Summary
نحن نصف بروتوكول لرصد التغيرات في نشاط الخلايا العصبية afferent خلال الأوامر الحركية في نموذج نظام خلايا الشعر الفقارية.
Abstract
تجمع الأنظمة الحسية الإشارات الضرورية لتوجيه السلوك ، ولكن يجب على الحيوانات فك شفرة المعلومات ذات الصلة بيولوجيا. يولد Locomotion إشارات إعادة أحشاء أن الحيوانات يجب أن تنفصل عن الإشارات الحسية ذات الصلة للبيئة المحيطة. على سبيل المثال، عندما تسبح سمكة، يتم الكشف عن التدفق المتولد عن تموج الجسم من قبل الأورام العصبية الميكانورية، التي تتألف من خلايا الشعر، التي تشكل نظام الخط الجانبي. خلايا الشعر ثم نقل معلومات حركة السوائل من جهاز الاستشعار إلى الدماغ عن طريق الخلايا العصبية الحسية afferent. في الوقت نفسه ، يتم ترحيل التفريغ الطبيعي للأمر الحركي إلى خلايا الشعر لمنع الحمل الزائد الحسي. ولذلك، فإن حساب التأثير المثبط للإشارات الحركية التنبؤية أثناء الحركة أمر بالغ الأهمية عند تقييم حساسية نظام الخط الجانبي. لقد طورنا نهجا كهربيا في الجسم الحي لمراقبة الخلايا العصبية الجانبية الخلفية ونشاط الجذر الحركي البطني في يرقات حمار وحشي (4-7 أيام بعد الإخصاب) في وقت واحد يمكن أن تستمر لعدة ساعات. يتم تحقيق التسجيلات خارج الخلية من الخلايا العصبية afferent باستخدام تقنية المشبك التصحيح فضفاضة، والتي يمكن الكشف عن النشاط من الخلايا العصبية واحد أو متعددة. يتم إجراء تسجيلات الجذر البطني من خلال الجلد مع أقطاب زجاجية للكشف عن نشاط الخلايا العصبية الحركية. يوفر بروتوكولنا التجريبي إمكانية مراقبة التغيرات الذاتية أو المثارة في المدخلات الحسية عبر السلوكيات الحركية في فقاريات سليمة ومتصرفة.
Introduction
تنقل الخلايا العصبية الأفرنتة في الأنظمة الحساسة الميكانيكية المعلومات من خلايا الشعر إلى الدماغ أثناء السمع والتوازن. يمكن أن يكشف علم الفيزيولوجيا الكهربية عن حساسية الخلايا العصبية من خلال التسجيلات المباشرة. في حين أن ترقيع الخلايا بأكملها من خلايا الشعر يمكن أن يكون تحديا، وتسجيل من الخلايا العصبية afferent المصب أسهل ويسمح تقييم إمكانات العمل استجابة لتحفيز تسيطر عليها1،2،3. تحفيز خلايا الشعر يؤدي إلى انحرافها، الذي يعدل هياكل الميكانيكا، وبالتالي يؤدي إلىزيادةفي إمكانات العمل (المسامير) في الخلايا العصبية afferent 4،5،6. في غياب المحفزات الخارجية ، ترتفع الخلايا العصبية الأفرنت أيضا تلقائيا بسبب تسرب الغلوتامات من خلايا الشعر إلى محطات ما بعد الاشتباك العصبي7،8، وقد ثبت أنها تساهم في الحفاظ علىالحساسية 9،10. التصحيح تسجيل المشبك من النشاط afferent تمكن من مراقبة حساسية خلايا الشعر وديناميات إشارة التي لا يمكن استخدام تقنيات ذات دقة زمنية أقل، كما هو الحال في microphonics11،12 أو التصوير الوظيفي الكالسيوم13،14،15. سيسمح البروتوكول التالي بتسجيل النشاط البؤري المتزامن مع الأوامر الحركية للكشف عن التغيرات الفورية في حساسية خلايا الشعر.
حمار وحشي (دانيو rerio) استخدام خلايا الشعر الواردة في الأورام العصبية التي تشكل نظام الخط الجانبي للكشف عن حركة المياه بالنسبة لجسمهم, الذي يترجم إلى إشارات عصبية ضرورية للملاحة16,17,18, تجنب المفترس, فريسة التقاط19,20, والتعليم21. ويمكن أيضا أن يكون تدفق المياه الذاتي ولدت من قبل حركات السباحة22،23،24، التنفس22،25،26، وتغذية27. وتشمل هذه السلوكيات الحركات المتكررة التي يمكن أن تعب خلايا الشعر وضعف الاستشعار. لذلك، من الضروري أن يميز نظام الخط الجانبي بين محفزات التدفق الخارجية (الخارجية) والمحفزات التدفقية ذاتية المولدة (إعادة الالتقيب). التفريغ الطبيعي يخفف إشارات التدفق الذاتي المولدة أثناء الحركة في حمار وحشي. يتم ترحيل هذه الإشارة الحركية التنبؤية المثبطة عبر الخلايا العصبية التنازلية إلى المستقبلات الحسية لتعديل الإدخال أو مقاطعة معالجة ردود الفعل reafferent28،29. عمل المنوية المساهمة في فهمنا المبكر لهذا النظام feedforward تعتمد على الاستعدادات في المختبر حيث لم يتم الحفاظ على الاتصال والنشاط الداخلي للدائرة العصبية28،30،31،32،33،34،35. يصف هذا البروتوكول نهجا للحفاظ على دائرة عصبية سليمة حيث يتم الحفاظ على ديناميكيات التغذية المرتدة الذاتية مما يتيح فهما أفضل للإفرازات الطبيعية في الجسم الحي.
يصف البروتوكول المبين هنا كيفية مراقبة الخلايا العصبية الجانبية الخلفية ونشاط الخلايا العصبية الحركية في وقت واحد في سمك الحمار الوحشي اليرقات. إن توصيف ديناميكيات الإشارات البؤرية قبل وأثناء وبعد الأوامر الحركية يوفر رؤى حول التغذية المرتدة الذاتية في الوقت الفعلي من الجهاز العصبي المركزي الذي يعدل حساسية خلايا الشعر أثناء الحركة. يحدد هذا البروتوكول المواد التي يجب إعدادها قبل التجارب ثم يصف كيفية شل يرقات حمار وحشي وإعدادها. وسوف يصف البروتوكول كيفية إنشاء تسجيل التصحيح فضفاضة مستقرة من الخلايا العصبية الأفرنت والجذر البطني خارج الخلية (VR) تسجيلات الخلايا العصبية الحركية. وتقدم البيانات التمثيلية التي يمكن الحصول عليها باستخدام هذا البروتوكول من فرد نموذجي، وقد أجريت تحليلات على نسخ متماثلة متعددة للبروتوكول التجريبي. يتم إجراء المعالجة المسبقة للبيانات باستخدام البرامج النصية المكتوبة المخصصة في MATLAB. وعموما، فإن هذا النموذج التجريبي في الجسم الحي يستعد لتوفير فهم أفضل لردود الفعل الحسية أثناء الحركة في نظام خلايا الشعر الفقارية النموذجية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم إجراء جميع رعاية الحيوانات والتجارب وفقا للبروتوكولات التي وافقت عليها اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة فلوريدا.
1. إعداد مواد للتسجيلات الكهربية
- جعل طبق تسجيل سيليكون الاستومر القاع.
- الاستغناء عن طبقة رقيقة من مكونات الاستومر السيليكون الذاتي خلط (على سبيل المثال، سيلغارد) في طبق زراعة الأنسجة غطاء الزجاج القاع حتى مستويات مع حافة البئر الضحلة. ما يقرب من 0.5 مل كافية.
- تغطية وعلاج الطبق لمدة لا تقل عن 48 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- جعل دبابيس تشريح.
- توفير شحنة سالبة (5 V) إلى كوب 100 مل من النقوش (3M KOH) باستخدام مصدر طاقة DC وإرفاق سلك التنغستن (0.002 بوصة؛ قطر 50.8 ميكرومتر) إلى الإخراج المشحون إيجابيا.
