Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

אינדוקציה מכוונת של אורגנואידים ברשתית מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

Published: April 21, 2021 doi: 10.3791/62298
Automatic Translation
1, 1
1Beijing Institute of Ophthalmology, Beijing Tongren Eye Center, Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University, Beijing Ophthalmology & Visual Science Key Laboratory

Summary

באמצעות שיטת התארגנות עצמית, אנו מפתחים פרוטוקול עם תוספת של COCO שיכול להגדיל באופן משמעותי את יצירת הפוטורצפטורים.

Abstract

השתלת תאי רשתית היא גישה טיפולית מבטיחה, שיכולה לשחזר את ארכיטקטורת הרשתית ולייצב או אפילו לשפר את יכולות הראייה לרשתית המנוונת. עם זאת, ההתקדמות בטיפול בתחליפי תאים מתמודדת כיום עם האתגרים הדורשים מקור מדף של רשתיות אנושיות איכותיות וסטנדרטיות. לכן, יש צורך בפרוטוקול קל ויציב לניסויים. כאן, אנו מפתחים פרוטוקול אופטימלי, המבוסס על שיטת ארגון עצמי עם שימוש במולקולות אקסוגניות וריאגנט A, כמו גם כריתה ידנית ליצירת אורגנואידים תלת מימדיים של הרשתית האנושית (RO). RO שמקורו בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (PSCs) מבטא סמנים ספציפיים לפוטורצפטורים. עם תוספת של COCO, אנטגוניסט רב תכליתי, יעילות ההבחנה של מבשרי פוטורצפטור ומדוכים גדלה באופן משמעותי. השימוש היעיל במערכת זו, שיש לה את היתרונות של קווי תאים ותאים ראשוניים, וללא בעיות המקור הקשורות לאחרון, עלול לייצר תאי רשתית מפגשים, במיוחד פוטורצפטורים. לפיכך, ההתמיינות של PSCs ל-RO מספקת פלטפורמה אופטימלית ורלוונטית ביולוגית למידול מחלות, בדיקת תרופות והשתלת תאים.

Introduction

תאי גזע פלוריפוטנטיים (PSCs) מאופיינים בהתחדשות עצמית וביכולתם להתמיין לכל מיני תאים סומטיים. לפיכך, אורגנואידים שמקורם ב-PSCs הפכו למשאב חשוב במחקר ברפואה רגנרטיבית. ניוון הרשתית מאופיין באובדן פוטורצפטורים (מוטות ומדוכים) ואפיתל פיגמנט רשתית. החלפת תאי רשתית יכולה להיות טיפול מעודד למחלה זו. עם זאת, לא ניתן להשיג רשתיות אנושיות למחקר וטיפול במחלות. לכן, אורגנואידים של הרשתית (ROs) שמקורם ב-PSCs, אשר משחזרים ביעילות ובהצלחה תאי רשתית מקומיים רב-שכבתיים, מועילים למחקר בסיסי ותרגומי 1,2,3. המחקר שלנו מתמקד בהתמיינות RO כדי לספק תאים מספיקים ואיכותיים לחקר ניוון הרשתית4.

שיטות להבחנה בין ROs מתפתחות ללא הרף, עם דיפרנציאציה תלת מימדית (3D) מתלים חלוצה על ידי מעבדת Sasai בשנת 20125. הצגנו את התג CRX-tdTomato בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) כדי לעקוב באופן ספציפי אחר התאים המבשרים של הפוטורצפטור ושינינו את השיטה עם תוספת של COCO, אנטגוניסט רב-תכליתי של מסלולי Wnt, TGF-β ו-BMP6. הוכח כי COCO משפר ביעילות את יעילות ההתמיינות של מבשרי פוטורצפטורומדוכים 6,7.

בסך הכל, על ידי שינוי שיטת ההבחנה הקלאסית, פיתחנו פרוטוקול נגיש לקצירת מבשרי פוטורצפטור ומדוכים רבים מ- ROs אנושיים לניתוח מחלת הרשתית הקשורה לפוטורצפטורים באמצעות חקירות מעבדה ולהמשך יישום קליני / השתלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה המוסדית של בית החולים בייג'ינג טונגרן, האוניברסיטה הרפואית קפיטל. H9 hESCs התקבלו ממכון המחקר WiCell והונדסו גנטית לקו תאים המתויגים על ידי tdTomato.

1. דור של ROs אנושיים

  1. תרבו את ה-hESCs בתנאים נטולי הזנה.
    1. מצפים באר אחת של צלחת 6 בארות עם 1 מ"ל של 0.1 מ"ג / מ"ל מגיב A (טבלת חומרים) ב 37 מעלות צלזיוס לפחות חצי שעה בהתאם להוראות היצרן. הפשרה של 1x106 hESCs.
      הערה: הכינו 3 מ"ל של מגיב B (טבלת חומרים) שחומם מראש והעבירו את התאים המוקפאים (1 מ"ל) ל-3 מ"ל של מדיום טרי. אין להעביר את ה-hESCs לתאים בודדים.
    2. צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 5 דקות ולהסיר את supernatant.
    3. זרעו את התאים לתוך צלחת מגיב מצופה A עם 2 מ"ל של מגיב B והחליפו 2 מ"ל של מגיב B מדי יום. תאי מעבר כאשר מגיעים לכ 80% מפגש (בדרך כלל סביב 4 ימים).
  2. יום 0
    1. יש לנתק את ה-hESCs לתרחיף חד-תאי באמצעות מדיום I (טבלה 1). הכן את Medium I על ידי ערבוב הפריטים הבאים: 20% (v/v) תחליף סרום KnockOut (KSR), תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA) של 0.1 mM MEM, פירובט 1 mM, 3 μM IWR-1-endo (IWR1e), 30 ננוגרם/מ"ל COCO, 100 U/mL פניצילין, 100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין (PS), 0.1 mM β-מרקפטואתנול, והמדיום החיוני המינימלי (GMEM) של גלזגו.
      הערה: לפני תחילת הדיסוציאציה, הכינו מדיום I והעבירו 12 מ"ל של מדיום I עם 20 מיקרומטר Y-27632 לצלחת פטרי בגודל 10 ס"מ, 500 מיקרוגרם מגיב C (טבלת חומרים) המכילים 0.05 מ"ג/מ"ל מגיב D (טבלת חומרים) ו-20 מיקרומטר Y-27632 בצינור של 1.5 מ"ל. בצע את השלבים לעיל בחושך, מכיוון שרכיב IWR1e במדיום I רגיש לאור.
    2. שטפו את ה-hESCs עם חיץ מלח (DPBS) של 1x Dulbecco שחומם מראש.
    3. הוסף את המגיב המוכן 500 μL (בצינור 1.5 מ"ל) ודגירה של hESCs במשך 3.5 דקות ב 37 °C ו 5% CO2.
    4. נתקו את התאים על ידי הזזת הצד והתחתית של הצלחת למשך מספר שניות והוסיפו 500 μL של מדיום מוכן I מצלחת פטרי לתוך צלחת hESC.
      הערה: הכן שפופרת של 1.5 מ"ל עם 900 μL של DPBS 1x והשתמש בהמוציטומטר לספירת תאים.
    5. קצירת התאים בצינור חדש של 1.5 מ"ל ופיפטה של מתלה התאים למעלה ולמטה ואז מוציאים 100 μL מהצינור ואז מוסיפים לתוך הצינור עם 900 μL של DPBS לספירת תאים.
    6. פזרו את תרחיף התאים השמאלי בנפח 900 μL ולאחר מכן דיללו את התאים עם מדיום מוכן I בצלחת פטרי ל-9 x 104 תאים /מ"ל.
      הערה: כל נפח המדיום הוא 12 מ"ל; 1.08 x 106 תאים נדרשים בסך הכל.
    7. הוסף 100 μL של תרחיף תאים לכל באר של צלחת שאינה דבקה, V-bottom, 96-well (טבלת חומרים).
      הערה: השתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי לקצר את הזמן ולוודא שכל באר מכילה מספר תא שווה ערך. יש לנער את צלחת הפטרי בכל פעם לפני הסרת מנות של 100 μL. חשוב כי התאים מופצים באופן אחיד.
    8. סובבו קלות את צלחת 96 הבאר בשייקר במהירות נמוכה למשך 5 דקות ולאחר מכן דגרו ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.
      הערה: שמור את הצלחת בחושך. הגדר את היום כיום 0.
  3. יום 2
    1. הוסף 1% מגיב A (טבלת חומרים). הכן ריאגנט A (ריכוז חלבון של 10 מ"ג/מ"ל) על ידי הוספת 133.4 μL של מגיב A לתוך 2 מ"ל של בינוני I.
      הערה: יש לשמור על ריאגנט A בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה לפני השימוש כדי להשיג התכה מלאה ואחידה. שים לב למידע על המוצר וחפש את מספר הקטלוג ואת מספר המגרש באתר הרשמי של החברה כדי לקבל את ריכוז החלבון של מגיב A כמו כל בקבוק של מגיב A הוא בריכוז חלבון שונה. אם ריכוז החלבון נמוך, נפח מוגבר של מגיב A יעזור.
    2. מוסיפים 20 μL של מגיב מוכן A לכל באר ופיפטה פעמיים במרכז כדי לפזר את התאים המתים.
      הערה: שמרו על מגיב A ועל צלחת 96 הבאר בתנאי קרירות והשלימו את כל השלבים על הקרח. מניחים את הצלחת בחושך.
  4. ימים 2-12
    1. מנקים את החלק התחתון של צלחת 96 הבאר ודוגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 עד היום ה-6. ביום 6, שנה מחצית מהמדיום על ידי הסרת 58 μL של המדיום מכל באר והוספת 60 μL של בינוני I.
      הערה: השתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי להשלים את חצי השינוי הבינוני. בצעו את הצעד הזה בעדינות כדי להבטיח שלא יוסרו כדורי תאים מהבאר. שאפו את המדיום לצלחת פטרי נקייה בקוטר 10 ס"מ. אם יש כדוריות תאים בפנים, הוסף אותן בחזרה לצלחת 96 הבאר.
  5. ימים 12- 18
    1. שנה את המדיום לבינוני II (טבלה 1) ביום 12. הכן את Medium II באמצעות מגיב A של 1% (v/v) על ידי ערבוב הפריטים הבאים: 10% סרום בקר עוברי (FBS), 0.1 mM NEAA, 1 mM פירובט, 100 U/mL פניצילין, 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, 0.1 mM β-מרקפטואתנול, 100 ננומטר SAG דיהידרוכלוריד ו- GMEM. אחסנו אותו בתנאים קרירים וחשוכים.
    2. קוצרים את כדורי התא בצינור חרוטי של 15 מ"ל מהצלחת בעלת 96 הבארות ומאפשרים לכדורים להתיישב באופן טבעי למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
      הערה: יש להסיר את המדיום ואת הכדורים בעדינות מתחת לפני השטח כדי למנוע בועות.
    3. הסר את supernatant תוך טיפול באורגנואידים. מעבירים את אגרגטי התאים לצלחת תלייה בקוטר 10 ס"מ המכילה 18 מ"ל של מדיום II מוכן עם מגיב A.
      הערה: אין להוסיף את המדיום II המוכן למנה בגודל 10 ס"מ מראש, שכן מגיב A צריך להיות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    4. דגירה ב 37 °C ו 5% CO2 עד היום 18.
  6. מהיום ה-18 ואילך
    1. שנה את המדיום למדיום III (טבלה 1). הכן את מדיום III בתנאים כהים על ידי ערבוב המרכיבים הבאים: 10% FBS, 1xsupplement 1, 0.5 μM חומצה רטינואית (RA), טאורין 100 μM, 100 U/mL פניצילין, 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין ותערובת 1:1 של תערובת הנשר המעובד (DMEM)/תערובת החומרים המזינים F-12 של דולבקו.
    2. ביום ה -18, כאשר נוצרת שלפוחית אופטית שקופה למחצה, חותכים את האורגנואידים באמצעות סכין מיקרו-כירורגית.
      הערה: מבקעים את האורגנואיד, בדרך כלל לארבעה חלקים, בצלחת פטרי עם מדיום II. כל חתיכה אמורה לגדול לכוס אופטית שלמה בשבועות הבאים.
    3. צוברים את כל הכדורים למרכז המנה. קצירת התאים לתוך צינור בז חרוטי של 15 מ"ל ומאפשרת התיישבות טבעית. לאחר מכן יש להסיר בעדינות את הסופרנטנט.
      הערה: בשל גודלם, ניתן לצבור אורגנואידים במרכז על ידי סיבוב צלחת פטרי בכיוון אחד במשך 90° במישור אופקי מספר פעמים.
    4. משהים ומפזרים את הכדורים בשתי צלחות פטרי בקוטר 10 ס"מ, עם 18 מ"ל בינוני III למנה, ומעבירים בעדינות את הכלים לאינקובטור כדי למנוע צבירת תאים. המשך להתרבות בבינוני III ב 37 °C ו 5% CO2 ולשנות את הבינוני מדי שבוע. ה-CRX התבטא לאחר היום ה-45 ועד היום ה-120, יכולנו לזהות את הקטע החיצוני של הפוטורצפטור.

2. ניתוח ROs אנושיים

  1. ניתוח FACS
    1. הרכיבו מהמנות שלושה אורגנואידים של CRX-tdTomato ושלושה אורגנואידים שמקורם ב-H9 ES באמצעות קצוות חתוכים של 1 מ"ל. לשטוף את האורגנואידים עם 1 מ"ל של DPBS מחומם מראש (טמפרטורת החדר).
    2. הכן את מאגר העיכול על ידי ערבוב תמיסת טריפסין-EDTA של 0.25% עם 0.05 מ"ג/מ"ל של מגיב D.
    3. נתקו את האורגנואידים לתאים בודדים על ידי שימוש במאגר העיכול המוכן למשך 8 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן הוסף את אותו נפח של DPBS עם 10% FBS ו 0.05 מ"ג / מ"ל של מגיב D כדי להשבית את התגובה.
    4. להשעות ולפזר קלות את התאים ולאחר מכן לסנן באמצעות מסננת תאים של 100 מיקרומטר ולהשתמש במערכת מיון תאים המופעלת על ידי פלואורסצנציה (FACS) בקו לייזר עירור של 561 ננומטר ובמסנן 780/60 כדי לנתח את האותות החיוביים של CRX-tdTomato.
      הערה: CRX מתבטא בתחילה ביום 45 ומתגבר עם הבשלת האורגנואידים. עשרת אלפים תאים משמשים עבור כל בדיקה, עבור כל נקודת זמן, לפחות שלוש חזרות הושלמו.
  2. כימות עוצמת פלואורסצנציה של ROs
    1. הכינו את האורגנואידים הקיימים באופן אקראי להדמיה.
      הערה: הגדר את הפרמטרים והשתמש באותם מסננים ופרמטרים עבור כל צגי עוצמת הפלואורסצנטיות.
    2. צלם תמונות ונתח את עוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת באמצעות תוכנה מתאימה (לדוגמה, ImageJ).
    3. ייבא את התמונות ולאחר מכן המר ל- 8 סיביות באמצעות Image | סוג.
    4. התאם את הסף באמצעות פרמטרי ברירת המחדל לפי Image | התאמת | סף.
    5. קבע את השטח הנמדד ולאחר מכן הערך האפור באמצעות נתח | למדוד.
      הערה: הערכים הממוצעים בלוח התוצאות הם עוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת של השטח הנמדד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

האיור הסכמטי מתאר את פרוטוקול ההתמיינות לשיפור תאים מבשרים באמצעות COCO (איור 1). מ- PSC ל- ROs, פרטים רבים עלולים לגרום לשינויים בתוצאות. מומלץ להקליט כל שלב ואפילו את המספר הקטלוגי ואת מספר המגרש של כל מדיום כדי לעקוב אחר ההליך כולו.

כאן אנו מספקים תמונות שדה בהירות לימים 6, 12, 18 ו-45 (איור 2). ביום השישי, האורגנואידים הם בדרך כלל בקוטר של כ-600 מיקרומטר בלוח של 96 בארות, עם חיבורים צפופים בפנים ושפה בהירה (איור 2A). ביום ה-12, מבנים דמויי שלפוחית אופטית נוצרים בתחילה (איור 2B). מיום 12 עד יום 18, נוכחותם של מבני שלפוחית אופטית ברורה, והם המשיכו לגדול לאחר היום ה -18. האורגנואידים ללא הארכיטקטורה דמוית השלפוחית מושלכים (איור 2C). עד היום ה-30, הארכיטקטורה דמוית השלפוחית ברורה יותר, וקל יותר להבחין בין ה-ROs המעולים לבין הנחותים (איור 2D-E). את האורגנואידים שמאבדים את המבנה השקוף (כוכביות באיור 2D-E), יש להסיר בימים הבאים.

האורגנואידים מבטאים את ה-CRX, שהוא סמן של מבשרי פוטורצפטור מהיום ה-45 ואילך (איור 2F,2I). סמנים מקדימים פוטורצפטורים אחרים, כגון RCVRN ו-OTX2, זוהו גם הם באופן חיובי ביום ה-45 (איור 2G-H). התוספת של COCO מקדמת את הדור של מבשרי פוטורצפטור.

Figure 1
איור 1. לוח זמנים לטיפול שלב עבור הבחנה RO מ hESC. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2. יצירת אורגנואיד רשתית אנושית. (א-ב) מבנה דמוי שלפוחית אופטית בשלב מוקדם נוצר בצלחת של 96 בארות. החצים השחורים מציינים את המבנים דמויי השלפוחית האופטית. (C) היום הראשון של תרבות ההשעיה בצלחת פטרי ביום 18. (ד-ה) מבני כוסות אופטיים נצפים בשלב זה. הכוכבים מראים את האורגנואידים הנחותים (F) תמונת השדה הבהירה ביום 45. סרגלי קנה מידה = 400 μm. (G-H) תוצאות אימונוסטיין של RCVRN (G) ו- OTX2 (H) ביום 45. פסי קנה מידה = 50 מיקרומטר. (I) אותות חיוביים של TdTomato מציינים את הביטוי של CRX ביום 45 אינץ' (F). סרגלי קנה מידה = 400 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

בינוני I (50 מ"ל)
KSR G-MEM ניאה פירובט בי-מי IWR1e קוקו נ.ב.
אחוז % או ריכוז סופי 20 78 0.1 מ"מ 1 מ"מ 0.1 מ"מ 3 מיקרומטר 30 ננוגרם/מ"ל 1
נפח 10 מ"ל 39 מ"ל 0.5 מ"ל 0.5 מ"ל 90.9 מיקרון ליטר 5 מיקרון 10 מיקרוגרם 0.5 מ"ל
ריכוז החנות של IWR1e הוא 30 mM. COCO הוא 150 מיקרוגרם / מ"ל.
בינוני II (50 מ"ל)
FBS G-MEM ניאה פירובט בי-מי סאג נ.ב.
אחוז % או ריכוז סופי 10 88 0.1 מ"מ 1 מ"מ 0.1 מ"מ 100 ננומטר 1
נפח 5 מ"ל 44 מ"ל 0.5 מ"ל 0.5 מ"ל 90.9 מיקרון ליטר 2.5 מיקרון ליטר 0.5 מ"ל
ריכוז החנות של SAG הוא 2 mM.
בינוני III (50 מ"ל)
FBS DMEM/F12 - גלוטמקס מוסף 1 רא טאורין נ.ב.
אחוז % או ריכוז סופי 10 88 1 0.5 מיקרומטר 100 מיקרומטר 1
נפח 5 מ"ל 44 מ"ל 0.5 מ"ל 5 מיקרון 50 מיקרון 0.5 מ"ל
ריכוז החנות של RA הוא 5 mM, ו טאורין הוא 100 mM.

טבלה 1: מתכונים בינוניים I, II ו- II

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

התמיינות אורגנואידית רשתית היא שיטה רצויה ליצירת תאי רשתית מתפקדים בשפע. ה-RO הוא תרכובת של תאי רשתית שונים, כגון תאי גנגליון, תאים דו קוטביים ופוטורצפטורים, הנוצרים על ידי תאי גזע פלוריפוטנטיים לכיוון הרשתית העצבית 4,5,8,9. למרות שניתן לקצור ROs נפגשים, זה גוזל זמן, מה שעשוי לדרוש תקופות גידול ארוכות (עד 180 יום). עם זאת, עבור השתלת פוטורצפטורים, או חקר ניוון חרוט-מוט או רוד-חרוט, כדאי להשיג אחוז גבוה יחסית של פוטורצפטורים במערכת התרבות התלת-ממדית10.

כמו כן, מאתגר לעקוב אחר התפתחות האורגנואידים מבלי להפריע לתהליכי ההתפתחות הנורמליים. לכן, השתמשנו ב-CRX, חלבון הומיאובוקס של חרוט, המתבטא בעיקר במבשרי פוטורצפטורים, כגן מטרה למעקב אחר תאים מבשרי פוטורצפטור במהלך ההתמיינות התלת-ממדית שלהם. עם מערכת tdTomato, תאים המבטאים CRX יכולים להיות במעקב זמני על ידי הפלואורסצנציה האדומה מבלי להפריע לרטינליזציה במהלך ההתמיינות התלת-ממדית שלהם. השימוש במערכת CRX-tdTomato יכול להאיץ את תהליך בדיקת התרופות להתמיינות מבשר פוטורצפטור ב- ROs.

באמצעות השיטה שלנו, כ-70% אורגנואידים יכולים להתפתח לאורגנואידים ברשתית, המציגים את המבנים דמויי השלפוחית. חשוב לציין שעם חתך של אורגנואידים מעולים, בדרך כלל נוכל לקצור כ-100 אורגנואידים ברשתית מצלחת של 96 בארות. בנוסף, מבשרי פוטורצפטור בשפע נוצרים בשלב מוקדם של הבשלת RO עם תרבית COCO, המסייעת להתקדם לקראת התמיינות ישירה של תאים מסוימים באמצעות ויסות מסלול11,12. ריכוז החלבון של מגיב A הוא קריטי להתמיינות. בסך הכל, מספיק מגיב A עם אגרגטים בימים הראשונים, כמו גם חיתוך של אורגנואידים ביום 18 חשובים כדי לקצור ROs בשפע באיכות גבוהה. שיטה זו גם מקדמת פיתוח של התמיינות כיוונית של תאי פוטורצפטור באורגנואידים תלת-ממדיים ותורמת להשתלת תאי פוטורצפטור.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

אנו מודים לחברי מעבדת 502 על התמיכה הטכנית וההערות המועילות בנוגע לכתב היד. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי הקרן העירונית למדעי הטבע של בייג'ינג (Z200014) ותוכנית המו"פ הלאומית של סין (2017YFA0105300).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-mercaptoethanol Life Technologies 21985-023
COCO R&D Systems 3047-CC-050 DAN Domain family of BMP antagonists
DMEM/F-12 Gibco 10565-042
DMSO Sigma D2650
DPBS Gibco C141905005BT
EDTA Thermo 15575020
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells Biological Industry 04-002-1A
GMEM Gibco 11710-035
KnockOut Serum Replacement-Multi-Species Gibco A3181502
MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X) sigma M7145
Pen Strep Gibco 15140-122
Primesurface 96 V-plate Sbio MS9096SZ Cell aggregation in 1.2.7
Pyruvate Sigma S8636
Reagent A BD 356231 Matrigel in 1.1.1
Reagent B StemCell 5990 mTeSR- E8 , PSCs basal medium in 1.1.2
Reagent C Gibco 12563-011 TrypLE Express in 1.2
Reagent D Roche 11284932001 DNase I , in 1.2
Retinoic acid Sigma R2625-100MG
SAG Enzo Life Science ALX-270-426-M001
Supplement 1 Life Technologies 17502-048 N-2 Supplement (100X), Liquid, supplemet in medum III
Taurine Sigma T-8691-25G
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Gibco 25200056 organoids dissociation in 2.1.3
Wnt Antagonist I, IWR-1-endo - Calbiochem Sigma 681669 Wnt inhibitor
Y-27632 2HCl Selleck S1049

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Xie, H., et al. Chromatin accessibility analysis reveals regulatory dynamics of developing human retina and hiPSC-derived retinal organoids. Science Advances. 6 (6), 5247 (2020).
  2. Lu, Y. F., et al. Single-Cell Analysis of Human Retina Identifies Evolutionarily Conserved and Species-Specific Mechanisms Controlling Development. Developmental Cell. 53 (4), 473-491 (2020).
  3. Cowan, C. S., et al. Cell Types of the Human Retina and Its Organoids at Single-Cell Resolution. Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).
  4. Jin, Z. B., et al. Stemming retinal regeneration with pluripotent stem cells. Progress in Retinal and Eye Research. 69, 38-56 (2019).
  5. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
  6. Pan, D., et al. COCO enhances the efficiency of photoreceptor precursor differentiation in early human embryonic stem cell-derived retinal organoids. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 366 (2020).
  7. Zhou, S., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into cone photoreceptors through simultaneous inhibition of BMP, TGFbeta and Wnt signaling. Development. 142 (19), 3294-3306 (2015).
  8. Deng, W. L., et al. Gene Correction Reverses Ciliopathy and Photoreceptor Loss in iPSC-Derived Retinal Organoids from Retinitis Pigmentosa Patients. Stem Cell Reports. 10 (4), 1267-1281 (2018).
  9. Gao, M. L., et al. Patient-Specific Retinal Organoids Recapitulate Disease Features of Late-Onset Retinitis Pigmentosa. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 128 (2020).
  10. Zhang, C. J., Ma, Y., Jin, Z. B. The road to restore vision with photoreceptor regeneration. Experimental Eye Research. 202, 108283 (2020).
  11. Reichman, S., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U. S. A. 111 (23), 8518-8523 (2014).
  12. Kuwahara, A., et al. Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue. Nature Communications. 6, 6286 (2015).

Tags

רפואה גיליון 170
אינדוקציה מכוונת של אורגנואידים ברשתית מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, X., Jin, Z. B. Directed… More

Zhang, X., Jin, