Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

פעילות של נוירונים אפרנט קו לרוחב אחורי במהלך שחייה בזברהפיש

Published: February 10, 2021 doi: 10.3791/62233
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biology, University of Florida, The Whitney Laboratory for Marine Bioscience

Summary

אנו מתארים פרוטוקול לניטור שינויים בפעילות הנוירונים האדיבים במהלך פקודות מוטוריות במערכת תאי שיער של בעלי חוליות מודל.

Abstract

מערכות חושיות אוספות רמזים החיוניים להכוונת התנהגות, אך בעלי חיים חייבים לפענח איזה מידע רלוונטי ביולוגית. תנועה מייצרת רמזים חוזרים כי בעלי חיים חייבים להתנתק מרמזים חושיים רלוונטיים של הסביבה שמסביב. לדוגמה, כאשר דג שוחה, זרימה הנוצרת מגלי גוף מזוהה על ידי נוירומסטים מכניים, הכוללים תאי שיער, המרכיבים את מערכת הקו לרוחב. תאי השיער מעבירים מידע על תנועת נוזלים מהחיישן למוח דרך תאי העצב החושיים. במקביל, פריקה corollary של הפקודה המוטורית מועברת לתאי השיער כדי למנוע עומס חושי. חשבונאות ההשפעה המעכבת של אותות מנוע חזוי במהלך הקטר הוא, אם כן, קריטי בעת הערכת הרגישות של מערכת הקו לרוחב. פיתחנו גישה אלקטרופיזיולוגית in vivo כדי לפקח בו זמנית על נוירון afferent קו לרוחב אחורי ופעילות שורש מנוע הגחוני בזחלים זברה (4-7 ימים לאחר הפריה) שיכול להימשך מספר שעות. הקלטות חוץ-תאיות של נוירונים afferent מושגות באמצעות טכניקת מהדק תיקון רופף, אשר יכול לזהות פעילות של נוירונים בודדים או מרובים. הקלטות שורש גחוני מבוצעות דרך העור עם אלקטרודות זכוכית כדי לזהות פעילות נוירון מוטורי. הפרוטוקול הניסיוני שלנו מספק את הפוטנציאל לנטר שינויים אנדוגניים או מעוררים בקלט חושי על פני התנהגויות מוטוריות בחולייתן שלם ומתנהג.

Introduction

נוירונים afferent של מערכות mechanosensory להעביר מידע מתאי שיער למוח במהלך שמיעה ואיזון. אלקטרופיזיולוגיה יכולה לחשוף את הרגישות של נוירונים afferent באמצעות הקלטות ישירות. בעוד תיקון תאים שלמים מתאי שיער יכול להיות מאתגר, הקלטה מתאי עצב afferent במורד הזרם קל יותר ומאפשר הערכה של פוטנציאל פעולה בתגובה גירויים מבוקרים1,2,3. מגרה תאי שיער להוביל הסטה שלהם, אשר משנה מבנים mechanosensory, ובכך לעורר עלייה בפוטנציאל הפעולה (קוצים) בתאי עצב אדיש4,5,6. בהיעדר גירויים חיצוניים, נוירונים afferent גם ספייק באופן ספונטני עקב דליפת גלוטמט מתאי השיער על מסופים פוסט סינפטיים afferent7,8, והוכחו לתרום לשמירה על רגישות9,10. הקלטת מלחציים של פעילות afferent מאפשרת תצפית על רגישות לתאי השיער ודינמיקת אותות שאינם אפשריים באמצעות טכניקות ברזולוציה זמנית נמוכה יותר, כגון במיקרופוניקה11,12 או הדמיית סידן תפקודית13,14,15. הפרוטוקול הבא יאפשר הקלטה של פעילות afferent במקביל לפקודות המנוע לחשוף שינויים מיידיים ברגישות לתאי השיער.

דגי זברה(Danio rerio)משתמשים בתאי שיער הכלולים בנוירומסטים המרכיבים את מערכת הקו לרוחב כדי לזהות תנועת מים יחסית לגופם, המתורגמת לאותות עצביים החיוניים לניווט16,17,18, הימנעות טורפים, לכידת טרף19,20, ולימוד21. זרימת מים יכולה להיווצר גם על ידי תנועות של שחייה22,23,24,נשימה 22,25,26, והאכלה27. התנהגויות אלה מהוות תנועות חוזרות ונשנות שיכולות להתעייף מתאי השיער ולפגוע בחישה. לכן, זה קריטי כי מערכת הקו לרוחב מבדיל בין חיצוני (exafferent) ו עצמית שנוצר (reafferent) גירויים זרימה. פריקה קורולית מקלה על אותות זרימה עצמיים במהלך תנועה בזברה. אות מנוע חיזוי מעכב זה מועבר באמצעות נוירונים יורדים לקולטנים החושיים כדי לשנות את הקלט או להפריע לעיבוד המשוב החביב28,29. עבודה מהותית שתרמה להבנתנו המוקדמת את מערכת ההזנה הזו הסתמכה על הכנות במבחנה שבהן הקישוריות והפעילות האנדוגנית של המעגל העצבי לא נשמרו28,30,31,32,33,34,35. פרוטוקול זה מתאר גישה לשימור מעגל עצבי שלם שבו נשמרת דינמיקת משוב אנדוגני ובכך מאפשר הבנה טובה יותר של הפרשות corollary ב vivo.

הפרוטוקול המתואר כאן מתאר כיצד לפקח על הנוירונים האחוריים לרוחב קו פעילות נוירון מוטורי בו זמנית זברה זחל. אפיון דינמיקת האותות לפני, במהלך ואחרי פקודות מוטוריות מספק תובנות לגבי משוב אנדוגני בזמן אמת ממערכת העצבים המרכזית המווסתת את רגישות תאי השיער במהלך התנועה. פרוטוקול זה מתאר אילו חומרים יצטרכו להיות מוכנים לפני הניסויים ולאחר מכן מתאר כיצד לשתק ולהכין זחלי זברה. הפרוטוקול יתאר כיצד להקים הקלטה יציבה של תיקון רופף של נוירונים afferent ואת השורש הגחוני חוץ תאי (VR) הקלטות של נוירונים מוטוריים. נתונים מייצגים שניתן להשיג באמצעות פרוטוקול זה מוצגים מאדם למופת וניתוח בוצע בשכפולים מרובים של הפרוטוקול הניסיוני. עיבוד מראש של נתונים מתבצע באמצעות קבצי Script כתובים מותאמים אישית ב- MATLAB. בסך הכל, פרדיגמה ניסיונית זו in vivo צפויה לספק הבנה טובה יותר של משוב חושי במהלך תנועה במערכת תאי שיער בעלי חוליות מודל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הטיפול והניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת פלורידה.

1. הכנת חומרים להקלטות אלקטרופיזיולוגיות

  1. מכינים צלחת הקלטה עם תחתית סיליקון.
    1. לוותר על שכבה דקה של רכיבים אלסטומר סיליקון ערבוב עצמי (למשל, Sylgard) לתוך צלחת תרבית רקמות תחתית זכוכית כיסוי עד שהוא מפלס עם שפת באר רדודה. כ 0.5 מ"ל מספיק.
    2. מכסים ומרפאים את המנה למינימום של 48 שעות בטמפרטורת החדר.
  2. הפוך סיכות ניתוח.
    1. לספק מטען שלילי (5 V) כדי 100 מל של תחריט (3M KOH) באמצעות ספק כוח DC ולחבר חוט טונגסטן (0.002 אינץ '; 50.8 מיקרומטר קוטר) לפלט טעון חיובית.
      התראה: חוטים שליליים וחיוביים לא צריכים ליצור קשר זה עם זה במהלך הליך זה כפי שאתה עלול להסתכן בהפקת ניצוצות, אשר עלול להוות סכנת שריפה פוטנציאלית.
    2. תחוט טונגסטן על ידי טבילה מהירה ושוב ושוב את קצה החוט לתוך האמבטיה תחריט עד הקצה מצטמצם לנקודה חדה. תחת סטריאומיקרוסקופ, חותכים את החוט כ 1 מ"מ מהקצה עם סכין גילוח קצה ישר. חזור על הפעולה שלוש פעמים נוספות ולאחר מכן הכנס סיכות לצלחת הקלטה שנרפאה באמצעות מלקחיים עדינים.
  3. הכן אלקטרודות הקלטה.
    1. משוך צינור נימי זכוכית בורוסיליקט (קוטר פנימי: 0.86 מ"מ, קוטר חיצוני: 1.50 מ"מ) באמצעות משיכה מיקרופיפט אופקית עם חוט תיבת לאלקטרודות עם קצה בקוטר 30 מיקרומטר עם התחדדות קלה (איור 1 Ai) שישמש לתיעוד נוירונים אמידים מהקו האחורי לרוחב.
    2. משוך צינור נימי זכוכית בורוסיליקט נוסף לתוך זוג אלקטרודות עם קטרים קצה קטן יותר (1-5 מיקרומטר). מחזיקים אלקטרודה אחת בכל יד, מפעילים בעדינות את הטיפים זה על פני זה כדי לשבור אותם לזווית של ~ 30°. בעזרת מיקרופורג', יש ללטש את הקצה המשופע עד לקבלת מרקם חלק. קוטר הקצה הסופי צריך להיות בין 30-50 מיקרומטר וישמש כרשת הגחון (VR) המתעדת אלקטרודה(איור 1 Aii).
    3. סמן את הצד של אלקטרודה VR עם הקצה המוביל עם דיו קבוע כדי לסייע בכיוון צמצם קצה כלפי מטה בעת החדרת האלקטרודה לתוך מחזיק פיפטה של כיסוי הראש (שלב 3.2).
      הערה: שינוי מכני של אלקטרודת הקלטת VR אינו מקרי וצעד 1.3.2 עשוי לדרוש ניסיונות מרובים עד מורפולוגיה טיפ מתאים מושגת לפני הליטוש. אלקטרודה הקלטת VR משופע כדי להתאים את עקומת הגוף של הזחלים. לאחר ייצור, אלקטרודה הקלטת VR ניתן להשתמש שוב ושוב כל עוד הקצה נשאר ברור ונקי בין ניסויים.
  4. צור את הפרוטוקול בתוכניות הקלטה אלקטרופיזיולוגיות.
    1. ודאו שהראש הימני מחובר לקלט של ערוץ 1 בחלק האחורי של זרם המיקרואלקטרוניקה ומגבר מלחצי המתח להקלטות הנוירונים והראש השמאלי מחובר לקלט של ערוץ 2 להקלטות ה-VR.
      הערה: מפרטי המחשב עבור מגבר מהדק הזרם והמתח דורשים באופן מינימלי 1 ג'יגה-הרץ או מעבד טוב יותר, Windows XP Pro או Mac OS X 10.46.6, כונן תקליטורים עם זיכרון RAM של 512 מגה-בתים, שטח כונן קשיח של 500 MB ו-2 יציאות USB.
    2. פתח את תוכנת המגבר הנשלטת על-ידי המחשב.
    3. הגדר את ערוץ 1 ואת ערוץ 2 למצב הידוק נוכחי על-ידי לחיצה על לחצן IC עבור כל ערוץ.
    4. הזן את הפרמטרים הבאים הן תחת הכרטיסיות I-Clamp 1 והן I-Clamp 2 . תפוקה ראשית: 100x AC פוטנציאל קרום (100,000 mV/mV), רווח: 1,000, בסל: 1 kHz , AC: 300 הרץ , היקף: מעקף . פלט משני: 100x AC פוטנציאל קרום (100 mV / mV) , רווח: 1 , מסנן Lowpass: 10 הרץ.
    5. שמור פרמטרי ערוץ כ Ch1_Aff וכ- Ch2_VR.
    6. התקן ופתח את תוכנת האלקטרופיזיולוגיה של מהדק התיקון.
    7. לחץ על קביעת תצורה ובחר ספסל מעבדה כדי להגדיר את האותות האנלוגיים על ידי הוספת Ch1_Aff Ch2_Vr לערוצי דיגיטייזר (למשל, אנלוגי IN #0 אנלוגי in #1)המחוברים, על ידי כבל קואקסיאלי BNC, לערוץ המתאים 1 וערוץ 2 יציאות קנה מידה של המגבר. לחץ על אישור.
      הערה: דרישות המחשב המינימליות עבור הדיגיטציה הן: מעבד 1 ג'יגה-הרץ או מעבד טוב יותר, Windows XP Pro או Mac OS X 10.46.6, כונן תקליטורים 512 MB RAM, שטח כונן קשיח של 500 MB ו- 2 יציאות USB.
    8. לחץ על רכוש ובחר פרוטוקול חדש.
    9. בכרטיסייה 'מצב/תעריף', בחרו 'ללא רווחים'; תחת מצב רכישה, הגדר את אורך הניסיון לשימוש בשטח דיסק זמין (כלומר, רשומה עד לעצירה) או כמשך מוגדר רצוי (hh:mm:ss)ולאחר מכן הגדר את קצב הדגימה לאות (Hz) ל- 20,000 כדי למקסם את הרזולוציה.
    10. תחת הכרטיסיה כניסות, בחר את ערוצי IN אנלוגיים שתצורתם נקבעה בעבר (בשלב 1.4.6) ובחר Ch1_Aff Ch2_VR עבור הערוץ המתאים.
    11. תחת הכרטיסיה יציאות, בחר Cmd 0 ו- Cmd 1 עבור #0 ערוצים וערוץ #1, בהתאמה.
      1. חבר את פקודת ערוץ 1 במגבר לאנלוגי Ouput 0 על הדיגיטציה באמצעות כבל קואקסיאלי BNC וחזור על פקודת ערוץ 2 לפלט אנלוגי 1.
    12. הכרטיסיות הנותרות יכולות להישאר תחת הגדרות ברירת המחדל. לחץ על אישור ולשמור את הפרוטוקול.

2. הכנת פתרון

  1. הכן את הפתרון של האנק: 137 mM NaCL, 5.4 mM KCl, 0.25 mM Na2HPO4, 0.44 mM KH2PO4, 1.3 mM CaCl2, 1.0 mM MgSO4, 4.2 mM NaHCO4; עמ' 7.3. לדלל 10% הפתרון של האנק על ידי הוספת הנפח המתאים של מים deionized למניה.
  2. הכן פתרון חוץ-תאי: 134 mM NaCl, 2.9 מ"מ KCl, 1.2 מ"מ MgCl2, 2.1 mM CaCl2, 10 מ"מ גלוקוז, 10 mM HEPES מאגר; pH 7.8 מותאם עם NaOH. פתרון חוץ תאי מסנן ואקום דרך המסנן עם גודל נקבובית 0.22 מיקרומטר.
  3. מכינים α -bungarotoxin: להמיס 1 מ"ג של α-bungarotoxin ליאופילי בתמיסה חוץ תאית 10 מ"ל לייצר 0.1% דילול.
  4. הכן פתרון המתת חסד: 50% (מ"ג / L) אגירה פרמצבטית כיתה MS-222 ב 10% הפתרון של האנק.
    התראה: α-bungarotoxin הוא רעלן עצבי חזק המשתק את השרירים על ידי חסימת קולטנים שימוש. כפפות נדרשות והגנה על העיניים מומלץ בעת טיפול משותק.

3. הכנת זחלים להקלטות אלקטרופיזיולוגיות

  1. לשתק זחלי זברה.
    1. השתמש זחלים מן האוכלוסייה במעבדה bred של זברה (דניו rerio; 4-7 ימים לאחר ההפריה) ובית בתמיסת העובר (10% הפתרון של האנק) ב 27 °C (69 °F).
    2. מעבירים זחלים מדיור לצלחת פטרי קטנה (35 מ"מ) באמצעות פיפטה העברה גדולה ומסירים כמה שיותר מהפתרון שמסביב.
      הערה: הסרת פתרון העובר מונעת דילול של משותק ומגבירה את יעילותו. הפינה של ניגוב משימה יכולה לשמש כדי לפתיל את פתרון העובר הנותר, וזה קריטי לא ליצור קשר עם הזחלים או להשאיר זחלים חשופים לאוויר.
    3. לטבול זחלים ב 10 μL של 0.1% α-bungarotoxin במשך כ 5 דקות.
      הערה: הזמן הדרוש כדי לשתק זחלים משתנה בין ההכנות. הכנה בריאה תלויה במעקב צמוד אחר זרימת דם מהירה מתמשכת וירידה בתגובות המוטוריות. חשיפת יתר קצרה לשיתוק יכולה להוביל לירידה איטית בבריאות הכללית של ההכנה גם לאחר סחף יסודי. עדיף ליישם לשטוף לפני הזחל הוא משותק לחלוטין בזמן שהוא עדיין מראה סימנים של תנודות שרירים עדינות.
    4. לשטוף זחל משותק עם פתרון חוץ תאי להתרחץ במשך 10 דקות.
      הערה: הסחף מאפשר לזחל לעבור מתנודות שרירים עדינות לשיתוק מוחלט. כמו כן, α-bungarotoxin הוא אנטגוניסט של קולטן אצטילכולין nicotinic (nAChR) α9-subunit, המהווה מרכיב קריטי של מעגל משוב אנדוגני פרוטוקול זה מתבונן; עם זאת, אפקט זה הוכח להיות הפיך בתאי השיער קסנופוס ו זברה לאחר 10 דקות סחף36,29.
  2. הצמד דגים בצלחת ההקלטה.
    הערה: הרדמה (למשל, MS-222, Tricaine) אינה נדרשת בעת הכנת זברה זחל (4-7 dpf) כפי שהוא מפריע לבריאות בעלי החיים. למעשה, דגי זברה זחל פטורים מפרוטוקולים מסוימים של בעלי חוליות.
    1. באמצעות פיפטה העברה, להעביר את הזחל מאמבט פתרון חוץ תאי לצלחת הקלטה עם תחתית סיליקון. ממלאים את שארית המנה בתמיסה חוץ-תאית.
    2. תחת סטריאומיקרוסקופ, מקמו בעדינות את הזחלים עם מלקחיים עדינים מעל מרכז מחצלת הסיליקון, צד לרוחב למעלה, כאשר הקצוות הצדדיים והאחוריים של הגוף רצים משמאל לימין, בהתאמה. ואז לתפוס סיכה חרוטה מן מחצלת סיליקון באמצעות מלקחיים עדינים ולהכניס את הסיכה, orthogonally לסיליקון, דרך notochord הגב של הזחלים ישירות הגב לפי הטבעת. הכנס את הסיכה השנייה דרך הנוכורדרד בסמוך לסוף הזנב והכנס את הסיכה השלישית דרך הגב הנוכורד של שלפוחית הגז(איור 1B).
      הערה: בעת החדרת סיכות, חשוב למקד את מרכז רוחב notochord כדי למנוע פגיעה בזרימת הדם או פגיעה בשרירים שמסביב. הנוכורד הוא גב לעצב הקו לרוחב האחורי, כך שעם הצמדה נכונה, לא צפוי נזק לנוירונים החושיים של הקו לרוחב. הכנס לאחר המגע הראשון כדי לא להפריע את הרקמה שמסביב. באופן אידיאלי, קוטר הסיכה הוא פחות ממחצית רוחב הנוכורד כדי להבטיח הכנסה נקייה. אם הפינים חורגים מרוחב זה, חזור על שלב 1.2 עד להשגת רוחב הסיכה הרצוי. אם זרימת הדם מאטה לאחר ההצמדה, חזור משלב 1.3 ואילך עם דגימה חדשה.
    3. הכנס את הפינה הרביעית דרך מעטה האוטי תוך מתן סיבוב קל לכיוון הצפני כאשר הסיכה מכניסה לתוך האנקפסולאנט (איור 1B). כמו סיבוב קל מוחל, לצפות את הרקמה בין cleithrum ואת vesicle אוטי לחשוף את האשכול של סומטה afferent.
      הערה: החדרה זוויתית של הסיכה הרביעית היא להבטיח את החשיפה של גנגליון afferent קו לרוחב האחורי, אשר נחסם אחרת על ידי vesicle otic גדול.

4. הקלטת שורש גחוני

  1. הניחו זחל מוצמד מתחת למטרת הטבילה במים 10x על מיקרוסקופ הפרעה דיפרנציאלית שלב קבוע (DIC) זקוף וכוונו את שסועות myseptal של גושי השרירים במקביל לווקטור הגישה לראש שמאל (איור 1B).
    1. מיקרוסקופ DIC בשלב קבוע צף על שולחן אוויר אופטי פועל בצורה הטובה ביותר כדי למנוע תנודות מלהפריע להקלטות. באמצעות מיקום ממונע, המיקרוסקופ יכול לנוע בחופשיות סביב השלב הקבוע שבו נערכים ההכנה והראש (איור 1C).
    2. מניחים את חוט הקרקע בתמיסת האמבטיה ומבטיחים שהוא מחובר לראש שמאל.
  2. מלאו את אלקטרודת הקלטת ה-VR ב-30 μL של פתרון חוץ-תאי בעזרת קצה פיפטה גמיש לטעינת ג'ל והכנסו למחזיק פיפטה שמאלי.
  3. מנמיכים את פיפט ההקלטה לתמיסת המנה עם מיקרומניפולטור תוך הפעלת לחץ חיובי (1-2 מ"מ-ח"ג) המיוצר על ידי מתמר פנאומטי. תחת הגדלה של 10x, ודא שהכיוון של פתח הקצה פונה כלפי מטה.
    1. המתמר הפנאומטי צריך להיות מחובר ליציאת מחזיק פיפטה באמצעות צינורות סיליקון.
  4. הנח את אלקטרודה VR על myoseptum
    1. באמצעות micromanipulator שוב, להוריד את קצה אלקטרודה VR עד שהוא מחזיק עמדה מעל הזחל. הגדל את ההגדלה לטבילה של פי 40.
    2. הביאו את קצה האלקטרודה מעל תמיסת ביניים בין שני מיומרים גחוניים לקו לרוחב עד שהסדק יתרכז בפתח קצה האלקטרודה VR(איור 1D).
    3. מנמיכים את הפיפט עד לקצה הפיגור של פתח הקצה בעדינות מגעים אפיתל. לאחר מגע ראשוני, לתמרן את פיפטה באלכסון כדי להבטיח את הקצה המוביל יוצר קשר והוא יכול ליצור חותם.
    4. החל לחץ שלילי (~ 100 מ"מ Hg) עם מתמר פנאומטי להחזיק.
      הערה: כיוון נכון של פיפטה VR ביחס myoseptum ולחץ שלילי מתמשך מייעל זיהוי פעילות נוירון מוטורי עם יחס אות לרעש גבוה דרך העור.
  5. לזהות פעילות נוירון מוטורי.
    1. יש לחבר את כיסוי הראש השמאלי למגבר, המעביר את האות המוגבר לדיגיטייזר המפיק את האות האמור לתוכנת האלקטרופיזיולוגיה של מלחצי התיקון לניטור במחשב סמוך (ראה סעיף 1.4).
    2. בתוכנת מלחציים לתיקון, לחץ על לחצן הפעל בסרגל הכלים כדי לנטר את אות ה- VR (איור 1E).
    3. ודאו שהקלטת ה-VR מושגת ברגע שפעילות הנוירונים המוטוריים עם דינמיקת אות פרץ סטריאוטיפית היטב נצפית29,37 (איור 1E).
      הערה: התקפי שחייה פיקטיביים הם דפוסי הפעילות של הנוירונים המוטוריים VR שממשיכים לשדר למרות שההכנה משותקת. לכן, שחייה פיקטיבית היא אמצעי נגיש לקביעת המצב ההתנהגותי של החיה ומדידת פרמטרים לוקומוטוריים ובו זמנית ביצוע הקלטות נוירון afferent הדורשים הכנה משותקת. בידיים שלנו, ברגע שהקלטת VR מושגת, הכנה בריאה תעורר התקפי שחייה פיקטיביים מרצון כל כמה שניות. זכור, הכנה בריאה סבלה מזרימת דם מהירה. שים לב, השגת אות VR מספיק עשויה להימשך מספר דקות ויחס האות לרעש עשוי להשתפר לאחר הגילוי הראשוני. לטובת הזמן, מקובל לעבור לסעיף 5.
    4. אם הקלטת VR עדיין לא מושגת לאחר השלמת סעיף 5, שחרר לחץ שלילי, העלה את האלקטרודה וחזור משלב 4.4.2 ואילך על myoseptum שונה אם בריאות הזחל עדיין אופטימלית.

5. הקלטת נוירון Afferent

  1. למלא את אלקטרודה הקלטה afferent עם 30 μL של פתרון חוץ תאי; הכנס לתוך מחזיק פיפטה הראש הימני(איור 1B,C),ונמוך יותר לתוך תמיסת המנה תוך הפעלת לחץ חיובי (1-2 מ"מ Hg) המיוצר על ידי מתמר פנאומטי.
  2. אתר והצמד באופן רופף לגנגליון אחורי לרוחב קו.
    1. באמצעות micromanipulator, להוריד את קצה אלקטרודה afferent עד שהוא מחזיק עמדה מעל cleithrum.
    2. הגדל את ההגדלה לטבילה של פי 40 ואתר את ההצטלבות של עצב הקו לרוחב האחורי וקליטרום. עקבו אחר קו העצבים הלרוחב מהקליתרום למקום שבו הסיבים הפנימיים את הגנגליון האחורי של הקו לרוחב, שניתן להבחין בו על ידי הצביר הדיסקרטי של סומה(איור 1F).
    3. מביאים את קצה האלקטרודה מעל הגנגליון האדיש ומנמיכים את הפיפט עד שהקצה יוצר קשר עם האפיתל. בעדינות, לתמרן את האלקטרודה כך היקף הקצה כולו יוצר קשר עם גנגליון afferent.
    4. יש להפעיל לחץ שלילי (20-50 מ"מ גרם) עם המתמר הפנאומטי ולהחזיק.
      הערה: הלחץ השלילי המופעל על הגנגליון האדיש עדין יותר מהיניקה המיושמת במהלך הקלטת השורש הגחוני. הגברת הלחץ השלילי יכולה לשפר את האות לרעש, אך בריאות הנוירונים פוחתת תחת שאיבה אגרסיבית מתמשכת, מה שמפחית את ההסתברות להקלטה מוצלחת.
  3. הקלט פעילות נוירון afferent.
    1. ודא שהראש הימני מחובר ברצף דומה כמתואר בשלב 4.5.1.
    2. ב pClamp10, לחץ על כפתור הפעל בסרגל הכלים כדי לפקח על נוירון afferent ואות VR בו זמנית.
    3. ודא כי התא כולו, הקלטת תיקון רופף של נוירונים afferent מושגת פעם קוצים להתרחש באופן ספונטני, בערך כל 100-200 ms1,29 (איור 1E).
    4. בהדרגה, להגדיל את הנוירון afferent הקלטת לחץ אלקטרודה בחזרה אטמוספרי (0 מ"מ Hg) ולהחזיק לשארית ההקלטה.

6. רכישת נתונים

  1. הקלטה בו זמנית.
    1. לאחר נוירון afferent ופעילות נוירון מוטורי מזוהים שניהם, לחץ על כפתור הקלטה בסרגל הכלים ב pClamp10 כדי ללכוד הקלטות ללא פער בו זמנית בשני הערוצים.
    2. רשומה למשך הרצוי (איור 1E).
      הערה: הקלטה בהכנה בריאה יכולה להימשך שעות רבות ולהישאר מגיבה לגירויים חיצוניים.
    3. שמור את ההקלטה כסוג קובץ נתמך ( .abf, pClamp10) כדי לשמר מטה-נתונים כגון פרמטרי רכישה.

7. המתת חסד

  1. החל לחץ חיובי (10 מ"מ Hg) הן אלקטרודות הקלטה afferent ו- VR באמצעות מתמרים פנאומטיים ולהרים את האלקטרודות מצלחת ההקלטה באמצעות micromanipulators.
  2. מעבירים את צלחת ההקלטה מהמיקרוסקופ DIC בשלב קבוע לסטריאומיקרוסקופ הנתיחה.
  3. באמצעות מלקחיים קצה דק, להסיר סיכות טונגסטן מן notochord כמוסה אוטי, ולהעביר את הזחלים באמצעות פיפטה העברה לתוך צלחת פטרי (35 מ"מ) המכיל 5 מ"ל של פתרון המתת חסד במשך מינימום של 5 דקות.

8. עיבוד מקדים וניתוח נתונים

הערה: עיבוד וניתוח מראש של נתונים יחייבו הבנה בסיסית של קידוד שורת הפקודה.

  1. המר את קובץ ההקלטה לעיבוד מקדים.
    1. התקן את תוכנת Matlab.
    2. הורד את קובץ ה- Script הכתוב המותאם אישית, abfload.m38 ושמור את הקובץ באותה תיקיה המאחסנת את קובץ ההקלטה הגולמי.
    3. בחלון עורך Matlab, פתח את abfload.m ולחץ על הפעל בסרגל הכלים. בחר שנה תיקיה, אם תתבקש לעשות זאת.
    4. בצע את הפונקציה בחלון הפקודה עם קובץ ההקלטה הגולמי כקלט,
      > [ד,סי,ח] = abfload('[שם קובץ הקלטה גולמי].abf')
      ושמור את סביבת העבודה של הפלט בשם קובץ הכולל ייעוד זחל, גיל ותאריך ניסיוני כגון [מספר דגימה]_[גיל ב- dpf]_[שם קובץ הקלטה גולמי (כולל תאריך ניסיוני כברירת מחדל)].
      הערה: שם הקובץ המומר צריך לכלול רק מספר שלם שלם של תווי מקף תחתון.
  2. בצע עיבוד מקדים של נתונים.
    1. הורד קובץ Script של Matlab AffVR_preprocess.m ופונקציות משויכות, שנכתבו בהתאמה אישית על ידי המחברים.
    2. בחלון העורך, פתח את AffVR_preprocess.m.
    3. תחת משתנים, התאם את ספי זיהוי ספייק הגבול התחתון הן עבור הקלטות afferent והן עבור הקלטות VR (spk_detect_lb ו- vr_detect_lb, קווים 8 ו - 14, בהתאמה) בהתאם להקלטה של יחס האות לרעש.
      הערה: זיהוי ספייק מסתמך על סף ידני כדי למיין ולבודד אותות מיותר מתא עצב אחד על ידי משרעת. רעש בסיסי ופעילות מיחידות אחרות מסוננים על-ידי סף כדי לכלול משרעת ספייק רק בתוך אחוז (למשל, spk_detect_lb) מהמקסימום (למשל, spk_detect_ub). סף גם מבטיח binning מדויק של פעילות מוטורית קוצים לתוך התפרצויות והתקפי שחייה פיקטיביים קולקטיביים. בדרך כלל, התחל עם גבול תחתון סף של 0.5, והקטן בהדרגה עד שיושג זיהוי מדויק. לדוגמה, הגדרת spk_detect_lb כ- 0.5 ו- spk_detect_ub כ- 1.0 תזהה את כל הקוצים השווים או גדולים מ- 50% מהמקסימום של משרעת ספייק ולא תכלול רעש או נוירונים נוספים של משרעת ספייק נמוכה יותר (איור 2A). לחלופין, אפשר גם להוריד את spk_detect_ub מ 1.0 כדי לא לכלול נוירונים של משרעת ספייק גבוה יותר על מנת לבודד את הנוירונים של משרעת ספייק נמוך. פלטי איורים לעיבוד מקדים (ראה שלב 7.2.6) יודיעו אם יש צורך בהתאמות וחזרה משלב 7.2.2.
    4. בחלון עורך, לחץ על הפעל כדי לבצע AffVR_preprocess.m.
    5. נווט אל קובץ הנתונים .mat שהומר בעבר (ראה שלב 7.1.3); בחר ולחץ על פתח כדי להתחיל עיבוד מקדים אוטומטי.
      הערה: בזמן שקובץ ה- Script המותאם אישית פועל, פלטים יופיעו בחלון הפקודה המודיעים על התקדמותו באמצעות שלבי עיבוד כגון "סינון נתונים ...", "זיהוי פעילות שורש גחוני ...", ו"יצירת דמויות ...".
    6. נתונים הנוצרים על ידי AffVR_preprocess.m ימחישו ספייק וזיהוי מציאות מדומה ויציינו אם יש להתאים משתני ניתוח כלשהם (איור 2).
    7. הזן "Y" בלוח המקשים כדי לשמור מטה-נתונים מעובדים מראש בתיקיית preprocess_output.
    8. נתונים מעובדים מראש יופקו באופן אוטומטי כ- data_out.xls.
  3. נתח את הנתונים המעובדים מראש כרצונך.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

לאחר זחלי זברה משתקים כראוי ואת גנגליון קו לרוחב האחורי והקלטת VR מושגת, פעילות הן נוירונים afferent ומוטורי ניתן למדוד בו זמנית. ערוצי הקלטה מוצגים באמצעות פרוטוקולי הקלטה ללא פערים (שלב 1.4) לניטור רציף של פעילות afferent ו- VR. בזמן אמת, ניתן להבחין בירידות בשיעור הזינוק הספונטני במקביל לפעילות מציאות מדומה המעידה על התקפי שחייה פיקטיביים(איור 1E). מצאנו כי התוצאות הטובות ביותר וזיהוי ספייק מדויק היו מוצרים של הקלטות שהשיגו יחס אות לרעש של לפחות 0.5. סקריפטים מותאמים אישית לעיבוד מראש בכתב יוצרים עלילות כדי לסייע בהדמיה של זיהוי קפיץ של afferent ו- VR. קוצים ספונטניים מזוהים באמצעות שילוב של פרמטרי ספייק כגון סף, משך זמן מינימלי (0.01 אלפיות השנייה) ומרווח זמן מינימלי בין ספייק (ISI; 1 אלפיות השנייה). הגברת הלחץ השלילי בעת הקמת ההקלטה לעיתים קרובות מניבה זיהוי אותות מיחידות afferent מרובות בבת אחת. סינון לפי משרעת מאפשר להבחין בין דינמיקת אותות של תפאורה עצמאית. ניתן להשיג אותות מבודדים על-ידי התאמת משתני הזיהוי בגבול התחתון ובגבול העליון בקובץ ה- Script לעיבוד מראש (איור 2A). יניקה אגרסיבית להשגת הקלטות מרובות יחידות יכולה להוביל להקלטות לא יציבות, רעש מכני, השפלה של בריאות אפרנטית, ובסופו של דבר אובדן אות. לכן, חשוב לחייג לאט בחזרה יניקה ללחץ אטמוספרי ברגע האות הרצוי מושגת. זיהוי ספייק שורש גחוני עוקב אחר פרמטרים זהים לזיהוי ספייק afferent אבל דורש תשומות נוספות כדי להגדיר התקפי שחייה פיקטיביים מובהקים. התפרצויות בתוך פקודה מוטורית מוגדרות על ידי פעילות VR עם מינימום של שני קוצים בתוך 0.1 ms אחד מהשני ונמשך מינימום של 5 ms. כל התקפי השחייה מסומנים לאחר מכן במינימום של שלושה פרצים עם מרווחים בין פרץ של <200 אלפיות השנייה(איור 2B).

קשה לפרש פעילות אפרנטית כשמסתכלים על הקלטה בשלמותה. סקריפטים לעיבוד מראש יכסו מקטעים של פעילות אפרנטית שבמרכזם תקופה מוגדרת היטב של עניין, במקרה זה, תחילתו של קרב שחייה (n = 33, איור 2C) כדי לסייע בהדמיית מגמות בדינמיקת אותות. פעילות afferent מיידית מחושבת באמצעות מסנן ממוצע נע וחלון דגימה של 100 אלפיות השנייה. פעילות ספונטנית ממוצעת מראה שינויים דרמטיים בתגובה לתחילת הפעילות המוטורית (איור 2C). כדי לנתח ולנתח טוב יותר פעילות afferent, תקופות לפני ואחרי השחייה מוגדרים כדי להתאים את מרווח הזמן של קרב השחייה המתאים. בתסריט שלפני העיבוד ותוצאות ניתוח מייצגות תקופות אלה נקראות "טרום שחייה" ו"לאחר השחייה". שיעורי הספייק שלפני השחייה, השחייה ואחרי השחייה חושבו על ידי לקיחת מספר הקוצים בתקופה המתאימה לאורך תקופתו. הדיוק של הערכות עבור כל אדם הוא בחלקו פונקציה של מספר השחייה, ולכן ניתחנו יחסים משתנים באמצעות רגרסיות משוקללות, עם משקולות בודדות השוות לשורש הריבועי של מספר השחייה.

הבדלים בשיעורי העלייה האדישים בתקופות העניין השונות (טרום שחייה, שחייה ואחרי שחייה) נבדקו על ידי ניתוח דו-כיווני של שונות (ANOVA). הבדיקה שלאחר ההוקי של Tukey זיהתה הבדלים משמעותיים בשיעורי הזינוק בין שיעורי הזינוק בשחייה ושיעורי עלייה חדה של שניהם לפני השחייה (8.94 ± 0.2 הרץ, ירידה יחסית של 57%) ואחרי השחייה (5.34 ± 0.2 הרץ, ירידה יחסית של 40%) תקופות. שיעור הזינוק לא חזר מיד לקו הבסיס בהתחשב בכך שמצאנו גם כי שיעור ספייק שלאחר השחייה היה נמוך משיעור ספייק טרום השחייה (Tukey לאחר בדיקות hoc על פני קבוצות, p < 0.001; איור 3A). מודלים ליניאריים שימשו לזיהוי קשרים בין קצב ספייק יחסי לבין פרמטרי שחייה פיקטיביים. קצב ספייק יחסי חושב על ידי לקיחת קצב עליית קצב השחייה מעל קצב עליית החדות שלפני השחייה. פרמטרי השחייה הפיקטיביים כללו משך שחייה, תדירות שחייה (כלומר, מספר התפרצויות בקרב שחייה לאורך כל תחרות השחייה) ומחזור חובה (כלומר, סכום פרץ השחייה לאורך כל תקופת תחרות השחייה). בידינו, הממוצע והשונות של קצב ספייק יחסי היו מתואמים, ולכן היה צורך שהנתונים יירשמו לצורך ניתוח. קצב ספייק Afferent היה בקורלציה שלילית עם משך השחייה כלומר הקו לרוחב חווה עיכוב גדול יותר במהלך שחייה שלמשך זמן ארוך יותר (r 2 = 0.186, F2,26 = 2.971, p = 0.045; איור 3B). לא זוהה מתאם בין קצב ספייק יחסי לבין תדירות שחייה או מחזור עבודה ((r2 = 0.099, F2,26 = 1.431, p = 0.231, ו- r2 = 0.047, F2,26 = 0.645, p = 0.932, בהתאמה; איור 3C,D). כל הניתוחים של מערכות יחסים משתנות היו משוקללים על ידי מספר השחייה לאדם וכל המשתנים היו אז ממוצע על ידי כל אדם (n = 29).