تنبيه: يجب ألا تتصل الأسلاك السلبية والإيجابية بعضها البعض أثناء هذا الإجراء حيث قد تتعرض لخطر إنتاج الشرر، مما قد يشكل خطرا محتملا على الحريق. - حفر الأسلاك التنغستن بسرعة وغمس مرارا وتكرارا غيض من السلك في حمام النقوش حتى يضيق طرف إلى نقطة حادة. تحت مجسم، قطع السلك حوالي 1 ملم من طرف مع شفرة حلاقة حافة مستقيمة. كرر ثلاث مرات أخرى ثم أدخل دبابيس في طبق تسجيل الشفاء باستخدام ملقط ناعم.
- توفير شحنة سالبة (5 V) إلى كوب 100 مل من النقوش (3M KOH) باستخدام مصدر طاقة DC وإرفاق سلك التنغستن (0.002 بوصة؛ قطر 50.8 ميكرومتر) إلى الإخراج المشحون إيجابيا.
- إعداد تسجيل الأقطاب الكهربائية.
- سحب أنبوب الشعيرات الدموية الزجاج borosilicate (القطر الداخلي: 0.86 مم، القطر الخارجي: 1.50 مم) باستخدام سحب micropipette الأفقي مع خيوط مربع في الأقطاب الكهربائية مع طرف قطرها 30 ميكرومتر مع تفتق طفيف (الشكل 1 Ai) التي سيتم استخدامها لتسجيل الخلايا العصبية afferent من الخط الجانبي الخلفي.
- سحب أنبوب إضافي البوروسيليكات الزجاج الشعرية في زوج من الأقطاب الكهربائية مع أصغر أقطار تلميح (1-5 ميكرومتر). عقد قطب واحد في كل يد، تشغيل بلطف نصائح عبر بعضها البعض لكسر لهم إلى زاوية ~ 30 درجة. باستخدام مثقبية، قم بتلميع الطرف المفلت حتى يصبح ناعما. يجب أن يكون قطر الطرف النهائي بين 30-50 ميكرومتر وسيتم استخدامه كقطب تسجيل الجذر البطني (VR)(الشكل 1 Aii).
- ضع علامة على جانب قطب الواقع الافتراضي مع الحافة الرائدة باستخدام الحبر الدائم للمساعدة في توجيه فتحة الطرف لأسفل عند إدخال القطب الكهربائي في حامل المصصة في المسرح (الخطوة 3.2).
ملاحظة: التعديل الميكانيكي لقطب تسجيل الواقع الافتراضي غير دقيق وقد تتطلب الخطوة 1.3.2 محاولات متعددة حتى يتم تحقيق مورفولوجيا طرف مناسب قبل التلميع. يتم شطب قطب تسجيل VR ليتوافق مع منحنى جسم اليرقات. بمجرد تصنيعه ، يمكن استخدام قطب تسجيل الواقع الافتراضي مرارا وتكرارا طالما أن الطرف لا يزال واضحا ونظيفا بين التجارب.
- إنشاء البروتوكول في برامج تسجيل الفيزيولوجيا الكهربية.
- تأكد من توصيل المسرح الأيمن بمدخلات القناة 1 في الجزء الخلفي من مكبر الصوت الحالي والجهدي للمشبك الكهربائي لتسجيلات الخلايا العصبية الوافرة ويتم توصيل المسرح الأيسر بمدخل القناة 2 لتسجيلات الواقع الافتراضي.
ملاحظة: تتطلب مواصفات الكمبيوتر لمكبر الصوت الحالي والجهد الحد الأدنى من 1 غيغاهرتز أو معالج أفضل، Windows XP Pro أو Mac OS X 10.46.6، محرك أقراص CD-ROM مع ذاكرة وصول عشوائي 512 ميغابايت، مساحة محرك أقراص ثابتة 500 ميغابايت، ومنفذي USB. - افتح برنامج مكبر الصوت الذي يتم التحكم فيه بواسطة الكمبيوتر.
- تعيين القناة 1 والقناة 2 إلى وضع المشبك الحالي عن طريق النقر فوق الزر IC لكل قناة.
- إدخال المعلمات التالية تحت كل من I-المشبك 1 و I-المشبك 2 علامات التبويب . الإخراج الأولي: 100x AC غشاء المحتملة (100،000 mV/mV)، كسب: 1،000، بيسل: 1 كيلوهرتز، AC: 300 هرتز ، نطاق: تجاوز . الإخراج الثانوي: 100x AC غشاء المحتملة (100 mV/mV) ، كسب: 1 ، Lowpass تصفية: 10 هرتز.
- حفظ معلمات القناة Ch1_Aff Ch2_VR.
- تثبيت وفتح التصحيح المشبك الكهربية البرمجيات.
- انقر على تكوين وحدد مختبر مقاعد البدلاء لإعداد الإشارات التناظرية عن طريق إضافة Ch1_Aff Ch2_Vr إلى قنوات رقمية (على سبيل المثال، التناظرية IN #0 والتناظرية في #1)التي ترتبط، عن طريق كابل محوري BNC، إلى القناة المقابلة 1 والقناة 2 تحجيم النواتج من مكبر للصوت. انقر على موافق.
ملاحظة: الحد الأدنى لمتطلبات الكمبيوتر للمرقم هي: معالج 1 غيغاهرتز أو أفضل، Windows XP Pro أو Mac OS X 10.46.6، محرك الأقراص المضغوطة 512 ميغابايت RAM، 500 ميغابايت مساحة القرص الصلب، و 2 منافذ USB. - انقر على الحصول على وحدد بروتوكول جديد.
- في علامة التبويب وضع / معدل، حدد الفجوة الحرة؛ ضمن وضع الامتلاك، قم بتعيين طول التجربة إلى إما استخدام مساحة القرص المتوفرة (أي التسجيل حتى توقف) أو مدة المجموعة المطلوبة (hh:mm:ss)، ثم تعيين معدل أخذ العينات لكل إشارة (هرتز) إلى 20000 لزيادة الدقة.
- ضمن علامة التبويب المدخلات حدد قنوات IN التمثيلية التي تم تكوينها مسبقا (في الخطوة 1.4.6) وحدد Ch1_Aff Ch2_VR للقناة المطابقة.
- ضمن علامة التبويب المخرجات، حدد Cmd 0 و Cmd 1 للقناة #0 والقناة #1،على التوالي.
- قم بتوصيل أمر القناة 1 على مكبر الصوت إلى التناظرية أوبوت 0 على الرقم عبر كابل محوري BNC وكرر للقناة 2 الأمر إلى الإخراج التناظرية 1.
- يمكن أن تظل علامات التبويب المتبقية ضمن الإعدادات الافتراضية. انقر فوق موافق وحفظ البروتوكول.
- تأكد من توصيل المسرح الأيمن بمدخلات القناة 1 في الجزء الخلفي من مكبر الصوت الحالي والجهدي للمشبك الكهربائي لتسجيلات الخلايا العصبية الوافرة ويتم توصيل المسرح الأيسر بمدخل القناة 2 لتسجيلات الواقع الافتراضي.
2. إعداد الحل
- إعداد الحل هانك: 137 MM NaCL, 5.4 M M KCl, 0.25 mM Na2HPO4, 0.44 mM KH2PO4, 1.3 mM CaCl2, 1.0 mM MgSO4, 4.2 mM NaHCO4; رقم الحموضة 7.3. تمييع إلى 10٪ حل هانك بإضافة الحجم المناسب من المياه deionized إلى المخزون.
- إعداد حل خارج الخلية: 134 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 1.2 mM MgCl2, 2.1 mM CaCl2, 10 mM الجلوكوز, 10 mM HEPES العازلة; درجة الحموضة 7.8 معدلة مع NaOH. فراغ تصفية حل خارج الخلية من خلال مرشح مع حجم المسام 0.22 ميكرومتر.
