Summary
我们描述了一个协议，以监测在模型脊椎动物毛细胞系统运动命令期间的无动于衷的神经元活动的变化。
Abstract
感官系统收集指导行为必不可少的线索，但动物必须破译哪些信息与生物学相关。运动产生重新获得线索，表明动物必须脱离周围环境的相关感官线索。例如，当鱼游泳时，由构成横向线系统的机械感应神经瘤（包括毛细胞）检测到身体起伏产生的流量。然后，毛细胞通过感官性神经元将流体运动信息从传感器传输到大脑。同时，电机指令的必然放电被传到毛细胞，以防止感官超载。因此，在评估横向线系统的灵敏度时，考虑运动过程中预测运动信号的抑制作用至关重要。我们已经开发出一种体内电生理学方法，可以同时监测斑马鱼幼虫（受精后4-7天）的后横向线轴神经元和腹腔运动根活动，这种活动可以持续几个小时。使用松散的贴片夹紧技术实现对有发声神经元的细胞外记录，该技术可以检测来自单个或多个神经元的活动。用玻璃电极通过皮肤进行心室根记录，以检测运动神经元活动。我们的实验协议提供了在完整、行为灵巧的脊椎动物中监测运动行为的内源性或唤起感官输入变化的潜力。
Introduction
机械感官系统的神经元在听觉和平衡过程中将信息从毛细胞传输到大脑。电子生理学可以通过直接记录揭示过敏神经元的敏感性。虽然从头发细胞的整个细胞修补可能具有挑战性，从下游的通风神经元记录更容易，并允许评估行动潜力，以响应受控刺激1，2，3。刺激头发细胞导致其偏转，从而改变机械感官结构，从而触发在无动于衷的神经元4，5，6的动作潜力（尖峰）增加。在没有外部刺激的情况下，由于谷氨酸从毛细胞泄漏到发精后7、8的终端，心酸神经元也会自发地尖峰，并被证明有助于保持敏感性9、10。贴片夹记录的通风活动，使观察头发细胞的敏感性和信号动力学，这是不可能使用技术与较低的时间分辨率，如在微音11，12或功能钙成像13，14，15。以下协议将允许记录与运动命令并存的无动于衷的活动，以显示毛细胞敏感性的瞬时变化。
斑马鱼（Danio rerio）使用神经瘤中所含的头发细胞组成横向线系统来检测相对于其身体的水运动，这些水体被转化为导航16、17、18、捕食者躲避、猎物捕获19、20和学校教育21所必需的神经信号。水流也可以由游泳22、23、24、呼吸22、25、26和喂食27的运动自行产生。这些行为包括重复运动，可以疲劳头发细胞和损害传感。因此，横向线系统必须区分外部（外向）和自生成（重现）流量刺激。在斑马鱼的运动过程中，必然放电会减弱自生成的流动信号。这种抑制性预测运动信号通过下降神经元传导到感官受体，以修改输入或中断处理再吸收反馈28，29。开创性的工作有助于我们早期了解这个馈送系统依赖于体外制备，其中神经回路的连接性和内源活动没有保持28，30，31，32，33，34，35。该协议描述了一种保存完整神经回路的方法，其中内源反馈动力学得以保持，从而能够更好地了解体内的必然放电。
此处概述的协议描述了如何同时监测幼虫斑马鱼的后横向线神经元和运动神经元活动。在运动指令之前、期间和之后对发光信号动态进行特征化，可深入了解中枢神经系统实时的内生反馈，这些反馈在运动过程中调节了毛细胞的敏感性。该协议概述了在实验前需要准备哪些材料，然后描述了如何瘫痪和准备斑马鱼幼虫。该协议将描述如何建立一个稳定的松散补丁记录的通风神经元和细胞外腹腔根（VR）记录的运动神经元。使用此协议可以获得的代表性数据来自一个范例个体，并针对实验协议的多个副本进行了分析。使用 MATLAB 中的自定义书面脚本对数据进行预处理。总的来说，这种体内实验范式有望在模型脊椎动物毛细胞系统中更好地了解运动过程中的感官反馈。
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Protocol
所有动物护理和实验都是按照佛罗里达大学机构动物护理和使用委员会批准的协议进行的。
1. 为电生理记录准备材料
- 制作硅胶弹性体底录音盘。
- 将一层薄薄的自混合硅弹性体组件（如 Sylgard）放入盖玻璃底组织培养盘中，直到它与浅井的边缘水平。大约 0.5 mL 就足够了。
- 在室温下将菜盖上并治愈至少48小时。
- 制作解剖引脚。
- 使用直流电源向 100 mL 等钢嘴 （3M KOH） 提供负电荷 （5 V），并将钨丝（0.002 英寸;直径 50.8μm）连接到正电荷输出。
注意：在此过程中，负线和正线不应相互接触，因为您可能会产生火花，从而可能构成潜在的火灾危险。 - 蚀刻钨丝通过快速和反复浸入电线尖到蚀刻浴缸，直到尖端缩小到一个尖锐点。在立体显微镜下，用直边剃刀刀片将电线从尖端切开约 1 毫米。再重复三次，然后使用细钳将引脚插入固化的录音盘中。
- 使用直流电源向 100 mL 等钢嘴 （3M KOH） 提供负电荷 （5 V），并将钨丝（0.002 英寸;直径 50.8μm）连接到正电荷输出。
- 准备录制电极。
- 使用带盒长丝的水平微皮拉器将一个具有 30μm 直径尖端的电极中拉入带轻微锥度（图 1 Ai）的电极中，用于记录后侧线的通风神经元。
- 将额外的薄氧玻璃毛细管拉入一对尖端直径较小的电极（1-5 μm）中。每只手握住一个电极，轻轻地将提示相互碾过，使其折断至~30°角。使用微型锻造机，抛光斜面尖端，直到光滑。最终尖端直径应在 30-50 μm 之间，并将用作记录电极（图 1 Aii）的腹根 （VR） 。
- 用永久墨水将 VR 电极的一侧标记为前缘，以帮助将电极插入头台的移液器支架（第 3.2 步）时向下定向倾斜尖端光圈。
注：VR 记录电极的机械修改不精确，步骤 1.3.2 可能需要多次尝试，直到在抛光前达到合适的尖端形态。VR 记录电极与幼虫的身体曲线相符。一旦制造完成，只要尖端在实验之间保持清晰和干净，VR 记录电极就可以反复使用。
- 在电生理学记录程序中生成协议。
- 确保右头连接到微电极电流背面的 通道 1 输入和用于通风神经元录音的电压夹钳放大器，左头台连接到 VR 录音 的第 2 频道 输入。
注意：电流和电压夹钳放大器的计算机规格最小要求 1 Ghz 或更好的处理器、Windows XP Pro 或 Mac OS X 10.46.6、带 512 MB RAM 的 CD-ROM 驱动器、500 MB 硬盘空间和 2 个 USB 端口。 - 打开计算机控制的放大器软件。
- 通过单击每个通道的IC按钮，将通道1和通道2设置为当前夹紧模式。
- 在 I-夹 1 和 I-夹 2 选项卡下输入以下参数。 主要输出： 100x 交流膜潜力 （100，000 mV/mV）， 增益： 1，000， 贝塞尔： 1 kHz， 交流： 300 Hz， 范围： 旁路 . 二次输出 ：100倍交流膜电位（100mV/mV）， 增益：1， 低通滤镜：10 赫兹。
- 将通道参数保存为Ch1_Aff和Ch2_VR。
- 安装并打开贴片夹电生理学软件。
- 单击配置并选择实验室台，通过将Ch1_Aff和Ch2_Vr添加到通过 BNC 同轴电缆连接到相应的信道 1和通道 2缩放输出的数字化通道（例如，模拟 in #0和模拟in #1）来设置模拟信号。点击确定。
注意：数字化器的最低计算机要求是：1 Ghz 或更好的处理器、Windows XP Pro 或 Mac OS X 10.46.6、CD-ROM 驱动器 512 MB RAM、500 MB 硬盘空间和 2 个 USB 端口。 - 点击 获取 并选择 新协议。
- 在 模式/速率 选项卡中，选择 无间隙：在 采集模式下，将 试用长度 设置为 使用可用磁盘空间 （即记录直到停止）或所需的设置 持续时间（hh：mm：ss），然后将 每个信号 （Hz） 的采样率 设置为 20，000 以最大限度地提高分辨率。
- 在"输入"选项卡下，选择以前配置的模拟 IN 通道（步骤 1.4.6），并为相应的通道选择Ch1_Aff和Ch2_VR。
- 在输出选项卡下，分别为频道#0和频道#1选择Cmd 0和Cmd 1。
- 通过 BNC 同轴电缆将放大器上的通道 1 命令连接到数字化器上的模拟 Ouput 0，并重复用于第 2 频道命令到模拟输出 1。
- 其余选项卡可以保留在默认设置下。单击 "确定" 并保存协议。
- 确保右头连接到微电极电流背面的 通道 1 输入和用于通风神经元录音的电压夹钳放大器，左头台连接到 VR 录音 的第 2 频道 输入。
2. 解决方案准备
- 准备汉克的解决方案： 137 mM 纳CL， 5.4 mM KCl， 0.25 mM 纳2HPO4， 0.44 mM KH2PO4，1.3 mM 卡Cl2， 1.0 mM MgSO4， 4.2 mM 纳赫科4：pH 7.3.通过向库存中添加适量的除离子水，稀释到 10% Hank 的解决方案。
- 准备细胞外解决方案： 134 m M NaCl， 2.9 mM KCl， 1.2 mM MgCl2，2.1 mM 卡Cl2，10 mM 葡萄糖， 10 mM HEPES 缓冲器：pH 7.8调整与NAOH。真空滤芯外溶液通过过滤器与0.22μm孔径大小。
- 准备α -邦加罗毒素：在10mL细胞外溶液中溶解1毫克的合金α-邦加罗毒素，产生0.1%稀释。
- 准备安乐死解决方案：50% （mg/L） 缓冲药物级 MS-222 在 10% 汉克的解决方案。
注意：α-邦加罗毒素是一种强大的神经毒素，通过阻断胆碱受体使肌肉瘫痪。在处理麻痹症时，需要手套和眼睛保护。
3. 为电生理记录准备幼虫
- 固定斑马鱼幼虫。
- 使用来自斑马鱼实验室繁殖种群的幼虫（Danio rerio;受精后4-7天），在27°C的胚胎溶液（10%汉克溶液）中容纳幼虫。
- 使用大尖移液器将幼虫从外壳转移到小培养皿（35 毫米），并尽可能多地去除周围的溶液。
注意：去除胚胎溶液可防止麻痹的稀释，并增加其疗效。任务擦拭的一角可以用来清除剩余的胚胎溶液，重要的是不要接触幼虫或让幼虫暴露在空气中。 - 将幼虫浸入 10 μL 的 0.1% α-邦加罗毒素中约 5 分钟。
注：固定幼虫所需的时间因准备而异。健康的准备取决于密切监测持续的快速血液流动和减少的运动反应。短暂过度暴露到麻痹可能导致准备的整体健康缓慢下降，即使在彻底洗净后。最好在幼虫完全固定之前进行洗涤，同时它仍然显示出微妙的肌肉振动迹象。 - 用细胞外溶液清洗瘫痪的幼虫，沐浴10分钟。
注意：冲洗允许幼虫从微妙的肌肉振动过渡到完全瘫痪。此外，α-邦加罗毒素是尼古丁乙酰胆碱受体（nAChR）+9亚单位的拮抗剂，这是本协议观察到的内源反馈电路的关键组成部分;然而，这种效果已被证明是可逆的Xenopus和斑马鱼头发细胞后，10分钟洗掉36，29。
- 在录音盘中钉鱼。
注：麻醉（如MS-222，三卡因）在准备幼虫斑马鱼（4-7 dpf）时不需要，因为它会干扰动物健康。事实上，幼虫斑马鱼不受某些脊椎动物协议的约束。- 使用转移移液器，将幼虫从细胞外溶液浴转移到硅胶底记录盘。将剩下的菜装满细胞外溶液。
- 在立体显微镜下，用细尖的钳子轻轻地将幼虫放置在硅胶垫的中心上方，侧向向上，身体的前端和后部分别从左到右运行。然后用细尖钳从硅胶垫上抓住蚀刻的针脚，然后通过幼虫的后部鼻孔直接向肛门插入针脚，正交地插入硅胶。将第二个针穿过靠近尾部的鼻梁，并通过气囊的鼻塞（图1B）插入第三个针脚。
注意：在插入针脚时，必须瞄准胸宽的中心，以防止影响血液流动或破坏周围的肌肉。鼻孔是后横向线神经的后部，因此通过适当的固定，预计横向线感官神经元不会受到损伤。第一次接触后插入，以免干扰周围组织。理想情况下，针的直径小于公针宽度的一半，以确保干净的插入。如果引脚超过此宽度，则重复步骤 1.2，直到达到所需的引脚宽度。如果固定后血液流动减慢，则用新标本从步骤 1.3 继续重复。 - 插入第四个针通过otic囊泡，同时提供轻微的旋转朝前，因为针插入封装剂（图1B）。当应用轻微的旋转时，注意和象形囊泡之间的组织，以显示发热的索马塔集群。
注意：倾斜插入第四个引脚是为了确保后侧线的暴露，否则被大的肠囊阻塞。
4. 文特尔根记录
- 将固定的幼虫置于固定阶段差分干扰对比 （DIC） 直立显微镜的 10 倍水浸入目标下，并定向肌肉块与左头接近向量平行的神秘裂口 （图 1B）。
- 漂浮在光学气台上的固定阶段 DIC 显微镜最能防止振动干扰录音。然后，显微镜使用电动定位器在固定的安装准备和头部的阶段（图 1C）自由移动。
- 将接地线放入浴缸溶液中，并确保它连接到左头。
- 使用灵活的凝胶加载移液器尖端填充 VR 记录电极，并插入左头台移液器支架。
- 使用微脉冲器将录音移液器放入盘中，同时施加气动传感器产生的正压（1-2 mmHg）。在 10 倍放大倍度下，确认尖端光圈朝下的方向。
- 气动传感器应通过硅胶管连接到移液器支架端口。
- 将VR电极放在肌囊上
- 再次使用微脉冲器，降低VR电极尖端，直到它保持幼虫上方的位置。将放大倍数增加到 40 倍沉浸式。
- 将电极尖端在两个肌膜腹腔之间的肌囊上带到横向线，直到裂口以VR电极尖孔径（图1D）为中心。
- 降低移液器，直到尖端光圈的滞后边缘轻轻地接触上皮。初始接触后，对角操纵移液器，以确保前缘进行接触并生成密封。
- 使用气动传感器施加负压（~100 mm Hg）并保持。
注：VR移液器相对于肌囊和连续负压的正确方向优化了检测运动神经元活动，通过皮肤的信号与噪声比很高。
- 检测运动神经元活动。
- 左头应连接到放大器，放大信号中继到数字化器中，将该信号输出到补丁夹电生理学软件中，以便在相邻计算机上进行监控（见第 1.4 节）。
- 在补丁夹软件中，单击工具栏上的"播放"按钮以监控 VR 信号 （图 1E）。
- 确保在观察到具有良好定型突发信号动力学的运动神经元活动后实现VR记录29，37 （图 1E）。
注：Fictive 游泳回合是 VR 运动神经元的活动模式，尽管准备瘫痪，这些神经元仍在继续传输。因此，虚构游泳是确定动物行为状态和测量运动体参数，同时执行需要固定准备的辅助神经元记录的一种可访问的手段。在我们手中，一旦实现了VR记录，健康的准备将引起自愿的虚构游泳比赛每隔几秒钟。请记住，健康的准备已经持续快速的血液流动。请注意，获得足够的 VR 信号可能需要几分钟时间，初始检测后信号与噪声比率可能会提高。为了时间的利益，可以转到第5节。 - 如果在完成第 5 节后仍未实现 VR 记录，则释放负压、提升电极，并在幼虫健康状况仍然最佳的情况下，从步骤 4.4.2 继续重复到不同的肌囊上。
5. 阿弗伦特神经元记录
- 用30μL的细胞外溶液填充通风记录电极;插入右头移液器支架（图1B，C），并降低到盘中溶液中，同时施加气动传感器产生的正压（1-2 mm Hg）。
- 定位并松散地连接到后横向线，以达到发热性结动。
- 使用微操纵器，降低心电极尖端，直到它保持在夹层上方的位置。
- 将放大倍数增加到 40 倍浸入，并定位后横向线神经和夹板的交集。跟随横向线神经前部从到纤维内侧线内侧线的外侧线，可区分为分离的索马簇（图 1F ）。
- 将电极尖端带过发泡的结节，降低移液器，直到尖端接触上皮。轻轻地，操纵电极，使整个尖端周长接触到发热的结节。
- 使用气动传感器施加负压（20-50 mm Hg）并保持。