Figure 1
איור 1: הקלטה אלקטרופיזיולוגית בו זמנית של נוירון אפרנטי בקו צדדי אחורי ופעילות שורש מוטורית גחונית. דוגמה של תיקון רופף afferent (i) ושורש מנוע הגחון (ii) הקלטת אלקטרודות. פסים בקנה מידה מייצגים 50 מיקרומטר. (B) דג זברה לארבל משותק ומוצמד בארבעה מיקומים (סמלי צלב) לצלחת סילגרד לתיעוד יציבות. צלבים מודגשים מייצגים נקודות הכנסה עבור פינים. (C)אסדת האלקטרופיזיולוגיה מותקנת על שולחן בידוד רטט ומורכבת ממיקרוסקופ שלב קבוע זקוף על בקר ממונע המסוגל להגדיל פי 40. שני שלבי ראש מהדק זרם ומתח מותקנים על מיקרומניפולטורים. (D)האוריות של שרירי הגוף מופרדות על ידי מיוספטה המשמשות כסיוני דרך לרישום נוירונים מוטוריים. אלקטרודת השורש המוטורי הגחוני מתקרבת לגוף הגחוני (משמאל) ומרוכזת ומורדת על גבי מיוסופטום (ראש חץ). סרגל קנה המידה מייצג 50 מיקרומטר. (E) לכידת מסך של הקלטה אלקטרופיזיולוגית בזמן אמת המאפשרת הדמיה של הפעילות האדישה הספונטנית (ערוץ 1) ופעילות שורש גחוני מתפרצת המעידה על תחרות שחייה פיקטיבית (ערוץ 2). הלחצנים הקלט והפעל מסומנים בחצים אדומים. (F)הקו האחורי לרוחב גנגליון (קו מקווקו) שוכב ממש מתחת לעור והוא יכול להיות מזוהה על ידי מקבץ הדוק של סומה afferent. הגנגליון יכול להיות ממוקם על ידי ביצוע עצב הקו לרוחב בעבר עצם cleithrum (ראש חץ) למקום שבו הוא מתחבר לגנגליון. סרגל קנה המידה מייצג 30 מיקרומטר.

Figure 2
איור 2: פלטי איורים לעיבוד מקדים מדמיינים זיהוי ספייק מדויק. (A)הקלטה חוץ-תאית, רפויה של תאי עצב אחוריים לרוחב. קוצים נפרדים (המסומנים בנקודות אדומות) מזוהים עם מרווח מינימלי של 1 אלפיות השנייה. רעש בסיסי ופעילות מיחידות אחרות מסוננים על-ידי סף כדי לכלול משרעת ספייק רק בטווח של 50% מהמקסימום. (B)הקלטת שורש מנוע גחוני (VR) של התקפי שחייה פיקטיביים חושפת פקודות מוטוריות התנדבותיות לאורך כל ההקלטה. קוצים VR (נקודות אדומות) מזוהים באמצעות מסנן סף דומה ולאחר מכן binned לתוך התקף שחייה יחיד (ירוק) על ידי גילוי פרץ של פעילות בתוך 200 ms אחד של השני (ראה להוסיף; סרגל קנה המידה מייצג 200 ms). קוצים שזוהו מחוץ לתחרות השחייה המוגדרת אינם מתרחשים במרווח בין ספייק של פעילות פרץ סטריאוטיפית ולכן אינם נכללים. (C) ממוצע קצב ספייק ספונטני afferent התמקדה תחילתה של כל תחרות שחייה (זמן = 0 s) הממחיש קצב ספייק לפני, במהלך, ואחרי שחייה. קווי שגיאה מייצגים ± SEM. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: כימות הפעילות האדישה לפני, במהלך ואחרי שחייה פיקטיבית. (A) שיעור הזינוק האפרנטי מצטמצם משמעותית במהלך השחייה ואפקט זה נמשך גם לאחר מכן. קבוצות דומות מבחינה סטטיסטית מסומנות על-ידי a ו- b. (B) משך שחייה ארוך יותר מתואם לירידה בשיעור העלייה. (C-D) תדירות השחייה ומחזור השחייה אינם מראים מתאם לקצב עליית מדרגה. כל הערכים מייצגים ממוצע ± SEM. אנשים בעלי משקל סטטיסטי נמוך הושמטו. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקול הניסיוני המתואר מספק את הפוטנציאל לניטור שינויים אנדוגניים בקלט החושי על פני התנהגויות מוטוריות בחולייתן שלם ומתנהג. באופן ספציפי, הוא מפרט גישה in vivo לביצוע הקלטות חוץ תאיות בו זמנית של נוירונים afferent קו לרוחב ושורשים מוטוריים גחוניים בזברה זחל. פעילות ספונטנית מתאפיינת בעבר בזברהפיש ללא התחשבות בפעילות מוטורית פוטנציאלית בו זמנית1,2,39,40,41. ללא ניטור נוכחות של פעילות מוטורית עם הקלטות שורש הגחון, פענוח פעילות afferent צפוי לזלזל בשל ההשפעה של עיכוב efferent במהלך, ואפילו אחרי, שחייה ספונטנית.

הקלטות אלקטרופיזיולוגיות In vivo הן מאתגרות מטבען. מניסיוננו, שמירה על הכנה בריאה היא הגורם הגדול ביותר להשגת הקלטות מוצלחות וארוכות טווח עבור נוירונים אפרנטיים ושורשים מוטוריים גחוניים. כדי לעשות זאת, חשוב לא רק לזהות ולנטר זרימת דם מהירה, אלא גם לזהות את מרקם העור ואת השרירים הבסיסיים. אנו ממליצים התבוננות כמה זחלים משותקים תחת מיקרוסקופ לפני טיפול נוסף כדי להכיר את זרימת הדם המהותית ואת מצב העור של זחלים בריאים. הקלטת שורש גחון מוצלחת דרך העור דורשת משטח עור חלק ובריא על מנת שאלקטרודה ההקלטה תיצור חותם הדוק. גישה זו עוקפת את הפרוטוקולים המסורתיים37,42 כי הם פולשניים זמן רב, אשר קוראים לנתח את האפיתל לחשוף את השרירים הבסיסיים. אי נוחות של הקלטה דרך העור היא השונות הפוטנציאלית בזמן לפני האותות מתממשים. אופטימיזציה של סדר הגודל ומשך הלחץ השלילי המופעל תקטין את הזמן הנדרש ליצירת אות וייתכן שישפר את יחס האות לרעש. הקלטות מהכנה בריאה ופעילה אמורות להניב קצבי ספייק ספונטניים בין 5-10 הרץ עם התקפי שחייה פיקטיביים המתרחשים כל כמה שניות.

