Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Активность афферентных нейронов задней боковой линии во время плавания у рыбок данио

Published: February 10, 2021 doi: 10.3791/62233
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biology, University of Florida, The Whitney Laboratory for Marine Bioscience

Summary

Описан протокол мониторинга изменений активности афферентных нейронов во время двигательных команд в модельной системе волосковых клеток позвоночных.

Abstract

Сенсорные системы собирают сигналы, необходимые для направления поведения, но животные должны расшифровать, какая информация является биологически значимой. Локомоция генерирует повторяющиеся сигналы, которые животные должны отпутать от соответствующих сенсорных сигналов окружающей среды. Например, когда рыба плавает, поток, генерируемый волнами тела, обнаруживается механорецептивными невриномачами, состоящими из волосковых клеток, которые составляют систему боковой линии. Затем волосковые клетки передают информацию о движении жидкости от датчика к мозгу через сенсорные афферентные нейроны. Одновременно, сопутствующий разряд двигательной команды передается волосковые клетки для предотвращения сенсорной перегрузки. Поэтому учет ингибирующего эффекта прогностических двигательных сигналов во время локомоции имеет решающее значение при оценке чувствительности системы боковых линий. Мы разработали электрофизиологический подход in vivo для одновременного мониторинга активности афферентного нейрона задней боковой линии и вентрального двигательного корня у личинок рыбок данио (4-7 дней после оплодотворения), которая может длиться в течение нескольких часов. Внеклеточные записи афферентных нейронов достигаются с использованием техники свободного зажима пластыря, которая может обнаруживать активность от одного или нескольких нейронов. Записи вентральных корней выполняются через кожу со стеклянными электродами для обнаружения активности двигательных нейронов. Наш экспериментальный протокол обеспечивает возможность мониторинга эндогенных или вызванных изменений сенсорного ввода в двигательном поведении у неповрежденного позвоночного.

Introduction

Афферентные нейроны механосенсорных систем передают информацию от волосковых клеток к мозгу во время слуха и равновесия. Электрофизиология может выявить чувствительность афферентных нейронов через прямые записи. В то время как патчинг целых клеток из волосковых клеток может быть сложным, запись из нисходящих афферентных нейронов проще и позволяет оценить потенциалы действия в ответ на контролируемые стимуляции1,2,3. Стимуляция волосковых клеток приводит к их отклонению, что модифицирует механосенсорные структуры, тем самым запуская увеличение потенциалов действия (шипов) в афферентных нейронах4,5,6. В отсутствие внешних стимулов афферентные нейроны также спонтанно скачут из-за утечки глутамата из волосковых клеток на афферентные постсинаптические терминали7,8и, как было показано, способствуют поддержанию чувствительности9,10. Запись афферентной активности за патч-зажимом позволяет наблюдать чувствительность волосковых клеток и динамику сигнала, которые невозможны с использованием методов с более низким временным разрешением, таких как в микрофонике11,12 или функциональной кальциевой визуализации13,14,15. Следующий протокол позволит регистрировать афферентную активность одновременно с двигательными командами, чтобы выявить мгновенные изменения чувствительности волосковых клеток.

Рыбки данио (Danio rerio) используют волосковые клетки, содержащиеся в нейромаматах, которые составляют систему боковой линии, для обнаружения движения воды относительно их тела, что переводится в нейронные сигналы, необходимые для навигации16,17,18,избегания хищников, захвата добычи19,20и стайки21. Поток воды также может быть самогенерируемым движениями плавания22,23,24,дыхания22,25,26и кормления27. Это поведение включает в себя повторяющиеся движения, которые могут утомлять волосковые клетки и ухудшать восприятие. Поэтому крайне важно, чтобы система боковых линий различала внешние (экзафферентные) и самогенерируемые (рефафферентные) стимулы потока. Вытекающий из этого разряд ожижает самогенерируемые сигналы потока во время передвижения у рыбок данио. Этот тормозной прогностический двигательный сигнал передается через нисходящие нейроны к сенсорным рецепторам для изменения входного сигнала или прерывания обработки обратной обратной связи28,29. Основополагающая работа, способствовающая нашему раннему пониманию этой системы, опиралась на препараты in vitro, где связь и эндогенная активность нейронной цепи не поддерживались28,30,31,32,33,34,35. Этот протокол описывает подход к сохранению неповрежденной нейронной цепи, где поддерживается динамика эндогенной обратной связи, что позволяет лучше понять сопутствующий разряд in vivo.

Протокол, описанный здесь, описывает, как контролировать активность афферентных нейронов задней боковой линии и двигательных нейронов одновременно у личинок рыбок данио. Характеристика динамики афферентного сигнала до, во время и после двигательных команд дает представление о эндогенной обратной связи центральной нервной системы в режиме реального времени, которая модулирует чувствительность волосковых клеток во время передвижения. В этом протоколе описывается, какие материалы необходимо будет подготовить до экспериментов, а затем описывается, как парализовать и подготовить личинок рыбок данио. Протокол будет описывать, как установить стабильную запись свободных пятен афферентных нейронов и внеклеточных вентральных корневых (VR) записей двигательных нейронов. Репрезентативные данные, которые могут быть получены с помощью этого протокола, представлены образцовым индивидуумом и анализ проводился на нескольких репликах экспериментального протокола. Предварительная обработка данных выполняется с использованием пользовательских письменных скриптов в MATLAB. В целом, эта экспериментальная парадигма in vivo готова обеспечить лучшее понимание сенсорной обратной связи во время передвижения в модельной системе волосковых клеток позвоночных.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все исследования по уходу за животными и эксперименты проводились в соответствии с протоколами, утвержденными Комитетом по уходу и использованию животных Университета Флориды.