注意：施加在发热性结扎上的负压比在心室根记录期间施加的吸力更温和。增加负压可以改善信号到噪声，但在持续的侵略性吸力下，心电神经元健康下降，这降低了成功记录的概率。
- 记录无精干的神经元活动。
- 确保右头以与步骤 4.5.1 中描述的类似顺序连接。
- 在 pClamp10 中，单击工具栏上的 "播放" 按钮，同时监控通风神经元和 VR 信号。
- 确保整个细胞，松散的贴片记录的异常神经元是实现一旦峰值自发发生，大约每100-200毫秒1，29（图1E）。
- 渐渐地，将记录电极压力的通风神经元增加回大气（0 mm Hg），并保留记录的剩余部分。
6. 数据获取
- 同步录制。
- 检测到异常神经元和运动神经元活动后，单击 pClamp10 工具栏上的 "记录 "按钮，以捕获两个通道中同时无间隙的录音。
- 记录所需的持续时间（图1E）。
注意：健康准备中的录音可以持续数小时，并且对外部刺激保持响应。 - 将录制保存为支持的文件类型 （.abf， pClamp10），以保留元数据（如获取参数）。
7. 安乐死
- 使用气动变频器对通风和VR记录电极施加正压（10 mm Hg），并使用微操纵器从录音盘中提升电极。
- 将录音盘从固定阶段 DIC 显微镜转移到解剖立体显微镜。
- 使用细尖钳，从诺托克和奥蒂克胶囊中取出钨针，使用转移移液器将幼虫转移到含有5mL安乐死溶液的培养皿（35毫米）中，最少5分钟。
8. 预处理和数据分析
注：数据预处理和分析需要对命令行编码进行基本了解。
- 将录制文件转换为预处理。
- 安装马特拉布软件。
- 下载自定义书面脚本，abfload.m 38，并将文件保存到存储原始记录文件的同一文件夹中。
- 在 Matlab 编辑器 窗口中，打开 abfload.m 并单击工具栏上的 "运行 "。如果提示，请选择 更改文件夹。
- 以原始记录文件为输入在 命令窗口 中执行功能，
> [d， si， h] = abfload（"原始录制文件名称" 。
并保存输出工作空间，其中包含幼虫的指定、年龄和实验日期，如 dpf 中的[样本编号][原始记录文件名称中的年龄（默认包括实验日期）] 。
注：已转换的文件名称仅应包含下划划的整数。
- 执行数据预处理。
- 下载Matlab脚本AffVR_preprocess.m和相关功能，由作者编写的自定义。
- 在 编辑器 窗口中，打开AffVR_preprocess.m。
- 根据 变量，根据信号与噪声比的记录，调整下限峰值检测阈值（分别为spk_detect_lb 和 vr_detect_lb、8号线和 14 号线）。
注：尖峰检测依赖于手动阈值来按振幅对多个发音神经元的信号进行排序和隔离。基线噪声和其他单位的活动通过阈值过滤掉，仅包括峰值振幅在最大（例如，spk_detect_ub）的百分比（例如，spk_detect_lb）以内。阈值还确保电机活动尖峰准确绑定成爆裂和集体虚构的游泳回合。通常，从 0.5 的阈值下限开始，并逐渐降低，直到实现精确检测。例如，将spk_detect_lb设置为 0.5 和spk_detect_ub为 1.0 将检测所有等于或大于峰值振幅最大值 50% 的尖峰，并排除较低峰值振幅的噪声或额外神经元（图 2A）。或者，还可以将spk_detect_ub从 1.0 降低到排除高峰值振幅的神经元，以便隔离下尖峰振幅的神经元。预处理数字输出（见步骤 7.2.6）将告知是否有必要从步骤 7.2.2 进行调整和重复。 - 在 编辑器 窗口中，单击 "运行" 以执行AffVR_preprocess.m。
- 导航到先前转换的 .mat 数据文件（参见步骤 7.1.3）;选择并单击 "打开" 以开始自动预处理。
注意：当自定义脚本运行时，输出将显示在 命令窗口 中，通过"过滤数据。。。"、"检测腹腔根活动。。。"和"生成数字"等处理步骤通知其进度。 - AffVR_preprocess.m生成的数字将可视化峰值和VR检测，并指示是否应调整任何分析变量（图 2）。
- 在键盘上输入"Y"，将预处理的元数据保存到preprocess_output文件夹中。
- 预处理的数据将自动输出为data_out.xls。
- 根据需要分析预先处理的数据。
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Representative Results
斑马鱼幼虫被正确固定，并实现后横向线腹膜和VR记录后，可以同时测量无光和运动神经元的活性。使用无间隙录制协议（第 1.4 步）显示录制通道，以持续监控通风和 VR 活动。实时地，可以观察到自发性尖峰率的降低与VR活动同时观察，指示虚构的游泳比赛（图1E）。我们发现，最佳结果和准确的峰值检测是记录产品，其信号与噪声比至少达到 0.5。自定义书面预处理脚本生成绘图，以帮助可视化通风和 VR 尖峰检测。使用阈值、最短持续时间（0.01 ms）和最小间尖峰间隔（ISI; 1 毫秒）等峰值参数的组合来识别自发的尖峰。在建立记录时增加负压力通常同时产生来自多个信号单元的信号检测。按振幅过滤允许区分独立信号的信号动力学。通过调整预处理脚本中的下界和上界检测变量（图 2A），可以实现隔离信号。积极吸力实现多单元录音可导致不稳定的录音、机械噪音、健康退化，并最终导致信号丢失。因此，一旦达到所需的信号，必须慢慢回拨到大气压力。文特尔根尖峰检测遵循相同的参数，以通风尖峰检测，但需要额外的输入来定义不同的虚构游泳回合。电机命令中的突发由 VR 活动定义，彼此之间至少存在两个峰值，并持续至少 5 毫秒。然后，所有游泳比赛都以至少三次爆发来划出，爆发间隔为<200毫秒（图2B）。
在查看完整录音时，难以解释有活力的活动。预处理脚本将覆盖以明确定义的兴趣期为中心的无动于衷活动的部分，在这种情况下，将开始游泳比赛（n = 33， 图 2C），以帮助可视化信号动态趋势。使用移动平均滤镜和 100 ms 采样窗口计算瞬时无动于衷的活动。平均自发活动显示运动活动开始时的巨大变化 （图 2C）。为了更好地解剖和分析运动，游泳前后的周期设置为匹配相应的游泳比赛的时间间隔。在预处理脚本和代表性分析结果中，这些周期称为"游泳前"和"游泳后"。游泳前、游泳和游泳后峰值速率是通过在相应期间内计算峰值数量计算得出的。每个人的估计精度部分是游泳次数的函数，因此我们使用加权回归分析可变关系，个人重量等于游泳次数的平方根。
通过对方差（ANOVA）的双向分析，测试了不同兴趣期（游泳前、游泳前和游泳后）的无动于衷的峰值利率差异。Tukey 的特例后测试发现游泳峰值率和游泳前峰值速率（8.94 ± 0.2 Hz，相对下降 57%） 之间的峰值速率存在显著差异。和游泳后 （5.34 ± 0.2 Hz， 相对下降 40%）时期。峰值率没有立即回到基线，因为我们还发现，游泳后峰值率低于游泳前峰值速率（图基后跨组测试，p < 0.001： 图3A）。线性模型用于检测相对峰值速率和虚构游泳参数之间的关系。相对峰值速率是通过将游泳峰值速率计入游泳峰值速率而不是游泳前峰值速率计算得出的。游泳参数包括游泳持续时间、游泳频率（即游泳比赛期间游泳比赛的爆发次数）和值班周期（即游泳比赛总持续时间的游泳爆发时间之和）。在我们手中，相对峰值速率的平均值和方差是相关的，因此有必要对数据进行日志转换以进行分析。异常峰值速率与游泳持续时间呈负相关，这意味着横向线在较长的游泳过程中受到更大的抑制（r2 = 0.186，F2，26 = 2.971，p = 0.045; 图3B）。未检测到相对峰值速率与游泳频率和值班周期之间的相关性（（r2 = 0.099，F2，26 = 1.431，p = 0.231，r2 = 0.047，F2，26 = 0.645，p = 0.932; 图 3C，D）。所有可变关系分析均按每个人游泳次数加权，然后由每个人平均所有变量（n = 29）。
图1：后横向线心肺神经元和心室运动根活动的同步电生理记录。松散补丁（i）和心室电机根（ii）记录电极的例子。比例杆代表 50μm. （B） 拉瓦尔斑马鱼瘫痪，并固定在四个位置（交叉符号）到西尔加德菜记录稳定性。粗体十字架表示针脚的插入点。（C） 电生理学钻机安装在振动隔离台上，由可放大40倍的电动控制器上直立的固定级显微镜组成。双电流夹和电压夹头阶段安装在微操纵器上。（D） 身体肌肉的肌瘤由肌瘤分离，作为运动神经元植树造林的地标。心室电机根电极接近心室体（左），中心和降低在肌囊（箭头）顶部。比例杆表示 50 μm. （E） 实时电子生理记录的屏幕捕获，允许可视化自发的无足无能活动（通道 1）和爆裂的腹腔根活动，指示虚构的游泳回合（通道 2）。记录和播放按钮表示为红色箭头。（F） 后横向线（虚线）位于皮肤下方，可以通过一组紧密的发热索马来识别。结节可以通过跟随横向线神经穿过夹板骨（箭头）到它连接到结节的地方来定位。比例栏表示 30μm。请单击此处查看此图的更大版本。
图2：预处理图输出可视化准确的峰值检测。 （A） 细胞外，松散补丁记录后横向线发音神经元。检测到离散尖峰（标记为红点），最小间尖峰间隔为 1 毫秒。基线噪声和其他单位的活动通过阈值过滤掉，仅包括最大值 50% 以内的峰值振幅。（B） 文特尔运动根记录 （VR） 的虚构游泳回合揭示了自愿运动命令在整个记录期间。使用类似的阈值滤清器检测 VR 尖峰（红点），然后通过检测彼此 200 毫秒内的活动爆发（参见插入;比例杆表示 200 毫秒）将它们装箱放入单个游泳回合（绿色）中。在定义的游泳比赛之外检测到的尖峰不会在刻板的爆裂活动之间的尖峰间歇内发生，因此被排除在外。（C） 表示以每次游泳比赛开始（时间 = 0s）为中心的自发性尖峰速率，说明游泳前、游泳期间和游泳后出现峰值速率。错误栏表示 Sem ±。 请单击此处查看此图的更大版本。
图3：在游泳前、游泳期间和游泳后对运动进行量化。 （A）游泳期间的尖峰率显著降低，这种影响甚至持续到之后。统计上相似的组表示为 a 和 b. （B） 更长的游泳持续时间与降低的尖峰速率相关。 （C-D）游泳频率和游泳值班周期与尖峰率没有关联。所有值都代表平均± Sem。省略了统计权重较低的外向个人。 请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
描述的实验协议提供了在完整、行为良好的脊椎动物中监测运动行为感官输入的内源性变化的潜力。具体来说，它详细介绍了一种体内方法，用于同时执行横向线轴神经元和幼虫斑马鱼腹腔运动根部的细胞外记录。自发性活动以前在斑马鱼中具有特征，没有考虑到潜在的并发运动活动1、2、39、40、41。如果不用腹根记录监测运动活动的存在，由于自发游泳期间甚至之后的剧烈抑制的影响，破译通风活动可能会被低估。
在体内电生理学记录本质上是具有挑战性的。根据我们的经验，保持健康的准备是实现对心室神经元和心室运动根部的成功、持久记录的最大因素。为此，不仅要识别和监测快速的血液流动，还要识别皮肤的质地和底层肌肉。我们建议在显微镜下观察几只瘫痪的幼虫，然后再进一步处理，以熟悉健康幼虫的内在血流和皮肤状态。通过皮肤成功记录腹腔根需要光滑、健康的皮肤表面，以便记录电极产生紧密的密封。这种方法绕过了侵入性和耗时的传统协议37，42，这需要解剖上皮，以暴露潜在的肌肉。通过皮肤记录的不便是信号实现前的时间的潜在变异性。优化应用负压的大小和持续时间将减少建立信号所需的时间，并有可能提高信号与噪声比率。来自健康、积极准备的录音应产生 5-10 Hz 之间的自发性峰值速率，每隔几秒钟就会发生一次虚构的游泳比赛。
除了揭示运动活动状态外，心室根记录还可以作为监测与运动命令平行放电的发光活动的代理，以减弱横向线活动30、31、32以及同源毛细胞系统（例如，听觉和前庭系统 35、43、44、45）中的活动。活泼的神经元深藏在后脑中，使得它们的电生理记录极具挑战性。斑马鱼是一个模型遗传系统，我们的电生理学协议可以辅之以转基因线，以有力地研究必然放电，毛细胞敏感性，兴奋性，等等。
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Disclosures
作者声明没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
我们感谢国家卫生研究院（DC010809）、国家科学基金会（IOS1257150，1856237）和惠特尼海洋生物科学实验室对J.C.L的支持。我们要感谢廖实验室过去和现在的成员鼓励讨论。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mL beaker | PYREX | 1000 | resceptacle for etchant |
| 10x water immersion objective | Olympus | UMPLFLN10xW | low magnification for positioning larvae and recording electrode |
| 40x water immersion objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | higher magnification for position electrode tip and establishing patch-clamp |
| abfload.m | supplemental coding file | custom written MATLAB script for converting raw electrophysiology recordings to .mat files | |
| AffVR_preprocess.m | supplemental coding file | custom written MATLAB script for preprocessing recording data | |
| BNC coaxial cables | ThorLabs | 2249-C-12 | connecting amplifier and digitizer channels; require 4 |
| borosilicate glass capillaries w/ filament | Warner Instruments | G150F-3 | inner diameter: 0.86, outer diameter: 1.50; capillary glass used to form recording electrodes |
| burst_detect | supplemental coding file | custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m | |
| computer | N/A | N/A | any computer should work |
| DC Power Supply | Tenma | 72-420 | used for electrically etching dissection pins |
| electrophysiology digitizer | Axon Instruments, Molecular Devices | Axon DigiData 1440A | enables acquisition of patch-clamp data |
| filament | Sutter Instrument Company | FB255B | 2.5 mm box filament used in micropipette puller |
| fine forceps | Fine Science Tools | Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10 | used to manipulate larvae and insert pins |
| fixed stage DIC microscope | Olympus | BX51WI | microscope used to visualize and establish patch-clamp recordings |
| flexible, tapered pipette tip | Fisher Scientific | 02-707-169 | flexible tips enable insertion into recording electrode to dispense extracellular solution at the tip |
| FluoroDish | World Precision Instruments Inc. | FD3510-100 | cover glass bottomed dish recording dish |
| KimWipe | KimTech | 34155 | task wipe used for wicking away excess fluid from larvae |
| Kwik-Gard | World Precision Instruments Inc. | 710172 | self-mixing sylgard elastomer |
| MATLAB | MathWorks | R2020b | command line software for preprocessing data |
| microelectrode amplifier | Axon Instruments, Molecular Devices | MultiClamp 700B | patch clamp amplifier for dual channel recordings |
| microforge | Narishige | MF-830 microforge | to polish recording electrode |
| micromanipulator control unit | Siskiyou | MC1000-eR/T | 4-axis dial coordinator for controlling micromanipulator |
| micropipette puller | Sutter Instrument Company | Flaming/Brown P-97 | for pulling capillary glass into recording electrodes |
| microscope control unit | Siskiyou | MC1000e | positions the microscope around the fixed stage and preparation |
| motorized micromanipulator | Siskiyou | MX7600 | positions the headstage and attached recording electrode for patch-clamp recording |
| MultiClamp Commander | Molecular Devices | 2.2.2 | downloadable from Axon MultiClamp 700B Commander download page |
| optical air table | Newport Corporation | VH3036W-OPT | breadboard isolation table to float microscope and minimize vibrations during recordings |
| pCLAMP | Molecular Devices | 10.7.0 | downloadable from Axon pCLAMP 10 Electrophysiology Data Acquisition & Analysis Software Download page |
| permanent ink marker | Sharpie | order from amazon.com | for marking the leading edge side of the VR electrode to ensure proper orientation when inserting into pipette holder |
| petri-dish | Falcon | 35-3001 | used to immerse larvae in paralytic |
| pipette holder | Molecular Devices | 1-HL-U | hold recording electrode and connect to the headstage |
| pneumatic transducer | Fluke Biomedical Instruments | DPM1B | for controlling recording electrode internal pressure |
| potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221473-25G | etchant for etching dissection pins |
| silicone tubing | Tygon | 14-169-1A | tubing to connect pneumatic transducer to pipette holder |
| spike_detect | supplemental coding file | custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m | |
| stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | used to visualize pin tips and during preparation of larvae |
| straight edge razor blade | Canopus | order from amazon.com | cuts the tungsten wire while making dissection pins |
| swimbout_detect | supplemental coding file | custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m | |
| syringe | Becton Dickinson Compoany | 309602 | filled with extracellular solution to inject into recording electrodes |
| transfer pipette | Sigma-Aldrich | Z135003-500EA | single use, non-sterile pipette for transfering larvae |
| tricaine methanesulfonate | Syndel | 12854 | pharmaceutical aneasthetic used to euthanize larvae with high dosage. |
| tungsten wire | World Precision Instruments Inc. | 715500 | 0.002 inch, 50.8 μm diameter; used to make dissection pins |
| vacuum filtration unit | Sigma-Aldrich | SCGVU11RE | single use, sterile, vacuum filtration units used to sterilize extracellular solution used for electrophysiology electrode ringer |
| voltage-clamp current-clamp headstage | Molecular Devices | CV-7B | supplied with MultiClamp 700B amplifier used as left and right headstages |
| α-bungarotoxin | ThermoFisher | B1601 | for immobilizing the larvae prior to recording |
References
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