- إعداد α -bungarotoxin: حل 1 ملغ من الليوفيلية α-bungarotoxin في محلول خارج الخلية 10 مل لإنتاج تخفيف 0.1٪.
- إعداد حل القتل الرحيم: 50٪ (ملغم / لتر) مخزنة من الدرجة الصيدلانية MS-222 في حل هانك 10٪.
تنبيه: α-bungarotoxin هو سم عصبي قوي يشل العضلات عن طريق منع مستقبلات الكوليني. القفازات مطلوبة ويوصى بحماية العين أثناء التعامل مع الشلل.
3. إعداد اليرقات للتسجيلات الكهربية
- شل يرقات حمار وحشي.
- استخدام اليرقات من السكان ولدت في المختبر من حمار وحشي(دانيو ريو; 4-7 أيام بعد الإخصاب) والمنزل في محلول الجنين (10٪ هانك الحل) في 27 °C.
- نقل اليرقات من السكن إلى طبق بيتري صغير (35 ملم) باستخدام ماصة نقل ذات رؤوس كبيرة وإزالة أكبر قدر ممكن من الحل المحيط.
ملاحظة: إزالة محلول الجنين يمنع تخفيف الشلل ويزيد من فعاليته. يمكن استخدام زاوية مسح المهمة لتخلص محلول الجنين المتبقي ، ومن الأهمية بمكان عدم الاتصال باليرقات أو ترك اليرقات عرضة للهواء. - يرقات تزج في 10 ميكرولتر من 0.1٪ α-bungarotoxin لمدة 5 دقائق تقريبا.
ملاحظة: يختلف الوقت اللازم لشل حركة اليرقات بين الاستعدادات. يعتمد التحضير الصحي على المراقبة الدقيقة لتدفق الدم السريع المستدام وانخفاض الاستجابات الحركية. التعرض المفرط القصير للشلال يمكن أن يؤدي إلى انخفاض بطيء في الصحة العامة للإعداد حتى بعد الاغتسال الشامل. من الأفضل تطبيق الغسيل قبل أن يتم شل حركة اليرقة تماما بينما لا تزال تظهر عليها علامات اهتزازات عضلية خفية. - اغسل اليرقات المشلولة بمحلول خارج الخلية واستحم لمدة 10 دقائق.
ملاحظة: يسمح الغسل لليرقة بالانتقال من اهتزازات العضلات الدقيقة إلى الشلل الكامل. أيضا, α-bungarotoxin هو خصم مستقبلات أستيل النيكوتينية (nAChR) α9-subunit, وهو عنصر حاسم من دائرة التغذية المرتدة الذاتية يلاحظ هذا البروتوكول; ومع ذلك، فقد ثبت أن هذا التأثير يمكن عكسه في خلايا الشعر Xenopus والحمار الوحشي بعد غسل 10 دقيقة36،29.
- دبوس الأسماك في طبق التسجيل.
ملاحظة: التخدير (على سبيل المثال، MS-222، Tricaine) غير مطلوب أثناء إعداد حمار وحشي يرقي (4-7 ديسيبل) لأنه يتعارض مع صحة الحيوان. في الواقع ، يتم إعفاء سمك الحمار الوحشي اليرقات من بروتوكولات فقارية معينة.- باستخدام ماصة النقل ، قم بنقل اليرقة من حمام المحلول خارج الخلية إلى طبق التسجيل ذو القاع السيليكوني. ملء ما تبقى من الطبق مع محلول خارج الخلية.
- تحت منظار مجسم ، ضع اليرقات برفق مع ملقط ذو رؤوس ناعمة فوق وسط حصيرة السيليكون ، الجانب الجانبي لأعلى ، مع انتهاء الجزء الأمامي والخلفي من الجسم من اليسار إلى اليمين ، على التوالي. ثم فهم دبوس محفورة من حصيرة السيليكون باستخدام ملقط غرامة يميل وإدراج دبوس، متعامد إلى السيليكون، من خلال نوتوشورد الظهري من اليرقات الظهر مباشرة إلى فتحة الشرج. إدراج دبوس الثاني من خلال notochord قرب نهاية الذيل وإدراج دبوس الثالث من خلال ظهرية notochord من المثانة الغاز (الشكل 1B).
ملاحظة: أثناء إدخال دبابيس، من المهم استهداف مركز عرض نوتوشورد لمنع المساس بتدفق الدم أو إتلاف العضلات المحيطة. و notochord هو الظهرية إلى العصب الخط الجانبي الخلفي، وذلك مع تثبيت السليم، ومن المتوقع أي ضرر للخلايا العصبية الحسية الخط الجانبي. إدراج بعد أول اتصال لعدم تعكير صفو الأنسجة المحيطة بها. من الناحية المثالية ، يكون قطر الدبوس أقل من نصف عرض نوتوشورد لضمان الإدراج النظيف. إذا تجاوزت الدبابيس هذا العرض، كرر الخطوة 1.2 حتى يتم تحقيق عرض الدبوس المطلوب. إذا تباطأ تدفق الدم بعد التثبيت، كرر من الخطوة 1.3 فصاعدا مع عينة جديدة. - إدراج دبوس الرابع من خلال الحويذ otic مع توفير دوران طفيف نحو الأمامي كما يدخل دبوس في encapsulant (الشكل 1B). كما يتم تطبيق دوران طفيف، ومشاهدة للأنسجة بين الحويزل المشقوق وotic للكشف عن مجموعة من سوماتا أففيرنت.
ملاحظة: الإدراج الزاوية من دبوس الرابع هو ضمان التعرض للعصابة خط الجانبي الخلفي afferent، الذي هو خلاف ذلك عرقلت من قبل vesicle otic كبيرة.
4. تسجيل الجذر فينترال
- ضع يرقة مثبتة تحت هدف غمر الماء 10x على تباين تداخل تفاضلي ثابت (DIC) مجهر مستقيم وتوجيه الشقوق المصبوبة للكتل العضلية الموازية لنقل نهج مرحلة الرأس اليسرى(الشكل 1B).
- يعمل مجهر DIC الثابت على طاولة هوائية بصرية بشكل أفضل لمنع الاهتزازات من التداخل مع التسجيلات. باستخدام الموضعي الآلية ، يمكن للمجهر ثم التحرك بحرية حول المرحلة الثابتة التي يتم فيها تركيب الإعداد والرؤوس(الشكل 1C).
- ضع السلك الأرضي في محلول الحمام وتأكد من توصيله بالمسارت الأيسر.
- املأ قطب تسجيل الواقع الافتراضي بمحلول خارج الخلية 30 ميكرولتر باستخدام طرف ماصة مرن لتحميل الجل وأدخله في حامل ماصة المسرح الأيسر.
- خفض ماصة التسجيل في محلول الطبق مع micromanipulator مع تطبيق الضغط الإيجابي (1-2 مم زئبق) التي تنتجها محول هوائي. تحت تكبير 10x ، تأكد من اتجاه فتحة الطرف التي تواجه لأسفل.
- يجب توصيل محول الهواء المضغوط بمنفذ حامل المصصة عبر أنابيب السيليكون.
- ضع قطب الواقع الافتراضي على الميوسبتوم
- باستخدام micromanipulator مرة أخرى ، خفض طرف القطب VR حتى يتم عقد الموقف فوق اليرقة. زيادة التكبير إلى 40x الغمر.
- جلب طرف القطب على myoseptum بين اثنين من الميرات البطني إلى الخط الجانبي حتى يتم تركز الشق في فتحة طرف القطب VR(الشكل 1D).
- خفض ماصة حتى حافة متخلفة من فتحة طرف الاتصالات بلطف ظهارة. بعد الاتصال الأولي، والمناورة ماصة قطريا لضمان حافة الرائدة يجعل الاتصال ويمكن أن تولد ختم.
- تطبيق الضغط السلبي (~ 100 ملم زئبق) مع محول هوائي وعقد.