1. Подготовка материалов для электрофизиологических записей

  1. Сделайте силиконовую эластомерную записывающее блюдо.
    1. Разрежьте тонкий слой самосмешивающихся компонентов силиконового эластомера (например, Sylgard) в чашку для культивирования тканей со стеклянным дном до тех пор, пока она не выровняется с ободком неглубокого колодца. Достаточно примерно 0,5 мл.
    2. Накройте крышкой и отверждайте блюдо минимум 48 ч при комнатной температуре.
  2. Сделайте рассечение булавок.
    1. Обеспечьте отрицательный заряд (5 В) к 100 мл травильного травильного крема (3 М КОН) с помощью источника питания постоянного тока и подключите вольфрамовый провод (0,002 дюйма; диаметр 50,8 мкм) к положительно заряженному выходу.
      ВНИМАНИЕ: Отрицательные и положительные провода не должны контактировать друг с другом во время этой процедуры, так как вы можете столкнуться с риском образования искр, которые могут представлять потенциальную опасность пожара.
    2. Травить вольфрамовую проволоку, быстро и многократно погружая наконечник проволоки в травильные ванны до тех пор, пока наконечник не сузится до острой точки. Под стереомикроскопом отрежьте проволоку примерно в 1 мм от наконечника лезвием бритвы с прямым краем. Повторите еще три раза, а затем вставьте штифты в отвержденную записывающее блюдо с помощью тонких щипцов.
  3. Подготовьте записывающие электроды.
    1. Вытяните боросиликатную стеклянную капиллярную трубку (внутренний диаметр: 0,86 мм, наружный диаметр: 1,50 мм) с помощью горизонтального съемника микропипетки с коробчатой нитью на электроды с наконечником диаметром 30 мкм с небольшим конусом(Рисунок 1 Ai),который будет использоваться для записи афферентных нейронов с задней боковой линии.
    2. Потяните дополнительную боросиликатную стеклянную капиллярную трубку в пару электродов с меньшим диаметром наконечника (1-5 мкм). Держа по одному электроду в каждой руке, осторожно провести кончиками друг по другу, чтобы разбить их под углом ~ 30 °. Используя микроковалку, отполирует скошенный наконечник до однородной массы. Конечный диаметр наконечника должен быть между 30-50 мкм и будет использоваться в качестве регистрирующем электрода вентрального корня (VR)(рисунок 1 Aii).
    3. Отметьте боковую часть электрода VR передней кромкой перманентными чернилами, чтобы помочь ориентировать отверстие наконечника вниз при вставке электрода в держатель пипетки головной ступени (шаг 3.2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Механическая модификация записывающего электрода VR является неточной, и шаг 1.3.2 может потребовать нескольких попыток до тех пор, пока перед полировкой не будет достигнута подходящая морфология наконечника. Регистрирующий электрод VR скошен, чтобы соответствовать изгибу тела личинок. После изготовления записывающий электрод VR можно использовать многократно, пока наконечник остается чистым и чистым между экспериментами.
  4. Сгенерируйте протокол в программах электрофизиологической записи.
    1. Убедитесь, что правая головная сцена подключена к входу канала 1 в задней части микроэлектродного усилителя тока и напряжения для записи афферентных нейронов, а левая головная сцена подключена к входу канала 2 для записей VR.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Компьютерные спецификации для усилителя тока и напряжения минимально требуют 1 ГГц или лучшего процессора, Windows XP Pro или Mac OS X 10.46.6, привода CD-ROM с 512 МБ ОЗУ, 500 МБ места на жестком диске и 2 портов USB.
    2. Откройте программное обеспечение усилителя с компьютерным управлением.
    3. Установите канал 1 и канал 2 в режим текущего зажима, нажав кнопку IC для каждого канала.
    4. Введите следующие параметры под вкладками I-Clamp 1 и I-Clamp 2. Первичный выход: 100x AC Мембранный потенциал (100 000 мВ / мВ), Усиление:1000, Бессель:1 кГц, Переменный ток:300 Гц, Область применения:Байпас. Вторичный выход: 100x AC Мембранный потенциал (100 мВ / мВ), усиление:1, Фильтр нижних частот: 10 Гц.
    5. Сохранение параметров канала в Ch1_Aff и Ch2_VR.
    6. Установите и откройте патч-зажим электрофизиологического программного обеспечения.
    7. Нажмите «Настроить» и выберите «Лабораторный стенд», чтобы настроить аналоговые сигналы, добавив Ch1_Aff и Ch2_Vr к каналам дигитайзера (например, аналоговый IN #0 и аналоговый IN #1),которые подключены коаксиальным кабелем BNC к соответствующим масштабируемым выходам усилителя Channel 1 и Channel 2. Нажмите OK.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Минимальные требования к компьютеру для дигитайзера: процессор с тактовой частотой 1 ГГц или выше, Windows XP Pro или Mac OS X 10.46.6, привод CD-ROM 512 МБ ОЗУ, 500 МБ места на жестком диске и 2 порта USB.
    8. Нажмите «Получить» и выберите «Новый протокол».
    9. На вкладке Режим/Скорость выберите Без разрывов; В разделе Режим полученияустановите для параметра Пробная длина значение Использовать доступное дисковое пространство (т. е. запись до остановки) или требуемый набор Длительность (чч:мм:сс),а затем установите для параметра Частота дискретизации на сигнал (Гц) значение 20 000, чтобы максимизировать разрешение.
    10. На вкладке Входы выберите ранее настроенные аналоговые IN-каналы (на шаге 1.4.6) и выберите Ch1_Aff и Ch2_VR для соответствующего канала.
    11. На вкладке Выходы выберите Cmd 0 и Cmd 1 для #0 каналов и #1 каналовсоответственно.
      1. Подключите команду Channel 1 на усилителе к Analog Ouput 0 на дигитайзере через коаксиальный кабель BNC и повторите команду канала 2 на аналоговый выход 1.
    12. Остальные вкладки могут оставаться в настройках по умолчанию. Нажмите OK и сохраните протокол.

2. Приготовление раствора

  1. Готовят раствор Хэнка: 137 мМ NaCL, 5,4 мМ KCl, 0,25 мМ Na2HPO4,0,44 мМ KH2PO4,1,3 мМ CaCl2,1,0 мМ MgSO4,4,2 мМ NaHCO4; рН 7,3. Разбавить до 10% раствор Хэнка, добавив в бульон соответствующий объем деионизированной воды.
  2. Готовят внеклеточный раствор: 134 мМ NaCl, 2,9 мМ KCl, 1,2 мМ MgCl2,2,1 мМ CaCl2,10 мМ глюкозы, 10 мМ hePES буфера; pH 7,8 регулируется с помощью NaOH. Вакуумный фильтр внеклеточный раствор через фильтр с размером пор 0,22 мкм.
  3. Приготовить α-бунгаротоксин: растворить 1 мг лиофилизированного α-бунгаротоксина в 10 мл внеклеточного раствора с производством 0,1% разведения.
  4. Готовят раствор для эвтаназии: 50% (мг/л) буферизованный фармацевтический класс MS-222 в 10% растворе Хэнка.
    ВНИМАНИЕ: α-бунгаротоксин является мощным нейротоксином, который парализует мышцы, блокируя холинергические рецепторы. Перчатки обязательны, и рекомендуется защита глаз при обращении с паралитическими.

3. Подготовка личинок к электрофизиологическим записям

  1. Обездвиживайте личинок рыбок данио.
    1. Используют личинок из лабораторно выведенной популяции рыбокданио (Danio rerio;4-7 дней после оплодотворения) и размещают в растворе эмбриона (10% раствора Хэнка) при 27 °C.
    2. Переложите личинку из корпуса в небольшую чашку Петри (35 мм) с помощью переносной пипетки с большим наконечником и удалите как можно больше окружающего раствора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Удаление эмбрионального раствора предотвращает разбавление паралитического вещества и повышает его эффективность. Уголочной салфетки можно использовать для оттока оставшегося раствора эмбриона, и очень важно не контактировать с личинками и не оставлять личинок под воздействием воздуха.
    3. Погружайте личинок в 10 мкл 0,1% α-бунгаротоксина в течение примерно 5 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время, необходимое для обездвижиживать личинок, варьируется между препаратами. Здоровый препарат зависит от тщательного мониторинга устойчивого быстрого кровотока и снижения двигательных реакций. Кратковременное переэкспонировать паралитическое может привести к медленному ухудшению общего состояния здоровья препарата даже после тщательного вымывания. Лучше всего применять промывку до того, как личинка будет полностью обездвижена, пока она еще демонстрирует признаки тонких мышечных вибраций.
    4. Парализованную личинку промыть внеклеточным раствором и купать в течение 10 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вымывание позволяет личинке перейти от тонких мышечных колебаний к полному параличу. Кроме того, α-бунгаротоксин является антагонистом никотинового ацетилхолинового рецептора (nAChR) α9-субъединицы, которая является критическим компонентом эндогенной цепи обратной связи, которую наблюдает этот протокол; однако было показано, что этот эффект обратим в волосковых клетках ксенопусов и рыбок данио после 10-минутного вымывания36,29.
  2. Приколоть рыбу в записывающем блюде.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Анестезия (например, MS-222, трикаин) не требуется при приготовлении личинок рыбок данио (4-7 dpf), так как это мешает здоровью животных. Фактически, личинки рыбок данио освобождены от определенных протоколов позвоночных.
    1. Используя переносную пипетку, переместите личинку из внеклеточной ванны с раствором в тарелку с силиконовым дном. Наполнить оставшуюся часть блюда внеклеточным раствором.
    2. Под стереомикроскопом осторожно расположите личинок с мелкоконечными щипцами над центром силиконового мата, боковой стороной вверх, с передним и задним концами тела, идущими слева направо соответственно. Затем возьмите вытравленный штифт из силиконового коврика с помощью щипцов с тонкими наконечниками и вставьте штифт, ортогонально к силикону, через дорсальную нотохорду личинок непосредственно дорсально к анусу. Вставьте второй штифт через нотохорду ближе к концу хвоста и вставьте третий штифт через нотохордную дорсальную часть газового пузыря(рисунок 1B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: При вставке штифтов важно нацеливаться на центр нотохорды ширины, чтобы предотвратить ущемление кровотока или повреждение окружающей мускулатуры. Нотохорда является дорсальной по отношению к заднему нерву боковой линии, поэтому при правильном закреплении не ожидается повреждения сенсорных нейронов боковой линии. Вводят после первого контакта, чтобы не нарушать окружающие ткани. В идеале диаметр штифта составляет менее половины ширины нотохорды, чтобы обеспечить чистую вставку. Если контакты превышают эту ширину, повторяйте шаг 1.2 до тех пор, пока не будет достигнута требуемая ширина контактов. Если кровоток замедляется после закрепления, повторите с шага 1.3 и далее с новым образцом.
    3. Вставьте четвертый штифт через отический везикулу, обеспечивая при этом небольшое вращение в сторону передней стороны, когда штифт вставляется в инкапсулятор(рисунок 1B). При небольшом вращении следите за тканью между клейтрумом и отическим везикулом, чтобы выявить скопление афферентных сомат.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Угловое вставление четвертого штифта предназначено для обеспечения обнажения афферентного ганглия задней боковой линии, который в противном случае блокируется большим лопочком отича.

4. Запись вентрального корня

  1. Поместите закрепленную личинку под 10-кратный объектив погружения в воду на вертикальном микроскопе с фиксированной стадией дифференциального интерференционного контраста (ДВС-сигнал) и ориентируйте мизептальные расщелины мышечных блоков параллельно левому вектору подхода к головной сцене(рисунок 1B).
    1. Микроскоп с фиксированным этапом DIC, плавающий на оптическом воздушном столе, лучше всего работает, чтобы предотвратить вибрации от вмешательства в записи. Используя моторизованный позиционер, микроскоп может затем свободно перемещаться по фиксированной ступени, в которой установлены подготовительные и головные ступени(рисунок 1C).
    2. Поместите провод заземления в раствор ванны и убедитесь, что он подключен к левой головной сцене.
  2. Заполните записывающий электрод VR 30 мкл внеклеточного раствора с помощью гибкого наконечника пипетки с гелевой загрузкой и вставьте в левый держатель пипетки головной сцены.
  3. Опуская записывающую пипетку в раствор тарелки с помощью микроманипулятора, применяя положительное давление (1-2 мм рт.ст.), создаваемое пневматическим преобразователем. При 10-кратном увеличении убедитесь, что ориентация отверстия наконечника обращена вниз.
    1. Пневматический преобразователь должен быть подключен к порту держателя пипетки через силиконовую трубку.
  4. Поместите электрод VR на миосептум
    1. Снова используя микроманипулятор, опустите наконечник электрода VR, пока он не удержет положение над личинкой. Увеличьте увеличение до 40-кратного погружения.
    2. Поднесите наконечник электрода над миосектумом между двумя вентральными миомерами к боковой линии до тех пор, пока расщелина не будет центрирована в апертуре кончика электрода VR(рисунок 1D).
    3. Опустите пипетку до тех пор, пока запаздывающий край отверстия наконечника мягко не соприкнется с эпителием. После первоначального контакта маневрируйте пипеткой по диагонали, чтобы убедиться, что передовая кромка вступает в контакт и может генерировать уплотнение.
    4. Нанесите отрицательное давление (~100 мм рт.ст.) с помощью пневматического датчика и удерживайте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Правильная ориентация пипетки VR относительно миозептума и непрерывное отрицательное давление оптимизируют обнаружение активности двигательных нейронов с высоким отношением сигнал/шум через кожу.
  5. Обнаружение активности двигательных нейронов.
    1. Левая головная сцена должна быть подключена к усилителю, который ретранслирует усиленный сигнал в дигитайзер, который выводит указанный сигнал в электрофизиологическое программное обеспечение для мониторинга на соседнем компьютере (см. раздел 1.4).
    2. В программном обеспечении patch clamp нажмите кнопку Play на панели инструментов, чтобы контролировать сигнал VR(рисунок 1E).
    3. Убедитесь, что запись VR достигается после того, как активность двигательных нейронов с хорошо стереотипной динамикой сигнала всплеска наблюдается29,37 (рисунок 1E).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фиктивные плавательные схватки - это паттерны активности двигательных нейронов VR, которые продолжают передаваться, несмотря на то, что подготовка парализована. Поэтому фиктивные заплывы являются доступным средством определения поведенческого состояния животного и измерения двигательных параметров при одновременном выполнении афферентных нейронных записей, требующих иммобилизованной подготовки. В наших руках, как только запись VR достигнута, здоровая подготовка вызовет добровольные фиктивные плавательные схватки каждые несколько секунд. Помните, что здоровый препарат поддерживает быстрый кровоток. Имейте в виду, что получение достаточного сигнала VR может занять несколько минут, а отношение сигнал/шум может улучшиться после первоначального обнаружения. В интересах времени приемлемо перейти к разделу 5.
    4. Если запись VR все еще не достигнута после завершения раздела 5, отпустите отрицательное давление, поднимите электрод и повторите с шага 4.4.2 и далее на другом миосекте, если здоровье личинки все еще оптимально.

5. Запись афферентных нейронов

  1. Заполнить афферентный записывающий электрод 30 мкл внеклеточного раствора; вставить в правый держатель пипетки головнойсцены (рисунок 1B,C)и опустить в раствор посуды при подаче положительного давления (1-2 мм рт.ст.), производимого пневматическим преобразователем.
  2. Расположите и свободно прикрепите к задней боковой линии афферентного ганглия.
    1. Используя микроманипулятор, опустите наконечник афферентного электрода до тех пор, пока он не удержит положение над клейтрумом.
    2. Увеличьте увеличение до 40-кратного погружения и найдите пересечение задней боковой линии нерва и клейтроума. Следуйте по боковой линии нерва, переднего от клейтрума туда, где волокна иннервируют заднюю боковую линию афферентного ганглия, различимого дискретным скоплением сомы(рисунок 1F).
    3. Поднесите наконечник электрода над афферентным ганглием и опустите пипетку до тех пор, пока наконечник не соприкнется с эпителием. Осторожно маневрируйте электродом так, чтобы вся окружность кончика контактировала с афферентным ганглием.
    4. Приложить отрицательное давление (20-50 мм рт.ст.) с помощью пневматического датчика и удерживать.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отрицательное давление, приложенное к афферентной ганглии, является более мягким, чем всасывание, применяемое во время записи вентрального корня. Повышение отрицательного давления может улучшить сигнал-шум, но здоровье афферентных нейронов ухудшается при устойчивом агрессивном всасывании, что снижает вероятность успешной записи.
  3. Запись активности афферентных нейронов.
    1. Убедитесь, что правая головная ступень соединена в той же последовательности, что описано в шаге 4.5.1.
    2. В pClamp10 нажмите кнопку Play на панели инструментов, чтобы одновременно отслеживать афферентный нейрон и сигнал VR.
    3. Убедитесь, что вся клетка, свободный участок записи афферентных нейронов достигается, как только всплески происходят спонтанно, примерно каждые 100-200мс 1,29 (рисунок 1E).
    4. Постепенно увеличивают афферентный нейрон, регистрирующий давление электрода обратно в атмосферу (0 мм рт.ст.) и удерживают до конца записи.

6. Сбор данных

  1. Одновременная запись.
    1. Как только активность афферентных нейронов и двигательных нейронов обнаружена, нажмите кнопку «Запись» на панели инструментов в pClamp10, чтобы захватить одновременные записи без зазоров в обоих каналах.
    2. Запись на нужную продолжительность(рисунок 1E).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Запись в здоровом препарате может длиться в течение многих часов и оставаться восприимчивой к внешним раздражителям.
    3. Сохраните запись как поддерживаемый тип файла (.abf, pClamp10) для сохранения метаданных, таких как параметры получения.

7. Эвтаназия

  1. Применяйте положительное давление (10 мм рт.ст.) как к афферентным, так и к VR-записывающим электродам с помощью пневматических преобразователей и поднимайте электроды из записывающей тарелки с помощью микроманипуляторов.
  2. Перенесите записывающее блюдо с микроскопа с фиксированной стадией DIC на рассеченный стереомикроскоп.
  3. Используя тонкие щипцы наконечника, удалите вольфрамовые штифты из нотохорды и отической капсулы и перенесите личинок с помощью переносной пипетки в чашку Петри (35 мм), содержащую 5 мл раствора для эвтаназии в течение минимум 5 минут.

8. Предварительная обработка и анализ данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительная обработка и анализ данных потребуют базового понимания кодирования командной строки.

  1. Преобразуйте файл записи для предварительной обработки.
    1. Установите программное обеспечение Matlab.
    2. Загрузите пользовательский написанный сценарий, abfload.m38 и сохраните файл в той же папке, в которую хранится необработанный файл записи.
    3. В окне редактора Matlab откройте abfload.m и нажмите кнопку Выполнить на панели инструментов. Выберите Изменить папку, если появится соответствующий запрос.
    4. Выполните функцию в командном окне с необработанным файлом записи в качестве входных данных,
      > [d,si,h] = abfload('[имя файла записи raw].abf')
      и сохраните выходную рабочую область с именем файла, которое включает обозначение личинки, возраст и дату эксперимента, например [номер образца]_[возраст в dpf]_[имя файла необработанной записи (включает экспериментальную дату по умолчанию)].
      ПРИМЕЧАНИЕ: Преобразованное имя файла должно включать только очерченные целые числа с подчеркиванием.
  2. Выполните предварительную обработку данных.
    1. Скачайте скрипт Matlab AffVR_preprocess.m и связанные с ним функции, написанные авторами.
    2. В окне Редактор откройте AffVR_preprocess.m.
    3. В разделе Переменныенастройте пороговые значения обнаружения всплесков нижней границы как для афферентных, так и для VR-записей(spk_detect_lb и vr_detect_lb,строк 8 и 14 соответственно) в зависимости от записи отношения сигнал/шум.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обнаружение шипов основано на ручном пороговом значении для сортировки и изоляции сигналов от более чем одного афферентного нейрона по амплитуде. Базовый шум и активность от других единиц отфильтровываются путем порогового значения, чтобы включить только амплитуды шипов в пределах процента (например, spk_detect_lb) от максимума (например, spk_detect_ub). Пороговое значение также обеспечивает точное смешение всплесков двигательной активности в всплески и коллективные фиктивные плавательные схватки. Как правило, начинают с пороговой нижней границы 0,5 и постепенно уменьшают до тех пор, пока не будет достигнуто точное обнаружение. Например, установка spk_detect_lb как 0,5 и spk_detect_ub как 1,0 обнаружит все всплески, равные или превышающие 50% от максимальной амплитуды шипа, и исключит шум или дополнительные нейроны нижних амплитуд шипов(рисунок 2A). В качестве альтернативы можно также снизить spk_detect_ub с 1,0, чтобы исключить нейроны с более высокими амплитудами шипов, чтобы изолировать нейроны более низких амплитуд шипов. Результаты предварительной обработки рисунков (см. этап 7.2.6) будут информировать о необходимости корректировки и повторения с шага 7.2.2.
    4. В окне редактора нажмите кнопку Выполнить, чтобы выполнить AffVR_preprocess.m.
    5. Перейдите к ранее преобразованным файлу данных .mat (см. шаг 7.1.3); выберите и нажмите кнопку Открыть, чтобы начать автоматическую предварительную обработку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время выполнения пользовательского скрипта в командном окне будут отображаться выходные данные, информирующие о его ходе обработки, такие как «фильтрация данных...», «обнаружение активности вентрального корня...» и «генерация цифр...».
    6. Цифры, сгенерированные AffVR_preprocess.m, будут визуализировать афферентный всплеск и обнаружение VR и указывать, следует ли корректировать какие-либо переменные анализа(рисунок 2).
    7. Введите «Y» на клавиатуре, чтобы сохранить предварительно обработанные метаданные в папку preprocess_output.
    8. Предварительно обработанные данные будут автоматически выведены в виде data_out.xls.
  3. Анализируйте предварительно обработанные данные по желанию.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

