を確認できる。正常な腸上皮は、陰窩内に幹細胞が存在するため3Dで培養した場合、陰窩からオルガノイドを生じさせることができるが、絨毛コンパートメントからは生じることができない。したがって、3D培養で培養したデファノイド絨毛上皮からオルガノイド形成は、細胞運命逆転から幹細胞形成を確認する。突然変異および/または損傷に起因する腸上皮における細胞運命逆転に関する報告は、2、3、9、10、11、12を増加している。したがって、この方法は、不分化した絨毛上皮が生体内の幹細胞マーカーを発現する類似のシナリオに適用できる。
Smad4 KO:β-カテニンGOF変異体のビリからオルガノイドの発達を確認した(図3)。最も重要な側面は、偽陽性につながるクリプト汚染に対する予防措置を講じることです。メッキ前後の絨毛製剤の純度を確保するために、次の措置が講じられました:a)絨毛が最も長い十二指腸の近位半分からの絨毛の分離、b)擦り傷の数を最小限に抑え、つながれた納骨堂なしで絨毛を生み出すために擦り傷の圧力を調整し、c)70μmメッシュsに置いた後にPBSで絨毛を洗浄するめっきの前後に収穫された絨毛の顕微鏡検査、およびe)めっきマトリックスで個別に視覚化できるように、ウェル当たりの絨毛メッキの数を最小限に抑える。
この手順を最適化するために、いくつかの考慮事項が加えられました。まず、ビリが最も長い近位十二指腸からビリを収穫しました。小腸の分化と増殖するコンパートメントの間の物理的な線引きは、絨毛をクリを暗号から機械的に分離するために擦り傷を採用することを可能にする。したがって、この方法は、分化と増殖コンパートメントの間の区画化が厳密に引き分けされている場合にのみ採用することができます - 小腸の場合と同様に、結腸では採用できません。第二に、インビボで観察された脱分化の程度に基づいて、突然変異の誘導後の絨毛の分離時間を最適化した。条件付きSmad4KOにおける脱分化:β-カテニンGOF変異体は、それぞれ7日および10日以内に、villus上皮における幹細胞マーカーおよび異所性陰窩の生体内での出現によって3に特徴付ける。したがって、変異絨毛からオルガノイドを開始するのに要する時間は、突然変異の誘導後に経過した時間が長くなるにつれて減少する。したがって、この方法を腸の他の脱分化モデルに適応させながら、ビリ単離のためにマウスを犠牲にするための最適な時期は、突然変異または傷害の種類および生体内での脱分化の程度に応じて経験的に決定されるべきである。第三に、上皮間葉間交が腸内の腸幹細胞機能に関与している5、6、7、8、13として、EDTAキレート法ではなく、掻き取り法によって掻き取ることによって絨毛を単離することを選択した。オルガノイドを開始するヴィリは、主に、基礎となる間質の存在のために暗く見える(図2Bおよび3)。我々は、幹細胞関連マーカーCD4414,15及び腸特異的転写因子Cdx2 16,17,18,19,20の発現を検証し、絨毛由来オルガノイドの上皮起源を確認した(図S1)。
インビボアプローチと比較して、オルガノイドは遺伝子操作やスクリーニングに適しています。同じSmad4KOの陰窩から出てくるオルガノイドと同じSmad4 KO βの絨毛との間に表皮の違いが見られるので、現在調査中の2つの分子の違いを推測します。したがって、この方法は、脱分化を引き起こす突然変異の影響と前駆子と分化コンパートメントにおけるその差動効果を調べに有用である。
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Disclosures
著者らは利益相反を宣言しない。
Acknowledgments
本書は、NIH国立がん研究所の賞番号K22 CA218462-03によって支援されました。R-Spondin1を発現するHEK293-T細胞は、マイケル・P・ヴェルジ博士からの寛大な贈り物でした。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced DMEM F-12 media | Gibco | 12634010 | |
| 3,3-diaminobenzidine | Vector Labs | SK-4105 | |
| 96 well U-bottom plate | Fisher Scientific | FB012932 | |
| ABC kit | Vector Labs | PK4001 | |
| Angled scissor | Fisher Scientific | 11-999 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Gibco | 12587010 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) Protease-free Powder | Fisher Scientific | BP9703100 | |
| CD44 antibody | BioLegend | 1030001 | |
| Cdx2 antibody | Cell Signaling | 12306 | |
| Corn oil | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | |
| Corning 70-micron cell strainer | Life Sciences | 431751 | |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type R1 | R&D | 3433-005-R1 | |
| Dissection scissors | Fisher Scientific | 22-079-747 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 17-456-209 | |
| Glutamax (100X) | Gibco | 35050-061 | |
| HEK 293-T cells expressing RSPO-1 | Gift from Dr. Michael Verzi | ||
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Histogel | Thermoscientific | HG-4000-012 | |
| Mesh filter | Fisher Scientific | 07-201-431 | |
| Micrscope glass slide | VWR | 89218-844 | |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| p200 Blunt tips | VWR | 46620-642 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| Primocin (50mg/mL) | Invivogen | ant-pm-1 | |
| Quality Biological Inc PBS (10X) | Fisher Scientific | 50-146-770 | |
| Recombinant Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | |
| Signal diluent | Cell Signaling | 8112L | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-1G | |
| 6-well tissue culture plate | Fisher Scientific | 50-146-770 |
References
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