ملاحظة: التوجه السليم للمواصة VR بالنسبة إلى الميوسبتوم والضغط السلبي المستمر يحسن الكشف عن نشاط الخلايا العصبية الحركية مع نسبة عالية من الإشارة إلى الضوضاء من خلال الجلد.
- الكشف عن نشاط الخلايا العصبية الحركية.
- يجب توصيل المسرح الأيسر بالمكبر، الذي ينقل الإشارة المكبرة إلى جهاز رقمي يخرج الإشارة المذكورة إلى برنامج الفيزيولوجيا الكهربية المشبك التصحيحي ليتم مراقبته على جهاز كمبيوتر مجاور (انظر القسم 1.4).
- في برنامج المشبك التصحيح، انقر على زر التشغيل على شريط أداة لمراقبة إشارة VR (الشكل 1E).
- تأكد من أن يتم تحقيق تسجيل VR مرة واحدة نشاط الخلايا العصبية الحركية مع ديناميات إشارة انفجار نمطية جيدا لوحظ29،37 (الشكل 1E).
ملاحظة: نوبات السباحة الوهمية هي أنماط نشاط الخلايا العصبية الحركية VR التي تستمر في الإرسال على الرغم من أن التحضير مشلول. لذلك ، السباحة الوهمية هي وسيلة يمكن الوصول إليها لتحديد الحالة السلوكية للحيوان وقياس المعلمات الحركية أثناء إجراء تسجيلات الخلايا العصبية الأفرنت في وقت واحد التي تتطلب إعدادا معطلا. في أيدينا ، بمجرد تحقيق تسجيل الواقع الافتراضي ، فإن الإعداد الصحي سيثير نوبات سباحة وهمية طوعية كل بضع ثوان. تذكر، وقد استمر إعداد صحي تدفق الدم السريع. كن على علم، قد يستغرق الحصول على إشارة VR كافية عدة دقائق وقد تتحسن نسبة الإشارة إلى الضوضاء بعد الكشف الأولي. ومن المقبول، لمصلحة الوقت، الانتقال إلى الباب 5. - إذا لم يتحقق تسجيل الواقع الافتراضي بعد الانتهاء من القسم 5 ، فاطلق الضغط السلبي ، ورفع القطب الكهربائي ، وكرر من الخطوة 4.4.2 فصاعدا على myoseptum مختلف إذا كانت صحة اليرقة لا تزال مثالية.
5. Afferent تسجيل الخلايا العصبية
- ملء القطب تسجيل afferent مع 30 ميكرولتر من محلول خارج الخلية; إدراج في حامل ماصة headstage الأيمن (الشكل 1B، C)، وأقل في محلول الطبق مع تطبيق الضغط الإيجابي (1-2 ملم زئبق) التي تنتجها محول هوائي.
- تحديد موقع وإرفاق فضفاضة إلى العقدة خط الجانبي الخلفي afferent.
- باستخدام ميكرومانيبولاتور، خفض طرف القطب afferent حتى يتم عقد موقف فوق cleithrum.
- زيادة التكبير إلى 40x الغمر وتحديد موقع تقاطع العصب الجانبي الخلفي خط وcleithrum. اتبع خط الجانبية الأمامية العصبية من cleithrum إلى حيث innervate الألياف الخلفي خط الجانبي afferent العقدة، يمكن تمييزها عن طريق مجموعة منفصلة من سوما (الشكل 1F).
- جلب طرف القطب فوق العقدة afferent وخفض ماصة حتى طرف الاتصالات ظهارة. بلطف، مناورة القطب بحيث محيط طرف كامل الاتصالات العقدة afferent.
- تطبيق الضغط السلبي (20-50 ملم زئبق) مع محول هوائي وعقد.
ملاحظة: الضغط السلبي المطبق على العقدة الأفرينت هو ألطف من الشفط المطبق أثناء تسجيل الجذر البطني. يمكن أن تحسن زيادة الضغط السلبي من الإشارة إلى الضوضاء ، ولكن صحة الخلايا العصبية المفرحة تنخفض تحت الشفط العدواني المستمر ، مما يقلل من احتمال التسجيل الناجح.
- سجل نشاط الخلايا العصبية afferent.
- تأكد من توصيل المرحلة الرئيسية اليمنى في تسلسل مماثل كما هو موضح في الخطوة 4.5.1.
- في pClamp10، انقر على زر التشغيل على شريط الأدوات لمراقبة الخلايا العصبية afferent وإشارة VR في وقت واحد.
- تأكد من أن الخلية بأكملها، يتم تحقيق تسجيل التصحيح فضفاضة من الخلايا العصبية afferent مرة واحدة طفرات تحدث تلقائيا، تقريبا كل 100-200 مللي1،29 (الشكل 1E).
- تدريجيا، وزيادة ضغط القطب تسجيل الخلايا العصبية afferent مرة أخرى إلى الغلاف الجوي (0 ملم زئبق) وعقد لبقية التسجيل.
6. الحصول على البيانات
- تسجيل متزامن.
- مرة واحدة يتم الكشف عن الخلايا العصبية afferent ونشاط الخلايا العصبية الحركية على حد سواء، انقر على زر تسجيل على شريط أداة في pClamp10 لالتقاط التسجيلات الحرة الفجوة في وقت واحد في كل من القنوات.
- سجل للمدة المطلوبة (الشكل 1E).
ملاحظة: يمكن أن يستمر التسجيل في إعداد صحي لساعات عديدة ويظل متجاوبا مع المحفزات الخارجية. - حفظ التسجيل كنوع ملف معتمد (.abf, pClamp10) للاحتفاظ ببيانات التعريف مثل معلمات الامتلاك.
7. القتل الرحيم
- تطبيق الضغط الإيجابي (10 ملم زئبق) على كل من afferent وVR تسجيل الأقطاب الكهربائية باستخدام محولات هوائية ورفع الأقطاب الكهربائية من طبق التسجيل باستخدام micromanipulators.
- نقل طبق التسجيل من المجهر DIC المرحلة الثابتة إلى تشريح مجسم.
- باستخدام ملقط طرف غرامة، وإزالة دبابيس التنغستن من نوتوشورد وكبسولة otic، ونقل اليرقات باستخدام ماصة نقل إلى طبق بيتري (35 ملم) تحتوي على 5 مل من محلول القتل الرحيم لمدة لا تقل عن 5 دقائق.
8. المعالجة المسبقة وتحليل البيانات
ملاحظة: تتطلب معالجة البيانات وتحليلها مسبقا فهما أساسيا لترميز سطر الأوامر.
- تحويل ملف التسجيل للمعالجة المسبقة.
- تثبيت برنامج Matlab.
- تحميل البرنامج النصي المكتوب المخصصة، abfload.m38 وحفظ الملف في نفس المجلد الذي يخزن ملف التسجيل الخام.
- في إطار محرر Matlab، افتح abfload.m وانقر على تشغيل على شريط الأدوات. حدد تغيير المجلد، إذا طلب منك ذلك.
- تنفيذ الدالة في إطار الأوامر مع ملف التسجيل الخام كما الإدخال،
> [d,si,h] = abfload('[اسم ملف التسجيل الخام].abf')
وحفظ مساحة عمل الإخراج باسم ملف يتضمن تسمية اليرقات والعمر والتاريخ التجريبي مثل [رقم العينة]_[العمر في dpf]_[اسم ملف التسجيل الخام (يتضمن التاريخ التجريبي افتراضيا)].
ملاحظة: يجب أن يتضمن اسم الملف المحول فقط الأعداد الصحيحة المحددة أسفل السطر.
- إجراء معالجة مسبقة للبيانات.
- تحميل برنامج Matlab النصي AffVR_preprocess.m والوظائف المرتبطة بها ، والعرف الذي كتبه المؤلفون.
- في إطار المحرر، افتح AffVR_preprocess.m.
- تحت المتغيرات، ضبط عتبات الكشف عن ارتفاع الحد الأدنى لكل من تسجيلات afferent وVR(spk_detect_lb vr_detect_lb، والخطوط 8 و 14 ، على التوالي) اعتمادا على تسجيل نسبة الإشارة إلى الضوضاء.
ملاحظة: يعتمد الكشف عن سبايك على العتبات اليدوية لفرز وعزل الإشارات عن أكثر من خلية عصبية واحدة عن طريق السعة. يتم تصفية الضوضاء الأساسية والنشاط من وحدات أخرى عن طريق العتبة لتشمل فقط السعة الارتفاع في غضون نسبة مئوية (على سبيل المثال، spk_detect_lb) من الحد الأقصى (على سبيل المثال، spk_detect_ub). العتبة يضمن أيضا binning دقيقة من طفرات النشاط الحركي في رشقات نارية ونوبات السباحة وهمية الجماعية. بشكل عام، ابدأ بعتبة أدنى من الحد 0.5، وتناقص تدريجيا حتى يتم تحقيق الكشف الدقيق. على سبيل المثال، تعيين spk_detect_lb كما 0.5 و spk_detect_ub كما 1.0 سوف الكشف عن جميع المسامير يساوي أو أكبر من 50٪ من الحد الأقصى للسعة ارتفاع واستبعاد الضوضاء أو الخلايا العصبية إضافية من انخفاض ارتفاع السعة(الشكل 2A). بدلا من ذلك، يمكن للمرء أيضا خفض spk_detect_ub من 1.0 لاستبعاد الخلايا العصبية من ارتفاع ارتفاع السعة من أجل عزل الخلايا العصبية من انخفاض السعة ارتفاع. وستبلغ نواتج أرقام التجهيز المسبق (انظر الخطوة 7-2-6) ما إذا كانت التعديلات والتكرار من الخطوة 7-2-2 ضروريين. - في إطار المحرر، انقر فوق تشغيل لتنفيذ AffVR_preprocess.m.
- انتقل إلى ملف البيانات .mat المحولة مسبقا (راجع الخطوة 7.1.3); حدد وانقر على فتح لبدء المعالجة المسبقة الآلي.
ملاحظة: أثناء تشغيل البرنامج النصي المخصص، ستظهر المخرجات في إطار الأوامر لإعلام تقدمها من خلال خطوات المعالجة مثل "تصفية البيانات ..."، "الكشف عن نشاط الجذر البطني ..."، و "إنشاء أرقام ...". - الأرقام التي تم إنشاؤها بواسطة AffVR_preprocess.m سوف تصور ارتفاع afferent والكشف VR وتشير إلى ما إذا كان ينبغي تعديل أي متغيرات التحليل(الشكل 2).
- أدخل "Y" على لوحة المفاتيح لحفظ بيانات التعريف المعالجة مسبقا في مجلد preprocess_output.
- سيتم إخراج البيانات المعالجة مسبقا تلقائيا كما data_out.xls.
- تحليل البيانات المعالجة مسبقا حسب الرغبة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بعد شل حركة يرقات حمار وحشي بشكل صحيح وتحقيق العقدة الجانبية الخلفية وتسجيل الواقع الافتراضي ، يمكن قياس النشاط في كل من الخلايا العصبية الأفرنتة والحركية في وقت واحد. يتم عرض قنوات التسجيل باستخدام بروتوكولات تسجيل خالية من الثغرات (الخطوة 1.4) للرصد المستمر لنشاط afferent وVR. في الوقت الحقيقي ، يمكن ملاحظة انخفاض في معدل الارتفاع التلقائي في afferent بالتزامن مع نشاط الواقع الافتراضي الذي يدل على نوبات السباحة الوهمية(الشكل 1E). وجدنا أن أفضل النتائج والكشف الدقيق عن المسامير كانت منتجات التسجيلات التي حققت نسبة إشارة إلى ضوضاء لا تقل عن 0.5. مخصص مكتوبة قبل معالجة البرامج النصية توليد المؤامرات للمساعدة في التصور من afferent وVR الكشف عن ارتفاع. يتم تحديد المسامير التلقائية باستخدام مجموعة من معلمات الارتفاع مثل العتبة والحد الأدنى للمدة (0.01 مللي ثانية) والحد الأدنى للفاصل الزمني بين الارتفاع (ISI؛ 1 مللي ثانية). زيادة الضغط السلبي أثناء إنشاء التسجيل غالبا ما تسفر عن الكشف عن إشارة من وحدات afferent متعددة في وقت واحد. التصفية حسب السعة تسمح للتمييز بين ديناميات إشارة من afferents مستقلة. يمكن تحقيق عزل الإشارات عن طريق ضبط المتغيرات الكشف السفلية والمرتبطة العليا في البرنامج النصي قبل المعالجة(الشكل 2A). يمكن أن يؤدي الشفط العدواني لتحقيق تسجيلات متعددة الوحدات إلى تسجيلات غير مستقرة ، وضوضاء ميكانيكية ، وتدهور الصحة الأفرينت ، وفي نهاية المطاف فقدان الإشارة. لذلك، من المهم الاتصال الهاتفي ببطء شفط مرة أخرى إلى الضغط الجوي بمجرد تحقيق الإشارة المطلوبة. تتبع ميزة الكشف عن ارتفاع الجذر البطني معلمات متطابقة لاكتشاف المسامير الأفرينت ولكنها تتطلب مدخلات إضافية لتحديد نوبات السباحة الوهمية المتميزة. يتم تعريف رشقات نارية داخل قيادة المحرك من قبل نشاط VR مع ما لا يقل عن اثنين من المسامير داخل 0.1 مللي ثانية من بعضها البعض واستمرت ما لا يقل عن 5 مللي ثانية. ثم يتم تحديد جميع نوبات السباحة من قبل ما لا يقل عن ثلاث رشقات نارية مع فترات بين انفجار <200 مللي ثانية(الشكل 2B).
من الصعب تفسير نشاط Afferent عند النظر إلى تسجيل بأكمله. سوف تراكب البرامج النصية قبل المعالجة أجزاء من النشاط الأفرنت تركز على فترة محددة جيدا من الاهتمام، في هذه الحالة، بداية نوبة السباحة (ن = 33، الشكل 2C) للمساعدة في تصور الاتجاهات في ديناميات الإشارة. يتم حساب النشاط الفوري afferent باستخدام مرشح المتوسط المتحرك ونافذة أخذ العينات 100 مللي ثانية. متوسط النشاط العفوي يظهر تغييرات جذرية استجابة لبداية النشاط الحركي(الشكل 2C). لتشريح وتحليل النشاط الأفرينت بشكل أفضل ، يتم تعيين فترات قبل وبعد السباحة لتتناسب مع الفاصل الزمني لنوبة السباحة المقابلة. في السيناريو قبل المعالجة وممثل تحليل النتائج هذه الفترات يطلق عليها "ما قبل السباحة" و "ما بعد السباحة". تم حساب معدلات الارتفاع قبل السباحة والسباحة وما بعد السباحة من خلال أخذ عدد المسامير خلال الفترة المعنية على مدى مدتها. دقة التقديرات لكل فرد هي جزئيا وظيفة لعدد السباحة، لذلك قمنا بتحليل العلاقات المتغيرة باستخدام الانحدارات المرجحة، مع الأوزان الفردية يساوي الجذر التربيعي لعدد السباحة.
