Summary
Utilizando un método de autoorganización, desarrollamos un protocolo con la adición de COCO que podría aumentar significativamente la generación de fotorreceptores.
Abstract
El trasplante de células de la retina es un enfoque terapéutico prometedor, que podría restaurar la arquitectura de la retina y estabilizar o incluso mejorar las capacidades visuales de la retina degenerada. Sin embargo, el progreso en la terapia de reemplazo celular actualmente enfrenta los desafíos de requerir una fuente estándar de retinas humanas estandarizadas y de alta calidad. Por lo tanto, se necesita un protocolo fácil y estable para los experimentos. Aquí, desarrollamos un protocolo optimizado, basado en un método de autoorganización con el uso de moléculas exógenas y reactivo A, así como la escisión manual para generar los organoides tridimensionales de la retina humana (RO). La RO derivada de células madre pluripotentes humanas (PSC) expresa marcadores específicos para los fotorreceptores. Con la adición de COCO, un antagonista multifuncional, la eficiencia de diferenciación de los precursores y conos de fotorreceptores aumenta significativamente. El uso eficiente de este sistema, que tiene los beneficios de las líneas celulares y las células primarias, y sin los problemas de abastecimiento asociados con estas últimas, podría producir células retinianas confluentes, especialmente fotorreceptores. Por lo tanto, la diferenciación de PSC a RO proporciona una plataforma óptima y biorelevante para el modelado de enfermedades, la detección de fármacos y el trasplante celular.
Introduction
Las células madre pluripotentes (PSC) se caracterizan por su auto-renovación y capacidad para diferenciarse en todo tipo de células somáticas. Por lo tanto, los organoides derivados de PSC se han convertido en un recurso importante en la investigación de la medicina regenerativa. La degeneración retiniana se caracteriza por la pérdida de fotorreceptores (bastones y conos) y epitelio pigmentario de la retina. El reemplazo de células retinianas podría ser un tratamiento alentador para esta enfermedad. Sin embargo, no es factible obtener retinas humanas para la investigación y terapia de enfermedades. Por lo tanto, los organoides retinianos (RO) derivados de PSCs, que recapitulan de manera efectiva y exitosa las células retinianas nativas de múltiples capas, son beneficiosos para la investigación básica y traslacional 1,2,3. Nuestra investigación se centra en la diferenciación de RO para proporcionar células suficientes y de calidad para estudiar la degeneración retiniana4.
Los métodos para diferenciar las RO están surgiendo continuamente, con la diferenciación de suspensión tridimensional (3D) iniciada por el laboratorio Sasai en 20125. Introdujimos la etiqueta CRX-tdTomato en las células madre embrionarias humanas (hESCs) para rastrear específicamente las células precursoras de fotorreceptores y modificamos el método con la adición de COCO, un antagonista multifuncional de las vías Wnt, TGF-β y BMP6. Se ha demostrado que el COCO mejora eficientemente la eficiencia de diferenciación de los precursores y conos de los fotorreceptores 6,7.
En conjunto, al modificar el método clásico de diferenciación, hemos desarrollado un protocolo accesible para recolectar abundantes precursores y conos de fotorreceptores de RO humanos para analizar la enfermedad retiniana asociada con los fotorreceptores a través de investigaciones de laboratorio y para su posterior aplicación clínica / trasplante.
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Protocol
Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética institucional del Hospital Tongren de Beijing, Universidad Médica Capital. Las hESCs H9 se obtuvieron del Instituto de Investigación WiCell y se modificaron genéticamente para la línea celular marcada con tdTomato.
1. Generación de ROs humanas
- Cultive los hESCs en condiciones libres de alimentador.
- Cubra un pocillo de una placa de 6 pocillos con 1 ml de 0,1 mg/ml de reactivo A (tabla de materiales) a 37 °C durante al menos media hora siguiendo las instrucciones del fabricante. Descongelar una alícuota de 1x106 hESCs.
NOTA: Prepare 3 ml de reactivo B precalentado (Tabla de materiales) y transfiera las células criopreservadas (1 ml) a 3 ml de medio fresco. No canalice las hESCs a células individuales. - Centrifugar a 200 x g durante 5 min y retirar el sobrenadante.
- Sembrar las células en la placa recubierta con reactivo A con 2 ml de reactivo B y cambiar 2 ml de reactivo B diariamente. Células de paso al alcanzar aproximadamente el 80% de confluencia (generalmente alrededor de 4 días).
- Cubra un pocillo de una placa de 6 pocillos con 1 ml de 0,1 mg/ml de reactivo A (tabla de materiales) a 37 °C durante al menos media hora siguiendo las instrucciones del fabricante. Descongelar una alícuota de 1x106 hESCs.
- Día 0
- Disociar las hESCs a una suspensión unicelular utilizando el medio I (Tabla 1). Prepare el medio I mezclando lo siguiente: reemplazo sérico KnockOut (KSR) al 20% (v/v), solución de aminoácidos no esenciales MEM de 0,1 mM (NEAA), piruvato de 1 mM, IWR-1-endo (IWR1e) de 3 μM, COCO de 30 ng/ml, penicilina de 100 U/ml, estreptomicina (PS) de 100 μg/ml, β-mercaptoetanol de 0,1 mM y medio esencial mínimo de Eagle (GMEM) de Glasgow.
NOTA: Antes del inicio de la disociación, preparar el medio I y transferir 12 mL de medio I con 20 μM Y-27632 a una placa de Petri de 10 cm, 500 μL de reactivo C (Tabla de materiales) que contenga 0,05 mg/ml de reactivo D (Tabla de materiales) y 20 μM Y-27632 en un tubo de 1,5 ml. Realice los pasos anteriores en la oscuridad, ya que el componente IWR1e en el medio I es sensible a la luz. - Lave las hESCs con 1x tampón salino tamponado con fosfato (DPBS) precalentado de Dulbecco.
- Añadir el tubo de reactivo preparado de 500 μL (en 1,5 ml) e incubar las hESCs durante 3,5 min a 37 °C y 5% deCO2.
- Separe las células moviendo el lado y el fondo de la placa durante unos segundos y agregue 500 μL de medio preparado I de la placa de Petri a la placa hESC.
NOTA: Prepare un tubo de 1.5 ml con 900 μL de 1x DPBS y use un hemocitómetro para el recuento celular. - Recolecte las células en un nuevo tubo de 1,5 ml y pipete la suspensión celular hacia arriba y hacia abajo y luego saque 100 μL del tubo y luego agréguelos al tubo con 900 μL de DPBS para el recuento celular.
- Dispersar la suspensión de células izquierda de 900 μL y luego diluir las células con medio preparado I en la placa de Petri a 9 x 104 células/ml.
NOTA: El volumen total del medio es de 12 mL; 1.08 x 10 Se necesitan6 celdas en total. - Agregue 100 μL de suspensión celular a cada pocillo de una placa de 96 pocillos no adherente, con fondo en V (Tabla de materiales).
NOTA: Utilice una pipeta multicanal para acortar el tiempo y asegurarse de que cada pocillo contiene un número de celda equivalente. Agite la placa de Petri cada vez antes de retirar las porciones de 100 μL. Es importante que las células estén distribuidas uniformemente. - Girar ligeramente la placa de 96 pocillos en un agitador de baja velocidad durante 5 minutos y luego incubar a 37 °C y 5% deCO2.
NOTA: Mantenga el plato en oscuridad. Establezca el día como día 0.
- Disociar las hESCs a una suspensión unicelular utilizando el medio I (Tabla 1). Prepare el medio I mezclando lo siguiente: reemplazo sérico KnockOut (KSR) al 20% (v/v), solución de aminoácidos no esenciales MEM de 0,1 mM (NEAA), piruvato de 1 mM, IWR-1-endo (IWR1e) de 3 μM, COCO de 30 ng/ml, penicilina de 100 U/ml, estreptomicina (PS) de 100 μg/ml, β-mercaptoetanol de 0,1 mM y medio esencial mínimo de Eagle (GMEM) de Glasgow.
- Día 2
- Agregue un 1% de reactivo A (Tabla de materiales). Preparar el reactivo A (concentración de proteína de 10 mg/ml) añadiendo 133,4 μL de reactivo A en 2 ml de medio I.
NOTA: Mantener el reactivo A a 4 °C durante la noche antes de usarlo para lograr una fusión completa y uniforme. Tenga en cuenta la información del producto y busque el número de catálogo y el número de lote en el sitio web oficial de la compañía para tener la concentración de proteína del reactivo A, ya que cada botella de reactivo A está en una concentración de proteína diferente. Si la concentración de proteína es baja, un mayor volumen de reactivo A sería útil. - Agregue 20 μL de reactivo A preparado a cada pocillo y pipete dos veces en el centro para dispersar las células muertas.
NOTA: Mantenga el reactivo A y la placa de 96 pocillos en condiciones frías y complete todos los pasos en hielo. Coloque el plato en la oscuridad.
- Agregue un 1% de reactivo A (Tabla de materiales). Preparar el reactivo A (concentración de proteína de 10 mg/ml) añadiendo 133,4 μL de reactivo A en 2 ml de medio I.
- Día 2-12
- Limpiar el fondo de la placa de 96 pocillos e incubar a 37 °C y 5% deCO2 hasta el día 6. En el día 6, cambie la mitad del medio eliminando 58 μL del medio de cada pocillo y agregando 60 μL del medio I.
NOTA: Utilice una pipeta multicanal para completar el cambio de medio medio. Realice este paso suavemente para asegurarse de que no se retiren los gránulos de células del pozo. Aspirar el medio en una placa de Petri limpia de 10 cm. Si hay gránulos de células en el interior, agréguelos nuevamente a la placa de 96 pocillos.
- Limpiar el fondo de la placa de 96 pocillos e incubar a 37 °C y 5% deCO2 hasta el día 6. En el día 6, cambie la mitad del medio eliminando 58 μL del medio de cada pocillo y agregando 60 μL del medio I.
- Día 12- 18
- Cambiar el medio a medio II (Tabla 1) en el día 12. Preparar el medio II utilizando el reactivo A al 1% (v/v) mezclando lo siguiente: suero bovino fetal al 10%, NEAA al 0,1 mM, piruvato de 1 mM, penicilina de 100 U/ml, estreptomicina de 100 μg/ml, β-mercaptoetanol de 0,1 mM, diclorhidrato SAG de 100 nM y GMEM. Guárdelo en condiciones frescas y oscuras.
- Coseche los gránulos celulares en un tubo cónico de 15 ml de la placa de 96 pocillos y permita que los gránulos se asienten naturalmente durante 5 minutos a temperatura ambiente.
NOTA: Retire el medio y los gránulos suavemente debajo de la superficie para evitar burbujas. - Retire el sobrenadante mientras cuida los organoides. Transfiera los agregados celulares a una placa de suspensión de 10 cm que contenga 18 ml de medio preparado II con reactivo A.
NOTA: No añadir el medio II preparado en la placa de 10 cm por adelantado, ya que el reactivo A debe estar a 4 °C. - Incubar a 37 °C y 5% deCO2 hasta el día 18.
- A partir del día 18
- Cambiar el medio a medio III (Tabla 1). Prepare el medio III en condiciones de oscuridad mezclando lo siguiente: 10% FBS, 1xsupplement 1, 0.5 μM de ácido retinoico (AR), 100 μM taurina, 100 U/ml de penicilina, 100 μg/ml de estreptomicina y mezcla 1:1 de medio de águila modificada (DMEM)/mezcla de nutrientes F-12 de Dulbecco.
- El día 18, cuando se genera una vesícula óptica semitransparente, cortar los organoides con un cuchillo microquirúrgico.
NOTA: Dividir el organoide, generalmente en cuatro piezas, en una placa de Petri con medio II. Cada pieza debe convertirse en una copa óptica intacta en las siguientes semanas. - Agregue todos los pellets al centro del plato. Cosechar las células en un tubo cónico de halcón de 15 ml y permitir el asentamiento natural. Luego retire suavemente el sobrenadante.
NOTA: Debido a sus tamaños, los organoides se pueden agregar en el centro girando la placa de Petri en una dirección durante 90 ° en un plano horizontal varias veces. - Suspender y dispersar los pellets en dos placas de Petri de 10 cm, con 18 mL de medio III por plato, y transferir suavemente los platos a la incubadora para evitar la agregación celular. Continuar cultivando en medio III a 37 °C y 5% deCO2 y cambiar el medio semanalmente. La CRX expresada después del día 45 y hasta el día 120, pudimos detectar el segmento externo del fotorreceptor.
2. Análisis de ROs humanas
- Análisis del sistema de control de los bienes sobre el terreno
- Ensamble tres organoides CRX-tdTomato y tres derivados de H9 ES de los platos utilizando las puntas cortadas de 1 ml. Lave los organoides con 1 ml de DPBS precalentados (a temperatura ambiente).
- Preparar el tampón de digestión mezclando solución de tripsina-EDTA al 0,25% con 0,05 mg/ml de reactivo D.
- Disociar los organoides en células individuales utilizando el tampón de digestión preparado durante 8 min a 37 °C. Luego agregue el mismo volumen de DPBS con 10% de FBS y 0.05 mg / ml de reactivo D para inactivar la reacción.
- Suspenda y disperse ligeramente las células y luego filtre usando un filtro celular de 100 μm y use un sistema de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) en una línea láser de excitación de 561 nm y un filtro 780/60 para analizar las señales positivas CRX-tdTomato.
NOTA: CRX se expresa inicialmente en el día 45 y aumenta con la maduración de los organoides. Se utilizan diez mil celdas para cada prueba, para cada punto de tiempo, se completan al menos tres repeticiones.
- Cuantificación de la intensidad de fluorescencia de ROs
- Prepare los organoides viables al azar para obtener imágenes.
NOTA: Establezca los parámetros y utilice los mismos filtros y parámetros para todos los monitores de intensidad de fluorescencia. - Capture imágenes y analice la intensidad media de fluorescencia utilizando el software adecuado (por ejemplo, ImageJ).
- Importe las imágenes y, a continuación, conviértalas a 8 bits mediante Image | Tipo.
- Ajuste el umbral utilizando los parámetros predeterminados de Image | Ajustar | Umbral.
- Determine el área medida y, a continuación, evalúe el valor de gris mediante Analizar | Medir.
NOTA: Los valores medios en el panel de resultados son la intensidad media de fluorescencia del área medida.
- Prepare los organoides viables al azar para obtener imágenes.
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Representative Results
La ilustración esquemática muestra el protocolo de diferenciación para mejorar las células precursoras con COCO (Figura 1). Desde PSC hasta ROs, numerosos detalles podrían causar variaciones en los resultados. Se recomienda registrar cada paso e incluso el número de catálogo y el número de lote de cada medio para rastrear todo el procedimiento.
En este documento, proporcionamos imágenes de campo brillante para los días 6, 12, 18 y 45 (Figura 2). El día 6, los organoides suelen tener alrededor de 600 μm de diámetro en una placa de 96 pocillos, con conexiones densas en el interior y borde brillante (Figura 2A). En el día 12, las estructuras en forma de vesícula óptica se generan inicialmente (Figura 2B). Desde el día 12 hasta el día 18, la presencia de estructuras de vesículas ópticas es clara, y continuaron creciendo después del día 18. Los organoides sin la arquitectura de vesícula se descartan (Figura 2C). Para el día 30, la arquitectura en forma de vesícula es más obvia, y es más fácil distinguir las RO superiores de las inferiores (Figura 2D-E). Los organoides que pierden la estructura translúcida (asteriscos en la Figura 2D-E), deben retirarse en los días siguientes.
Los organoides expresan el CRX, que es un marcador de precursores fotorreceptores, a partir del día 45 (Figura 2F,2I). Otros marcadores precursores de fotorreceptores, como RCVRN y OTX2, también se detectaron positivamente en el día 45 (Figura 2G-H). La adición de COCO promueve la generación de precursores fotorreceptores.
Figura 1. Calendario para el tratamiento gradual de la diferenciación de RO de hESC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Generación de organoides retinianos humanos. (A-B) Estructura similar a vesícula óptica en etapa temprana formada en una placa de 96 pocillos. Las flechas negras indican las estructuras ópticas en forma de vesícula. (C) El primer día de cultivo en suspensión en una placa de Petri el día 18. (D-E) Las estructuras ópticas de la copa se observan en esta etapa. Las estrellas muestran los organoides inferiores (F) La imagen de campo brillante en el día 45. Barras de escala = 400 μm. (G-H) Resultados de inmunotinción de RCVRN (G) y OTX2 (H) en el día 45. Barras de escala = 50 μm. (I) Las señales TdTomato-positivas indican la expresión de CRX en el día 45 en (F). Barras de escala = 400 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Medio I (50 mL) | ||||||||
| KSR | G-MEM | NEAA | Piruvato | b-ME | IWR1e | COCO | P.D | |
| Porcentaje % O concentración final | 20 | 78 | 0,1 mM | 1 mM | 0,1 mM | 3 μM | 30 ng/ml | 1 |
| Volumen | 10 ml | 39 ml | 0.5 mL | 0.5 mL | 90,9 μL | 5 μL | 10 μL | 0.5 mL |
| La concentración almacenada de IWR1e es de 30 mM. COCO es de 150 μg/mL. | ||||||||
| Medio II (50 mL) | ||||||||
| FBS (en inglés) | G-MEM | NEAA | Piruvato | b-ME | SAG | P.D | ||
| Porcentaje % O concentración final | 10 | 88 | 0,1 mM | 1 mM | 0,1 mM | 100 nM | 1 | |
| Volumen | 5 ml | 44 ml | 0.5 mL | 0.5 mL | 90,9 μL | 2,5 μL | 0.5 mL | |
| La concentración almacenada de SAG es de 2 mM. | ||||||||
| Medio III (50 mL) | ||||||||
| FBS (en inglés) | DMEM/F12- Glutamax | Suplemento 1 | RA | Taurina | P.D | |||
| Porcentaje % O concentración final | 10 | 88 | 1 | 0,5 μM | 100 μM | 1 | ||
| Volumen | 5 ml | 44 ml | 0.5 mL | 5 μL | 50 μL | 0.5 mL | ||
| La concentración almacenada de AR es de 5 mM, y la taurina es de 100 mM. | ||||||||
Tabla 1: Recetas medianas I, II y II
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Discussion
La diferenciación de organoides retinianos es un método deseable para la generación de amplias células funcionales de la retina. La RO es un compuesto de diferentes células de la retina, como células ganglionares, células bipolares y fotorreceptores, generados por células madre pluripotentes hacia la retina neural 4,5,8,9. Aunque se pueden cosechar RO confluentes, lleva mucho tiempo, lo que puede requerir largos períodos de cultivo (hasta 180 días). Sin embargo, para el trasplante de fotorreceptores, o para el estudio de la distrofia cono-bastón o bastón-cono, es ventajoso obtener un porcentaje relativamente alto de fotorreceptores en el sistema de cultivo 3D10.
También es difícil monitorear el desarrollo de los organoides sin interrumpir los procesos normales de desarrollo. Por lo tanto, utilizamos CRX, una proteína homeobox de cónico-bastón, expresada predominantemente en precursores de fotorreceptores, como gen objetivo para rastrear células precursoras de fotorreceptores durante su diferenciación 3D. Con el sistema tdTomato, las células que expresan CRX pueden ser rastreadas espacio-temporalmente por la fluorescencia roja sin interrumpir la retinalización durante su diferenciación 3D. La utilización del sistema CRX-tdTomato podría acelerar el proceso de cribado farmacológico para la diferenciación de precursores fotorreceptores en las RO.
Usando nuestro método, alrededor del 70% de los organoides podrían convertirse en organoides retinianos, que muestran las estructuras similares a vesículas. Es importante destacar que, con la incisión de organoides superiores, generalmente podríamos cosechar alrededor de 100 organoides retinianos de una placa de 96 pocillos. Además, se generan abundantes precursores fotorreceptores en la etapa temprana de la maduración de la OI con el cultivo COCO, lo que ayuda a la progresión hacia la diferenciación directa de ciertas células a través de la regulación de la vía11,12. La concentración de proteína del reactivo A es crucial para la diferenciación. En conjunto, suficiente reactivo A con los agregados en los primeros días, así como el corte de los organoides en el día 18 son importantes para cosechar abundantes RO con alta calidad. Este método también promueve el desarrollo de la diferenciación direccional de las células fotorreceptoras en organoides 3D y contribuye al trasplante de células fotorreceptoras.
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Acknowledgments
Agradecemos a los miembros del laboratorio 502 por sus apoyos técnicos y comentarios útiles sobre el manuscrito. Este trabajo fue apoyado en parte por la Fundación Municipal de Ciencias Naturales de Beijing (Z200014) y el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (2017YFA0105300).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| COCO | R&D Systems | 3047-CC-050 | DAN Domain family of BMP antagonists |
| DMEM/F-12 | Gibco | 10565-042 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| DPBS | Gibco | C141905005BT | |
| EDTA | Thermo | 15575020 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells | Biological Industry | 04-002-1A | |
| GMEM | Gibco | 11710-035 | |
| KnockOut Serum Replacement-Multi-Species | Gibco | A3181502 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X) | sigma | M7145 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Primesurface 96 V-plate | Sbio | MS9096SZ | Cell aggregation in 1.2.7 |
| Pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Reagent A | BD | 356231 | Matrigel in 1.1.1 |
| Reagent B | StemCell | 5990 | mTeSR- E8 , PSCs basal medium in 1.1.2 |
| Reagent C | Gibco | 12563-011 | TrypLE Express in 1.2 |
| Reagent D | Roche | 11284932001 | DNase I , in 1.2 |
| Retinoic acid | Sigma | R2625-100MG | |
| SAG | Enzo Life Science | ALX-270-426-M001 | |
| Supplement 1 | Life Technologies | 17502-048 | N-2 Supplement (100X), Liquid, supplemet in medum III |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | organoids dissociation in 2.1.3 |
| Wnt Antagonist I, IWR-1-endo - Calbiochem | Sigma | 681669 | Wnt inhibitor |
| Y-27632 2HCl | Selleck | S1049 |
References
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