Summary
यह प्रोटोकॉल एक विशेष अंतःशिरा कैथेटर के उपयोग का विवरण देता है, मानकीकृत बाँझ डिस्पोजेबल ट्यूबिंग, वास्तविक समय की निगरानी द्वारा पूरक तापमान नियंत्रण, और दो-चरणीय कोलेजेनेस परफ्यूजन प्रक्रिया के लिए एक अलार्म प्रणाली के उपयोग का विवरण देता है ताकि अलग-थलग प्राथमिक चूहे हेपेटोसाइट्स की व्यवहार्यता, उपज और कार्यक्षमता में स्थिरता में सुधार हो सके।
Abstract
प्राथमिक हेपेटोसाइट्स व्यापक रूप से जिगर की बीमारियों पर बुनियादी अनुसंधान में और विट्रो में विषाक्तता परीक्षण के लिए उपयोग किया जाता है। प्राथमिक हेपेटोसाइट अलगाव के लिए दो-चरणीय कोलेजेनेस परफ्यूजन प्रक्रिया तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है, विशेष रूप से पोर्टल शिरा कैनुलेशन में। प्रक्रिया भी कभी-कभी संदूषण और परफ्यूजन सेटअप के असेंबली, अनुकूलन, या रखरखाव में कठिनाइयों के कारण परफ्यूजन स्थितियों में भिन्नताओं के लिए प्रवण है। यहां, मल्टीपैरामीटर परफ्यूजन नियंत्रण के साथ एक बेहतर दो-चरणीय कोलेजेनेस परफ्यूजन प्रक्रिया के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। प्राथमिक चूहे हेपेटोसाइट्स को प्रक्रिया के महत्वपूर्ण चरणों में आवश्यक तकनीकी सावधानियां बरतते हुए सफलतापूर्वक और मज़बूती से अलग किया गया था, और परिचालन कठिनाई को कम करके और एक विशेष अंतःशिरा कैथेटर, मानकीकृत बाँझ डिस्पोजेबल टयूबिंग, तापमान नियंत्रण, और वास्तविक समय की निगरानी और अलार्म प्रणाली को अपनाने के माध्यम से परफ्यूजन पैरामीटर की परिवर्तनशीलता को कम करके। पृथक प्राथमिक चूहा हेपेटोसाइट्स लगातार उच्च सेल व्यवहार्यता (85% -95%), उपज (2-5 x 108 कोशिकाओं प्रति 200-300 ग्राम चूहा) और कार्यक्षमता (एल्ब्यूमिन, यूरिया और सीवाईपी गतिविधि) का प्रदर्शन करते हैं। प्रक्रिया को एक एकीकृत परफ्यूजन प्रणाली द्वारा पूरक किया गया था, जो एसेप्टिक ऑपरेशन को सुनिश्चित करने के लिए लैमिनर फ्लो हुड में स्थापित करने के लिए पर्याप्त कॉम्पैक्ट है।
Introduction
प्राथमिक हेपेटोसाइट्स जिगर से संबंधित बुनियादी अनुसंधान, रोग उपचार और दवा परीक्षण जैसे आवेदन के लिए महत्वपूर्ण उपकरण हैं। प्राथमिक हेपेटोसाइट अलगाव के लिए वर्तमान स्वर्ण मानक दो-चरणीय कोलेजेनेस परफ्यूजन प्रक्रिया 1,2,3 है जिसे1970 के दशक में सेग्लेन द्वारा पेश किया गयाथा। हालांकि, यह प्रक्रिया तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है और नौसिखिए सर्जनों द्वारा किए जाने पर उच्च विफलता दर है। यहां तक कि जब एक परफ्यूजन को सफल माना जाता है, तो हेपेटोसाइट व्यवहार्यता (आमतौर पर 60% -95%) और उपज (0.5-5 x 108 प्रति 200-300 ग्राम चूहा) में भारी अंतर अलगाव के बीच देखा जा सकता है। यह डाउनस्ट्रीम प्रयोगों की गुणवत्ता और पैमाने को प्रभावित करता है। तकनीकी प्रक्रिया के अलावा, अलगाव के लिए उपयोग किया जाने वाला परफ्यूजन सेटअप, या तो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है या कस्टम निर्मित, एक योगदान कारक है। परफ्यूजन सेटअप के असेंबली, ऑप्टिमाइज़ेशन और रखरखाव पर ध्यान दिया जाना चाहिए। इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य तकनीकी प्रक्रिया के मल्टीपैरामीटर परफ्यूजन नियंत्रण और दो-चरणीय कोलेजेनेस परफ्यूजन प्रक्रिया के परफ्यूजन सेटअप के माध्यम से प्राथमिक चूहे हेपेटोसाइट्स के अलगाव के बीच सफलता दर और स्थिरता में सुधार करना है।
तकनीकी पहलू से, प्रक्रिया में सबसे कठिन कदम पोर्टल शिरा कैनुलेशन है। अन्य चरणों के लिए, यदि अच्छा अभ्यास देखा जाता है और सामान्य सावधानी बरती जाती है, तो अलगाव की स्थिरता में सुधार किया जा सकता है। इसलिए, प्रत्येक चरण के लिए तर्क की समझ महत्वपूर्ण है ताकि सर्जन प्रक्रिया के दौरान होने वाले विभिन्न चरों का जवाब दे सके।
हेपेटोसाइट्स और जिगर के अलगाव के लिए विभिन्न प्रोटोकॉल चूहे और माउस से गैर-पैरेन्काइमल कोशिकाओंको 1,2,5,6,7,8,9 प्रकाशित किया गया है। इन प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले परफ्यूजन सेटअप के कई नुकसान थे, जिनमें परफ्यूजन ट्यूबिंग का पुन: उपयोग, तापमान नियंत्रण के साथ समस्याएं, परफ्यूजन पैरामीटर के नियमित अनुकूलन की आवश्यकता, और / या पोर्टल शिरा कैनुलेशन के लिए अनुपयुक्त प्रकार के अंतःशिरा (IV) कैथेटर का उपयोग शामिल है। परफ्यूजन ट्यूबिंग का पुन: उपयोग संदूषण की संभावना को बढ़ाएगा, खासकर अगर टयूबिंग को ठीक से साफ और कीटाणुरहित नहीं किया गया था। नियमित प्रतिस्थापन के बिना टयूबिंग का पुन: उपयोग भी लीक टयूबिंग या कनेक्टर्स, भरा हुआ बुलबुला जाल और संकुचित ट्यूबिंग जैसी समस्याओं के लिए परफ्यूजन सेटअप को उजागर करेगा, जिनमें से सभी परफ्यूसेट दबाव और प्रवाह दर को काफी हद तक कम कर देंगे, इस प्रकार, यकृत पाचन दक्षता को प्रभावित करेंगे। तापमान नियंत्रण के लिए कुछ सेटअप में एक निरंतर गर्मी स्रोत के बिना, पूर्व-गर्म बफ़र्स समय के साथ ठंडा हो जाएगा, जिससे कम कोलेजनेस गतिविधि और पाचन होगा। यद्यपि अन्य सेटअप बफर को गर्म करने के लिए एक पानी के संचारक से जुड़े एक जैकेट वाले ग्लास कंडेनसर का उपयोग करते हैं, वे भारी होते हैं और सावधानीपूर्वक सफाई की आवश्यकता होती है। कैथेटर से बाहर निकलने वाले बफर के तापमान, दबाव और प्रवाह दर को मापा जाना चाहिए और स्थिर परफ्यूजन स्थिति को सुनिश्चित करने के लिए अलगाव की शुरुआत से पहले अनुकूलित किया जाना चाहिए। अनुकूलन के बाद भी, पैरामीटर अभी भी ऑपरेटर के कार्यों के कारण अलगाव के दौरान आधे रास्ते में बदल सकते हैं, जिससे सबऑप्टिमल परफ्यूजन और पाचन होता है। अधिकांश प्रकार के IV कैथेटर पोर्टल शिरा कैनुलेशन के लिए उपयुक्त नहीं हैं क्योंकि वे कैनुलेशन के दौरान निरंतर परफ्यूजन की अनुमति नहीं देते हैं। वे तुरंत सर्जन को सूचित करने में असमर्थ हैं जब कैनुलेशन सफल होता है। इसके अलावा, इसे विकृत किए बिना नरम कैथेटर पर पोर्टल नस को सुरक्षित करना चुनौतीपूर्ण है।
यहां, हम मानकीकृत डिस्पोजेबल बाँझ टयूबिंग, सटीक और स्थिर तापमान नियंत्रण के लिए एक सिलिकॉन हीटर जैकेट, डेटा भंडारण और प्रबंधन के साथ वास्तविक समय की निगरानी और अलार्म सिस्टम और एक विशेष IV कैथेटर के उपयोग का उपयोग करके इन समस्याओं को संबोधित करते हैं, जो कैनुलेशन के दौरान पोर्टल नस को पंक्चर करते समय निरंतर परफ्यूजन की अनुमति देता है। हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, हम इन सभी सुविधाओं को एक एकीकृत परफ्यूजन सिस्टम (आईपीएस) में संयोजित करने वाले पहले समूह हैं जो कॉम्पैक्ट है, जिससे यह अत्यधिक पोर्टेबल हो जाता है और एसेप्टिक ऑपरेशन सुनिश्चित करने के लिए एक लैमिनर प्रवाह हुड में फिट होने में सक्षम होता है।
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Protocol
सभी प्रक्रियाओं और पशु आवास प्रोटोकॉल संख्या R15-0027 और R19-0669 के तहत सिंगापुर के राष्ट्रीय विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) की आवश्यकताओं के अनुसार किया गया था।
1. समाधान और सर्जिकल उपकरणों की तैयारी
- अल्ट्राप्योर पानी का उपयोग करके तालिका 1 में बफर और सेल संस्कृति मीडिया तैयार करें।
- उपयोग से पहले एक पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस के लिए कैल्शियम मुक्त बफर और कोलेजनेस बफर को पूर्व-गर्म करें।
- निम्नलिखित सर्जिकल उपकरणों और प्रयोगशाला उपकरणों को आटोक्लेव करें: तेज-कुंद सर्जिकल कैंची की एक जोड़ी, कुंद-कुंद सर्जिकल कैंची की एक जोड़ी, घुमावदार सर्जिकल कैंची की एक जोड़ी, दांत-ऊतक संदंश के दो जोड़े, घुमावदार संदंश के दो जोड़े, दो शिरा क्लिप, एक 5 सेमी लंबा 3-0 रेशम सर्जिकल सीवन, एक 100 μm नायलॉन जाल फिल्टर, एक 400 एमएल बीकर, और एक चरण (फ्लोटिंग माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब रैक)।
2. आईपीएस की स्थापना ( चित्रा 1 देखें)
- 70% इथेनॉल के साथ लैमिनर प्रवाह हुड को पोंछ लें। 70% इथेनॉल के साथ आईपीएस को पोंछें और इसे लैमिनर फ्लो हुड में ले जाएं। हुड पर स्विच करने से पहले >15 मिनट के लिए यूवी द्वारा निष्फल करें।
सावधानी: यूवी प्रकाश के संपर्क में आने से दर्दनाक आंखें और त्वचा जल सकती है। सुनिश्चित करें कि जब यूवी लाइट चालू हो जाती है तो सैश पूरी तरह से बंद हो जाता है। - आईपीएस पर डिस्पोजेबल टयूबिंग का एक नया सेट इकट्ठा करें। एक सिलिकॉन हीटर जैकेट में पेरिस्टाल्टिक पंप के नीचे की ओर टयूबिंग लपेटें। सिलिकॉन हीटर जैकेट के नीचे की ओर टयूबिंग पर परफ्यूजन मॉनिटर को इकट्ठा करें।
- सुनिश्चित करें कि दोनों टयूबिंग इनलेट्स के लिए रोलर क्लैंप पूरी तरह से ढीले हैं। प्रत्येक टयूबिंग इनलेट को एक बाँझ 2 एमएल आकांक्षा पिपेट के पतले अंत से कनेक्ट करें। बाद के प्राइमिंग चरणों के दौरान बफर के पुन: परिसंचरण की अनुमति देने के लिए कैल्शियम-मुक्त बफर के साथ 1 एल बोतल में आकांक्षा पिपेट्स (इनलेट्स) और आईवी कैथेटर (आउटलेट) दोनों को छोड़ दें।
चित्र 2: स्व-परीक्षण इंटरफ़ेस। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
- IPS पर स्विच करें। टच स्क्रीन नियंत्रण कक्ष पर निम्न कार्रवाई निष्पादित करें। सॉफ्टवेयर हर बार जब यह शुरू किया जाता है तो एक व्यापक आत्म-परीक्षण करेगा।
चेतावनी: आईपीएस एक विद्युत उपकरण है जो एक बाहरी शक्ति स्रोत से जुड़ा हुआ है। आईपीएस या पावर केबल पर तरल रिसाव बिजली के खतरों का उत्पादन कर सकता है।- सुनिश्चित करें कि स्व-परीक्षण स्थिति स्क्रीन पर प्रदर्शित होती है (चित्र2)। स्व-परीक्षण पास करने वाले घटकों को हरे रंग में दिखाया जाएगा; जो असफल रहे हैं उन्हें लाल रंग में दिखाया जाएगा। सुधार के बाद, स्व-परीक्षण को फिर से दोहराने के लिए परीक्षण आइकन पर टैप करें या सीधे ऑपरेशन इंटरफ़ेस में प्रवेश करने के लिए सिस्टम दर्ज करें आइकन पर टैप करें।
- ऑपरेशन इंटरफ़ेस में लॉग इन करने के लिए स्क्रीन पर कहीं भी टैप करें।
- ऑपरेशन इंटरफ़ेस (चित्रा 3) के ऊपरी-बाएँ कोने पर, पेरिस्टाल्टिक पंप के लिए रोटेशन की दिशा निर्धारित करने के लिए या तो परिपत्र तीर आइकन टैप करें। इंटरफ़ेस के दाएँ पैनल पर, संबंधित पैरामीटर के लिए मान सेट करने के लिए ऊपर/नीचे तीर आइकन टैप करें. प्रवाह को निरंतर प्रवाह मोड पर सेट करें; हीटर जैकेट का तापमान 42 डिग्री सेल्सियस तक (यह सुनिश्चित करने के लिए समायोजित किया जाना है कि परफ्यूसेट का तापमान 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा जाता है); और ~ 33 mL / मिनट की प्रवाह दर के लिए 38 rpm करने के लिए पंप गति।
- ऑपरेशन इंटरफ़ेस के निचले-दाएं पैनल पर, बुलबुला अलार्म, परफ्यूजन स्टॉप अलार्म और म्यूट आइकन की स्थिति की जांच करें।
- बाएं पैनल में परफ्यूसेट के तापमान, दबाव और प्रवाह दर की जांच करें। स्तंभों के ऊपर और नीचे ऊपर-नीचे तीरों पर क्लिक करके अंतराल को मैन्युअल रूप से सेट करें. स्तंभों के मध्य में मानों के रूप में दिखाए गए वास्तविक समय डेटा की जाँच करें. यदि वास्तविक समय डेटा सेट सीमा से परे चला जाता है, तो स्तंभ का रंग हरे से लाल रंग में बदल जाएगा.
- प्रारंभ करने, रोकने और परफ्यूजन को रोकने के लिए चिह्नों की स्थिति जानें, और मध्य पैनल में चार्ट मोड में रीयल-टाइम डेटा डिस्प्ले से स्विच करने के लिए आइकन। परफ्यूजन शुरू करने के लिए स्टार्ट आइकन पर टैप करें और कैल्शियम-मुक्त बफर के साथ टयूबिंग को प्राइम करें। एक नया लॉग बनाया जाएगा। पॉपअप विंडो में फ़ाइल नाम और उपयोगकर्ता नाम दर्ज करें (चित्र4).
चित्र 3: ऑपरेशन इंटरफ़ेस। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।
चित्र 4: पॉपअप विंडो फ़ाइल नाम और उपयोगकर्ता नाम के लिए संकेत दे रही है। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।
- ड्रिप कक्ष को आधा भरा भरें। सुनिश्चित करें कि प्राइमिंग के दौरान टयूबिंग में कोई फंसी हुई हवा की जेब नहीं है।
- बुलबुले को अलग करने के लिए टयूबिंग पर फ़्लिक करके बुलबुला फ़िल्टर के डाउनस्ट्रीम रूपों वाले किसी भी बुलबुले को हटा दें और इसे बाहर निकालने की अनुमति दें।
नोट: बुलबुले टयूबिंग के साथ फार्म के रूप में बफर हीटर जैकेट द्वारा गर्म किया जाता है. - कोलेजेनेस बफर के 200 एमएल के साथ एक 400 एमएल बीकर भरें। बीकर के ऊपर मंच रखो। टयूबिंग में किसी भी हवा को पेश किए बिना, टयूबिंग इनलेट्स में से एक के लिए रोलर क्लैंप को पूरी तरह से कस लें और बीकर में इनलेट के लिए आकांक्षा पिपेट को स्थानांतरित करें।
3. पशु प्रक्रिया
- शरीर के वजन में लगभग 200-300 ग्राम एक युवा वयस्क पुरुष विस्टार चूहे को तैयार करें।
नोट: यह प्रोटोकॉल शरीर के वजन में लगभग 200-300 ग्राम चूहों के लिए अनुकूलित किया गया था। नर चूहों को पसंद किया जाता है क्योंकि मादा चूहों में एस्ट्रोस चक्र के दौरान हार्मोनल परिवर्तन हेपेटोसाइट फ़ंक्शन को प्रभावित करेंगे। - संज्ञाहरण
- एंटी-कोआगुलेंट हेपरिन (5,000 आईयू / एमएल; 0.2 एमएल / 100 ग्राम शरीर के वजन) और चूहे संज्ञाहरण केटामाइन / xylazine कॉकटेल (37.5 मिलीग्राम / एमएल केटामाइन, 5 मिलीग्राम / एमएल xylazine; 0.2 एमएल / 100 ग्राम शरीर के वजन) की आवश्यक मात्रा को 27 जी सुई के साथ 1 एमएल सिरिंज में खींचें।
सावधानी: संज्ञाहरण और हेपरिन हानिकारक पदार्थ हैं। शार्प्स को संभालते समय सावधान रहें। - चूहे को रोकें। इंट्रापेरिटोनियल रूप से हेपरिन इंजेक्ट करें, इसके बाद पेट के निचले-दाएं चतुर्थांश में केटामाइन / xylazine कॉकटेल होता है।
नोट:: caecum बाईं ओर स्थित होने की एक उच्च संभावना है। संदूषण के जोखिम को कम करने के लिए इंजेक्शन के दौरान caecum puncturing से बचें। - 10 मिनट के बाद, चूहे के दोनों पैरों पर पेडल रिफ्लेक्स का आकलन करके संज्ञाहरण की गहराई की जांच करें। समय-समय पर जांचना जारी रखें और तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि चूहा अब पैर की अंगुली के चुटकी का जवाब न दे। अतिरिक्त संज्ञाहरण इंजेक्शन दिया जा सकता है, के रूप में आवश्यक है।
- एंटी-कोआगुलेंट हेपरिन (5,000 आईयू / एमएल; 0.2 एमएल / 100 ग्राम शरीर के वजन) और चूहे संज्ञाहरण केटामाइन / xylazine कॉकटेल (37.5 मिलीग्राम / एमएल केटामाइन, 5 मिलीग्राम / एमएल xylazine; 0.2 एमएल / 100 ग्राम शरीर के वजन) की आवश्यक मात्रा को 27 जी सुई के साथ 1 एमएल सिरिंज में खींचें।
- एक ट्रे के शीर्ष पर एक एल्यूमीनियम पन्नी से ढके हुए पॉलीस्टीरीन प्लेटफ़ॉर्म पर फैले अंगों के साथ चूहे को एक सुपाइन स्थिति में रखें। चूहे के पैरों को टेप करें और टेप को 27 जी सुइयों के साथ मंच पर सुरक्षित रूप से पिन करें।
- 70% इथेनॉल के साथ छिड़काव और उन्हें भिगोकर छाती और पेट को कीटाणुरहित करें। कीटाणुशोधन से पहले शेविंग वैकल्पिक है। चूहे को हुड में रखो। अगले चरण को जारी रखें, जबकि फर अभी भी गीला है।
नोट: 70% इथेनॉल के साथ भिगोना भी कम से कम करने के लिए डैंडर और फर धूल रखता है। - त्वचा को मांसपेशियों से अलग करें।
- एक हाथ में दांत-ऊतक संदंश की एक जोड़ी के साथ, पेट के आधार के पास त्वचा को उठाएं। दूसरे हाथ में तेज-कुंद सर्जिकल कैंची की एक जोड़ी के साथ, तम्बू वाली त्वचा को काट लें। त्वचा के नीचे कैंची के तेज अंत को धक्का दें और पिछले पैरों के ठीक ऊपर से सामने के पैरों के ठीक नीचे तक त्वचा पर एक मिडलाइन चीरा बनाएं।
- संदंश के साथ त्वचा को खींचते और हल्के से खींचते समय, छाती और पेट में मांसपेशियों पर त्वचा को पकड़ने वाले किसी भी संयोजी ऊतक को काट लें। संदूषण के जोखिम को कम करने के लिए, ढीले फर को मांसपेशियों पर गिरने से रोकें। कैंची पर निर्मित ढीले फर को हटाने के लिए, उन्हें त्वचा के कीटाणुरहित बाहरी पक्ष पर पोंछ दें।
- त्वचा पर पार्श्व चीरों को बनाएं, मध्यरेखा से चूहे के दोनों किनारों तक हिंद पैरों के थोड़ा ऊपर और सामने के पैरों के थोड़ा नीचे। मांसपेशियों को उजागर करने के लिए त्वचा के फ्लैप को पक्षों पर धकेलें।
- अंगों को उजागर करने के लिए पेट की मांसपेशियों को काटें।
- एक हाथ में दांत-ऊतक संदंश की एक नई जोड़ी के साथ, मांसपेशियों को पेट के आधार के पास उठाएं। दूसरे हाथ में कुंद-कुंद सर्जिकल कैंची की एक जोड़ी के साथ, किसी भी अंग को निक किए बिना मांसपेशियों के माध्यम से सावधानीपूर्वक काटें। पिछले पैरों के थोड़ा ऊपर से उरोस्थि तक मांसपेशियों पर एक मध्यरेखा चीरा बनाएं।
- मांसपेशियों पर पार्श्व चीरों को बनाएं, मिडलाइन से चूहे के दोनों किनारों तक हिंद पैरों के थोड़ा ऊपर और रिब पिंजरे के ठीक नीचे, किसी भी अंग को निक किए बिना। अंगों को उजागर करने के लिए मांसपेशियों के फ्लैप को पक्षों में धकेलें। सुनिश्चित करें कि त्वचा और मांसपेशियों के पार्श्व चीरों चूहे के किनारों तक पहुंचने के लिए रक्त और buffers बाद के चरणों में पेट गुहा से बाहर प्रवाह करने के लिए अनुमति देने के लिए।
- पोर्टल शिरा कैनुलेशन
- घुमावदार संदंश के पीछे के साथ, धीरे से आंतों को दाईं ओर धकेलें। धीरे से पोर्टल नस को उजागर करने के लिए जिगर लोब को फ्लिप करें।
- जिगर के करीब पोर्टल नस के चारों ओर एक बहुत ही ढीला लिगचर बनाने के लिए 3-0 रेशम सर्जिकल सीवन का उपयोग करें, बस शिरा शाखाओं से पहले छोड़ दिया और सही विभिन्न जिगर लोब में। पोर्टल नस के माध्यम से रक्त के प्रवाह को बाधित करने से बचने के लिए लिगेचर को कसें नहीं। पित्त नलिका के नीचे एक बहुत पतली झिल्ली को घुमावदार संदंश की नोक के साथ तोड़ने की आवश्यकता होगी, इससे पहले कि सिवनी नीचे से गुजर सके और पोर्टल नस (और पित्त नलिका) के चारों ओर लूप किया जा सके।
- घुमावदार संदंश के दो जोड़े की युक्तियों का उपयोग करते हुए, पोर्टल नस को नुकसान पहुंचाए बिना, पोर्टल नस के नीचे ऊतक के माध्यम से सावधानीपूर्वक एक छेद को पंचर करें। पहले लिगचर के लगभग 2-3 सेमी अपस्ट्रीम के बारे में ऐसा करें, पोर्टल नस से गैस्ट्रिक शिरा शाखाओं से ठीक पहले। ऊतक इस विशिष्ट स्थान पर पतला है।
- संदंश के साथ छेद को सावधानीपूर्वक बड़ा खींचें। यह छेद संदंश को कैनुलेशन के दौरान पोर्टल शिरा का समर्थन करने की अनुमति देगा।
- ~ 3 mL / मिनट की प्रवाह दर के लिए पंप की गति को 4 rpm तक कम करें। सुनिश्चित करें कि चतुर्थ कैथेटर से कैल्शियम मुक्त बफर का बहिर्वाह एक धीमी ड्रिप तक कम हो गया है।
नोट: जिगर में दबाव बिल्ड-अप हेपेटोसाइट मृत्यु का कारण होगा। एक कम प्रवाह दर को बाद के चरण में पोर्टल नस में प्रवेशनी के सफल सम्मिलन पर जिगर में दबाव बिल्ड-अप को धीमा करना चाहिए। - धीरे से संदंश का उपयोग कर पोर्टल नस का समर्थन करें. दूसरी ओर, सुई के बेवेल के साथ IV कैथेटर को पकड़ो। एक 10-20 ° कोण पर पोर्टल नस में सुई को निर्देशित करें और धीरे-धीरे तब तक आगे बढ़ें जब तक कि पूरे बेवल नस के अंदर न हो। एक बार जब सुई को पोर्टल नस में सही ढंग से डाला जाता है, तो जिगर ब्लैंच करना शुरू कर देगा और अपना गहरा लाल रंग खो देगा।
नोट: सुई के पूरे bevel शिरा में डाला जाना चाहिए एक छेद बनाने के लिए कैनुला के सम्मिलन के लिए पर्याप्त बड़ा. हालांकि, नस puncturing से बचने के लिए सुई को बहुत गहराई से न डालें। - सुई के ऊपर और नस में प्रवेशनी अग्रिम. फिर, सुई को तब तक वापस लें जब तक कि यह कैनुला के पीछे 2-3 मिमी न हो; बस इतना है कि तेज टिप सुरक्षित रूप से प्रवेशनी के भीतर है. कैथेटर को पकड़ने के लिए अंगूठे और मध्यम उंगली का उपयोग करें और सुई को वापस लेने के लिए पंख को वापस खींचने के लिए तर्जनी का उपयोग करें।
- जल्दी से एक शिरा क्लिप के साथ कैथेटर पर पोर्टल नस को सुरक्षित करें। परफ्यूसेट प्रवाह को बाधित करने से बचने के लिए सुई के साइड होल पर सीधे क्लिप न करें। इसके बजाय, इसके नीचे क्लिप करें।
- जिगर में दबाव निर्माण को रोकने के लिए तुरंत इन्फ्राहेपेटिक अवर वेना कावा (आईवीसी) काट लें। अब तक infrahepatic IVC और आसन्न रक्त वाहिकाओं पोर्टल नस से रक्त द्वारा अस्पष्ट हो जाएगा। यह सुनिश्चित करने के लिए कि आईवीसी को सही ढंग से काटा और काटा गया था, दालों में खून निकलने के लिए निरीक्षण करें; रक्त केवल आसन्न वाहिकाओं से बाहर निकल जाएगा।
नोट: कैनुलेशन के बाद इन्फ्राहेपेटिक आईवीसी को काटने के लिए बहुत लंबा समय लेना या अगले चरण पर जाने से पहले इसे काटने में विफलता हेपेटोसाइट मृत्यु का कारण बनेगी। जानवर को इस चरण के दौरान (आईवीसी के काटने के माध्यम से) द्वारा संज्ञाहरण के तहत euthanized किया जाता है। प्रक्रिया जारी रहनी चाहिए जबकि रक्त की कमी चल रही है। मृत्यु की पुष्टि दिल की धड़कन / श्वसन की समाप्ति के दृश्य अवलोकन द्वारा की जा सकती है जब छाती गुहा को बाद के चरण में खोला जाता है। - ~ 33 mL / मिनट की प्रवाह दर के लिए पंप की गति को 38 rpm तक बढ़ाएं। 2-3 s के लिए संदंश के साथ IVC को बंद करके तीन बार जिगर को फ्लश करें (लेकिन बहुत लंबे समय तक नहीं) और इसे फिर से खोलना।
नोट: फ्लशिंग के दौरान, सामान्य पर लौटने से पहले जिगर थोड़ा विस्तार करेगा। फ्लशिंग पूरे जिगर में परफ्यूसेट के पारगमन की सुविधा प्रदान करता है। फ्लशिंग के बाद, जिगर को पूरी तरह से हल्के भूरे रंग का होना चाहिए। - सुनिश्चित करें कि कैनुला टिप को उस बिंदु से पहले रखा जाता है जहां पोर्टल शिरा विभिन्न यकृत लोबों में शाखाएं, सभी जिगर लोबों के छिड़काव को सुनिश्चित करने के लिए। यदि आवश्यक हो, तो पोर्टल नस को अनलिप करें और कैनुला की स्थिति को समायोजित करें। इसके बाद फिर से क्लिप करें।
- पोर्टल नस के चारों ओर ढीले लिगचर को कसें, ब्रांचिंग बिंदु के थोड़ा ऊपर की ओर। तीन समुद्री मील बनाएं जहां नरम प्रवेशनी कठोर धातु सुई द्वारा समर्थित है, बेवल और साइड होल के बीच में। सुनिश्चित करें कि समुद्री मील स्थिति में कैनुला को ठीक करते हैं, इसे पोर्टल नस में सुरक्षित करते हैं, और बफर के बैकफ्लो को रोकते हैं।
- पूरे जिगर को बरकरार रखें।
- अगले 12 मिनट के लिए ~ 33 एमएल / मिनट की प्रवाह दर पर कैल्शियम मुक्त बफर के साथ जिगर को पारफ्यूज करें ( चित्रा 5 ए देखें)। इस बीच, जिगर लकीर प्रदर्शन करें। यदि आवश्यक हो तो परफ्यूजन समय बढ़ाया जा सकता है, लेकिन यह सुनिश्चित करें कि कैल्शियम-मुक्त बफर समाप्त न हो।
- घुमावदार कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करते हुए, ध्यान से मेसेंट्री को काटकर आंतों से पोर्टल नस को अलग करें जो उन्हें एक साथ जोड़ता है। यह सुनिश्चित करने के लिए कि कोई संदूषण नहीं होता है, गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट (एसोफैगस, पेट, और छोटी और बड़ी आंतों) को निक न करें।
नोट: यह जिगर लकीर के दौरान चारों ओर ले जाया जाता है जब फाड़ से पोर्टल नस को रोकने के लिए है। - संयोजी ऊतकों, अग्न्याशय और mesentery है कि जठरांत्र संबंधी मार्ग के लिए जिगर को जोड़ता है कि जठरांत्र संबंधी मार्ग से जोड़ता है काटने के द्वारा जठरांत्र संबंधी मार्ग से जिगर को अलग. अलग करने के लिए, हमेशा कैंची के साथ काटें और आंसू के लिए न खींचें। फिर से, जठरांत्र संबंधी मार्ग को निक या काट न करें।
- डायाफ्राम को उजागर करने के लिए धीरे से जिगर को फ्लिप करें। पसलियों की दीवारों के बाद डायाफ्राम काटें। सुनिश्चित करें कि अधिकांश डायाफ्राम जिगर से जुड़ा रहता है। सावधान रहें कि जिगर को प्रहार या चोट न पहुंचे।
- एक बार छाती गुहा खोलने के बाद, दो नलिकाओं को देखा जा सकता है: बाईं ओर सफेद सुप्राहेपेटिक आईवीसी, और दाईं ओर पीले रंग का अन्नप्रणाली। सुपरहेपेटिक आईवीसी क्लिप करें और क्लिप के ठीक ऊपर इसे काट दें। सुपरहेपेटिक आईवीसी को काटना वैकल्पिक है। यह छाती गुहा को बाढ़ आने से रोकता है।
नोट: नेत्रहीन दिल की धड़कन / श्वसन की समाप्ति के लिए पशु मृत्यु की पुष्टि करने के लिए निरीक्षण करें। - अन्नप्रणाली डायाफ्राम से घिरा हुआ है। डायाफ्राम से एसोफैगस को अलग करने के लिए, डायाफ्राम के माध्यम से दाईं ओर से घुटकी की ओर काटें। किसी भी शेष संयोजी ऊतकों को काटें जो अन्नप्रणाली और पेट को जिगर और डायाफ्राम से जोड़ते हैं।
- गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट को दाईं ओर धकेलें। suprahepatic IVC से नस क्लिप infrahepatic IVC करने के लिए स्थानांतरण; बफर अब suprahepatic IVC से बाहर perfuse जाएगा.
नोट: परफ्यूजन के दौरान, कैनुला और इन्फ्राहेपेटिक आईवीसी को जिगर द्वारा कवर किया जाएगा। Suprahepatic IVC से मजबूत बफर बहिर्वाह सर्जन को परफ्यूजन रिसाव को बाहर निकालने में मदद करेगा। - किसी भी शेष डायाफ्राम को काटें जो जिगर को छाती गुहा से जोड़ता है। जिगर को उदर गुहा से जोड़ने वाले ऊतकों को काट लें। जिगर से क्लिप को अलग करने से बचने के लिए क्लिप के ऊपर infrahepatic IVC को काटने के लिए सावधान रहें।
- यह सुनिश्चित करने के लिए कि जिगर पूरी तरह से उच्छेदित है, संदंश के साथ डायाफ्राम को पकड़कर सावधानीपूर्वक जिगर को उठाएं। यदि जिगर को उदर गुहा से जोड़ने वाले कोई शेष ऊतक हैं, तो उन्हें काट दें। यदि गुर्दे और प्लीहा अभी भी जिगर से जुड़े हुए हैं, तो उन्हें अलग करें।
4. जिगर परफ्यूजन और पाचन
- यदि लकीर जल्दी पूरी हो गई थी, तो तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि जिगर को 12 मिनट के लिए कैल्शियम मुक्त बफर के साथ परफ्यूज नहीं किया जाता है।
- कोलेजनेस बफर के लिए परफ्यूजन बफर परिवर्तित करें। कैल्शियम मुक्त बफर के लिए रोलर क्लैंप को पूरी तरह से कसने से पहले कोलेजेनेस बफर के लिए रोलर क्लैंप को पूरी तरह से ढीला करें ( चित्रा 5 बी देखें)। एक बार जब कोलेजनेस बफर टयूबिंग के माध्यम से जिगर तक पहुंच जाता है, तो 2-3 एस के लिए सुप्राहेपेटिक आईवीसी को बंद करके और इसे फिर से खोलकर जिगर को तीन बार फ्लश करें।
- ध्यान से कोलेजनेस बफर के recirculation के लिए बीकर के शीर्ष पर मंच के लिए जिगर ले जाएँ. कैथेटर का समर्थन करते समय संदंश के साथ डायाफ्राम पर पकड़कर जिगर को स्थानांतरित करें। आकस्मिक कैथेटर टुकड़ी को रोकने के लिए कैथेटर पर टगिंग से बचें।
नोट: यदि कैथेटर अलग हो जाता है और पोर्टल नस भी पुन: cannulation के लिए क्षतिग्रस्त है, suprahepatic IVC cannulate और पोर्टल नस से बाहर perfuse करने के लिए बफर की अनुमति दें। सुनिश्चित करें कि infrahepatic IVC clipped रहता है। - 12 मिनट के लिए जिगर को पचाएं। पारभासी धब्बों / नेटवर्क की उपस्थिति के लिए निरीक्षण करें क्योंकि जिगर अपनी चिकनी भूरे रंग की बनावट को खोना शुरू कर देता है। जिगर बड़ा और नरम हो जाएगा क्योंकि यह पच जाता है। एक बार जिगर एक mushy स्थिरता है, परफ्यूजन बंद करो. यदि आवश्यक हो तो पाचन समय बढ़ाया जा सकता है।
नोट: यदि ग्लिसन का कैप्सूल टूट गया है, तो बीकर में कोलेजेनेस बफर जिगर की कोशिकाओं से बचने के कारण बादल हो सकता है।
5. हेपेटोसाइट अलगाव
- ध्यान से पोर्टल नस को काट कर कैनुला को हटा दें। क्लिप को सावधानीपूर्वक निकालें. जिगर को 150 मिमी पकवान में स्थानांतरित करें जिसमें 60 मिलीलीटर ठंडा ड्यूलबेको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) शामिल हैं।
- धीरे से घुमावदार संदंश के पीछे का उपयोग करके जिगर को टैप करें और ग्लिसन के कैप्सूल को तोड़ने और छीलने के लिए। फिर, धीरे से जिगर की कोशिकाओं को जारी करने के लिए डीएमईएम में जिगर की ओर से साइड में लहराते हैं। ऐसा तब तक करना जारी रखें जब तक कि जिगर की कोशिकाओं को डीएमईएम में पूरी तरह से अलग नहीं किया जाता है।
नोट: कभी-कभी पूरे जिगर या कुछ लोब केवल आंशिक रूप से पच जाएंगे। जिगर को स्क्रैप न करके जो जबरन हटा देगा, और अविच्छिन्न हेपेटोसाइट्स को नुकसान पहुंचाएगा, एक उच्च और अधिक सुसंगत सेल व्यवहार्यता प्राप्त की जा सकती है। - धीरे से 150 मिमी पकवान रॉक जब तक जिगर कोशिकाओं DMEM में अच्छी तरह से वितरित कर रहे हैं. ऊतक के टुकड़े और सेल clumps को हटाने के लिए, एक नए 150 मिमी पकवान पर रखा एक 100 μm ताकना आकार नायलॉन जाल फिल्टर के माध्यम से सेल निलंबन डालो। DMEM के 30 mL के साथ पुराने पकवान कुल्ला और जाल फिल्टर के लिए निलंबन हस्तांतरण. जाल फिल्टर पर धीरे से नल के लिए फंसे हुए एकल जिगर कोशिकाओं के माध्यम से पारित करने की अनुमति देने के लिए.
- जाल फिल्टर निकालें और धीरे से नए 150 मिमी पकवान रॉक जब तक जिगर कोशिकाओं अच्छी तरह से वितरित कर रहे हैं. निलंबन को समान रूप से 4 x 50 एमएल ट्यूबों में विभाजित करें। डीएमईएम के 30 एमएल के साथ पकवान को कुल्ला करें और निलंबन को समान रूप से एक ही ट्यूब में विभाजित करें। सुनिश्चित करें कि प्रत्येक ट्यूब में सेल निलंबन की समान मात्रा है।
- 4 °C पर 2 मिनट के लिए 50 x g पर सेल निलंबन के 4 x 50 mL ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें। ध्यान से ढीले गोली परेशान किए बिना supernatant aspirate. supernatant को छोड़ दें। प्रत्येक ट्यूब में DMEM के 20 mL जोड़ें और धीरे से सेल गोली resuspend करने के लिए ट्यूबों रॉक. चार ट्यूबों से सेल निलंबन को दो में मिलाएं।
- 4 °C पर 2 मिनट के लिए 20 x g पर 2 x 50 mL ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें। एस्पिरेट करें और supernatant को छोड़ दें। प्रत्येक ट्यूब में DMEM के 20 mL जोड़ें और धीरे से सेल गोली resuspend करने के लिए ट्यूबों रॉक. एक में दो ट्यूबों से सेल निलंबन गठबंधन. उपयोग करने तक कोशिकाओं को बर्फ पर रखें।
- ट्रिपैन नीले रंग के 50 μL के साथ 1x PBS के 400 μL मिश्रण द्वारा trypan नीले समाधान तैयार करें। ट्राइपैन नीले समाधान में हेपेटोसाइट निलंबन के 50 μL जोड़ें। प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत हेमोसाइटोमीटर के साथ व्यवहार्य और मृत हेपेटोसाइट्स की संख्या की गणना करें।
6. हेपेटोसाइट संस्कृति
- हुड में सभी सेल संस्कृति चरणों का प्रदर्शन करें। एक 35 मिमी पकवान में 1 एमएल कोलेजन कोटिंग समाधान जोड़ें और 4 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। 1x PBS के साथ व्यंजन ों को तीन बार कुल्ला।
- हेपेटोसाइट संस्कृति माध्यम में 0.8 मिलियन कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता के लिए हेपेटोसाइट निलंबन को पतला करें। 35 मिमी पकवान में पतला हेपेटोसाइट निलंबन के 1 मिलीलीटर जोड़ें।
नोट: हेपेटोसाइट्स पिपेटिंग के दौरान कतरनी तनाव के प्रति संवेदनशील होते हैं। चौड़े बोर पिपेट युक्तियों का उपयोग करने पर विचार करें। - हेपेटोसाइट्स को समान रूप से वितरित करने के लिए पकवान को रॉक करें। हेपेटोसाइट्स को संलग्न करने की अनुमति देने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर 3-4 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
- सैंडविच संस्कृति के लिए।
- हेपेटोसाइट संस्कृति माध्यम निकालें। असंबद्ध कोशिकाओं को हटाने के लिए 1 एमएल हेपेटोसाइट संस्कृति माध्यम के साथ एक बार कुल्ला करें। कोलेजन ओवरले समाधान के 1 एमएल जोड़ें। समाधान में बुलबुले पेश करने से बचने के लिए पकवान की दीवारों पर कोलेजन ओवरले समाधान जोड़ें।
- कोलेजन जेलेशन की अनुमति देने के लिए रात भर के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट करें।
- ताजा हेपेटोसाइट संस्कृति माध्यम के 1 एमएल जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट करें।
- मोनोलेयर संस्कृति के लिए।
- चरण 6.3 के बाद, हेपेटोसाइट संस्कृति माध्यम को हटा दें। असंबद्ध कोशिकाओं को हटाने के लिए 1 एमएल हेपेटोसाइट संस्कृति माध्यम के साथ एक बार कुल्ला करें।
- ताजा हेपेटोसाइट संस्कृति माध्यम के 1 एमएल जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट करें।
- हेपेटोसाइट शुद्धता और हेपेटोसाइट-विशिष्ट मार्कर और कार्यात्मक assays के लिए immunostaining प्रदर्शन करके कार्य का आकलन करें जैसा कि पहले10,11 वर्णित है।
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Representative Results
एक सर्जन बता सकता है कि क्या जिगर परफ्यूजन कुछ चरणों के बाद परिणाम को देखकर सुचारू रूप से चल रहा है। पहला परिणाम कैनुलेशन पर देखा जा सकता है, इन्फ्राहेपेटिक आईवीसी को काटना, और परफ्यूजन प्रवाह दर को बहाल करना। जिगर को अपनी मात्रा को बनाए रखते हुए गहरे लाल से भूरे रंग में पूरी तरह से बदल जाना चाहिए था। यदि जिगर थोड़ा deflated लग रहा है और एक लाल रंग की टिंट या लाल रंग के धब्बे है, तो इसका मतलब है कि परफ्यूजन प्रवाह दर गलत तरीके से सेट किया गया था (बहुत कम), या पोर्टल नस सही ढंग से cannulated नहीं किया गया था। यदि जिगर न केवल भूरे रंग का हो जाता है, बल्कि फूला हुआ और कठोर हो जाता है, तो इसका मतलब है कि प्रवाह दर गलत तरीके से निर्धारित की गई थी (बहुत अधिक), या इन्फ्राहेपेटिक आईवीसी को ठीक से नहीं काटा गया था। यदि केवल कुछ लोब ों को अच्छी तरह से परफ्यूज नहीं किया जा रहा है, तो इसका मतलब है कि कैथेटर को बहुत गहरा डाला गया था और केवल पोर्टल नस की एक शाखा को पार कर रहा है। दूसरा परिणाम लकीर और infrahepatic IVC की कतरन के बाद देखा जा सकता है। यदि सुप्राहेपेटिक आईवीसी से बहिर्वाह धीमा और कमजोर है, तो इसका मतलब यह हो सकता है कि कैथेटर लकीर के दौरान अलग हो गया था, या यह कि इन्फ्राहेपेटिक आईवीसी को ठीक से नहीं काटा गया था। तीसरा परिणाम पाचन के दौरान देखा जा सकता है। भूरे रंग के जिगर पर, पारभासी धब्बे / नेटवर्क दिखाई देना चाहिए और बड़ा होना चाहिए। जिगर को अपनी वसंत स्थिरता खो देनी चाहिए और नरम और भावुक हो जाना चाहिए। हम अपने कोलेजनेस एकाग्रता को अनुकूलित करते हैं ताकि इस स्थिति को 12 मिनट के भीतर पहुंचा जा सके। कोलेजनेज के एक नए बहुत बाहर की कोशिश करते समय, पाचन समय को तब तक बढ़ाया जाना चाहिए जब तक कि इस स्थिति तक नहीं पहुंच जाता है। चौथा परिणाम तब देखा जा सकता है जब कोशिकाओं को जिगर से जारी किया जाता है। जब कोशिकाओं को जारी किया जाता है, तो मीडिया को बादल दिखना चाहिए। यदि बहुत अधिक दानेदार बनावट देखी जाती है, तो इसका मतलब यह हो सकता है कि जिगर अपर्याप्त रूप से पचा हुआ था। यदि पाचन पूरा हो जाता है, तो केवल सफेद वेब जैसे जहाजों को छोड़ दिया जाना चाहिए। यहां तक कि अगर पाचन आंशिक है (चित्रा 6), तब भी अच्छी कोशिकाओं को प्राप्त करना संभव है।
यहां वर्णित हमारा प्रोटोकॉल लगातार 200-300 ग्राम वजन वाले चूहों से प्रति अलगाव 5 × 108 हेपेटोसाइट्स तक की उच्च सेल उपज उत्पन्न करता है और 88% -94.8% के बीच सेल व्यवहार्यता के रूप में ट्रिपैन ब्लू काउंटिंग 12,13,14,15,16 (तालिका 2) द्वारा निर्धारित किया गया है। एल्ब्यूमिन के इम्युनोस्टेनिंग द्वारा निर्धारित हेपेटोसाइट शुद्धता 96.8 ± 2.0% 11 (चित्रा 7) थी। सैंडविच संस्कृति में हेपेटोसाइट्स ने अलग-अलग पित्त कैनालिकुली का गठन किया और इसमें अच्छा सेल-सेल संपर्क था (चित्रा 8)। हेपेटोसाइट्स में उच्च कार्यक्षमता होती है जैसा कि एल्बुमिन, यूरिया और सीवाईपी एसेस10 (तालिका 3) द्वारा दिखाया गया है।
चित्रा 1: आईपीएस का योजनाबद्ध आरेख। परफ्यूसेट परफ्यूसेट बैग या बोतल (1, 2) में शुरू होता है। दो प्रवाह नियामक (3, 4) परफ्यूसेट के मार्ग को नियंत्रित करने के लिए एक साथ काम करते हैं। Perfusate एक बुलबुला जाल (5) के लिए आगे बढ़ता है। बाद की प्रक्रियाओं को मुख्य प्रणाली के एलसीडी टच स्क्रीन (6) द्वारा नियंत्रित किया जाता है। परफुसेट को तब एक पेरिस्टाल्टिक पंप (7) द्वारा खींचा जाता है और एक सिलिकॉन जैकेट वाले इलेक्ट्रॉनिक हीटर (8) से गुजरता है, जो वांछित तापमान तक परफ्यूसेट को गर्म करता है। सिलिकॉन हीटर जैकेट (8) एक कनेक्टर (9) द्वारा मुख्य प्रणाली से जुड़ा हुआ है। जब आवश्यक हो, तो एक डिस्पोजेबल दबाव सेंसर (10) को मुख्य प्रणाली से कनेक्टर (11) द्वारा जोड़ा जा सकता है, ताकि परफ्यूजन दबाव के माप की अनुमति मिल सके। परफ्यूजेट तब एक परफ्यूजन मॉनिटर (12) से गुजरता है, जो परफ्यूसेट के तापमान को मापता है और बुलबुले की उपस्थिति का पता लगाता है। मॉनिटर यह भी निर्धारित कर सकता है कि परफ्यूसेट समाप्त हो गया है या नहीं। मॉनिटर रीडिंग को लोरा के माध्यम से मुख्य प्रणाली में प्रेषित किया जाता है। परफ्यूसेट तब एक बुलबुला फिल्टर (13) पर आगे बढ़ता है और पोर्टल शिरा प्रवेशनी (14) के माध्यम से जिगर में प्रवेश करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 5: प्राथमिक चूहे हेपेटोसाइट अलगाव के लिए दो-चरणीय कोलेजेनेस परफ्यूजन का योजनाबद्ध आरेख। (A) कैल्शियम-मुक्त बफर का परफ्यूजन। रोलर क्लैंप पूरी तरह से इनलेट 1 के लिए ढीला है और इनलेट 2 के लिए पूरी तरह से कस दिया गया है। (बी) कोलेजनेस बफर के साथ जिगर पाचन। उच्छेदित जिगर को बफर परिसंचरण की अनुमति देने के लिए बीकर के शीर्ष पर स्थानांतरित किया जाता है। रोलर क्लैंप पूरी तरह से इनलेट 2 के लिए ढीला है और इनलेट 1 के लिए पूरी तरह से कस दिया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 6: कोलेजनेस पाचन और हेपेटोसाइट अलगाव के बाद जिगर। दिखाया गया एक आंशिक रूप से पचा हुआ जिगर लोब है। जिगर के बिना पचे हुए हिस्से भूरे रंग के बने हुए थे। जिगर के पचे हुए हिस्सों में, केवल सफेद वाहिकाओं को पीछे छोड़ दिया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 7: हेपेटोसाइट शुद्धता के परिमाणीकरण के लिए हेपेटोसाइटिक मार्कर का इम्युनोस्टेनिंग। (ए) अशुद्ध जिगर सेल निलंबन की सैंडविच संस्कृति (विभेदक सेंट्रीफ्यूजेशन से पहले; बाएं) और शुद्ध हेपेटोसाइट निलंबन (विभेदक सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद; दाएं) कम सेल घनत्व पर बीज। (बी) प्रतिनिधि छवियां डीएपीआई (नाभिक; नीले) और एल्ब्यूमिन (हेपेटोसाइट-विशिष्ट मार्कर; हरे) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ दाग वाली कोशिकाओं को दिखाती हैं। (ग) हेपेटोसाइट शुद्धता का परिमाणीकरण। शुद्धता को डीएपीआई परमाणु धुंधला द्वारा विज़ुअलाइज़ किए गए कुल सेल नंबर के संबंध में एल्ब्यूमिन सकारात्मक फ्लोरोसेंट दाग कोशिकाओं की गिनती करके निर्धारित किया गया था। झूठे रंगों में छवियों को दिखाया गया था। एल्बुमिन (हरा), एल्ब्यूमिन (नीले) के साथ कोशिकाओं का नाभिक, एल्ब्यूमिन (लाल) के बिना कोशिकाओं का नाभिक। स्केल बार 100 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।
चित्रा 8: दिन 3 पर सैंडविच संस्कृति में दो-चरणीय कोलेजेनेस परफ्यूजन से अलग-थलग प्राथमिक चूहे हेपेटोसाइट्स की चरण विपरीत छवि। स्केल बार 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।
| बफ़र्स/मीडिया का नाम | अंतिम एकाग्रता | राशि | टिप्पणियाँ/विवरण |
| हेपेटोसाइट संस्कृति मीडिया | |||
| विलियम के ई मीडिया | 500 mL | विलियम के ई मीडिया में सभी अभिकर्मकों को जोड़ें। 0.22 μm फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। | |
| BSA | 1 mg/mL | 0.5 ग्राम | |
| पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (100X) | 1X | 5 mL | |
| इंसुलिन (20 मिलीग्राम / मिलीलीटर) | 0.5 μg/mL | 12.5 μL | |
| डेक्सामेथासोन (1 mM) | 100 nM | 50 μL | |
| लिनोलिक एसिड (7.5 μg / mL) | 50 ng/mL | 3.33 μL | |
| ग्लूटामैक्स (100X) | 1X | 5 mL | |
| कोलेजेनेस बफर | |||
| NaCl | 0.100 ग्राम | अल्ट्राप्योर पानी के 380 मिलीलीटर में भंग करें। पीएच 7.49 - NaOH के साथ 7.51 को समायोजित करें। अल्ट्राप्योर पानी के साथ 400 मिलीलीटर तक ऊपर। 0.22 μm फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। | |
| KCl | 0.789 ग्राम | ||
| कोलेजनेस प्रकार IV | 80 - 200 U/mL | ||
| CaCl2·2H2O | 0.140 ग्राम | ||
| HEPES | 4.800 ग्राम | ||
| कैल्शियम मुक्त बफर | |||
| KH2PO4 | 0.0815 ग्राम | अल्ट्राप्योर पानी के 900 मिलीलीटर में भंग करें। HCl के साथ पीएच 7.49-7.51 को समायोजित करें। अल्ट्राप्योर पानी के साथ 1 एल तक टॉप करें। 0.22 μm फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें. | |
| NaHCO3 | 1.0500 ग्राम | ||
| NaCl | 3.4480 ग्राम | ||
| KCl | 0.1750 ग्राम | ||
| सेल अलगाव के लिए DMEM | |||
| DMEM | 1 सैशे | अल्ट्राप्योर पानी के साथ 1 एल तक ऊपर। 0.22 μm फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। | |
| NaHCO3 | 1.5 ग्राम | ||
| पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (100X) | 1X | 10 mL | |
| कोलेजन ओवरले (1 मिलीलीटर) | |||
| 0.1 M NaOH | 1 भाग | 20.8 μL | ताजा तैयार करें। कोलेजन पिछले जोड़ें. |
| 10X PBS | 1 भाग | 20.8 μL | |
| 1X PBS | 6 भाग | 125 μL | |
| हेपेटोसाइट संस्कृति मीडिया | 32 भागों | 667 μL | |
| प्रकार मैं गोजातीय कोलेजन | 8 भाग | 167 μL | |
| कोलेजन कोटिंग समाधान (1 मिलीलीटर) | |||
| प्रकार मैं गोजातीय कोलेजन | 1 भाग | 0.5 mL | ताजा तैयार करें। |
| 0.01 N HCl | 1 भाग | 0.5 mL | |
तालिका 1: बफ़र्स और समाधान के लिए व्यंजनों.
| हेपेटोसाइट व्यवहार्यता (%) | हेपेटोसाइट उपज (x 108 कोशिकाएं) | व्यवहार्य हेपेटोसाइट उपज (x 108 कोशिकाओं) |
| 91.4 ± 3.4 | 4.39 ± 1.58 | 4.04 ± 1.48 |
तालिका 2: सेल व्यवहार्यता और उपज। 18 विभिन्न प्रयोगों से एसडी ± मान दिखाए गए हैं।
| यूरिया (μg / million cells / day) | एल्ब्यूमिन (μg / million cells / day) | CYP1A2 गतिविधि (μg / मिलियन कोशिकाओं / दिन) | CYP2B1/2 गतिविधि (μg/million cells/day) | CYP3B2 गतिविधि (μg / मिलियन कोशिकाओं / दिन) | |
| दिन 1 | 124 ± 2.6 | 39.0 ± 3.6 | |||
| दिन 3 | 65.7 ± 3.8 | 516.0 ± 95.1 | 2249 ± 56 | 188 ± 49 | 93.7 ± 0.6 |
तालिका 3: सैंडविच संस्कृति में अलग-थलग प्राथमिक चूहा हेपेटोसाइट के कार्यात्मक स्तर। यूरिया, एल्बुमिन, CYP1A2, CYP2B1/2, और CYP3B2 assays के एसडी ± मूल्यों को तीन अलग-अलग प्रयोगों से दिखाया गया है।
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Discussion
कुछ बिंदु हैं जो सामान्य रूप से दो-चरणीय कोलेजेनेस परफ्यूजन प्रक्रिया के लिए विशेष रूप से निरीक्षण करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। सबसे पहले, जिगर को उच्छेदन करते समय विशेष देखभाल की जानी चाहिए। सुनिश्चित करें कि जठरांत्र संबंधी मार्ग क्षतिग्रस्त नहीं है क्योंकि सामग्री के रिसाव के परिणामस्वरूप जीवाणु संदूषण होगा। इसके अलावा, ग्लिसन के कैप्सूल को नुकसान पहुंचाने से बचें, जो पशु प्रक्रिया के दौरान जिगर की सतह को कवर करता है। यदि आंसू काफी बड़ा है, तो यह कोलेजेनेस बफर में असंबद्ध हेपेटोसाइट्स की समय से पहले रिहाई की अनुमति दे सकता है। दूसरे, अच्छी हेपेटोसाइट व्यवहार्यता सुनिश्चित करते हुए जिगर को पचाने के लिए कोलेजनेस की क्षमता बहुत संख्या में भिन्न हो सकती है। उपयोग किए जाने वाले कोलेजेनेज की मात्रा को कोलेजेनेस5 के हर नए लॉट के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। यह सलाह दी जाती है कि कुछ बहुत सारे कोलेजेनेस का परीक्षण करें और थोक में खरीदने से पहले सबसे अच्छा बहुत कुछ चुनें। सुनिश्चित करें कि पानी अल्ट्राप्योर है, और पीएच सही है। फेरस और फेरिक आयनों जैसे पानी में अशुद्धियां और गलत पीएच कोलेजेनेस गतिविधि को प्रभावित कर सकती हैं, जो तब अलग-थलग कोशिकाओं की गुणवत्ता को काफी प्रभावित करेगी। यद्यपि इस प्रोटोकॉल में कोलेजेनेस बफर पुनर्संचरण वैकल्पिक हो सकता है, यह उचित नहीं है क्योंकि कोलेजनेज बफर की मात्रा की आवश्यकता >400 मिलीलीटर तक बढ़ जाएगी। अंत में, परफ्यूजन दबाव और प्रवाह दर एक उपयुक्त सीमा में होनी चाहिए। उच्च दबाव और प्रवाह दर यकृत कोशिका मृत्यु का कारण बनेगी जबकि कम दबाव और प्रवाह दर के परिणामस्वरूप छोटे जहाजों के माध्यम से अपर्याप्त बफर प्रवाहहोगा। कैल्शियम मुक्त बफर परफ्यूजन के दौरान, दबाव शुरू में बढ़ जाएगा। हालांकि, कोलेजनेस बफर परफ्यूजन पर, दबाव तब धीरे-धीरे समय के साथ गिर जाएगा क्योंकि कोलेजेनेस द्वारा पाचन प्रवाह प्रतिरोध को कम कर देता है। यदि दबाव में गिरावट नहीं देखी गई थी, तो पाचन समय को आवश्यकतानुसार बढ़ाया जा सकता है। चूंकि आईपीएस में वैकल्पिक दबाव सेंसर है, इसलिए दबाव विविधताओं की क्षतिपूर्ति करने के लिए परफ्यूसेट की प्रवाह दर को अलग करना संभव है। एक अन्य नोट पर, हालांकि एक ऑक्सीजनेटर के साथ सर्किट को फ्लश करने का उपयोग कुछ प्रोटोकॉल 2,5 में किया गया था, हमने पाया कि यह हेपेटोसाइट व्यवहार्यता और उपज के लिए महत्वपूर्ण नहीं था। इस प्रकार, हमारे डिवाइस में एक ऑक्सीजनेटर शामिल नहीं है।
लकीर से पहले जिगर पाचन के सामान्य अभ्यास के विपरीत, इस प्रोटोकॉल में पाचन से पहले जिगर की लकीर शामिल है। इस प्रोटोकॉल में दृष्टिकोण सामान्य अभ्यास की तुलना में कई फायदे रखता है। सबसे पहले, जिगर के अति-पाचन से बचा जा सकता है। सर्जन के कौशल के आधार पर, जिगर की लकीर 5-10 मिनट से कहीं भी ले सकती है। आम अभ्यास के बाद, भले ही परफ्यूजन को रोक दिया गया है, यह अभी भी एक अतिरिक्त 5-10 मिनट के बराबर है जहां जिगर कोलेजेनेस के संपर्क में है। अधिक पाचन सेल व्यवहार्यता को कम कर सकता है और हेपेटोसाइट लगाव और कार्य को कम कर सकता है। दूसरे, यह दृष्टिकोण संभावित रूप से हेपेटोसाइट हानि को कम कर सकता है। ग्लिसन के कैप्सूल को फाड़ने की संभावना कम होती है जब जिगर अभी भी पाचन से पहले वसंत होता है, जब यह पाचन के बाद नरम और चिकना होता है। अंत में, पाचन से पहले जिगर की लकीर कोलेजनेस परिसंचरण की संभावना को सक्षम बनाती है। कोलेजेनेज पुन: परिसंचरण तैयार किए जा रहे कोलेजनेज की अपर्याप्त मात्रा के कारण असफल अलगाव की घटना को समाप्त करता है। हमारा दृष्टिकोण पाचन समय को बढ़ाने की अनुमति देता है, जैसा कि आवश्यक हो। यह भी अलगाव प्रति कोलेजन की मात्रा को कम करने का एक मामूली लाभ है। इस दृष्टिकोण का मुख्य नुकसान यह है कि यह परफ्यूजन के दौरान कैथेटर टुकड़ी की एक नई समस्या का परिचय देता है, लेकिन जिसे कुछ तकनीकी सावधानियों के साथ संबोधित किया जा सकता है। एक और अंतर यह है कि इस प्रोटोकॉल में घनत्व ग्रेडिएंट जैसे परकोल का उपयोग शामिल नहीं है। मृत कोशिकाओं को हटाकर, Percoll को 20% -50% 16 से उपज के कुछ नुकसान के साथ कोशिकाओं की अंतिम व्यवहार्यता को बढ़ाने की सूचना दी गई है। हमारी सेल व्यवहार्यता उच्च है क्योंकि हम परीक्षण करते हैं और कोलेजनेस लॉट का चयन करते हैं। हमारे अनुभव से, कुछ कोलेजनेस बहुत से लगातार कम व्यवहार्यता देते हैं। घनत्व centrifugation के बिना, यह पूर्व परीक्षण के माध्यम से बुरा कोलेजनेस बहुत से बचने के लिए आवश्यक हो जाएगा। उन लोगों के लिए जिनके पास ऐसी स्वतंत्रता नहीं है और घनत्व ढाल पर विचार करना चाहिए, परकोल कमजोर पड़ने के दौरान देखभाल की जानी चाहिए ताकि थोड़ा अलग चयापचय प्रोफ़ाइल17,18 के साथ हेपेटोसाइट उप-आबादी के चयन से बचा जा सके।
प्राथमिक चूहे हेपेटोसाइट अलगाव के लिए एक आईपीएस का उपयोग करने में हमारा दृष्टिकोण मौजूदा परफ्यूजन सेटअप 1,2,5,6,7,8,9 के साथ कई मुद्दों को हल करता है। डिस्पोजेबल बाँझ टयूबिंग का उपयोग प्रत्येक अलगाव से पहले और बाद में परफ्यूजन ट्यूबिंग को साफ और कीटाणुरहित करने की आवश्यकता को हटाकर समय बचाता है। यह आग के खतरे को कम करता है क्योंकि परफ्यूजन ट्यूबिंग को ज्वलनशील 70% इथेनॉल से भरने की आवश्यकता नहीं होती है जब बाँझपन बनाए रखने के लिए उपयोग में नहीं होता है। अनुचित कीटाणुशोधन और भंडारण के कारण संदूषण के जोखिम को भी समाप्त किया जा सकता है। सबसे महत्वपूर्ण बात, पुराने टयूबिंग के नियमित प्रतिस्थापन की आवश्यकता को दरकिनार किया जा सकता है; यह प्रक्रिया आवश्यक है लेकिन अक्सर जटिल और समय लेने वाली होती है। कैथेटर के पास टयूबिंग के लिए एक बुलबुला फिल्टर के अलावा कैथेटर तक पहुंचने से पहले बुलबुले को भागने की अनुमति देता है और हवा को पार करने से रोकता है जब परफ्यूजन बफर समाप्त हो जाता है। तापमान नियंत्रण प्रणाली के रूप में एक सिलिकॉन हीटर जैकेट का उपयोग पाचन के दौरान परफ्यूसेट तापमान के सटीक और स्थिर रखरखाव की अनुमति देता है, इसके विपरीत पूर्व-गर्म बफर जो समय के साथ काफी ठंडा हो जाएगा। इसके अलावा, सिलिकॉन हीटर जैकेट कॉम्पैक्ट है और इसे आसानी से बनाए रखा जा सकता है, एक ग्लास जैकेट के विपरीत एक पानी स्नान परिसंचरणक के लिए युग्मित। तापमान और दबाव के लिए निगरानी सेंसर का उपयोग अलगाव से पहले अनुकूलन चरण को प्रतिस्थापित करता है। प्रयोगों के दौरान या उनके बीच तापमान भिन्नता हो सकती है। दबाव (और इस प्रकार प्रवाह दर) परफ्यूजन टयूबिंग के साथ मुद्दों के कारण भी बदल सकता है। कैनुला के पास सेंसर का प्लेसमेंट जिगर में बफर परफ्यूजिंग के तापमान के अधिक सटीक पढ़ने की अनुमति देता है। सेंसर अलार्म उपयोगकर्ता को सुधारात्मक कार्रवाई करने के लिए याद दिला सकते हैं। रिकॉर्ड किया गया लॉग भी समस्या निवारण के लिए अनुमति देता है। कैनुलेशन के लिए एक विशेष IV कैथेटर का उपयोग पोर्टल शिरा के कैनुलेशन को सरल बनाता है। अन्य प्रकार के IV कैथेटर के विपरीत, यहां वर्णित कैथेटर सुई के किनारे पर एक छेद के कारण अपने पंक्चरिंग और वापस ली गई सुई की स्थिति दोनों में कैनुला और टयूबिंग के बीच द्रव संचार की अनुमति देता है। इस प्रकार, सर्जन सफल कैनुलेशन के संकेत के रूप में जिगर के रंग परिवर्तन का उपयोग कर सकते हैं। सफल कैनुलेशन पर, पोर्टल नस के पुन: भेदी को रोकने के लिए कैथेटर टिप के पीछे सुई की नोक को वापस लिया जा सकता है। वापस ली गई सुई भी लिगचर के लिए एक नींव के रूप में कार्य कर सकती है ताकि पोर्टल शिरा को नरम प्रवेशनी पर सुरक्षित किया जा सके और इसे विकृत होने से रोका जा सके। इस कैथेटर को एक हाथ से संचालित किया जा सकता है; इसलिए, गैर-प्रमुख हाथ का उपयोग संदंश के साथ पोर्टल शिरा का समर्थन करने के लिए किया जा सकता है। कॉम्पैक्ट एकीकृत डिजाइन पूरे परफ्यूजन डिवाइस को लैमिनर हुड में डालने की अनुमति देता है, संदूषण के जोखिम को कम करता है, और अंतरिक्ष की बचत करता है। यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है यदि पशु प्रक्रिया को एक समर्पित पशु सुविधा में किया जाना है जहां अंतरिक्ष की उपलब्धता एक चुनौती हो सकती है।
दो-चरणीय कोलेजेनेस परफ्यूजन प्रक्रिया1 का उपयोग करके पहले से रिपोर्ट किए गए चूहे हेपेटोसाइट अलगाव प्रोटोकॉल की तुलना में, वर्णित स्थितियां लगातार प्रति अलगाव 5 x 10 8 हेपेटोसाइट्स तक की उच्च सेल उपज उत्पन्न करती हैं,88 % -94.8% के बीच सेल व्यवहार्यता और अच्छे हेपेटोसाइट-विशिष्ट कार्य।
इस प्रोटोकॉल का उपयोग एक ही चूहे से अन्य गैर-पैरेन्काइमल यकृत कोशिकाओं जैसे कुप्फर कोशिकाओं, यकृत एंडोथेलियल कोशिकाओं और यकृत ताराकार कोशिकाओं को अलग करने के लिए समवर्ती रूप से किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल को कैनुलेशन के लिए एक छोटे गेज IV कैथेटर का उपयोग करके चूहों से जिगर की कोशिकाओं के अलगाव के लिए भी संशोधित किया जा सकता है और माउस प्रजातियों के लिए उपयुक्त सीमा तक परफ्यूजन प्रवाह दर को कम कियाजा सकता है। चूहों के लिए परफ्यूजन प्रक्रिया को पाचन के बाद जिगर को उच्छेदन करके सरल बनाया जा सकता है।
इस प्रयोग में उपयोग किए जाने वाले आईपीएस डिवाइस का उपयोग पूर्व विवो लिवर परफ्यूजन एप्लिकेशन के लिए भी किया जा सकता है जैसे कि यकृत प्रत्यारोपण पर प्रयोगों के साथ-साथ कृंतक और त्याग दिए गए मानव जिगर के डीसेल्युलराइजेशन19,20। आईपीएस के पास एक लाभ है जहां जिगर को लंबे समय तक परफ्यूज किया जाना चाहिए क्योंकि आईपीएस वास्तविक समय में परफ्यूजन की स्थिति की निगरानी कर सकता है और रिमोट कंट्रोल द्वारा स्वचालित रूप से या मैन्युअल रूप से पूरा होने पर परफ्यूजन को बंद करने की अनुमति दे सकता है।
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Disclosures
झोउ यान और हैरी यू प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा करते हैं क्योंकि वे वासिनफ्यूज में इक्विटी रखते हैं, जो एकीकृत परफ्यूजन सिस्टम का निर्माण और विपणन करता है। Hanry यू Histoindex, Invitrocue, Osteopore, Pishon Biomedical, Ants Innovate, और Synally Futuristech में इक्विटी रखता है जो यहां रिपोर्ट की गई जानकारी के साथ कोई प्रतिस्पर्धी हित नहीं रखते हैं।
Acknowledgments
यह काम MOE ARC (MOE2017-T2-1-149) द्वारा भाग में समर्थित है; NUHS इनोवेशन बीज अनुदान 2017 (NUHSRO/ 2017/051/InnovSeed/02); सिंगापुर के Mechanobiology संस्थान (R-714-106-004-135); और बायोइंजीनियरिंग और नैनो टेक्नोलॉजी संस्थान, बायोमेडिकल रिसर्च काउंसिल, विज्ञान, प्रौद्योगिकी और अनुसंधान एजेंसी (ए * स्टार) (परियोजना संख्या IAF-PP H18/01/a0/014, IAF-PP H18/01/a0/K14 और MedCaP-LOA-18-02) हैनी यू को वित्त पोषण। एनजी चैन वे सिंगापुर के राष्ट्रीय विश्वविद्यालय के एक शोध विद्वान हैं। हम हेपेटोसाइट शुद्धता विश्लेषण में मदद और सलाह के लिए सिंगापुर के राष्ट्रीय विश्वविद्यालय की कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी यूनिट और फ्लो साइटोमेट्री यूनिट को धन्यवाद देना चाहते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material/Equipment | |||
| 1 mL syringe | Nipro | ||
| 27G needle | Nipro | ||
| Black braided silk non-absorbable, non-sterile surgical suture | Look | SP117 | |
| Bochem 18/10 stainless steel forceps, sharp tip contain bent round tip | Bochem | 10333511 | |
| Disposable Perfusion Set | Vasinfuse | BPF-112 | |
| Floating circular 1.5 mL microcentrifuge tube rack | Sigma-Aldrich | R3133 | |
| German Standard Tissue Forceps, Serrated / 1×2 teeth , 14.5cm | Walentech | ||
| Greiner Cellstar aspirating pipette | Merck | GN710183 | |
| Haemocytometer | |||
| Integrated Perfusion System | Vasinfuse | IPS-001 | |
| Iris Scissors curved, stainless, 11cm | Optimal Medical Products Pte Ltd | CVD | |
| Light microscope with 10X lens | Olympus | ||
| Mesh Sheet 100µM Nylon | Spectra-Teknic(s) Pte Ltd | 06630-75 | |
| Operating Scissors, BL/BL, 13cm | Optimal Medical Products Pte Ltd | STR – BL/BL | |
| Operating Scissors, SH/BL, 13cm | Optimal Medical Products Pte Ltd | STR – SH/BL | |
| Reverse force hemostatic clip | Shanghai Jin Zhong Pte Ltd | XEC230 | |
| Water bath | Grant | ||
| Reagents/Chemicals | |||
| 10X Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | ||
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9056 | |
| CaCl2·2H2O | Merck | 137101 | |
| Collagenase Type IV | Gibco | 17104019 | |
| Dexamethasone | TCI | D1961 | |
| DMEM | Gibco | 31600-034 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| HEPES | Invitrogen | 11344-041 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | 1-9278 | |
| KCl | VWR | VWRC26764.298 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Linoleic acid | Sigma-Aldrich | L9530 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S8875 | |
| NaOH | Merck | 106462 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Type I bovine collagen | Advanced BioMatrix | 5005-100ml | |
| William’s E Media | Sigma-Aldrich | W1878 |
References
- Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q. H., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3917 (2012).
- Cabral, F., et al. Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).
- Green, C. J., et al. The isolation of primary hepatocytes from human tissue: optimising the use of small non-encapsulated liver resection surplus. Cell and Tissue Banking. 18 (4), 597-604 (2017).
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).
- Gopalakrishnan, S., Harris, E. N. In vivo liver endocytosis followed by purification of liver cells by liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3138 (2011).
- Wen, J. W., Olsen, A. L., Perepelyuk, M., Wells, R. G. Isolation of rat portal fibroblasts by in situ liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3669 (2012).
- Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60501 (2019).
- Shi, W., et al. Isolation and purification of immune cells from the liver. International Immunopharmacology. 85 (95), 106632 (2020).
- Salem, E. S. B., et al. Isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive L-azidohomoalanine labeling method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58323 (2018).
- Xia, L., et al. Tethered spheroids as an in vitro hepatocyte model for drug safety screening. Biomaterials. 33 (7), 2165-2176 (2012).
- Kegel, V., et al. Protocol for isolation of primary human hepatocytes and corresponding major populations of non-parenchymal liver cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53069 (2016).
- Zhu, L., et al. A vertical-flow bioreactor array compacts hepatocytes for enhanced polarity and functions. Lab on a Chip. 16 (20), 3898-3908 (2016).
- Du, Y., et al. Synthetic sandwich culture of 3D hepatocyte monolayer. Biomaterials. 29 (3), 290-301 (2008).
- Tong, W. H., et al. Constrained spheroids for prolonged hepatocyte culture. Biomaterials. 80, 106-120 (2016).
- Xia, L., et al. Laminar-flow immediate-overlay hepatocyte sandwich perfusion system for drug hepatotoxicity testing. Biomaterials. 30 (30), 5927-5936 (2009).
- Gupta, K., et al. Bile canaliculi contract autonomously by releasing calcium into hepatocytes via mechanosensitive calcium channel. Biomaterials. 259, 120283 (2020).
- Horner, R., et al. Impact of Percoll purification on isolation of primary human hepatocytes. Scientific Reports. 9 (1), 6542 (2019).
- Osypiw, J. C., et al. Subpopulations of rat hepatocytes separated by Percoll density-gradient centrifugation show characteristics consistent with different acinar locations. The Biochemical Journal. 304, Pt 2 617-624 (1994).
- Beal, E. W., et al. A small animal model of ex vivo normothermic liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57541 (2018).
- Hillebrandt, K., et al. Procedure for decellularization of rat livers in an oscillating-pressure perfusion device. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (102), e53029 (2015).