После того, как личинки рыбок данио должным образом обездвижены и достигнут афферентный ганглий задней боковой линии и запись VR, активность как в афферентных, так и в двигательных нейронах может быть измерена одновременно. Каналы записи отображаются с использованием протоколов записи без пробелов (шаг 1.4) для непрерывного мониторинга афферентной и VR-активности. В режиме реального времени снижение скорости спонтанных афферентных всплесков может наблюдаться одновременно с активностью VR, свидетельствующей о фиктивных плавательных схватках(рисунок 1E). Мы обнаружили, что наилучшие результаты и точное обнаружение всплесков были продуктами записей, которые достигли отношения сигнал/шум не менее 0,5. Пользовательские скрипты предварительной обработки генерируют графики, помогая в визуализации обнаружения афферентов и всплесков VR. Спонтанные афферентные всплески идентифицируются с использованием комбинации параметров всплеска, таких как порог, минимальная продолжительность (0,01 мс) и минимальный интервал между всплесками (ISI; 1 мс). Увеличение отрицательного давления при установлении записи часто дает обнаружение сигнала от нескольких афферентных блоков одновременно. Фильтрация по амплитуде позволяет различать динамику сигнала независимых афферентов. Изоляция сигналов может быть достигнута путем настройки переменных обнаружения нижней и верхней границ в скрипте предварительной обработки(рисунок 2A). Агрессивное всасывание для достижения многоблоковых записей может привести к нестабильной записи, механическому шуму, ухудшению состояния афферента и, в конечном счете, к потере сигнала. Поэтому важно медленно набирать обратно всасывание к атмосферным давлению, как только желаемый сигнал будет достигнут. Обнаружение вентрального корневого шипа следует тем же параметрам, что и обнаружение афферентного всплеска, но требует дополнительных входных данных для определения различных фиктивных плавательных схваток. Всплески внутри команды двигателя определяются активностью VR с минимум двумя всплесками в пределах 0,1 мс друг от друга и длится не менее 5 мс. Все плавательные схватки затем очерчены как минимум тремя всплесками с интервалами между всплесками <200мс (рисунок 2B).

Афферентную активность трудно интерпретировать при рассмотрении записи во всей ее полноте. Скрипты предварительной обработки будут накладывать участки афферентной активности, сосредоточенные на четко определенном периоде интереса, в данном случае на начале плавательного боя (n = 33, рисунок 2C),чтобы помочь в визуализации тенденций в динамике сигнала. Мгновенная афферентная активность рассчитывается с помощью фильтра скользящей средней и окна выборки 100 мс. Средняя спонтанная активность показывает резкие изменения в ответ на начало двигательной активности(рисунок 2С). Чтобы лучше проанализировать и проанализировать афферентную активность, периоды до и после заплыва устанавливаются в соответствии с временным интервалом соответствующего плавательного боя. В скрипте предварительной обработки и репрезентативных проанализированных результатах эти периоды называются «предварительным заплывом» и «пост-плаванием». Показатели всплесков до заплыва, плавания и после заплыва были рассчитаны путем взятия количества всплесков в течение соответствующего периода в течение его продолжительности. Точность оценок для каждого человека частично является функцией количества заплывов, поэтому мы проанализировали переменные отношения с использованием взвешенных регрессий, с индивидуальными весами, равными квадрату корня из числа заплывов.

Различия в показателях афферентных всплесков в различные периоды интереса (до заплыва, плавания и после заплыва) были проверены с помощью двустороннего анализа дисперсии (ANOVA). Пост-специальный тест Туки обнаружил значительные различия в скорости всплесков между частотой всплесков плавания и скоростью всплесков как до заплыва (8,94 ± 0,2 Гц, относительное снижение на 57%) и после заплыва (5,34 ± 0,2 Гц, относительное снижение на 40%) Периоды. Частота всплесков не сразу вернулась к исходному уровню, учитывая, что мы также обнаружили, что частота всплесков после плавания была ниже, чем частота всплесков до плавания (пост-специальные тесты Tukey в группах, p < 0,001; Рисунок 3А). Линейные модели использовались для обнаружения взаимосвязей между относительной скоростью всплеска и фиктивными параметрами плавания. Относительная скорость всплеска была рассчитана путем принятия скорости всплеска плавания над скоростью всплеска перед заплывом. Фиктивные параметры плавания включали продолжительность плавания, частоту заплыва (т.е. количество всплесков в плавательном бою в течение всего плавательного боя) и рабочий цикл (т.е. сумму продолжительности плавательного всплеска за общую продолжительность плавательного боя). В наших руках среднее и дисперсия относительной скорости всплеска коррелировали, поэтому для анализа необходимо было преобразовать данные в журнал. Скорость афферентных всплесков отрицательно коррелировала с продолжительностью плавания, что означало, что боковая линия испытывает большее торможение во время заплывов большей продолжительности(r2 = 0,186, F2,26 = 2,971, p = 0,045; Рисунок 3B). Не было обнаружено корреляции между относительной скоростью всплеска и частотой плавания или рабочим циклом ((r2 = 0,099, F2,26 = 1,431, p = 0,231 и r2 = 0,047, F2,26 = 0,645, p = 0,932, соответственно; Рисунок 3C,D). Все анализы переменных зависимостей были взвешены по количеству заплывов на человека, а все переменные затем усреднялись по каждому индивидууму (n = 29).

Figure 1
Рисунок 1:Одновременная электрофизиологическая регистрация активности афферентного нейрона задней боковой линии и вентрального двигательного корня. (А). Пример рыхло-патч-афферента(i)и вентрального моторного корня(ii)регистрирующий электроды. Чешуйчатые полосы представляют 50 мкм.(B)Личинки рыбок данио парализованы и закреплены в четырех местах (перекрестные символы) к блюду Сильварда для записи стабильности. Жирным шрифтом выделены точки вставки для булавок. (C)Электрофизиологическая установка установлена на виброизоляционном столе и состоит из вертикального стационарного микроскопа на моторизованного контроллере, способного к 40-кратному увеличению. На микроманипуляторах установлены ступени с двойным током и напряжения зажимной головки. (D)Миомеры мускулатуры тела разделены миосептами, которые служат регистрируя ориентиры для арборизации двигательных нейронов. Вентральный моторный корневой электрод приближается к вентральному телу (слева) и центрируется и опускается поверх миосекта (наконечник стрелы). Шкала представляет собой 50 мкм.(E)Снимок экрана электрофизиологической записи в режиме реального времени, позволяющий визуализировать спонтанную афферентную активность (канал 1) и разрыв вентрального корня, свидетельствующие о фиктивном плавании (канал 2). Кнопки Запись и Воспроизведение обозначены красными стрелками. (F) Задняя боковая линия афферентного ганглия (пунктирная линия) лежит прямо под кожей и может быть идентифицирована по плотному скоплению афферентной сомы. Ганглий может быть локализован путем следования за боковой линией нерва мимо кости клейтрума (наконечник стрелы) туда, где он соединяется с ганглием. Шкала представляет 30 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2:Предварительная обработка выводов фигуры визуализирует точное обнаружение шипов. (A) Внеклеточная, рыхлая запись афферентных нейронов задней боковой линии. Дискретные шипы (помеченные красными точками) обнаруживаются с минимальным интервалом между шипами 1 мс. Базовый шум и активность от других устройств отфильтровываются путем пороговых значений, чтобы включить только амплитуды шипов в пределах 50% от максимального. (B)Запись вентрального моторного корня (VR) фиктивных плавательных схваток выявляет добровольные двигательные команды на протяжении всей записи. Пики VR (красные точки) обнаруживаются с помощью аналогичного порогового фильтра, а затем скрепляются в один заплыв (зеленый) путем обнаружения всплеска активности в пределах 200 мс друг от друга (см. вставку; шкала представляет 200 мс). Всплески, обнаруженные вне определенного плавательного боя, не происходят в пределах межскозового интервала стереотипной взрывной активности и, следовательно, исключаются. (C) Среднее значение спонтанной афферентной скорости всплеска, сосредоточенное на начале каждого плавательного боя (время = 0 с), иллюстрирующее частоту всплесков до, во время и после плавания. Панели ошибок представляют ± SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3:Количественная оценка афферентной активности до, во время и после фиктивного плавания. (A)Частота афферентных всплесков значительно снижается во время плавания, и этот эффект сохраняется даже после. Статистически сходные группировки обозначаются a и b. (B) Более длительная продолжительность плавания коррелирует с уменьшением скорости афферентных всплесков. (С-Г) Частота плавания и рабочий цикл плавания не показывают корреляции со скоростью афферентного всплеска. Все значения представляют собой среднее ± SEM. Отдельные лица с низким статистическим весом были опущены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Описанный экспериментальный протокол обеспечивает потенциал для мониторинга эндогенных изменений сенсорного ввода в двигательном поведении у неповрежденного, ведомого позвоночного. В частности, в нем подробно описывается подход in vivo к выполнению одновременных внеклеточных записей афферентных нейронов боковой линии и вентральных моторных корней у личинок рыбок данио. Спонтанная афферентная активность ранее характеризовалась у рыбок данио без учета потенциальной одновременной двигательной активности1,2,39,40,41. Без мониторинга наличия двигательной активности с вентральными записями корней расшифровка афферентной активности, вероятно, будет недооценена из-за влияния эфферентного торможения во время и даже после спонтанного плавания.

Электрофизиологические записи in vivo по своей сути сложны. По нашему опыту, поддержание здоровой подготовки является единственным величайшим фактором для достижения успешных, длительных записей для афферентных нейронов и вентральных моторных корней. Для этого важно не только выявлять и контролировать быстрый кровоток, но и распознавать текстуру кожи и подлежащую мускулатуру. Мы рекомендуем наблюдать за несколькими парализованными личинками под микроскопом перед дальнейшим обращением, чтобы ознакомиться с внутренним кровотоком и состоянием кожи здоровых личинок. Успешная запись вентрального корня через кожу требует гладкой, здоровой поверхности кожи, чтобы записывающий электрод генерировал плотное уплотнение. Этот подход обходит традиционные протоколы37,42, которые являются инвазивными и трудоемкими, которые требуют рассечения эпителия для обнажения основной мускулатуры. Неудобством записи через кожу является потенциальная изменчивость во времени до того, как сигналы будут реализованы. Оптимизация величины и продолжительности приложенного отрицательного давления уменьшит время, необходимое для установления сигнала, и потенциально улучшит отношение сигнал/шум. Записи со здорового, активного препарата должны давать спонтанные афферентные всплески частоты между 5-10 Гц с фиктивными плавательными схватками, происходящими каждые несколько секунд.

В дополнение к выявлению состояния двигательной активности, записи вентральных корней могут служить прокси для мониторинга эфферентной активности, которая разряжается параллельно двигательным командам для ослабления активности боковой линии30,31,32, а также активности в гомологических системах волосковых клеток (например, слуховой и вестибулярной системе35,43,44,45). Эфферентные нейроны находятся глубоко в заднем мозге, что делает электрофизиологические записи их чрезвычайно сложными. Рыбки данио являются модельной генетической системой, и наш протокол электрофизиологии может быть дополнен трансгенными линиями для мощного исследования аспектов сопутствующего разряда, чувствительности волосковых клеток, экситотоксичности и не только.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Мы с благодарностью признаем поддержку со стороны Национального института здравоохранения (DC010809), Национального научного фонда (IOS1257150, 1856237) и Лаборатории морских биологических наук Уитни J.C.L. Мы хотели бы поблагодарить бывших и нынешних членов Лаборатории Ляо за стимулирование дискуссий.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mL beaker PYREX 1000 resceptacle for etchant
10x water immersion objective Olympus UMPLFLN10xW low magnification for positioning larvae and recording electrode
40x water immersion objective Olympus LUMPLFLN40XW higher magnification for position electrode tip and establishing patch-clamp
abfload.m supplemental coding file custom written MATLAB script for converting raw electrophysiology recordings to .mat files
AffVR_preprocess.m supplemental coding file custom written MATLAB script for preprocessing recording data
BNC coaxial cables ThorLabs 2249-C-12 connecting amplifier and digitizer channels; require 4
borosilicate glass capillaries w/ filament Warner Instruments G150F-3 inner diameter: 0.86, outer diameter: 1.50; capillary glass used to form recording electrodes
burst_detect supplemental coding file custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m
computer N/A N/A any computer should work
DC Power Supply Tenma 72-420 used for electrically etching dissection pins
electrophysiology digitizer Axon Instruments, Molecular Devices Axon DigiData 1440A enables acquisition of patch-clamp data
filament Sutter Instrument Company FB255B 2.5 mm box filament used in micropipette puller
fine forceps Fine Science Tools Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10 used to manipulate larvae and insert pins
fixed stage DIC microscope Olympus BX51WI microscope used to visualize and establish patch-clamp recordings
flexible, tapered pipette tip Fisher Scientific 02-707-169 flexible tips enable insertion into recording electrode to dispense extracellular solution at the tip
FluoroDish World Precision Instruments Inc. FD3510-100 cover glass bottomed dish recording dish
KimWipe KimTech 34155 task wipe used for wicking away excess fluid from larvae
Kwik-Gard World Precision Instruments Inc. 710172 self-mixing sylgard elastomer
MATLAB MathWorks R2020b command line software for preprocessing data
microelectrode amplifier Axon Instruments, Molecular Devices MultiClamp 700B patch clamp amplifier for dual channel recordings
microforge Narishige MF-830 microforge to polish recording electrode
micromanipulator control unit Siskiyou MC1000-eR/T 4-axis dial coordinator for controlling micromanipulator
micropipette puller Sutter Instrument Company Flaming/Brown P-97 for pulling capillary glass into recording electrodes
microscope control unit Siskiyou MC1000e positions the microscope around the fixed stage and preparation
motorized micromanipulator Siskiyou MX7600 positions the headstage and attached recording electrode for patch-clamp recording
MultiClamp Commander Molecular Devices 2.2.2 downloadable from Axon MultiClamp 700B Commander download page
optical air table Newport Corporation VH3036W-OPT breadboard isolation table to float microscope and minimize vibrations during recordings
pCLAMP Molecular Devices 10.7.0 downloadable from Axon pCLAMP 10 Electrophysiology Data Acquisition & Analysis Software Download page
permanent ink marker Sharpie order from amazon.com for marking the leading edge side of the VR electrode to ensure proper orientation when inserting into pipette holder
petri-dish Falcon 35-3001 used to immerse larvae in paralytic
pipette holder Molecular Devices 1-HL-U hold recording electrode and connect to the headstage
pneumatic transducer Fluke Biomedical Instruments DPM1B for controlling recording electrode internal pressure
potassium hydroxide Sigma-Aldrich 221473-25G etchant for etching dissection pins
silicone tubing Tygon 14-169-1A tubing to connect pneumatic transducer to pipette holder
spike_detect supplemental coding file custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m
stereomicroscope Carl Zeiss Stemi 2000-C used to visualize pin tips and during preparation of larvae
straight edge razor blade Canopus order from amazon.com cuts the tungsten wire while making dissection pins
swimbout_detect supplemental coding file custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m
syringe Becton Dickinson Compoany 309602 filled with extracellular solution to inject into recording electrodes
transfer pipette Sigma-Aldrich Z135003-500EA single use, non-sterile pipette for transfering larvae
tricaine methanesulfonate Syndel 12854 pharmaceutical aneasthetic used to euthanize larvae with high dosage.
tungsten wire World Precision Instruments Inc. 715500 0.002 inch, 50.8 μm diameter; used to make dissection pins
vacuum filtration unit Sigma-Aldrich SCGVU11RE single use, sterile, vacuum filtration units used to sterilize extracellular solution used for electrophysiology electrode ringer
voltage-clamp current-clamp headstage Molecular Devices CV-7B supplied with MultiClamp 700B amplifier used as left and right headstages
α-bungarotoxin ThermoFisher B1601 for immobilizing the larvae prior to recording