تم اختبار الاختلافات في معدلات الارتفاع في مختلف فترات الاهتمام (ما قبل السباحة والسباحة وما بعد السباحة) من خلال تحليل ثنائي الاتجاه للتباين (ANOVA). كشف اختبار توكي اللاحق لتكي عن اختلافات كبيرة في معدلات الارتفاع بين معدلات ارتفاع السباحة ومعدلات الارتفاع في كل من مرحلة ما قبل السباحة (8.94 ± 0.2 هرتز، وانخفاض نسبي بنسبة 57٪) وبعد السباحة (5.34 ± 0.2 هرتز، انخفاض نسبي 40٪) الفترات. ولم يعد معدل الارتفاع على الفور إلى خط الأساس بالنظر إلى أننا وجدنا أيضا أن معدل الارتفاع بعد السباحة كان أقل من معدل الارتفاع قبل السباحة (اختبارات توكي اللاحقة للتكز عبر المجموعات، p < 0.001؛ الشكل 3A). واستخدمت نماذج خطية للكشف عن العلاقات بين معدل الارتفاع النسبي ومعلمات السباحة الوهمية. تم حساب معدل الارتفاع النسبي عن طريق أخذ معدل ارتفاع السباحة على معدل الارتفاع قبل السباحة. وشملت معلمات السباحة الوهمية مدة السباحة، وتواتر السباحة (أي عدد الرشقات داخل نوبة السباحة على مدى مدة نوبة السباحة)، ودورة الواجب (أي مجموع مدة انفجار السباحة على مدى المدة الإجمالية لنوبة السباحة). في أيدينا ، كان متوسط وتباين معدل الارتفاع النسبي مرتبطا ، لذلك كان من الضروري تحويل البيانات للتحليل. ارتبط معدل الارتفاع البؤري سلبا بمدة السباحة مما يعني أن الخط الجانبي يواجه تثبيطا أكبر أثناء السباحة لمدة أطول (ص2 = 0.186 ، F2،26 = 2.971 ، p = 0.045 ؛ الشكل 3ب). لم يتم الكشف عن أي ارتباط بين معدل الارتفاع النسبي ولا تردد السباحة ولا دورة الواجب ((r2 = 0.099، F2,26 = 1.431، p = 0.231، و r2 = 0.047، F2,26 = 0.645، p = 0.932، على التوالي؛ الشكل 3C، دال. تم ترجيح جميع تحليلات العلاقات المتغيرة بعدد السباحة لكل فرد ثم تم تقييم جميع المتغيرات من قبل كل فرد (n = 29).
الشكل 1: تسجيل كهربي في وقت واحد من الخلايا العصبية الجانبية الخلفية خط afferent ونشاط الجذر الحركي البطني. (A). مثال على afferent فضفاضة التصحيح (1) وجذر المحرك البطني (2) تسجيل الأقطاب الكهربائية. تمثل أشرطة المقياس 50 ميكرومترا (B) يتم شل سمك الحمار الوحشي اليرقات وتثبيته في أربعة مواقع (رموز متقاطعة) إلى طبق Sylgard لتسجيل الاستقرار. تمثل الصلبان الجريئة نقاط الإدراج للدبابيس. (ج) يتم تركيب جهاز الحفر الكهربي على طاولة عزل الاهتزاز ويتكون من مجهر مرحلة ثابتة مستقيمة على وحدة تحكم مزودة بمحرك قادرة على التكبير 40x. يتم تركيب المشبك الحالي المزدوج ومراحل رأس المشبك الجهد على micromanipulators. (د)يتم فصل myomeres من العضلات الجسم من قبل myosepta التي هي بمثابة تسجيل معالم لar arborizations الخلايا العصبية الحركية. يقترب قطب الجذر الحركي البطني من الجسم البطني (يسار) ويتم توسيطه وخفضه فوق الميوسبتوم (رأس السهم). يمثل شريط المقياس 50 ميكرومتر (E) التقاط الشاشة للتسجيل الكهربي في الوقت الحقيقي مما يسمح بالتصور للنشاط التلقائي (القناة 1) ونشاط الجذر البطني المتفجر الذي يدل على نوبة سباحة وهمية (القناة 2). يتم الإشارة إلى زري التسجيل والتشغيل بأسهم حمراء. (F) العقدة الجانبية خط الخلفي afferent (خط متقطع) تقع فقط تحت الجلد ويمكن التعرف عليها من قبل مجموعة ضيقة من سوما afferent. يمكن تحديد موقع العقدة باتباع العصب الجانبي بعد عظمة الكريثروم (رأس السهم) إلى حيث يتصل بالعصابة. يمثل شريط المقياس 30 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: إخراجات الرقم قبل المعالجة تصور الكشف عن ارتفاع دقيق. (أ) خارج الخلية، تسجيل فضفاضة التصحيح من الخلايا العصبية الجانبية خط الخلفي. يتم الكشف عن المسامير المنفصلة (المسماة بالنقاط الحمراء) مع فاصل زمني أدنى بين الارتفاعات يبلغ 1 مللي ثانية. يتم تصفية الضوضاء الأساسية والنشاط من وحدات أخرى عن طريق العتبة لتشمل فقط السعة الارتفاع في غضون 50٪ من الحد الأقصى. (ب)تسجيل الجذر الحركي البطني (VR) لنوبات السباحة الوهمية تكشف عن الأوامر الحركية الطوعية طوال مدة التسجيل. يتم الكشف عن مسامير VR (النقاط الحمراء) باستخدام فلتر عتبة مماثلة ثم يتم تحويلها إلى نوبة سباحة واحدة (خضراء) عن طريق اكتشاف انفجار النشاط في غضون 200 مللي ثانية من بعضها البعض (انظر إدراج؛ يمثل شريط المقياس 200 مللي ثانية). لا تحدث المسامير التي تم اكتشافها خارج نوبة السباحة المحددة ضمن الفاصل الزمني بين الارتفاع لنشاط الاندفاع النمطي وبالتالي يتم استبعادها. (C) متوسط معدل ارتفاع afferent عفوية تركزت على بداية كل نوبة السباحة (الوقت = 0 ق) مما يدل على ارتفاع معدل قبل وأثناء وبعد السباحة. تمثل أشرطة الخطأ ± SEM. الرجاء النقر هنا لعرض إصدار أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: يتم تقليلكمية النشاط afferent قبل وأثناء وبعد السباحة وهمية. (A) يتم تخفيض معدل ارتفاع Afferent بشكل كبير أثناء السباحة وهذا التأثير لا يزال قائما حتى بعد ذلك. يتم الإشارة إلى التجمعات المتشابهة إحصائيا ب a و b. (B) ترتبط مدة السباحة الأطول بانخفاض معدل الارتفاع. (C-D) تردد السباحة ودورة واجب السباحة لا تظهر أي ارتباط لمعدل ارتفاع afferent. تمثل جميع القيم متوسط ± SEM. تم حذف الأفراد الذين يعانون من انخفاض الوزن الإحصائي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يوفر البروتوكول التجريبي الموصوف إمكانية مراقبة التغيرات الذاتية في المدخلات الحسية عبر السلوكيات الحركية في فقاريات سليمة ومتصرفة. على وجه التحديد ، فإنه يفصل نهج في الجسم الحي لأداء التسجيلات خارج الخلية في وقت واحد من الخلايا العصبية الجانبية الخط النافر والجذور الحركية البطنية في حمار وحشي اليرقات. وقد تم وصف النشاط التلقائي afferent سابقا في حمار وحشي دون النظر في النشاط الحركي المتزامنالمحتملة 1،2،39،40،41. دون رصد وجود النشاط الحركي مع تسجيلات الجذر البطني، فك النشاط afferent من المرجح أن يكون الاستهانة بسبب تأثير تثبيط فوفيرنت أثناء، وحتى بعد، السباحة العفوية.
في التسجيلات الكهربية الحية هي بطبيعتها صعبة. في تجربتنا، والحفاظ على إعداد صحي هو العامل الأكبر واحد لتحقيق النجاح، تسجيلات طويلة الأمد للخلايا العصبية afferent والجذور الحركية البطنية. للقيام بذلك، من المهم ليس فقط تحديد ورصد تدفق الدم السريع، ولكن أيضا التعرف على نسيج الجلد والعضلات الكامنة. نوصي بمراقبة العديد من اليرقات المشلولة تحت المجهر قبل المزيد من التعامل معها لتصبح مألوفة مع تدفق الدم الجوهري وحالة الجلد لليرقات السليمة. يتطلب تسجيل الجذر البطني الناجح من خلال الجلد سطح بشرة ناعم وصحي من أجل أن يولد قطب التسجيل ختما ضيقا. هذا النهج يتحايل على البروتوكولات التقليدية37،42 التي هي الغازية وتستغرق وقتا طويلا ، والتي تدعو إلى تشريح بعيدا الظهارة لفضح العضلات الكامنة. إزعاج التسجيل من خلال الجلد هو التغير المحتمل في الوقت المناسب قبل أن تتحقق الإشارات. ومن شأنه تحسين حجم ومدة الضغط السلبي المطبق أن يقلل من الوقت اللازم لإنشاء إشارة، ومن المحتمل أن يحسن نسبة الإشارة إلى الضوضاء. التسجيلات من إعداد صحي ونشط يجب أن تسفر عن معدلات ارتفاع afferent عفوية بين 5-10 هرتز مع نوبات السباحة وهمية تحدث كل بضع ثوان.
بالإضافة إلى الكشف عن حالة النشاط الحركي ، يمكن أن تكون تسجيلات الجذر البطني بمثابة وكيل لرصد النشاط الفوار الذي يفرغ بالتوازي مع الأوامر الحركية لتوهين نشاط الخط الجانبي30،31،32 وكذلك النشاط في أنظمة خلايا الشعر المثلية (على سبيل المثال ، النظام السمعي والدهليزي35،43،44،45). الخلايا العصبية الفوارة يقيمون في عمق الدماغ الخلفي، مما يجعل التسجيلات الكهربية لهم تحديا للغاية. Zebrafish هي نظام وراثي نموذجي ، ويمكن استكمال بروتوكول الفيزيولوجيا الكهربية لدينا بخطوط معدلة وراثيا للتحقيق بقوة في جوانب التفريغ الطبيعي ، وحساسية خلايا الشعر ، والسمية المثيرة ، وما بعدها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
ونحن نعرب عن امتناننا للدعم المقدم من المعهد الوطني للصحة (DC010809)، والمؤسسة الوطنية للعلوم (IOS1257150، 1856237)، ومختبر ويتني للعلوم البيولوجية البحرية إلى J.C.L. ونود أن نشكر الأعضاء السابقين والحاليين في مختبر لياو على حفز المناقشات.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mL beaker | PYREX | 1000 | resceptacle for etchant |
| 10x water immersion objective | Olympus | UMPLFLN10xW | low magnification for positioning larvae and recording electrode |
| 40x water immersion objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | higher magnification for position electrode tip and establishing patch-clamp |
| abfload.m | supplemental coding file | custom written MATLAB script for converting raw electrophysiology recordings to .mat files | |
| AffVR_preprocess.m | supplemental coding file | custom written MATLAB script for preprocessing recording data | |
| BNC coaxial cables | ThorLabs | 2249-C-12 | connecting amplifier and digitizer channels; require 4 |
| borosilicate glass capillaries w/ filament | Warner Instruments | G150F-3 | inner diameter: 0.86, outer diameter: 1.50; capillary glass used to form recording electrodes |
| burst_detect | supplemental coding file | custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m | |
| computer | N/A | N/A | any computer should work |
| DC Power Supply | Tenma | 72-420 | used for electrically etching dissection pins |
| electrophysiology digitizer | Axon Instruments, Molecular Devices | Axon DigiData 1440A | enables acquisition of patch-clamp data |
| filament | Sutter Instrument Company | FB255B | 2.5 mm box filament used in micropipette puller |
| fine forceps | Fine Science Tools | Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10 | used to manipulate larvae and insert pins |
| fixed stage DIC microscope | Olympus | BX51WI | microscope used to visualize and establish patch-clamp recordings |
| flexible, tapered pipette tip | Fisher Scientific | 02-707-169 | flexible tips enable insertion into recording electrode to dispense extracellular solution at the tip |
| FluoroDish | World Precision Instruments Inc. | FD3510-100 | cover glass bottomed dish recording dish |
| KimWipe | KimTech | 34155 | task wipe used for wicking away excess fluid from larvae |
| Kwik-Gard | World Precision Instruments Inc. | 710172 | self-mixing sylgard elastomer |
| MATLAB | MathWorks | R2020b | command line software for preprocessing data |
| microelectrode amplifier | Axon Instruments, Molecular Devices | MultiClamp 700B | patch clamp amplifier for dual channel recordings |
| microforge | Narishige | MF-830 microforge | to polish recording electrode |
| micromanipulator control unit | Siskiyou | MC1000-eR/T | 4-axis dial coordinator for controlling micromanipulator |
| micropipette puller | Sutter Instrument Company | Flaming/Brown P-97 | for pulling capillary glass into recording electrodes |
| microscope control unit | Siskiyou | MC1000e | positions the microscope around the fixed stage and preparation |
| motorized micromanipulator | Siskiyou | MX7600 | positions the headstage and attached recording electrode for patch-clamp recording |
| MultiClamp Commander | Molecular Devices | 2.2.2 | downloadable from Axon MultiClamp 700B Commander download page |
| optical air table | Newport Corporation | VH3036W-OPT | breadboard isolation table to float microscope and minimize vibrations during recordings |
| pCLAMP | Molecular Devices | 10.7.0 | downloadable from Axon pCLAMP 10 Electrophysiology Data Acquisition & Analysis Software Download page |
| permanent ink marker | Sharpie | order from amazon.com | for marking the leading edge side of the VR electrode to ensure proper orientation when inserting into pipette holder |
| petri-dish | Falcon | 35-3001 | used to immerse larvae in paralytic |
| pipette holder | Molecular Devices | 1-HL-U | hold recording electrode and connect to the headstage |
| pneumatic transducer | Fluke Biomedical Instruments | DPM1B | for controlling recording electrode internal pressure |
| potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221473-25G | etchant for etching dissection pins |
| silicone tubing | Tygon | 14-169-1A | tubing to connect pneumatic transducer to pipette holder |
| spike_detect | supplemental coding file | custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m | |
| stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | used to visualize pin tips and during preparation of larvae |
| straight edge razor blade | Canopus | order from amazon.com | cuts the tungsten wire while making dissection pins |
| swimbout_detect | supplemental coding file | custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m | |
| syringe | Becton Dickinson Compoany | 309602 | filled with extracellular solution to inject into recording electrodes |
| transfer pipette | Sigma-Aldrich | Z135003-500EA | single use, non-sterile pipette for transfering larvae |
| tricaine methanesulfonate | Syndel | 12854 | pharmaceutical aneasthetic used to euthanize larvae with high dosage. |
| tungsten wire | World Precision Instruments Inc. | 715500 | 0.002 inch, 50.8 μm diameter; used to make dissection pins |
| vacuum filtration unit | Sigma-Aldrich | SCGVU11RE | single use, sterile, vacuum filtration units used to sterilize extracellular solution used for electrophysiology electrode ringer |
| voltage-clamp current-clamp headstage | Molecular Devices | CV-7B | supplied with MultiClamp 700B amplifier used as left and right headstages |
| α-bungarotoxin | ThermoFisher | B1601 | for immobilizing the larvae prior to recording |
References
- Trapani, J. G., Nicolson, T. Mechanism of spontaneous activity in afferent neurons of the zebrafish lateral-line organ. The Journal of Neuroscience. 31 (5), 1614-1623 (2011).
- Haehnel-Taguchi, M., Akanyeti, O., Liao, J. C. Afferent and motorneuron activity in response to single neuromast stimulation in the posterior lateral line of larval zebrafish. Journal of Neurophysiology. 112 (6), 1329-1339 (2014).
- Levi, R., Akanyeti, O., Ballo, A., Liao, J. C. Frequency response properties of primary afferent neurons in the posterior lateral line system of larval zebrafish. Journal of Neurophysiology. 113 (2), 657-668 (2015).
- Harris, G. G., Fishkopf, L. S., Flock, A. Receptor potentials from hair cells of the lateral line. Science. 167 (3914), 76-79 (1970).
- Dow, E., Jacobo, A., Hossain, S., Siletti, K., Hudspeth, A. J. Connectomics of the zebrafish's lateral line neuromast reveals wiring and miswiring in a simple microcircuit. eLife. 7, 33988 (2018).
- Obholzer, N., et al. Vesicular glutamate transporter 3 is required for synaptic transmission in zebrafish hair cells. The Journal of Neuroscience. 28 (9), 2110-2118 (2008).
- Keen, E. C., Hudspeth, A. J. Transfer characteristics of the hair cell's afferent synapse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (14), 5537-5542 (2006).
- Li, G., Keen, E., Andor-Ardó, D., Hudspeth, A. J., von Gersdorff, H. The unitary event underlying multiquantal EPSCs at a hair cell's ribbon synapse. The Journal of Neuroscience. 29 (23), 7558-7568 (2009).
- Manley, G. A., Robertson, D. Analysis of spontaneous activity of auditory neurons in the spiral ganglion of the guinea-pig cochlea. The Journal of Physiology. 258 (2), 323-336 (1976).
- Kiang, N. Y. S., Watanabe, T., Thomas, E., Clark, L. Discharge patterns of single fibers in the cat's auditory nerve. , MIT Press. Cambridge MA. (1965).
- Corey, D. P., Hudspeth, A. J. Ionic basis of the receptor potential in a vertebrate hair cell. Nature. 281 (5733), 675-677 (1979).
- Trapani, J. G., Nicolson, T. Physiological recordings from zebrafish lateral-line hair cells and afferent neurons. Methods in Cell Biology. 100, 219-231 (2010).
- Reinig, S., Driever, W., Arrenberg, A. B. The descending diencephalic dopamine system is tuned to sensory stimuli. Current Biology. 27 (3), 318-333 (2017).
- Zhang, Q., et al. Synaptically silent sensory hair cells in zebrafish are recruited after damage. Nature Communications. 9 (1), 1388 (2018).
- Pichler, P., Lagnado, L. Motor behavior selectively inhibits hair cells activated forward motion in the lateral line of zebrafish. Current Biology. 30 (1), 150-157 (2020).
- Olszewski, J., Haehnel, M., Taguchi, M., Liao, J. C. Zebrafish larvae exhibit rheotaxis and can escape a continuous suction source using their lateral line. PloS One. 7 (5), 36661 (2012).
- Suli, A., Watson, G. M., Rubel, E. W., Raible, D. W. Rheotaxis in larval zebrafish is mediated by lateral line mechanosensory hair cells. PLoS One. 7 (2), 29727 (2012).
- Oteiza, P., Odstcil, I., Lauder, G., Portugues, R., Engert, F. A novel mechanism for mechanosensory-based rheotaxis in larval zebrafish. Nature. 547 (7664), 445-448 (2017).
- McHenry, M. J., Feitl, K. E., Strother, J. A. Larval zebrafish rapidly sense the water flow of a predator's strike. Biology Letters. 5 (4), 477-479 (2009).
- Stewart, W. J., Cardenas, G. S., McHenry, M. J. Zebrafish larvae evade predators by sensing water flow. The Journal of Experimental Biology. 216, Pt 3 388-398 (2013).
- Mekdara, P. J., Schwalbe, M. A. B., Coughlin, L. L., Tytell, E. D. The effects of lateral line ablation and regeneration in schooling giant danios. The Journal of Experimental Biology. 221, Pt 8 175166 (2018).
- Palmer, L. M., Giuffrida, B. A., Mensinger, A. F. Neural recordings from the lateral line in free-swimming toadfish, Opsanus tau. The Biological Bulletin. 205 (2), 216-218 (2003).
- Ayali, A., Gelman, S., Tytell, E. D., Cohen, A. H. Lateral line activity during undulatory body motions suggests a feedback link in closed-loop control of sea lamprey swimming. Canadian Journal of Zoology. 87 (8), 671-683 (2009).
- Mensinger, A. F., Van Wert, J. C., Rogers, L. S. Lateral line sensitivity in free-swimming toad fish Opsanus tau. The Journal of Experimental Biology. 222, Pt 2 190587 (2019).
- Montgomery, J., Bodznick, D., Halstead, M. Hindbrain signal processing in the lateral line system of the dwarf scorpionfish Scopeana papillosus. The Journal of Experimental Biology. 199, Pt 4 893-899 (1996).
- Montgomery, J. C., Bodznick, D. An adaptive filter that cancels self-induced noise in the electrosensory and lateral line mechanosensory systems of fish. Neuroscience Letters. 174 (2), 145-148 (1994).
- Palmer, L. M., Deffenbaugh, M., Mensinger, A. F. Sensitivity of the anterior lateral line to natural stimuli in the oyster toadfish, Opsanus tau (Linnaeus). The Journal of Experimental Biology. 208, Pt 18 3441-3450 (2005).
- Russell, I. J., Roberts, B. L. Inhibition of spontaneous lateral-line activity of efferent nerve stimulation. The Journal of Experimental Biology. 57, 77-82 (1972).
- Lunsford, E. T., Skandalis, D. A., Liao, J. C. Efferent modulation of spontaneous lateral line activity during and after zebrafish motor commands. Journal of Neurophysiology. 122 (6), 2438-2448 (2019).
- Russell, I. J. The pharmacology of efferent synapses in the lateral-line system of Xenopus laevis. The Journal of Experimental Biology. 54 (3), 643-659 (1971).
- Roberts, B. L., Russell, I. J. The activity of lateral-line efferent neurons in stationary and swimming dogfish. The Journal of Experimental Biology. 57 (2), 435-448 (1972).
- Flock, A., Russell, I. J. The post-synaptic action of efferent fibres in the lateral line organ of the burbot Lota lota. The Journal of Physiology. 235 (3), 591-605 (1973).
- Montgomery, J. C. Noise cancellation in the electrosensory system of the thornback ray; common mode rejection of input produced by the animal's own ventilatory movement. Journal of Comparative Physiology. 155, 103-111 (1984).
- Tricas, T. C., Highstein, S. M. Action of the octavolateralis efferent system upon the lateral line of free-swimming toadfish, Opsanus tau. Journal of Comparative Physiology. 169 (1), 25-37 (1991).
- Weeg, M. S., Land, B. R., Bass, A. H. Vocal pathways modulate efferent neurons to the inner ear and lateral line. The Journal of Neuroscience. 25 (25), 5967-5974 (2005).
- Elgoyhen, A. B., Johnson, D. S., Boulter, J., Vetter, D. E., Heinemann, S. α9: an acetylcholine receptor with novel pharmacological properties expressed in rat cochlear hair cells. Cell. 79 (4), 705-715 (1994).
- Masino, M. A., Fetcho, J. R. Fictive swimming motor patterns in wild type and mutant larval zebrafish. Journal of Neurophysiology. 93 (6), 3177-3188 (2005).
- Hentschke, H. abfload. 1.4.0.0. MATLAB Central File Exchange. , (2020).
- Harris, G. G., Milne, D. C. Input-output characteristics of the lateral-line sense organs of Xenopus laevis. The Journal of the Acoustical Society of America. 40 (1), 32-42 (1966).
- Liao, J. C., Haehnel, M. Physiology of afferent neurons in larval zebrafish provides a functional framework for lateral line somatotopy. Journal of Neurophysiology. 107 (10), 2615-2623 (2012).
- Song, S., et al. Mathematical modeling and analyses of interspike-intervals of spontaneous activity in afferent neurons of the zebrafish lateral line. Nature Science Reports. 8, 14851 (2018).
- Liao, J. C., Fetcho, J. R. Shared versus specialized glycinergic spinal interneurons in axial motor circuits of larval zebrafish. The Journal of Neuroscience. 28 (48), 12982-12992 (2008).
- von Holst, E., Mittelstaedt, H. The principle of reafference: interactions between the central nervous system and the peripheral organs. Die Naturwissenschften. 37, 463 (1950).
- Crapse, T. B., Sommer, M. A. Corollary discharge across the animal kingdom. Nature Reviews. Neuroscience. 9 (8), 587-600 (2008).
- Brichta, A. M., Goldberg, J. M. Responses to efferent activation and excitatory response-intensity relations of turtle posterior-crista afferents. Journal of Neurophysiology. 83 (3), 1224-1242 (2000).