בנוסף לחשיפת מצב הפעילות המוטורית, הקלטות שורש הגחון יכולות לשמש פרוקסי לניטור פעילות תוססת המשחררת במקביל לפקודות המנוע כדי להקל על פעילות קו רוחבי30,31,32, כמו גם פעילות במערכות תא שיער הומולוגיות (למשל, מערכת השמיעה ושיווי המשקל35,43,44,45). נוירונים Efferent שוכנים עמוק ב hindbrain, מה שהופך הקלטות אלקטרופיזיולוגיות שלהם מאתגר מאוד. דגי זברה הם מערכת גנטית לדוגמה, ופרוטוקול האלקטרופיזיולוגיה שלנו יכול להיות משלים קווים מהונדסים כדי לחקור בעוצמה היבטים של פריקה corollary, רגישות לתאי השיער, excitotoxicity, ומעבר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

אנו מודים בהכרת תודה על תמיכת המכון הלאומי לבריאות (DC010809), הקרן הלאומית למדע (IOS1257150, 1856237), ומעבדת ויטני למדעי המוח הימיים ל J.C.L. ברצוננו להודות לחברי מעבדת ליאו בעבר ובהווה על הדיונים הממריצה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mL beaker PYREX 1000 resceptacle for etchant
10x water immersion objective Olympus UMPLFLN10xW low magnification for positioning larvae and recording electrode
40x water immersion objective Olympus LUMPLFLN40XW higher magnification for position electrode tip and establishing patch-clamp
abfload.m supplemental coding file custom written MATLAB script for converting raw electrophysiology recordings to .mat files
AffVR_preprocess.m supplemental coding file custom written MATLAB script for preprocessing recording data
BNC coaxial cables ThorLabs 2249-C-12 connecting amplifier and digitizer channels; require 4
borosilicate glass capillaries w/ filament Warner Instruments G150F-3 inner diameter: 0.86, outer diameter: 1.50; capillary glass used to form recording electrodes
burst_detect supplemental coding file custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m
computer N/A N/A any computer should work
DC Power Supply Tenma 72-420 used for electrically etching dissection pins
electrophysiology digitizer Axon Instruments, Molecular Devices Axon DigiData 1440A enables acquisition of patch-clamp data
filament Sutter Instrument Company FB255B 2.5 mm box filament used in micropipette puller
fine forceps Fine Science Tools Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10 used to manipulate larvae and insert pins
fixed stage DIC microscope Olympus BX51WI microscope used to visualize and establish patch-clamp recordings
flexible, tapered pipette tip Fisher Scientific 02-707-169 flexible tips enable insertion into recording electrode to dispense extracellular solution at the tip
FluoroDish World Precision Instruments Inc. FD3510-100 cover glass bottomed dish recording dish
KimWipe KimTech 34155 task wipe used for wicking away excess fluid from larvae
Kwik-Gard World Precision Instruments Inc. 710172 self-mixing sylgard elastomer
MATLAB MathWorks R2020b command line software for preprocessing data
microelectrode amplifier Axon Instruments, Molecular Devices MultiClamp 700B patch clamp amplifier for dual channel recordings
microforge Narishige MF-830 microforge to polish recording electrode
micromanipulator control unit Siskiyou MC1000-eR/T 4-axis dial coordinator for controlling micromanipulator
micropipette puller Sutter Instrument Company Flaming/Brown P-97 for pulling capillary glass into recording electrodes
microscope control unit Siskiyou MC1000e positions the microscope around the fixed stage and preparation
motorized micromanipulator Siskiyou MX7600 positions the headstage and attached recording electrode for patch-clamp recording
MultiClamp Commander Molecular Devices 2.2.2 downloadable from Axon MultiClamp 700B Commander download page
optical air table Newport Corporation VH3036W-OPT breadboard isolation table to float microscope and minimize vibrations during recordings
pCLAMP Molecular Devices 10.7.0 downloadable from Axon pCLAMP 10 Electrophysiology Data Acquisition & Analysis Software Download page
permanent ink marker Sharpie order from amazon.com for marking the leading edge side of the VR electrode to ensure proper orientation when inserting into pipette holder
petri-dish Falcon 35-3001 used to immerse larvae in paralytic
pipette holder Molecular Devices 1-HL-U hold recording electrode and connect to the headstage
pneumatic transducer Fluke Biomedical Instruments DPM1B for controlling recording electrode internal pressure
potassium hydroxide Sigma-Aldrich 221473-25G etchant for etching dissection pins
silicone tubing Tygon 14-169-1A tubing to connect pneumatic transducer to pipette holder
spike_detect supplemental coding file custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m
stereomicroscope Carl Zeiss Stemi 2000-C used to visualize pin tips and during preparation of larvae
straight edge razor blade Canopus order from amazon.com cuts the tungsten wire while making dissection pins
swimbout_detect supplemental coding file custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m
syringe Becton Dickinson Compoany 309602 filled with extracellular solution to inject into recording electrodes
transfer pipette Sigma-Aldrich Z135003-500EA single use, non-sterile pipette for transfering larvae
tricaine methanesulfonate Syndel 12854 pharmaceutical aneasthetic used to euthanize larvae with high dosage.
tungsten wire World Precision Instruments Inc. 715500 0.002 inch, 50.8 μm diameter; used to make dissection pins
vacuum filtration unit Sigma-Aldrich SCGVU11RE single use, sterile, vacuum filtration units used to sterilize extracellular solution used for electrophysiology electrode ringer
voltage-clamp current-clamp headstage Molecular Devices CV-7B supplied with MultiClamp 700B amplifier used as left and right headstages
α-bungarotoxin ThermoFisher B1601 for immobilizing the larvae prior to recording

