Summary
Vi beskriver ett protokoll för att övervaka förändringar i den afferenta neuron aktiviteten under motoriska kommandon i en modell ryggradsdjur hår cell system.
Abstract
Sensoriska system samlar ledtrådar som är nödvändiga för att styra beteendet, men djur måste dechiffrera vilken information som är biologiskt relevant. Rörelse genererar återafferenta signaler om att djur måste frigöra sig från relevanta sensoriska signaler i den omgivande miljön. Till exempel, när en fisk simmar, detekteras flöde som genereras från kroppsanfall av de mekanoreceptiva neuromasterna, bestående av hårceller, som komponerar sidolinjesystemet. Hårcellerna överför sedan flytande rörelseinformation från sensorn till hjärnan via de sensoriska afferenta nervcellerna. Samtidigt vidarebefordras corollary urladdning av motorkommandot till hårceller för att förhindra sensorisk överbelastning. Att redovisa den hämmande effekten av prediktiva motoriska signaler under rörelse är därför avgörande vid utvärdering av känsligheten hos sidoledningssystemet. Vi har utvecklat en in vivo elektrofysiologisk strategi för att samtidigt övervaka bakre laterala linjen afferent neuron och ventral motorrot verksamhet i zebrafisk larver (4-7 dagar efter befruktning) som kan pågå i flera timmar. Extracellulära inspelningar av afferenta nervceller uppnås med hjälp av den lösa patchklämman tekniken, som kan upptäcka aktivitet från enstaka eller flera nervceller. Ventrala rotinspelningar utförs genom huden med glaselektroder för att upptäcka motorisk neuronaktivitet. Vårt experimentella protokoll ger potential att övervaka endogena eller framkallade förändringar i sensorisk ingång över motoriska beteenden i ett intakt, beteende ryggradsdjur.
Introduction
Afferenta nervceller av mekanosensoriska system överför information från hårceller till hjärnan under hörsel och balans. Elektrofysiologi kan avslöja känsligheten hos afferenta nervceller genom direkta inspelningar. Medan hela cell patchning från hårceller kan vara utmanande, inspelning från nedströms afferenta nervceller är lättare och möjliggör bedömning av åtgärder potentialer som svar på kontrollerade stimuleringar1,2,3. Stimulerande hårceller leder till deras avböjning, vilket ändrar mekanosensoriska strukturer, vilket utlöser en ökning av åtgärdspotentialer (spikar) i afferenta nervceller4,5,6. I avsaknad av yttre stimuli spikar afferenta nervceller också spontant på grund av glutamatläckage från hårcellerna på till afferenta postsynaptiska terminaler7,8, och har visat sig bidra till att upprätthållakänslighet 9,10. Patchklämma inspelning av afferent aktivitet möjliggör observation av hårcellskänslighet och signaldynamik som inte är möjliga med hjälp av tekniker med lägre temporal upplösning, såsom i mikrofonik11,12 eller funktionell kalciumavbildning13,14,15. Följande protokoll gör det möjligt att registrera afferent aktivitet samtidigt med motorkommandon för att avslöja omedelbara förändringar i hårcellskänsligheten.
Zebrafisk (Danio rerio) använder hårceller som finns i neuromaster som komponerar sidolinjesystemet för att upptäcka vattenrörelser i förhållande till kroppen, vilket översätts till neurala signaler som är väsentliga förnavigering 16,17,18,rovdjursundvikande, bytefångst19,20ochskolgång 21. Vattenflödet kan också vara självgenererat av rörelserna i simning22,23,24,andning22,25,26och utfodring27. Dessa beteenden omfattar repetitiva rörelser som kan trötta ut hårceller och försämra avkänningen. Därför är det viktigt att sidolinjesystemet skiljer mellan yttre (exafferent) och självgenererade (reafferent) flödesstimulanser. En corollary urladdning dämpar självgenererade flöde signaler under rörelse i zebrafisk. Denna hämmande prediktiva motorsignal vidarebefordras via fallande nervceller till de sensoriska receptorerna för att modifiera ingången eller avbryta behandlingen av den återafferenta återkopplingen28,29. Seminalt arbete som bidrar till vår tidiga förståelse av detta feedforward-system förlitade sig på in vitro-preparat där anslutningen och endogen aktivitet hos neuralkretsen inte bibehölls28,30,31,32,33,34,35. Detta protokoll beskriver en metod för att bevara en intakt neural krets där endogen feedback dynamik upprätthålls, vilket möjliggör bättre förståelse för den corollary ansvarsfrihet in vivo.
Protokollet som beskrivs här beskriver hur man övervakar bakre laterala linjen afferent neuron och motor neuron verksamhet samtidigt i larv zebrafish. Karakteriserande afferent signaldynamik före, under och efter motoriska kommandon ger insikter i realtid, endogen feedback från centrala nervsystemet som modulerar hårcellskänslighet under rörelse. Detta protokoll beskriver vilka material som kommer att behöva förberedas före experiment och beskriver sedan hur man förlamar och förbereder zebrafisklarver. Protokollet kommer att beskriva hur man upprättar en stabil lös patch inspelning av afferenta nervceller och extracellulära ventrala rot (VR) inspelningar av motoriska nervceller. Representativa data som kan erhållas med hjälp av detta protokoll presenteras från en exemplarisk individ och analys utfördes på flera replikat av det experimentella protokollet. Förbehandling av data utförs med hjälp av anpassade skriftliga skript i MATLAB. Sammantaget är detta experimentella paradigm in vivo redo att ge en bättre förståelse för sensorisk feedback under rörelse i ett modell ryggradsdjur hårcellssystem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
All djurvård och alla experiment utfördes i enlighet med protokoll som godkänts av University of Floridas institutional animal care and use committee.
1. Beredning av material för elektrofysiologiska registreringar
- Gör en silikon elastomerbottnad inspelningsfat.
- Dela ut ett tunt lager av självblandande silikon elastomerkomponenter (t.ex. Sylgard) i en täckglasbottnad vävnadskulturrätt tills den jämnar med kanten av grunt brunn. Cirka 0,5 ml räcker.
- Täck och härda skålen i minst 48 timmar vid rumstemperatur.
- Gör dissekeringsstift.
- Ge en negativ laddning (5 V) till en 100 ml bägare etchant (3M KOH) med hjälp av en likströmsströmförsörjning och fäst en volframtråd (0,002 tum; 50,8 μm diameter) på den positivt laddade utgången.
VARNING: Negativa och positiva ledningar bör inte kontakta varandra under denna procedur eftersom du kan riskera att producera gnistor, vilket kan utgöra en potentiell brandrisk. - Etsa volframtråd genom att snabbt och upprepade gånger doppa trådspetsen i etchantbadet tills spetsen smalnar till en skarp punkt. Skär tråden cirka 1 mm från spetsen under ett stereomikroskop med ett rakblad med rakblad med rakblad med rakkant. Upprepa ytterligare tre gånger och sätt sedan in stift i härdad inspelningsskål med fina tångar.
- Ge en negativ laddning (5 V) till en 100 ml bägare etchant (3M KOH) med hjälp av en likströmsströmförsörjning och fäst en volframtråd (0,002 tum; 50,8 μm diameter) på den positivt laddade utgången.
- Förbered inspelningselektroder.
- Dra ett kapillärrör av borosilikatglas (innerdiameter: 0,86 mm, ytterdiameter: 1,50 mm) med hjälp av en horisontell mikropipettedragare med lådfilament i elektroder med en 30 μm diameterspets med lätt avsmalning (Figur 1 Ai) som kommer att användas för att spela in afferenta nervceller från den bakre sidolinjen.
- Dra in ytterligare ett kapillärrör av borosilikatglas i ett par elektroder med mindre spetsdiametrar (1-5 μm). Håll en elektrod i varje hand, kör försiktigt spetsarna över varandra för att bryta dem till en ~ 30 ° vinkel. Polera den fasade spetsen med hjälp av en mikroforge tills den är slät. Den slutliga spetsdiametern ska vara mellan 30-50 μm och kommer att användas som ventralrot (VR) som registrerar elektrod (figur 1 Aii).
- Markera sidan av VR-elektroden med framkanten med permanent bläck för att underlätta orienteringen av spetsens öppning nedåt när elektroden förs in i gathuvudets pipetthållare (steg 3.2).
OBS: Mekanisk modifiering av VR-inspelningselektroden är oprecis och steg 1.3.2 kan kräva flera försök tills en lämplig spetsmorfologi uppnås före polering. VR-inspelningselektrod avfasas för att överensstämma med larvernas kroppskurva. När den är tillverkad kan VR-inspelningselektroden användas upprepade gånger så länge spetsen förblir klar och ren mellan experimenten.
- Generera protokollet i elektrofysiologiska inspelningsprogram.
- Se till att den högra huvudentappen är ansluten till kanal 1-ingången på baksidan av mikroelektrodströmmen och spänningsklämman för afferenta neuroninspelningar och att vänster huvudtack är ansluten till Kanal 2-ingången för VR-inspelningarna.
OBS: Datorspecifikationer för ström- och spänningsklämmorförstärkaren kräver minimalt 1 GHz eller en bättre processor, Windows XP Pro eller Mac OS X 10.46.6, CD-ROM-enhet med 512 MB RAM, 500 MB hårddiskutrymme och 2 USB-portar. - Öppna den datorstyrda förstärkarprogramvaran.
- Ställ in Kanal 1 och Kanal 2 i aktuellt klämläge genom att klicka på IC-knappen för varje kanal.
- Mata in följande parametrar under både I-Clamp 1 och I-Clamp 2 flikar . Primär utgång: 100x AC-membranpotential (100 000 mV/mV), Förstärkning:1 000, Bessel:1 kHz , AC:300 Hz , Scope: Bypass . Sekundär utgång: 100x AC-membranpotential (100 mV/ mV), Förstärkning:1 , Lowpass Filter: 10 Hz.
- Spara kanalparametrar Ch1_Aff och Ch2_VR.
- Installera och öppna patchklämman elektrofysiologi programvara.
- Klicka på Konfigurera och välj Labbbänk för att ställa in de analoga signalerna genom att lägga till Ch1_Aff och Ch2_Vr till Digitizer-kanaler (t.ex. Analog IN #0 och Analog IN #1)som är anslutna, via BNC-koaxialkabel, till motsvarande kanal 1- och kanal 2-skalade utgångar för förstärkaren. Klicka på OK.
OBS: Minimidatorkraven för digitizern är: en 1 GHz eller bättre processor, Windows XP Pro eller Mac OS X 10.46.6, CD-ROM-enhet 512 MB RAM, 500 MB hårddiskutrymme och 2 USB-portar. - Klicka på Hämta och välj Nytt protokoll.
- Välj Mellanrumsfri på fliken Läge/pris; under Förvärvslägeställer du in Provlängden så att antingen Använd tillgängligt diskutrymme (dvs. post tills det stoppas) eller önskad inställd varaktighet (hh:mm:ss)och ställer sedan in samplingshastigheten per signal (Hz) till 20 000 för att maximera upplösningen.
- Under fliken Indata väljer du analoga IN-kanaler som tidigare konfigurerats (i steg 1.4.6) och väljer Ch1_Aff och Ch2_VR för motsvarande kanal.
- Välj Cmd 0 och Cmd 1 för Kanal #0 och Kanal #1under fliken Utdata.
- Anslut kanal 1-kommandot på förstärkaren till Analog Ouput 0 på digitizern via BNC-koaxialkabel och upprepa för Kanal 2-kommando till Analog utgång 1.
- De återstående flikarna kan förbli under standardinställningar. Klicka på OK och spara protokollet.
- Se till att den högra huvudentappen är ansluten till kanal 1-ingången på baksidan av mikroelektrodströmmen och spänningsklämman för afferenta neuroninspelningar och att vänster huvudtack är ansluten till Kanal 2-ingången för VR-inspelningarna.
2. Lösningsberedning
- Förbered Hanks lösning: 137 mM NaCL, 5,4 mM KCl, 0,25 mM Na2HPO4,0,44 mM KH2PO4,1,3 mM CaCl2,1,0 mM MgSO4,4,2 mM NaHCO4; pH 7.3. Späd till 10% Hanks lösning genom att tillsätta lämplig volym avjoniserat vatten till beståndet.
- Förbered extracellulär lösning: 134 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 1,2 mM MgCl2,2,1 mM CaCl2,10 mM glukos, 10 mM HEPES-buffert; pH 7,8 justerat med NaOH. Vakuumfilter extracellulär lösning genom filtret med 0,22 μm porstorlek.
- Bered α -bungarotoxin: Lös upp 1 mg lyofiliiserat α-bungarotoxin i 10 ml extracellulär lösning för att producera 0,1% utspädning.
- Förbered dödshjälpslösning: 50% (mg/L) buffrad läkemedelsklass MS-222 i 10% Hanks lösning.
VARNING: α-bungarotoxin är ett potent neurotoxin som förlamar muskler genom att blockera kolinerga receptorer. Handskar krävs och ögonskydd rekommenderas vid hantering av förlamad.
3. Beredning av larver för elektrofysiologiska registreringar
- Immobilisera zebrafisklarver.
- Använd larver från den laboratorieuppfödda populationen av zebrafisk(Danio rerio, 4-7 dagar efter befruktning) och hus i embryolösning (10% Hanks lösning) vid 27 °C.
- Överför larven från höljet till en liten Petri-skål (35 mm) med en storspetsad överföringspipett och ta bort så mycket av den omgivande lösningen som möjligt.
OBS: Avlägsnande av embryolösningen förhindrar utspädning av den paralytiska och ökar dess effektivitet. Hörnet av en uppgiftsservett kan användas för att veka bort den återstående embryolösningen, och det är viktigt att inte kontakta larverna eller lämna larver utsatta för luft. - Sänk ner larverna i 10 μL 0,1% α-bungarotoxin i cirka 5 min.
OBS: Den tid som krävs för att immobilisera larver varierar mellan preparaten. En hälsosam förberedelse beror på noggrann övervakning av ihållande snabbt blodflöde och minskade motoriska svar. Kort överexponering för den förlamade kan leda till en långsam minskning av preparatets allmänna hälsa även efter en grundlig washout. Det är bäst att applicera en tvätt innan larven är helt immobiliserad medan den fortfarande visar tecken på subtila muskelvibrationer. - Tvätta förlamad larva med extracellulär lösning och bada i 10 min.
OBS: Washouten gör det möjligt för larven att övergå från subtila muskelvibrationer till fullständig förlamning. α bungarotoxin är också en antagonist till nikotin acetylkolinreceptorn (nAChR) α9-underenhet, vilket är en kritisk komponent i den endogena återkopplingskretsen som detta protokoll observerar; Denna effekt har dock visat sig vara reversibel i Xenopus och zebrafisk hårceller efter en 10 min washout36,29.
- Fäst fisken i inspelningsrätten.
OBS: Anestesi (t.ex. MS-222, Tricaine) krävs inte vid beredning av larv zebrafisk (4-7 dpf) eftersom den stör djurhälsan. Faktum är att larv zebrafisk är undantagna från vissa ryggradsdjur protokoll.- Använd överföringspipetten och flytta larven från det extracellulära lösningsbadet till den silikonbottnade inspelningsfatet. Fyll resten av skålen med extracellulär lösning.
- Under ett stereomikroskop placerar du försiktigt larverna med finspetsade tångar ovanför silikonmattans mitt, sidosidan uppåt, med kroppens främre respektive bakre ändar som löper från vänster till höger. Ta sedan tag i en etsad stift från silikonmattan med finspetsade tångar och sätt in stiftet, orthogonally till silikonet, genom larvernas dorsala notokonaord direkt dorsala till anus. För in den andra stiftet genom notokosken nära svansens ände och för in den tredje stiftet genom gasblåsans notochorddräng (figur 1B).
OBS: När du sätter in stift är det viktigt att rikta in sig på mitten av notokonordbredden för att förhindra att blodflödet hindras eller omgivande muskulatur skadas. Notochord är dorsal till den bakre laterala linjen nerv, så med korrekt pinning, ingen skada förväntas på laterala linjen sensoriska nervceller. Sätt i efter första kontakten för att inte störa den omgivande vävnaden. Helst är stiftets diameter mindre än hälften av notokordets bredd för att säkerställa ren insättning. Om stiften överskrider denna bredd, upprepa steg 1.2 tills önskad stiftbredd uppnås. Om blodflödet saktar ner efter fastspockning, upprepa från steg 1.3 och framåt med ett nytt prov. - För in den fjärde stiftet genom otic-vesikeln samtidigt som den ger en liten rotation mot främre när stiftet förs in i inkapslingen (figur 1B). Som en liten rotation appliceras, titta på vävnaden mellan cleithrum och otic vesikel för att avslöja klustret av afferent somata.
OBS: Vinklad införing av den fjärde stiftet är att säkerställa exponeringen av den bakre laterala linjen afferent ganglion, som annars hindras av den stora otic vesikeln.
4. Ventral rotinspelning
- Placera fastsatt larva under 10x vattensänkningsmålet på ett fast steg differential interferenskontrast (DIC) upprätt mikroskop och orientera muskelblockens myseptala klykar parallellt med den vänstra huvudstegsinflygningsvektorn (Figur 1B).
- Ett DIC-mikroskop med fast steg som flöt på ett optiskt luftbord fungerar bäst för att förhindra att vibrationer stör inspelningarna. Med hjälp av en motoriserad positionerare kan mikroskopet sedan röra sig fritt runt det fasta stadiet där beredningen och huvudtagen är monterade (figur 1C).
- Placera jordkabeln i badlösningen och se till att den är ansluten till vänster huvudtage.
- Fyll VR-inspelningselektroden med 30 μL extracellulär lösning med en flexibel pipettspets med gelbelastning och sätt in i den vänstra huvudtaletthållaren.
- Sänk inspelningspipetten i disklösningen med en mikromanipulator samtidigt som du applicerar positivt tryck (1-2 mmHg) som produceras av en pneumatisk givare. Under 10x förstoring, bekräfta att spetsöppningens orientering är vänd nedåt.
- Den pneumatiska givaren ska anslutas till pipetthållarporten via silikonrör.
- Placera VR-elektroden på myoseptum
- Använd mikromanipulatorn igen och sänk VR-elektrodspetsen tills den håller positionen ovanför larven. Öka förstoringen till 40x nedsänkning.
- För elektrodspetsen över en myoseptum mellan två myomer ventrala till sidolinjen tills klyven är centrerad i VR-elektrodspetsöppningen(figur 1D).
- Sänk pipetten tills spetsens fördröjningskant försiktigt kommer i kontakt med epitelet. Efter första kontakten manövrerar du pipetten diagonalt för att säkerställa att framkanten kommer i kontakt och kan generera en tätning.
- Applicera undertryck (~100 mm Hg) med den pneumatiska givaren och håll.
OBS: Korrekt orientering av VR-pipetten i förhållande till myoseptum och kontinuerligt undertryck optimerar detektering av motorisk neuronaktivitet med ett högt signal-till-brusförhållande genom huden.
- Upptäck motorisk neuronaktivitet.
- Den vänstra huvudtagen ska anslutas till förstärkaren, som vidarebefordrar den förstärkta signalen till en digitizer som matar ut den anade signalen i patchklämman elektrofysiologi programvara som ska övervakas på en intilliggande dator (se avsnitt 1.4).
- Klicka på knappen Spela på verktygsfältet i patchklämman för att övervaka VR-signalen (bild 1E).
- Se till att VR-registreringen uppnås när motorisk neuronaktivitet med välstereotypsprängsignaldynamik observeras 29,37 (Figur 1E).
OBS: Fictive simmatcher är aktivitetsmönstren för VR-motoriska nervceller som fortsätter att överföra trots att preparatet är förlamat. Därför är fictive simning ett tillgängligt sätt att bestämma djurets beteendemässiga tillstånd och mäta lokomotoriska parametrar samtidigt som man utför afferenta neuroninspelningar som kräver en immobiliserad förberedelse. I våra händer, när en VR-inspelning har uppnåtts, kommer en hälsosam förberedelse att framkalla frivilliga fictive simmatcher med några sekunders mellanrum. Kom ihåg att en hälsosam förberedelse har lidit snabbt blodflöde. För att få en tillräcklig VR-signal kan det ta flera minuter och signal-till-brus-förhållandet kan förbättras efter den första detektionen. Av tidens intresse är det acceptabelt att gå vidare till avsnitt 5. - Om en VR-inspelning fortfarande inte uppnås efter att ha slutfört avsnitt 5, släpp ut undertryck, höj elektroden och upprepa från steg 4.4.2 och framåt på ett annat myoseptum om larvens hälsa fortfarande är optimal.
5. Afferent neuron inspelning
- Fyll den afferenta inspelningselektroden med 30 μL extracellulär lösning; för in i den högra huvudtornspipetthållaren (figur 1B, C) och sänk i skållösningen samtidigt som det applicerar positivt tryck (1-2 mm Hg) som produceras av en pneumatisk givare.
- Lokalisera och fäst löst på bakre laterala linjen afferent ganglion.
- Använd en mikromanipulator och sänk den afferenta elektrodspetsen tills den håller positionen ovanför cleithrum.
- Öka förstoringen till 40x nedsänkning och lokalisera skärningspunkten mellan den bakre laterala linjen nerv och cleithrum. Följ sidolinjen nerv främre från cleithrum till där fibrerna innervate den bakre laterala linjen afferent ganglion, som kan särskiljas av det diskreta klustret av soma (Figur 1F).
- För elektrodspetsen över den afferenta ganglionen och sänk pipetten tills spetsen kommer i kontakt med epitelet. Manövrera försiktigt elektroden så att hela spetsens omkrets kommer i kontakt med den afferenta ganglionen.
- Applicera undertryck (20-50 mm Hg) med den pneumatiska givaren och håll.
OBS: Det negativa tryck som appliceras på den afferenta ganglionen är mildare än suget som appliceras under ventralrotinspelningen. Ökande negativt tryck kan förbättra signal-till-brus, men afferent neuron hälsa minskar under ihållande aggressiv sugning, vilket minskar sannolikheten för en framgångsrik inspelning.
- Registrera afferent neuron aktivitet.
- Se till att rätt huvudsteg är anslutet i en liknande sekvens enligt beskrivningen i steg 4.5.1.
- I pClamp10 klickar du på knappen Spela upp i verktygsfältet för att övervaka afferent neuron och VR-signal samtidigt.
- Se till att hela cellen, lös patchinspelning av afferenta nervceller uppnås när spikar sker spontant, ungefär var 100-200 ms1,29 (Figur 1E).
- Gradvis öka det afferenta neuroninspelningselektrodtrycket tillbaka till atmosfäriskt (0 mm Hg) och håll under resten av inspelningen.
6. Datainsamling
- Samtidig inspelning.
- När afferent neuron och motor neuron aktivitet upptäcks, klicka på inspelningsknappen på verktygsfältet i pClamp10 för att fånga samtidiga gap gratis inspelningar i båda kanalerna.
- Registrera för önskad varaktighet (figur 1E).
OBS: En inspelning i en hälsosam förberedelse kan pågå i många timmar och förbli lyhörd för yttre stimuli. - Spara inspelningen som en filtyp som stöds (.abf, pClamp10) för att bevara metadata som anskaffningsparametrar.
7. Dödshjälp
- Applicera positivt tryck (10 mm Hg) på både afferenta och VR-inspelningselektroder med hjälp av pneumatiska givare och lyft elektroderna från inspelningsfatet med hjälp av mikromanipulatorerna.
- Överför inspelningsskålen från DIC-mikroskopet med fast steg till dissekeringstereomikroskopet.
- Använd fina spetstångar, ta bort volframstift från notokost och otic kapsel och överför larverna med en överföringspipett till en petriskål (35 mm) som innehåller 5 ml dödshjälpslösning i minst 5 minuter.
8. Förbehandling och dataanalys
OBS: Dataförbehandling och analys kräver en grundläggande förståelse för kommandoradskodning.
- Konvertera inspelningsfilen för förbearbetning.
- Installera Matlab-programvaran.
- Ladda ner det anpassade skrivna skriptet, abfload.m38 och spara filen i samma mapp som lagrar den råa inspelningsfilen.
- Öppna abfload i fönstret Matlab Editor.m och klicka på Kör på verktygsfältet. Välj Ändra mappom du uppmanas att göra det.
- Kör funktionen i kommandofönstret med den råa inspelningsfilen som indata,
> [d,si,h] = abfload('[rå inspelningsfilnamn].abf')
och spara utdataarbetsytan med ett filnamn som inkluderar larvabeteckning, ålder och experimentellt datum, till exempel [provnummer]_[ålder i dpf]_[råregistreringsfilnamn (inkluderar experimentellt datum som standard)].
Obs: Det konverterade filnamnet bör endast innehålla understreck avgränsade heltal.
- Utför dataförbehandling.
- Ladda ner Matlab-AffVR_preprocess.m och tillhörande funktioner, anpassade skrivna av författarna.
- Öppna den här AffVR_preprocess.m i redigeringsfönstret.
- Under Variablerjusterar du tröskelvärden för lägre bunden spikdetektering för både afferenta ochVR-inspelningar (spk_detect_lb och vr_detect_lb,raderna 8 respektive 14) beroende på registreringen av signal-till-brusförhållandet.
OBS: Spike detektering förlitar sig på manuell tröskel för att sortera och isolera signaler från mer än en afferent neuron genom amplitud. Baslinjebuller och aktivitet från andra enheter filtreras bort genom tröskelvärden för att endast inkludera spikamlituder inom en procent (t.ex. spk_detect_lb) av det maximala (t.ex. spk_detect_ub). Tröskel tröskel säkerställer också noggrann binning av motoriska aktivitet spikar i bursts och kollektiva fictive simmatcher. Börja i allmänhet med en tröskel lägre gräns på 0,5 och minska gradvis tills korrekt detektering uppnås. Om du till exempel anger spk_detect_lb som 0,5 och spk_detect_ub som 1,0 identifieras alla toppar som är lika med eller större än 50 % av högsta tillåtna spikamlitud och ljud eller ytterligare nervceller med lägre spikamlituder utesluts (figur 2A). Alternativt kan man också sänka spk_detect_ub från 1,0 för att utesluta nervceller av högre spik amplituder för att isolera nervcellerna i lägre spik amplituder. Förbehandlingssiffran (se steg 7.2.6) informerar om justeringar och upprepningar från steg 7.2.2 är nödvändiga. - Klicka på Kör i redigeringsfönstret för att köra AffVR_preprocess.m.