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Trapani, J. G., Nicolson, T. Mechanism of spontaneous activity in afferent neurons of the zebrafish lateral-line organ. The Journal of Neuroscience. 31 (5), 1614-1623 (2011).
  2. Haehnel-Taguchi, M., Akanyeti, O., Liao, J. C. Afferent and motorneuron activity in response to single neuromast stimulation in the posterior lateral line of larval zebrafish. Journal of Neurophysiology. 112 (6), 1329-1339 (2014).
  3. Levi, R., Akanyeti, O., Ballo, A., Liao, J. C. Frequency response properties of primary afferent neurons in the posterior lateral line system of larval zebrafish. Journal of Neurophysiology. 113 (2), 657-668 (2015).
  4. Harris, G. G., Fishkopf, L. S., Flock, A. Receptor potentials from hair cells of the lateral line. Science. 167 (3914), 76-79 (1970).
  5. Dow, E., Jacobo, A., Hossain, S., Siletti, K., Hudspeth, A. J. Connectomics of the zebrafish's lateral line neuromast reveals wiring and miswiring in a simple microcircuit. eLife. 7, 33988 (2018).
  6. Obholzer, N., et al. Vesicular glutamate transporter 3 is required for synaptic transmission in zebrafish hair cells. The Journal of Neuroscience. 28 (9), 2110-2118 (2008).
  7. Keen, E. C., Hudspeth, A. J. Transfer characteristics of the hair cell's afferent synapse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (14), 5537-5542 (2006).
  8. Li, G., Keen, E., Andor-Ardó, D., Hudspeth, A. J., von Gersdorff, H. The unitary event underlying multiquantal EPSCs at a hair cell's ribbon synapse. The Journal of Neuroscience. 29 (23), 7558-7568 (2009).
  9. Manley, G. A., Robertson, D. Analysis of spontaneous activity of auditory neurons in the spiral ganglion of the guinea-pig cochlea. The Journal of Physiology. 258 (2), 323-336 (1976).
  10. Kiang, N. Y. S., Watanabe, T., Thomas, E., Clark, L. Discharge patterns of single fibers in the cat's auditory nerve. , MIT Press. Cambridge MA. (1965).
  11. Corey, D. P., Hudspeth, A. J. Ionic basis of the receptor potential in a vertebrate hair cell. Nature. 281 (5733), 675-677 (1979).
  12. Trapani, J. G., Nicolson, T. Physiological recordings from zebrafish lateral-line hair cells and afferent neurons. Methods in Cell Biology. 100, 219-231 (2010).
  13. Reinig, S., Driever, W., Arrenberg, A. B. The descending diencephalic dopamine system is tuned to sensory stimuli. Current Biology. 27 (3), 318-333 (2017).
  14. Zhang, Q., et al. Synaptically silent sensory hair cells in zebrafish are recruited after damage. Nature Communications. 9 (1), 1388 (2018).
  15. Pichler, P., Lagnado, L. Motor behavior selectively inhibits hair cells activated forward motion in the lateral line of zebrafish. Current Biology. 30 (1), 150-157 (2020).
  16. Olszewski, J., Haehnel, M., Taguchi, M., Liao, J. C. Zebrafish larvae exhibit rheotaxis and can escape a continuous suction source using their lateral line. PloS One. 7 (5), 36661 (2012).
  17. Suli, A., Watson, G. M., Rubel, E. W., Raible, D. W. Rheotaxis in larval zebrafish is mediated by lateral line mechanosensory hair cells. PLoS One. 7 (2), 29727 (2012).
  18. Oteiza, P., Odstcil, I., Lauder, G., Portugues, R., Engert, F. A novel mechanism for mechanosensory-based rheotaxis in larval zebrafish. Nature. 547 (7664), 445-448 (2017).
  19. McHenry, M. J., Feitl, K. E., Strother, J. A. Larval zebrafish rapidly sense the water flow of a predator's strike. Biology Letters. 5 (4), 477-479 (2009).
  20. Stewart, W. J., Cardenas, G. S., McHenry, M. J. Zebrafish larvae evade predators by sensing water flow. The Journal of Experimental Biology. 216, Pt 3 388-398 (2013).
  21. Mekdara, P. J., Schwalbe, M. A. B., Coughlin, L. L., Tytell, E. D. The effects of lateral line ablation and regeneration in schooling giant danios. The Journal of Experimental Biology. 221, Pt 8 175166 (2018).
  22. Palmer, L. M., Giuffrida, B. A., Mensinger, A. F. Neural recordings from the lateral line in free-swimming toadfish, Opsanus tau. The Biological Bulletin. 205 (2), 216-218 (2003).
  23. Ayali, A., Gelman, S., Tytell, E. D., Cohen, A. H. Lateral line activity during undulatory body motions suggests a feedback link in closed-loop control of sea lamprey swimming. Canadian Journal of Zoology. 87 (8), 671-683 (2009).
  24. Mensinger, A. F., Van Wert, J. C., Rogers, L. S. Lateral line sensitivity in free-swimming toad fish Opsanus tau. The Journal of Experimental Biology. 222, Pt 2 190587 (2019).
  25. Montgomery, J., Bodznick, D., Halstead, M. Hindbrain signal processing in the lateral line system of the dwarf scorpionfish Scopeana papillosus. The Journal of Experimental Biology. 199, Pt 4 893-899 (1996).
  26. Montgomery, J. C., Bodznick, D. An adaptive filter that cancels self-induced noise in the electrosensory and lateral line mechanosensory systems of fish. Neuroscience Letters. 174 (2), 145-148 (1994).
  27. Palmer, L. M., Deffenbaugh, M., Mensinger, A. F. Sensitivity of the anterior lateral line to natural stimuli in the oyster toadfish, Opsanus tau (Linnaeus). The Journal of Experimental Biology. 208, Pt 18 3441-3450 (2005).
  28. Russell, I. J., Roberts, B. L. Inhibition of spontaneous lateral-line activity of efferent nerve stimulation. The Journal of Experimental Biology. 57, 77-82 (1972).
  29. Lunsford, E. T., Skandalis, D. A., Liao, J. C. Efferent modulation of spontaneous lateral line activity during and after zebrafish motor commands. Journal of Neurophysiology. 122 (6), 2438-2448 (2019).
  30. Russell, I. J. The pharmacology of efferent synapses in the lateral-line system of Xenopus laevis. The Journal of Experimental Biology. 54 (3), 643-659 (1971).
  31. Roberts, B. L., Russell, I. J. The activity of lateral-line efferent neurons in stationary and swimming dogfish. The Journal of Experimental Biology. 57 (2), 435-448 (1972).
  32. Flock, A., Russell, I. J. The post-synaptic action of efferent fibres in the lateral line organ of the burbot Lota lota. The Journal of Physiology. 235 (3), 591-605 (1973).
  33. Montgomery, J. C. Noise cancellation in the electrosensory system of the thornback ray; common mode rejection of input produced by the animal's own ventilatory movement. Journal of Comparative Physiology. 155, 103-111 (1984).
  34. Tricas, T. C., Highstein, S. M. Action of the octavolateralis efferent system upon the lateral line of free-swimming toadfish, Opsanus tau. Journal of Comparative Physiology. 169 (1), 25-37 (1991).
  35. Weeg, M. S., Land, B. R., Bass, A. H. Vocal pathways modulate efferent neurons to the inner ear and lateral line. The Journal of Neuroscience. 25 (25), 5967-5974 (2005).
  36. Elgoyhen, A. B., Johnson, D. S., Boulter, J., Vetter, D. E., Heinemann, S. α9: an acetylcholine receptor with novel pharmacological properties expressed in rat cochlear hair cells. Cell. 79 (4), 705-715 (1994).
  37. Masino, M. A., Fetcho, J. R. Fictive swimming motor patterns in wild type and mutant larval zebrafish. Journal of Neurophysiology. 93 (6), 3177-3188 (2005).
  38. Hentschke, H. abfload. 1.4.0.0. MATLAB Central File Exchange. , (2020).
  39. Harris, G. G., Milne, D. C. Input-output characteristics of the lateral-line sense organs of Xenopus laevis. The Journal of the Acoustical Society of America. 40 (1), 32-42 (1966).
  40. Liao, J. C., Haehnel, M. Physiology of afferent neurons in larval zebrafish provides a functional framework for lateral line somatotopy. Journal of Neurophysiology. 107 (10), 2615-2623 (2012).
  41. Song, S., et al. Mathematical modeling and analyses of interspike-intervals of spontaneous activity in afferent neurons of the zebrafish lateral line. Nature Science Reports. 8, 14851 (2018).
  42. Liao, J. C., Fetcho, J. R. Shared versus specialized glycinergic spinal interneurons in axial motor circuits of larval zebrafish. The Journal of Neuroscience. 28 (48), 12982-12992 (2008).
  43. von Holst, E., Mittelstaedt, H. The principle of reafference: interactions between the central nervous system and the peripheral organs. Die Naturwissenschften. 37, 463 (1950).
  44. Crapse, T. B., Sommer, M. A. Corollary discharge across the animal kingdom. Nature Reviews. Neuroscience. 9 (8), 587-600 (2008).
  45. Brichta, A. M., Goldberg, J. M. Responses to efferent activation and excitatory response-intensity relations of turtle posterior-crista afferents. Journal of Neurophysiology. 83 (3), 1224-1242 (2000).

Tags

Неврология Выпуск 168 волосковая клетка электрофизиология вентральный корень эфферентная копия сопутствующий разряд
Активность афферентных нейронов задней боковой линии во время плавания у рыбок данио
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lunsford, E. T., Liao, J. C.… More

Lunsford, E. T., Liao, J. C. Activity of Posterior Lateral Line Afferent Neurons during Swimming in Zebrafish. J. Vis. Exp. (168), e62233, doi:10.3791/62233 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter