Summary
Med hjälp av en självorganiserande metod utvecklar vi ett protokoll med tillägg av COCO som avsevärt kan öka genereringen av fotoreceptorer.
Abstract
Retinalcellstransplantation är ett lovande terapeutiskt tillvägagångssätt som kan återställa retinalarkitekturen och stabilisera eller till och med förbättra de visuella egenskaperna hos den degenererade näthinnan. Icke desto mindre står framsteg inom cellersättningsterapi för närvarande inför utmaningarna att kräva en färdig källa av högkvalitativa och standardiserade mänskliga näthinnor. Därför behövs ett enkelt och stabilt protokoll för experimenten. Här utvecklar vi ett optimerat protokoll, baserat på en självorganiserande metod med användning av exogena molekyler och reagens A samt manuell excision för att generera de tredimensionella mänskliga näthinneorganoiderna (RO). De humana pluripotenta stamcellerna (PSC) -härledda RO uttrycker specifika markörer för fotoreceptorer. Med tillsats av COCO, en multifunktionell antagonist, ökar differentieringseffektiviteten hos fotoreceptorprekursorer och kottar avsevärt. Den effektiva användningen av detta system, som har fördelarna med cellinjer och primära celler, och utan de inköpsproblem som är förknippade med det senare, kan producera sammanflytande retinala celler, särskilt fotoreceptorer. Differentieringen av privata säkerhetsföretag till RO ger således en optimal och biorelevant plattform för sjukdomsmodellering, läkemedelsscreening och celltransplantation.
Introduction
Pluripotenta stamceller (PSC) kännetecknas av deras självförnyelse och förmåga att differentiera till alla typer av somatiska celler. Således har organoider som härrör från PSC blivit en viktig resurs i regenerativ medicinforskning. Retinal degeneration kännetecknas av förlust av fotoreceptorer (stavar och kottar) och retinal pigmentepitel. Retinal cellbyte kan vara en uppmuntrande behandling för denna sjukdom. Det är dock inte möjligt att få mänskliga näthinnor för sjukdomsforskning och terapi. Därför är retinala organoider (ROs) härledda från PSC, som effektivt och framgångsrikt rekapitulerar flerskiktiga infödda retinala celler, fördelaktiga för grundläggande och translationell forskning 1,2,3. Vår forskning fokuserar på RO-differentiering för att ge tillräckliga och kvalitetsceller för att studera retinal degeneration4.
Metoder för att differentiera ROs växer kontinuerligt fram, med tredimensionell (3D) suspensionsdifferentiering som var banbrytande av Sasai-laboratoriet 20125. Vi introducerade CRX-tdTomato-taggen i de mänskliga embryonala stamcellerna (hESC) för att specifikt spåra fotoreceptorprekursorcellerna och modifierade metoden med tillägg av COCO, en multifunktionell antagonist för Wnt-, TGF-β- och BMP-vägarna6. COCO har visat sig effektivt förbättra differentieringseffektiviteten hos fotoreceptorprekursorer och kottar 6,7.
Sammantaget har vi, genom att modifiera den klassiska differentieringsmetoden, utvecklat ett tillgängligt protokoll för att skörda rikliga fotoreceptorprekursorer och kottar från mänskliga ROs för att analysera näthinnesjukdomen associerad med fotoreceptorerna genom laboratorieundersökningar och för ytterligare klinisk tillämpning / transplantation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna studie godkändes av den institutionella etikkommittén vid Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University. H9 hESC erhölls från WiCell Research Institute och genetiskt konstruerades till tdTomato-taggad cellinje.
1. Generering av mänskliga ROs
- Odla hESC under matarfria förhållanden.
- Täck en brunn på en 6-brunnsplatta med 1 ml 0,1 mg/ml reagens A (materialtabell) vid 37 °C i minst en halvtimme enligt tillverkarens anvisningar. Tina en alikvot på 1x106 hESC.
OBS: Bered 3 ml förvärmt reagens B (materialtabell) och överför de kryokonserverade cellerna (1 ml) till 3 ml färskt medium. Pipettera inte hESC: erna till enstaka celler. - Centrifugera vid 200 x g i 5 minuter och ta bort supernatanten.
- Frö cellerna i reagenset A-belagd platta med 2 ml reagens B och byt 2 ml reagens B dagligen. Passageceller när de når cirka 80% sammanflöde (vanligtvis cirka 4 dagar).
- Täck en brunn på en 6-brunnsplatta med 1 ml 0,1 mg/ml reagens A (materialtabell) vid 37 °C i minst en halvtimme enligt tillverkarens anvisningar. Tina en alikvot på 1x106 hESC.
- Dag 0
- Dissociera hESC med en encellssuspension med hjälp av medium I (tabell 1). Förbered medium I genom att blanda följande: 20% (v / v) KnockOut serumersättning (KSR), 0,1 mM MEM icke-essentiell aminosyralösning (NEAA), 1 mM pyruvat, 3 μM IWR-1-endo (IWR1e), 30 ng / ml COCO, 100 U / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin (PS), 0,1 mM β-merkaptoetanol och Glasgows Eagles minimala väsentliga medium (GMEM).
OBS: Innan dissociationen börjar, förbered medium I och överför 12 ml medium I med 20 μM Y-27632 till en 10 cm petriskål, 500 μL reagens C (materialtabell) innehållande 0,05 mg / ml reagens D (materialtabell) och 20 μM Y-27632 i ett 1,5 ml rör. Utför ovanstående steg i mörkret, eftersom komponent IWR1e i medium I är ljuskänslig. - Tvätta hESC: erna med förvärmd 1x Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS) buffert.
- Tillsätt det beredda 500 μl-reagensröret (i 1,5 ml) och inkubera hESC:erna i 3,5 minuter vid 37 °C och 5 %CO2.
- Lossa cellerna genom att knäppa sidan och botten av plattan i några sekunder och tillsätt 500 μL berett medium I från petriskålen i hESC-plattan.
OBS: Förbered ett 1,5 ml rör med 900 μL 1x DPBS och använd en hemocytometer för cellräkning. - Skörda cellerna i ett nytt 1,5 ml rör och pipettera cellsuspensionen upp och ner och ta sedan ut 100 μL från röret och tillsätt sedan i röret med 900 μL DPBS för cellräkning.
- Sprid den vänstra 900 μl cellsuspensionen och späd sedan cellerna med beredd medium I i petriskålen till 9 x 104 celler/ml.
OBS: Hela volymen av mediet är 12 ml; 1,08 x 106 celler behövs totalt. - Tillsätt 100 μL cellsuspension till varje brunn i en icke-vidhäftande, V-botten, 96-brunnsplatta (materialtabell).
OBS: Använd en flerkanalig pipett för att förkorta tiden och se till att varje brunn innehåller ett motsvarande cellnummer. Skaka petriskålen varje gång innan du tar bort 100 μl portioner. Det är viktigt att cellerna är jämnt fördelade. - Snurra lätt ner 96-brunnsplattan i en låghastighetsskakare i 5 minuter och inkubera sedan vid 37 ° C och 5% CO2.
OBS: Håll plattan mörk. Ställ in dagen som dag 0.
- Dissociera hESC med en encellssuspension med hjälp av medium I (tabell 1). Förbered medium I genom att blanda följande: 20% (v / v) KnockOut serumersättning (KSR), 0,1 mM MEM icke-essentiell aminosyralösning (NEAA), 1 mM pyruvat, 3 μM IWR-1-endo (IWR1e), 30 ng / ml COCO, 100 U / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin (PS), 0,1 mM β-merkaptoetanol och Glasgows Eagles minimala väsentliga medium (GMEM).
- Dag 2
- Tillsätt 1% reagens A (materialtabell). Bered reagens A (proteinkoncentration på 10 mg/ml) genom att tillsätta 133,4 μl reagens A till 2 ml medium I.
OBS: Håll reagens A vid 4 °C över natten före användning för att uppnå fullständig och jämn smältning. Observera produktinformationen och sök i katalognumret och partinumret på företagets officiella webbplats för att ha proteinkoncentrationen av reagens A eftersom varje flaska reagens A har en annan proteinkoncentration. Om proteinkoncentrationen är låg skulle en ökad volym reagens A vara till hjälp. - Tillsätt 20 μL beredt reagens A till varje brunn och pipettera två gånger i mitten för att sprida de döda cellerna.
OBS: Håll reagenset A och 96-brunnsplattan under svala förhållanden och slutför alla steg på is. Placera plattan i mörker.
- Tillsätt 1% reagens A (materialtabell). Bered reagens A (proteinkoncentration på 10 mg/ml) genom att tillsätta 133,4 μl reagens A till 2 ml medium I.
- Dag 2-12
- Rengör botten av 96-brunnsplattan och inkubera vid 37 °C och 5 %CO2 fram till dag 6. Vid dag 6, byt hälften av mediet genom att ta bort 58 μl av mediet från varje brunn och tillsätt 60 μL medium I.
OBS: Använd en flerkanalig pipett för att slutföra halvmediumbytet. Utför detta steg försiktigt för att säkerställa att inga cellpellets tas bort från brunnen. Aspirera mediet i en ren 10 cm petriskål. Om det finns cellpellets inuti, lägg tillbaka dem till 96-brunnsplattan.
- Rengör botten av 96-brunnsplattan och inkubera vid 37 °C och 5 %CO2 fram till dag 6. Vid dag 6, byt hälften av mediet genom att ta bort 58 μl av mediet från varje brunn och tillsätt 60 μL medium I.
- Dag 12- 18
- Ändra medium till medium II (tabell 1) vid dag 12. Bered medium II med 1% (v / v) reagens A genom att blanda följande: 10% fetalt bovint serum (FBS), 0,1 mM NEAA, 1 mM pyruvat,100 U / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin, 0,1 mM β-merkaptoetanol, 100 nM SAG dihydroklorid och GMEM. Förvara den under svala och mörka förhållanden.
- Skörda cellpelletsen i ett 15 ml koniskt rör från 96-brunnsplattan och låt pelletsen sätta sig naturligt i 5 minuter vid rumstemperatur.
OBS: Ta bort mediet och pellets försiktigt under ytan för att undvika bubblor. - Ta bort supernatanten medan du tar hand om organoiderna. Överför cellaggregaten till en 10 cm suspensionsskål innehållande 18 ml berett medium II med reagens A.
OBS: Tillsätt inte det beredda mediet II i 10 cm skålen i förväg, eftersom reagenset A ska vara vid 4 °C. - Inkubera vid 37 °C och 5 %CO2 fram till dag 18.
- Från dag 18 och framåt
- Ändra medium till medium III (tabell 1). Förbered medium III under mörka förhållanden genom att blanda följande: 10% FBS, 1xsupplement 1, 0,5 μM retinsyra (RA), 100 μM taurin, 100 U / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin och 1: 1 blandning av Dulbeccos modifierade örnmedium (DMEM) / näringsblandning F-12.
- På dag 18, när en semitransparent optisk vesikel genereras, skär organoiderna med en mikrokirurgisk kniv.
OBS: Klyva organoiden, vanligtvis i fyra delar, i en petriskål med medium II. Varje bit ska växa till en intakt optisk kopp under de följande veckorna. - Aggregera alla pellets till mitten av skålen. Skörda cellerna i ett 15 ml koniskt falkrör och tillåt naturlig sedimentering. Ta sedan försiktigt bort supernatanten.
OBS: På grund av deras storlek kan organoider aggregeras i mitten genom att rotera petriskålen i en riktning i 90 ° på ett horisontellt plan några gånger. - Stäng av och sprid pelletsen i två 10 cm petriskålar, med 18 ml medium III per skål, och överför försiktigt diskarna till inkubatorn för att undvika cellaggregering. Fortsätt odla i medium III vid 37 °C och 5 %CO2 och byt medium varje vecka. CRX uttryckt efter dag 45 och fram till dag 120 kunde vi upptäcka utsegmentet av fotoreceptorn.
2. Analysera mänskliga ROs
- FACS-analys
- Montera tre CRX-tdTomato och tre H9 ES-härledda organoider från diskarna med hjälp av de skurna 1 ml spetsarna. Tvätta organoiderna med 1 ml förvärmd (rumstemperatur) DPBS.
- Förbered matsmältningsbufferten genom att blanda 0,25% trypsin-EDTA-lösning med 0,05 mg / ml reagens D.
- Dissociera organoiderna i enskilda celler med hjälp av den beredda digestionsbufferten i 8 minuter vid 37 °C. Tillsätt sedan samma volym DPBS med 10% FBS och 0,05 mg / ml reagens D för att inaktivera reaktionen.
- Suspendera och sprida cellerna lätt och filtrera sedan med en 100 μm cellsil och använd ett Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS) -system vid 561 nm excitationslaserlinje och 780/60 filter för att analysera CRX-tdTomato positiva signaler.
OBS: CRX uttrycker initialt vid dag 45 och ökar med mognad av organoider. Tio tusen celler används för varje test, för varje tidpunkt slutförs minst tre upprepningar.
- Kvantifiering av fluorescensintensitet av ROs
- Förbered de livskraftiga organoiderna slumpmässigt för avbildning.
OBS: Ställ in parametrarna och använd samma filter och parametrar för alla fluorescensintensitetsmonitorer. - Ta bilder och analysera den genomsnittliga fluorescensintensiteten med lämplig programvara (t.ex. ImageJ).
- Importera bilderna och konvertera sedan till 8-bitars med Image | Typ.
- Justera tröskelvärdet med hjälp av standardparametrarna efter Image | Justera | Tröskel.
- Bestäm det uppmätta området och utvärdera sedan gråvärdet med hjälp av Analysera | Mät.
OBS: Medelvärdena i resultatpanelen är den genomsnittliga fluorescensintensiteten för det uppmätta området.
- Förbered de livskraftiga organoiderna slumpmässigt för avbildning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den schematiska illustrationen visar differentieringsprotokollet för att förbättra prekursorceller med COCO (figur 1). Från PSC till ROs kan många detaljer orsaka resultatvariationer. Det rekommenderas att spela in varje steg och till och med katalognummer och partinummer för varje medium för att spåra hela proceduren.
Häri tillhandahåller vi ljusa fältbilder för dag 6, 12, 18 och 45 (figur 2). På dag 6 är organoiderna vanligtvis cirka 600 μm i diameter i en 96-brunnsplatta, med täta anslutningar inuti och ljus kant (figur 2A). På dag 12 genererar de optiska vesikelliknande strukturerna initialt (figur 2B). Från dag 12 till dag 18 är närvaron av optiska vesikelstrukturer tydlig och de fortsatte att växa efter dag 18. Organoiderna utan den vesikelliknande arkitekturen kasseras (figur 2C). Vid dag 30 är den vesikelliknande arkitekturen mer uppenbar, och det är lättare att skilja de överlägsna RO: erna från de sämre (figur 2D-E). De organoider som förlorar den genomskinliga strukturen (asterisker i figur 2D-E) bör avlägsnas under de följande dagarna.
Organoiderna uttrycker CRX, som är en markör för fotoreceptorprekursorer, från dag 45 och framåt (figur 2F,2I). Andra fotoreceptorprekursormarkörer, såsom RCVRN och OTX2, detekterades också positivt vid dag 45 (figur 2G-H). Tillsatsen av COCO främjar genereringen av fotoreceptorprekursorer.
Figur 1. Tidplan för stegvis behandling för RO-differentiering från hESC. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Mänsklig retinal organoid generation. (A–B) Tidigt stadium optisk vesikelliknande struktur bildad i en 96-brunnsplatta. De svarta pilarna indikerar de optiska vesikelliknande strukturerna. (C) Den första dagen av suspensionskulturen i en petriskål på dag 18. (D-E) Optiska koppstrukturer observeras i detta skede. Stjärnorna visar de sämre organoiderna (F) Den ljusa fältbilden på dag 45. Skalstänger = 400 μm. (G-H) Immunfärgningsresultat av RCVRN (G) och OTX2 (H) på dag 45. Skalstänger = 50 μm. (I) TdTomato-positiva signaler indikerar uttrycket av CRX på dag 45 in (F). Skalstänger = 400 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Medel I (50 ml) | ||||||||
| KSR | G-MEM | NEAA | Pyruvat | b-ME | IWR1e | COCO | PS | |
| Procentandel % ELLER slutlig koncentration | 20 | 78 | 0,1 mM | 1 mM | 0,1 mM | 3 μM | 30 ng/ml | 1 |
| Volym | 10 ml | 39 ml | 0,5 ml | 0,5 ml | 90,9 μl | 5 μl | 10 μl | 0,5 ml |
| Butikskoncentrationen för IWR1e är 30 mM. COCO är 150 μg/ml. | ||||||||
| Medel II (50 ml) | ||||||||
| FBS | G-MEM | NEAA | Pyruvat | b-ME | SJUNKA | PS | ||
| Procentandel % ELLER slutlig koncentration | 10 | 88 | 0,1 mM | 1 mM | 0,1 mM | 100 nM | 1 | |
| Volym | 5 ml | 44 ml | 0,5 ml | 0,5 ml | 90,9 μl | 2,5 μl | 0,5 ml | |
| Butikskoncentrationen av SAG är 2 mM. | ||||||||
| Medel III (50 ml) | ||||||||
| FBS | DMEM/F12- Glutamax | Tillägg 1 | RA | Taurin | PS | |||
| Procentandel % ELLER slutlig koncentration | 10 | 88 | 1 | 0,5 μM | 100 μM | 1 | ||
| Volym | 5 ml | 44 ml | 0,5 ml | 5 μl | 50 μl | 0,5 ml | ||
| Butikskoncentrationen av RA är 5 mM och Taurin är 100 mM. | ||||||||
Tabell 1: Medium I-, II- och II-recept
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Retinal organoid differentiering är en önskvärd metod för generering av rikliga funktionella retinala celler. RO är en sammansättning av olika retinala celler, såsom ganglionceller, bipolära celler och fotoreceptorer, genererade av pluripotenta stamceller mot den neurala näthinnan 4,5,8,9. Även om sammanflytande ROs kan skördas är det tidskrävande, vilket kan kräva långa odlingsperioder (upp till 180 dagar). För fotoreceptortransplantation, eller studier av konstångs- eller stavkondystrofi, är det emellertid fördelaktigt att erhålla en relativt hög andel fotoreceptorer i 3D-odlingssystemet10.
Det är också utmanande att övervaka organoidernas utveckling utan att avbryta de normala utvecklingsprocesserna. Därför använde vi CRX, ett konstångshomeoboxprotein, främst uttryckt i fotoreceptorprekursorer, som en målgen för att spåra fotoreceptorprekursorceller under deras 3D-differentiering. Med tdTomato-systemet kan CRX-uttryckande celler spåras spatio-temporalt av den röda fluorescensen utan att avbryta retinaliseringen under deras 3D-differentiering. Användningen av CRX-tdTomato-systemet kan påskynda processen för läkemedelsscreening för fotoreceptorprekursordifferentiering i ROs.
Med hjälp av vår metod kan cirka 70% organoider utvecklas till retinala organoider, som visar de vesikelliknande strukturerna. Det är viktigt att vi med snittet av överlägsna organoider vanligtvis kunde skörda cirka 100 retinala organoider från en 96-brunnsplatta. Dessutom genereras rikliga fotoreceptorprekursorer i det tidiga stadiet av RO-mognad med COCO-kulturen, vilket hjälper utvecklingen mot direkt differentiering av vissa celler genom vägreglering11,12. Proteinkoncentrationen av reagens A är avgörande för differentieringen. Sammantaget är tillräckligt med reagens A med aggregaten i början samt skärning av organoiderna på dag 18 viktigt för att skörda rikliga ROs med hög kvalitet. Denna metod främjar också utvecklingen av riktningsdifferentiering av fotoreceptorceller i 3D-organoider och bidrar till transplantation av fotoreceptorceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi tackar medlemmarna i 502-laboratoriet för deras tekniska support och hjälpsamma kommentarer angående manuskriptet. Detta arbete stöddes delvis av Beijing Municipal Natural Science Foundation (Z200014) och National Key R&D Program of China (2017YFA0105300).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| COCO | R&D Systems | 3047-CC-050 | DAN Domain family of BMP antagonists |
| DMEM/F-12 | Gibco | 10565-042 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| DPBS | Gibco | C141905005BT | |
| EDTA | Thermo | 15575020 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells | Biological Industry | 04-002-1A | |
| GMEM | Gibco | 11710-035 | |
| KnockOut Serum Replacement-Multi-Species | Gibco | A3181502 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X) | sigma | M7145 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Primesurface 96 V-plate | Sbio | MS9096SZ | Cell aggregation in 1.2.7 |
| Pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Reagent A | BD | 356231 | Matrigel in 1.1.1 |
| Reagent B | StemCell | 5990 | mTeSR- E8 , PSCs basal medium in 1.1.2 |
| Reagent C | Gibco | 12563-011 | TrypLE Express in 1.2 |
| Reagent D | Roche | 11284932001 | DNase I , in 1.2 |
| Retinoic acid | Sigma | R2625-100MG | |
| SAG | Enzo Life Science | ALX-270-426-M001 | |
| Supplement 1 | Life Technologies | 17502-048 | N-2 Supplement (100X), Liquid, supplemet in medum III |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | organoids dissociation in 2.1.3 |
| Wnt Antagonist I, IWR-1-endo - Calbiochem | Sigma | 681669 | Wnt inhibitor |
| Y-27632 2HCl | Selleck | S1049 |
References
- Xie, H., et al. Chromatin accessibility analysis reveals regulatory dynamics of developing human retina and hiPSC-derived retinal organoids. Science Advances. 6 (6), 5247 (2020).
- Lu, Y. F., et al. Single-Cell Analysis of Human Retina Identifies Evolutionarily Conserved and Species-Specific Mechanisms Controlling Development. Developmental Cell. 53 (4), 473-491 (2020).
- Cowan, C. S., et al. Cell Types of the Human Retina and Its Organoids at Single-Cell Resolution. Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).
- Jin, Z. B., et al. Stemming retinal regeneration with pluripotent stem cells. Progress in Retinal and Eye Research. 69, 38-56 (2019).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
- Pan, D., et al. COCO enhances the efficiency of photoreceptor precursor differentiation in early human embryonic stem cell-derived retinal organoids. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 366 (2020).
- Zhou, S., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into cone photoreceptors through simultaneous inhibition of BMP, TGFbeta and Wnt signaling. Development. 142 (19), 3294-3306 (2015).
- Deng, W. L., et al. Gene Correction Reverses Ciliopathy and Photoreceptor Loss in iPSC-Derived Retinal Organoids from Retinitis Pigmentosa Patients. Stem Cell Reports. 10 (4), 1267-1281 (2018).
- Gao, M. L., et al. Patient-Specific Retinal Organoids Recapitulate Disease Features of Late-Onset Retinitis Pigmentosa. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 128 (2020).
- Zhang, C. J., Ma, Y., Jin, Z. B. The road to restore vision with photoreceptor regeneration. Experimental Eye Research. 202, 108283 (2020).
- Reichman, S., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U. S. A. 111 (23), 8518-8523 (2014).
- Kuwahara, A., et al. Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue. Nature Communications. 6, 6286 (2015).