- Navigera till den tidigare konverterade .mat-datafilen (se steg 7.1.3). välj och klicka på Öppna för att påbörja automatiserad förbearbetning.
Obs: Medan det anpassade skriptet körs visas utdata i kommandofönstret som informerar dess framsteg genom bearbetningssteg som "filtrera data ...", "upptäcka ventral rotaktivitet ..." och "generera siffror ...". - Siffror som genereras AffVR_preprocess.m kommer att visualisera en betydande spik och VR-detektering och ange om några analysvariabler ska justeras (figur 2).
- Ange "Y" på tangentbordet för att spara för bearbetade metadata i en preprocess_output mapp.
- För bearbetade data matas automatiskt ut som data_out.xls.
- Analysera de för bearbetade data efter behov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter zebrafisk larver är ordentligt immobiliserade och den bakre laterala linjen afferent ganglion och VR inspelning uppnås, aktivitet i både afferent och motoriska nervceller kan mätas samtidigt. Inspelningskanaler visas med hjälp av gapfria inspelningsprotokoll (steg 1.4) för kontinuerlig övervakning av afferent- och VR-aktivitet. I realtid kan minskningar av spontan afferent spikhastighet observeras samtidigt med VR-aktivitet som tyder på fictive simmatcher (Figur 1E). Vi fann att bästa resultat och noggrann spikdetektering var produkter av inspelningar som uppnådde ett signal-till-brus-förhållande på minst 0,5. Anpassade skrivna förbearbetningsskript genererar tomter för att hjälpa till att visualisera afferent och VR spike detection. Spontana afferenta toppar identifieras med hjälp av en kombination av spikparametrar som tröskelvärde, minsta varaktighet (0,01 ms) och minsta intervall mellan spiken (ISI; 1 ms). Ökande undertryck vid upprättandet av inspelningen ger ofta signaldetektering från flera afferenta enheter samtidigt. Filtrering med amplitud gör det möjligt att skilja mellan signaldynamiken hos oberoende afferenter. Isolerande signaler kan uppnås genom att justera de nedre och övre detektionsvariablerna i förbearbetningsskriptet (figur 2A). Aggressiv sugning för att uppnå inspelningar med flera enheter kan leda till instabila inspelningar, mekaniskt brus, försämring av afferent hälsa och i slutändan en förlust av signal. Därför är det viktigt att långsamt ringa tillbaka sugningen till atmosfärstrycket när önskad signal har uppnåtts. Ventral root spike detektering följer identiska parametrar till afferent spike detektering men kräver ytterligare indata för att definiera distinkta fictive simmatcher. Bursts inom ett motorkommando definieras av VR-aktivitet med minst två toppar inom 0,1 ms från varandra och varade minst 5 ms. Alla simmatcher avgränsas sedan med minst tre skurar med intervaller mellan <200 ms (Figur 2B).
Afferent aktivitet är svår att tolka när man tittar på en inspelning i sin helhet. Förbehandlingsskript kommer att överlagra delar av en aktivitet som är centrerad kring en väldefinierad period av intresse, i det här fallet uppkomsten av en simmatch (n = 33, figur 2C)för att hjälpa till att visualisera trender i signaldynamiken. Momentan afferent aktivitet beräknas med hjälp av ett glidande medelvärde filter och ett 100 ms provtagnings fönster. Genomsnittlig spontan aktivitet visar dramatiska förändringar som svar på uppkomsten av motorisk aktivitet (figur 2C). För att bättre dissekera och analysera afferent aktivitet är perioder före och efter simningen inställda på att matcha tidsintervallet för motsvarande simmatch. I förbehandlingsskriptet och representativa analyserade resultat kallas dessa perioder "pre-swim" och "post-swim". Försimning, simning och efter simning spik priser beräknades genom att ta antalet spikar inom respektive period under dess varaktighet. Precisionen i uppskattningarna för varje individ är delvis en funktion av antalet simningar, så vi analyserade variabla relationer med hjälp av viktade regressioner, med individuella vikter som motsvarar kvadratroten av antalet simningar.
Skillnader i afferent spike kurser över de olika perioderna av intresse (pre-swim, simning och post-swim) testades av en tvåvägs analys av varians (ANOVA). Tukeys post hoc-test upptäckte betydande skillnader i spikhastigheter mellan simspikhastigheter och spikhastigheter för båda pre-swim (8,94 ± 0,2 Hz, relativ minskning 57%) och efter simning (5,34 ± 0,2 Hz, relativ minskning 40%) Perioder. Spikhastigheten återvände inte omedelbart till baslinjen med tanke på att vi också fann att spikhastigheten efter simning var lägre än spikhastigheten före simning (Tukey post-hoc-tester över grupper, p < 0,001; Figur 3A). Linjära modeller användes för att upptäcka samband mellan relativ spikhastighet och fictive simparametrar. Relativ spikhastighet beräknades genom att ta simspikhastigheten över spikhastigheten före simningen. Fictive simparametrar inkluderade simlängd, simfrekvens (dvs. antal bursts inom en simmatch under simningens längd) och arbetscykel (dvs. summan av simning burst varaktigheter över simning bout total varaktighet). I våra händer var medelvärdet och variansen för relativ spikhastighet korrelerad, så det var nödvändigt att data loggades för analys. Afferent spike rate var negativt korrelerad med simning varaktighet vilket innebär att laterala linjen upplever större hämning under simningar med längre varaktighet (r2 = 0,186, F2,26 = 2,971, p = 0,045; Figur 3B). Det upptäcktes inget samband mellan relativ spikhastighet och varken simfrekvens eller arbetscykel ((r2 = 0,099, F2,26 = 1,431, p = 0,231 och r2 = 0,047, F2,26 = 0,645, p = 0,932, respektive; Figur 3C,D). Alla analyser av variabla relationer viktades med antalet simningar per individ och alla variabler var då genomsnittliga av varje individ (n = 29).
Figur 1:Samtidig elektrofysiologisk registrering av bakre sidolinjen afferent neuron och ventral motorrotsaktivitet. Exempel på en lösplåster afferent (i) och ventral motorrot ( ii )inspelningav elektroder. Skalstänger representerar 50 μm. (B) Larv zebrafisk är förlamade och fästade på fyra platser (korssymboler) på en Sylgard-skål för inspelningsstabilitet. Fetstilta kors representerar insättningspunkter för stift. (C) Elektrofysiologiriggen är monterad på ett vibrationsisoleringsbord och består av ett upprätt fast scenmikroskop på en motoriserad styrenhet som kan 40x förstoring. Dubbla strömklämma och spänningsklämmahuvudsteg är monterade på mikromanipulatorer. (D) Myomererna i kroppsmuskulaturen separeras av myosepta som fungerar som inspelning av landmärken för motoriska neuronarborizations. Ventralmotorns rotelektrod närmar sig ventralkroppen (vänster) och centrerar och sänks ovanpå en myoseptum (pilspets). Skalstång representerar 50 μm. (E) Skärmdump av elektrofysiologisk inspelning i realtid som möjliggör visualisering av den spontana afferenta aktiviteten (kanal 1) och sprucken ventral rotaktivitet som tyder på fictiv sim bout (kanal 2). Knapparna Spela in och spela upp betecknas med röda pilar. (F) Den bakre laterala linjen afferent ganglion (streckad linje) ligger precis under huden och kan identifieras av ett tätt kluster av afferent soma. Ganglion kan lokaliseras genom att följa sidolinjen nerv förbi cleithrum ben (pilspets) till där den ansluter till ganglion. Skalstrecket representerar 30 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2:Förbearbetning av figurutgångar visualiserar korrekt spikdetektering. A)Extracellulär, lös patch inspelning av bakre laterala linje afferenta nervceller. Diskreta toppar (märkta med röda punkter) detekteras med ett minsta intervall mellan spiken på 1 ms. Baslinjebrus och aktivitet från andra enheter filtreras bort genom tröskelvärden för att endast inkludera spikamlituder inom 50 % av det maximala värdet. B)Ventral motorrotinspelning (VR) av fictive swim bouts avslöjar frivilliga motoriska kommandon under hela inspelningen. VR-toppar (röda punkter) identifieras med ett liknande tröskelfilter och kastas sedan i en enda simmatch (grön) genom att upptäcka en aktivitetsvåg inom 200 ms av varandra (se infoga; skalstreck representerar 200 ms). Spikar som upptäcks utanför den definierade simmatchen inträffar inte inom intervallet mellan spiken av stereotyp burst-aktivitet och är därför uteslutna. (C) Genomsnittlig spontan afferent spikhastighet centrerad på uppkomsten av varje simmatch (tid = 0 s) som illustrerar spikhastigheten före, under och efter simning. Felstaplar representerar ± SEM. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Kvantifiering av afferent aktivitet före, under och efter fictive simning. (A) Afferent spikhastighet reduceras avsevärt under simning och denna effekt kvarstår även efteråt. Statistiskt likartade grupperingar betecknas med a ochb.( B ) Längre simtid korreleras till minskad afferent spikhastighet. C-D) Simfrekvens och simtjänstcykel visar inget samband med en viss spikhastighet. Alla värden representerar medelvärdet ± SEM. Avlysande individer med låg statistisk vikt utelämnades. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det experimentella protokollet som beskrivs ger potential att övervaka endogena förändringar i sensorisk ingång över motoriska beteenden i ett intakt, beter sig ryggradsdjur. Specifikt beskriver det en in vivo-metod för att utföra samtidiga extracellulära inspelningar av laterala linje afferenta nervceller och ventrala motoriska rötter i larv zebrafisk. Spontan afferent aktivitet har tidigare karakteriserats i zebrafisk utan hänsyn till potentiell samtidig motoriskaktivitet 1,2,39,40,41. Utan övervakning av förekomsten av motorisk aktivitet med ventrala rotinspelningar, kommer dechiffrering av afferent aktivitet sannolikt att underskattas på grund av påverkan av efferent hämning under, och även efter, spontan simning.
In vivo elektrofysiologiska inspelningar är i sig utmanande. Enligt vår erfarenhet är upprätthållandet av en hälsosam förberedelse den enskilt största faktorn för att uppnå framgångsrika, långvariga inspelningar för afferenta nervceller och ventrala motoriska rötter. För att göra detta är det viktigt att inte bara identifiera och övervaka snabbt blodflöde, men också känna igen hudens struktur och underliggande muskulatur. Vi rekommenderar att observera flera förlamade larver under ett mikroskop innan du vidare hanterar för att bli bekant med det inneboende blodflödet och hudtillståndet hos friska larver. En lyckad ventral rotinspelning genom huden kräver en jämn, hälsosam hudyta för att inspelningselektroden ska generera en tät tätning. Detta tillvägagångssätt kringgår traditionella protokoll37,42 som är invasiva och tidskrävande, som kräver att dissekera bort epitel för att exponera den underliggande muskulaturen. En olägenhet med att spela in genom huden är den potentiella variationen i tid innan signaler realiseras. Om du optimerar omfattningen och varaktigheten av anbringat undertryck minskar den tid som krävs för att upprätta en signal och potentiellt förbättra signal-till-brusförhållandet. Inspelningar från en hälsosam, aktiv förberedelse bör ge spontana afferent spike priser mellan 5-10 Hz med fictive simmatcher inträffar med några sekunders mellanrum.
Förutom att avslöja motoriskt aktivitetstillstånd kan ventrala rotinspelningar fungera som en proxy för övervakning av efferent aktivitet som släpper ut parallellt med motoriska kommandon för att dämpa sidolinjeaktivitet30,31,32 samt aktivitet i homologa hårcellssystem (t.ex. hörsel- och vestibulärt system35,43,44,45). Efferent nervceller bor djupt i bakhjärnan, vilket gör elektrofysiologiska inspelningar av dem oerhört utmanande. Zebrafisk är ett modellgenetiksystem, och vårt elektrofysiologiska protokoll kan kompletteras med transgena linjer för att kraftfullt undersöka aspekter av följdurladdning, hårcellskänslighet, excitotoxicitet och därefter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi erkänner tacksamt stöd från National Institute of Health (DC010809), National Science Foundation (IOS1257150, 1856237) och Whitney Laboratory for Marine Biosciences till J.C.L. Vi vill tacka tidigare och nuvarande medlemmar i Liao Lab för att de stimulerat till diskussioner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mL beaker | PYREX | 1000 | resceptacle for etchant |
| 10x water immersion objective | Olympus | UMPLFLN10xW | low magnification for positioning larvae and recording electrode |
| 40x water immersion objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | higher magnification for position electrode tip and establishing patch-clamp |
| abfload.m | supplemental coding file | custom written MATLAB script for converting raw electrophysiology recordings to .mat files | |
| AffVR_preprocess.m | supplemental coding file | custom written MATLAB script for preprocessing recording data | |
| BNC coaxial cables | ThorLabs | 2249-C-12 | connecting amplifier and digitizer channels; require 4 |
| borosilicate glass capillaries w/ filament | Warner Instruments | G150F-3 | inner diameter: 0.86, outer diameter: 1.50; capillary glass used to form recording electrodes |
| burst_detect | supplemental coding file | custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m | |
| computer | N/A | N/A | any computer should work |
| DC Power Supply | Tenma | 72-420 | used for electrically etching dissection pins |
| electrophysiology digitizer | Axon Instruments, Molecular Devices | Axon DigiData 1440A | enables acquisition of patch-clamp data |
| filament | Sutter Instrument Company | FB255B | 2.5 mm box filament used in micropipette puller |
| fine forceps | Fine Science Tools | Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10 | used to manipulate larvae and insert pins |
| fixed stage DIC microscope | Olympus | BX51WI | microscope used to visualize and establish patch-clamp recordings |
| flexible, tapered pipette tip | Fisher Scientific | 02-707-169 | flexible tips enable insertion into recording electrode to dispense extracellular solution at the tip |
| FluoroDish | World Precision Instruments Inc. | FD3510-100 | cover glass bottomed dish recording dish |
| KimWipe | KimTech | 34155 | task wipe used for wicking away excess fluid from larvae |
| Kwik-Gard | World Precision Instruments Inc. | 710172 | self-mixing sylgard elastomer |
| MATLAB | MathWorks | R2020b | command line software for preprocessing data |
| microelectrode amplifier | Axon Instruments, Molecular Devices | MultiClamp 700B | patch clamp amplifier for dual channel recordings |
| microforge | Narishige | MF-830 microforge | to polish recording electrode |
| micromanipulator control unit | Siskiyou | MC1000-eR/T | 4-axis dial coordinator for controlling micromanipulator |
| micropipette puller | Sutter Instrument Company | Flaming/Brown P-97 | for pulling capillary glass into recording electrodes |
| microscope control unit | Siskiyou | MC1000e | positions the microscope around the fixed stage and preparation |
| motorized micromanipulator | Siskiyou | MX7600 | positions the headstage and attached recording electrode for patch-clamp recording |
| MultiClamp Commander | Molecular Devices | 2.2.2 | downloadable from Axon MultiClamp 700B Commander download page |
| optical air table | Newport Corporation | VH3036W-OPT | breadboard isolation table to float microscope and minimize vibrations during recordings |
| pCLAMP | Molecular Devices | 10.7.0 | downloadable from Axon pCLAMP 10 Electrophysiology Data Acquisition & Analysis Software Download page |
| permanent ink marker | Sharpie | order from amazon.com | for marking the leading edge side of the VR electrode to ensure proper orientation when inserting into pipette holder |
| petri-dish | Falcon | 35-3001 | used to immerse larvae in paralytic |
| pipette holder | Molecular Devices | 1-HL-U | hold recording electrode and connect to the headstage |
| pneumatic transducer | Fluke Biomedical Instruments | DPM1B | for controlling recording electrode internal pressure |
| potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221473-25G | etchant for etching dissection pins |
| silicone tubing | Tygon | 14-169-1A | tubing to connect pneumatic transducer to pipette holder |
| spike_detect | supplemental coding file | custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m | |
| stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | used to visualize pin tips and during preparation of larvae |
| straight edge razor blade | Canopus | order from amazon.com | cuts the tungsten wire while making dissection pins |
| swimbout_detect | supplemental coding file | custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m | |
| syringe | Becton Dickinson Compoany | 309602 | filled with extracellular solution to inject into recording electrodes |
| transfer pipette | Sigma-Aldrich | Z135003-500EA | single use, non-sterile pipette for transfering larvae |
| tricaine methanesulfonate | Syndel | 12854 | pharmaceutical aneasthetic used to euthanize larvae with high dosage. |
| tungsten wire | World Precision Instruments Inc. | 715500 | 0.002 inch, 50.8 μm diameter; used to make dissection pins |
| vacuum filtration unit | Sigma-Aldrich | SCGVU11RE | single use, sterile, vacuum filtration units used to sterilize extracellular solution used for electrophysiology electrode ringer |
| voltage-clamp current-clamp headstage | Molecular Devices | CV-7B | supplied with MultiClamp 700B amplifier used as left and right headstages |
| α-bungarotoxin | ThermoFisher | B1601 | for immobilizing the larvae prior to recording |
References
- Trapani, J. G., Nicolson, T. Mechanism of spontaneous activity in afferent neurons of the zebrafish lateral-line organ. The Journal of Neuroscience. 31 (5), 1614-1623 (2011).
- Haehnel-Taguchi, M., Akanyeti, O., Liao, J. C. Afferent and motorneuron activity in response to single neuromast stimulation in the posterior lateral line of larval zebrafish. Journal of Neurophysiology. 112 (6), 1329-1339 (2014).
- Levi, R., Akanyeti, O., Ballo, A., Liao, J. C. Frequency response properties of primary afferent neurons in the posterior lateral line system of larval zebrafish. Journal of Neurophysiology. 113 (2), 657-668 (2015).
- Harris, G. G., Fishkopf, L. S., Flock, A. Receptor potentials from hair cells of the lateral line. Science. 167 (3914), 76-79 (1970).
- Dow, E., Jacobo, A., Hossain, S., Siletti, K., Hudspeth, A. J. Connectomics of the zebrafish's lateral line neuromast reveals wiring and miswiring in a simple microcircuit. eLife. 7, 33988 (2018).
- Obholzer, N., et al. Vesicular glutamate transporter 3 is required for synaptic transmission in zebrafish hair cells. The Journal of Neuroscience. 28 (9), 2110-2118 (2008).
- Keen, E. C., Hudspeth, A. J. Transfer characteristics of the hair cell's afferent synapse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (14), 5537-5542 (2006).
- Li, G., Keen, E., Andor-Ardó, D., Hudspeth, A. J., von Gersdorff, H. The unitary event underlying multiquantal EPSCs at a hair cell's ribbon synapse. The Journal of Neuroscience. 29 (23), 7558-7568 (2009).
- Manley, G. A., Robertson, D. Analysis of spontaneous activity of auditory neurons in the spiral ganglion of the guinea-pig cochlea. The Journal of Physiology. 258 (2), 323-336 (1976).
- Kiang, N. Y. S., Watanabe, T., Thomas, E., Clark, L. Discharge patterns of single fibers in the cat's auditory nerve. , MIT Press. Cambridge MA. (1965).
- Corey, D. P., Hudspeth, A. J. Ionic basis of the receptor potential in a vertebrate hair cell. Nature. 281 (5733), 675-677 (1979).
- Trapani, J. G., Nicolson, T. Physiological recordings from zebrafish lateral-line hair cells and afferent neurons. Methods in Cell Biology. 100, 219-231 (2010).
- Reinig, S., Driever, W., Arrenberg, A. B. The descending diencephalic dopamine system is tuned to sensory stimuli. Current Biology. 27 (3), 318-333 (2017).
- Zhang, Q., et al. Synaptically silent sensory hair cells in zebrafish are recruited after damage. Nature Communications. 9 (1), 1388 (2018).
- Pichler, P., Lagnado, L. Motor behavior selectively inhibits hair cells activated forward motion in the lateral line of zebrafish. Current Biology. 30 (1), 150-157 (2020).
- Olszewski, J., Haehnel, M., Taguchi, M., Liao, J. C. Zebrafish larvae exhibit rheotaxis and can escape a continuous suction source using their lateral line. PloS One. 7 (5), 36661 (2012).
- Suli, A., Watson, G. M., Rubel, E. W., Raible, D. W. Rheotaxis in larval zebrafish is mediated by lateral line mechanosensory hair cells. PLoS One. 7 (2), 29727 (2012).
- Oteiza, P., Odstcil, I., Lauder, G., Portugues, R., Engert, F. A novel mechanism for mechanosensory-based rheotaxis in larval zebrafish. Nature. 547 (7664), 445-448 (2017).
- McHenry, M. J., Feitl, K. E., Strother, J. A. Larval zebrafish rapidly sense the water flow of a predator's strike. Biology Letters. 5 (4), 477-479 (2009).
- Stewart, W. J., Cardenas, G. S., McHenry, M. J. Zebrafish larvae evade predators by sensing water flow. The Journal of Experimental Biology. 216, Pt 3 388-398 (2013).
- Mekdara, P. J., Schwalbe, M. A. B., Coughlin, L. L., Tytell, E. D. The effects of lateral line ablation and regeneration in schooling giant danios. The Journal of Experimental Biology. 221, Pt 8 175166 (2018).
- Palmer, L. M., Giuffrida, B. A., Mensinger, A. F. Neural recordings from the lateral line in free-swimming toadfish, Opsanus tau. The Biological Bulletin. 205 (2), 216-218 (2003).
- Ayali, A., Gelman, S., Tytell, E. D., Cohen, A. H. Lateral line activity during undulatory body motions suggests a feedback link in closed-loop control of sea lamprey swimming. Canadian Journal of Zoology. 87 (8), 671-683 (2009).
- Mensinger, A. F., Van Wert, J. C., Rogers, L. S. Lateral line sensitivity in free-swimming toad fish Opsanus tau. The Journal of Experimental Biology. 222, Pt 2 190587 (2019).
- Montgomery, J., Bodznick, D., Halstead, M. Hindbrain signal processing in the lateral line system of the dwarf scorpionfish Scopeana papillosus. The Journal of Experimental Biology. 199, Pt 4 893-899 (1996).
- Montgomery, J. C., Bodznick, D. An adaptive filter that cancels self-induced noise in the electrosensory and lateral line mechanosensory systems of fish. Neuroscience Letters. 174 (2), 145-148 (1994).
- Palmer, L. M., Deffenbaugh, M., Mensinger, A. F. Sensitivity of the anterior lateral line to natural stimuli in the oyster toadfish, Opsanus tau (Linnaeus). The Journal of Experimental Biology. 208, Pt 18 3441-3450 (2005).
- Russell, I. J., Roberts, B. L. Inhibition of spontaneous lateral-line activity of efferent nerve stimulation. The Journal of Experimental Biology. 57, 77-82 (1972).
- Lunsford, E. T., Skandalis, D. A., Liao, J. C. Efferent modulation of spontaneous lateral line activity during and after zebrafish motor commands. Journal of Neurophysiology. 122 (6), 2438-2448 (2019).
- Russell, I. J. The pharmacology of efferent synapses in the lateral-line system of Xenopus laevis. The Journal of Experimental Biology. 54 (3), 643-659 (1971).
- Roberts, B. L., Russell, I. J. The activity of lateral-line efferent neurons in stationary and swimming dogfish. The Journal of Experimental Biology. 57 (2), 435-448 (1972).
- Flock, A., Russell, I. J. The post-synaptic action of efferent fibres in the lateral line organ of the burbot Lota lota. The Journal of Physiology. 235 (3), 591-605 (1973).
- Montgomery, J. C. Noise cancellation in the electrosensory system of the thornback ray; common mode rejection of input produced by the animal's own ventilatory movement. Journal of Comparative Physiology. 155, 103-111 (1984).
- Tricas, T. C., Highstein, S. M. Action of the octavolateralis efferent system upon the lateral line of free-swimming toadfish, Opsanus tau. Journal of Comparative Physiology. 169 (1), 25-37 (1991).
- Weeg, M. S., Land, B. R., Bass, A. H. Vocal pathways modulate efferent neurons to the inner ear and lateral line. The Journal of Neuroscience. 25 (25), 5967-5974 (2005).
- Elgoyhen, A. B., Johnson, D. S., Boulter, J., Vetter, D. E., Heinemann, S. α9: an acetylcholine receptor with novel pharmacological properties expressed in rat cochlear hair cells. Cell. 79 (4), 705-715 (1994).
- Masino, M. A., Fetcho, J. R. Fictive swimming motor patterns in wild type and mutant larval zebrafish. Journal of Neurophysiology. 93 (6), 3177-3188 (2005).
- Hentschke, H. abfload. 1.4.0.0. MATLAB Central File Exchange. , (2020).
- Harris, G. G., Milne, D. C. Input-output characteristics of the lateral-line sense organs of Xenopus laevis. The Journal of the Acoustical Society of America. 40 (1), 32-42 (1966).
- Liao, J. C., Haehnel, M. Physiology of afferent neurons in larval zebrafish provides a functional framework for lateral line somatotopy. Journal of Neurophysiology. 107 (10), 2615-2623 (2012).
- Song, S., et al. Mathematical modeling and analyses of interspike-intervals of spontaneous activity in afferent neurons of the zebrafish lateral line. Nature Science Reports. 8, 14851 (2018).
- Liao, J. C., Fetcho, J. R. Shared versus specialized glycinergic spinal interneurons in axial motor circuits of larval zebrafish. The Journal of Neuroscience. 28 (48), 12982-12992 (2008).
- von Holst, E., Mittelstaedt, H. The principle of reafference: interactions between the central nervous system and the peripheral organs. Die Naturwissenschften. 37, 463 (1950).
- Crapse, T. B., Sommer, M. A. Corollary discharge across the animal kingdom. Nature Reviews. Neuroscience. 9 (8), 587-600 (2008).
- Brichta, A. M., Goldberg, J. M. Responses to efferent activation and excitatory response-intensity relations of turtle posterior-crista afferents. Journal of Neurophysiology. 83 (3), 1224-1242 (2000).