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Trapani, J. G., Nicolson, T. Mechanism of spontaneous activity in afferent neurons of the zebrafish lateral-line organ. The Journal of Neuroscience. 31 (5), 1614-1623 (2011).
  2. Haehnel-Taguchi, M., Akanyeti, O., Liao, J. C. Afferent and motorneuron activity in response to single neuromast stimulation in the posterior lateral line of larval zebrafish. Journal of Neurophysiology. 112 (6), 1329-1339 (2014).
  3. Levi, R., Akanyeti, O., Ballo, A., Liao, J. C. Frequency response properties of primary afferent neurons in the posterior lateral line system of larval zebrafish. Journal of Neurophysiology. 113 (2), 657-668 (2015).
  4. Harris, G. G., Fishkopf, L. S., Flock, A. Receptor potentials from hair cells of the lateral line. Science. 167 (3914), 76-79 (1970).
  5. Dow, E., Jacobo, A., Hossain, S., Siletti, K., Hudspeth, A. J. Connectomics of the zebrafish's lateral line neuromast reveals wiring and miswiring in a simple microcircuit. eLife. 7, 33988 (2018).
  6. Obholzer, N., et al. Vesicular glutamate transporter 3 is required for synaptic transmission in zebrafish hair cells. The Journal of Neuroscience. 28 (9), 2110-2118 (2008).
  7. Keen, E. C., Hudspeth, A. J. Transfer characteristics of the hair cell's afferent synapse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (14), 5537-5542 (2006).
  8. Li, G., Keen, E., Andor-Ardó, D., Hudspeth, A. J., von Gersdorff, H. The unitary event underlying multiquantal EPSCs at a hair cell's ribbon synapse. The Journal of Neuroscience. 29 (23), 7558-7568 (2009).
  9. Manley, G. A., Robertson, D. Analysis of spontaneous activity of auditory neurons in the spiral ganglion of the guinea-pig cochlea. The Journal of Physiology. 258 (2), 323-336 (1976).
  10. Kiang, N. Y. S., Watanabe, T., Thomas, E., Clark, L. Discharge patterns of single fibers in the cat's auditory nerve. , MIT Press. Cambridge MA. (1965).
  11. Corey, D. P., Hudspeth, A. J. Ionic basis of the receptor potential in a vertebrate hair cell. Nature. 281 (5733), 675-677 (1979).
  12. Trapani, J. G., Nicolson, T. Physiological recordings from zebrafish lateral-line hair cells and afferent neurons. Methods in Cell Biology. 100, 219-231 (2010).
  13. Reinig, S., Driever, W., Arrenberg, A. B. The descending diencephalic dopamine system is tuned to sensory stimuli. Current Biology. 27 (3), 318-333 (2017).
  14. Zhang, Q., et al. Synaptically silent sensory hair cells in zebrafish are recruited after damage. Nature Communications. 9 (1), 1388 (2018).
  15. Pichler, P., Lagnado, L. Motor behavior selectively inhibits hair cells activated forward motion in the lateral line of zebrafish. Current Biology. 30 (1), 150-157 (2020).
  16. Olszewski, J., Haehnel, M., Taguchi, M., Liao, J. C. Zebrafish larvae exhibit rheotaxis and can escape a continuous suction source using their lateral line. PloS One. 7 (5), 36661 (2012).
  17. Suli, A., Watson, G. M., Rubel, E. W., Raible, D. W. Rheotaxis in larval zebrafish is mediated by lateral line mechanosensory hair cells. PLoS One. 7 (2), 29727 (2012).
  18. Oteiza, P., Odstcil, I., Lauder, G., Portugues, R., Engert, F. A novel mechanism for mechanosensory-based rheotaxis in larval zebrafish. Nature. 547 (7664), 445-448 (2017).
  19. McHenry, M. J., Feitl, K. E., Strother, J. A. Larval zebrafish rapidly sense the water flow of a predator's strike. Biology Letters. 5 (4), 477-479 (2009).
  20. Stewart, W. J., Cardenas, G. S., McHenry, M. J. Zebrafish larvae evade predators by sensing water flow. The Journal of Experimental Biology. 216, Pt 3 388-398 (2013).
  21. Mekdara, P. J., Schwalbe, M. A. B., Coughlin, L. L., Tytell, E. D. The effects of lateral line ablation and regeneration in schooling giant danios. The Journal of Experimental Biology. 221, Pt 8 175166 (2018).
  22. Palmer, L. M., Giuffrida, B. A., Mensinger, A. F. Neural recordings from the lateral line in free-swimming toadfish, Opsanus tau. The Biological Bulletin. 205 (2), 216-218 (2003).
  23. Ayali, A., Gelman, S., Tytell, E. D., Cohen, A. H. Lateral line activity during undulatory body motions suggests a feedback link in closed-loop control of sea lamprey swimming. Canadian Journal of Zoology. 87 (8), 671-683 (2009).
  24. Mensinger, A. F., Van Wert, J. C., Rogers, L. S. Lateral line sensitivity in free-swimming toad fish Opsanus tau. The Journal of Experimental Biology. 222, Pt 2 190587 (2019).
  25. Montgomery, J., Bodznick, D., Halstead, M. Hindbrain signal processing in the lateral line system of the dwarf scorpionfish Scopeana papillosus. The Journal of Experimental Biology. 199, Pt 4 893-899 (1996).
  26. Montgomery, J. C., Bodznick, D. An adaptive filter that cancels self-induced noise in the electrosensory and lateral line mechanosensory systems of fish. Neuroscience Letters. 174 (2), 145-148 (1994).
  27. Palmer, L. M., Deffenbaugh, M., Mensinger, A. F. Sensitivity of the anterior lateral line to natural stimuli in the oyster toadfish, Opsanus tau (Linnaeus). The Journal of Experimental Biology. 208, Pt 18 3441-3450 (2005).
  28. Russell, I. J., Roberts, B. L. Inhibition of spontaneous lateral-line activity of efferent nerve stimulation. The Journal of Experimental Biology. 57, 77-82 (1972).
  29. Lunsford, E. T., Skandalis, D. A., Liao, J. C. Efferent modulation of spontaneous lateral line activity during and after zebrafish motor commands. Journal of Neurophysiology. 122 (6), 2438-2448 (2019).
  30. Russell, I. J. The pharmacology of efferent synapses in the lateral-line system of Xenopus laevis. The Journal of Experimental Biology. 54 (3), 643-659 (1971).
  31. Roberts, B. L., Russell, I. J. The activity of lateral-line efferent neurons in stationary and swimming dogfish. The Journal of Experimental Biology. 57 (2), 435-448 (1972).
  32. Flock, A., Russell, I. J. The post-synaptic action of efferent fibres in the lateral line organ of the burbot Lota lota. The Journal of Physiology. 235 (3), 591-605 (1973).
  33. Montgomery, J. C. Noise cancellation in the electrosensory system of the thornback ray; common mode rejection of input produced by the animal's own ventilatory movement. Journal of Comparative Physiology. 155, 103-111 (1984).
  34. Tricas, T. C., Highstein, S. M. Action of the octavolateralis efferent system upon the lateral line of free-swimming toadfish, Opsanus tau. Journal of Comparative Physiology. 169 (1), 25-37 (1991).
  35. Weeg, M. S., Land, B. R., Bass, A. H. Vocal pathways modulate efferent neurons to the inner ear and lateral line. The Journal of Neuroscience. 25 (25), 5967-5974 (2005).
  36. Elgoyhen, A. B., Johnson, D. S., Boulter, J., Vetter, D. E., Heinemann, S. α9: an acetylcholine receptor with novel pharmacological properties expressed in rat cochlear hair cells. Cell. 79 (4), 705-715 (1994).
  37. Masino, M. A., Fetcho, J. R. Fictive swimming motor patterns in wild type and mutant larval zebrafish. Journal of Neurophysiology. 93 (6), 3177-3188 (2005).
  38. Hentschke, H. abfload. 1.4.0.0. MATLAB Central File Exchange. , (2020).
  39. Harris, G. G., Milne, D. C. Input-output characteristics of the lateral-line sense organs of Xenopus laevis. The Journal of the Acoustical Society of America. 40 (1), 32-42 (1966).
  40. Liao, J. C., Haehnel, M. Physiology of afferent neurons in larval zebrafish provides a functional framework for lateral line somatotopy. Journal of Neurophysiology. 107 (10), 2615-2623 (2012).
  41. Song, S., et al. Mathematical modeling and analyses of interspike-intervals of spontaneous activity in afferent neurons of the zebrafish lateral line. Nature Science Reports. 8, 14851 (2018).
  42. Liao, J. C., Fetcho, J. R. Shared versus specialized glycinergic spinal interneurons in axial motor circuits of larval zebrafish. The Journal of Neuroscience. 28 (48), 12982-12992 (2008).
  43. von Holst, E., Mittelstaedt, H. The principle of reafference: interactions between the central nervous system and the peripheral organs. Die Naturwissenschften. 37, 463 (1950).
  44. Crapse, T. B., Sommer, M. A. Corollary discharge across the animal kingdom. Nature Reviews. Neuroscience. 9 (8), 587-600 (2008).
  45. Brichta, A. M., Goldberg, J. M. Responses to efferent activation and excitatory response-intensity relations of turtle posterior-crista afferents. Journal of Neurophysiology. 83 (3), 1224-1242 (2000).

Tags

מדעי המוח גיליון 168 תא שיער אלקטרופיזיולוגיה שורש הגחון עותק אפרנטי הפרשות קורולה
פעילות של נוירונים אפרנט קו לרוחב אחורי במהלך שחייה בזברהפיש
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lunsford, E. T., Liao, J. C.… More

Lunsford, E. T., Liao, J. C. Activity of Posterior Lateral Line Afferent Neurons during Swimming in Zebrafish. J. Vis. Exp. (168), e62233, doi:10.3791/62233 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter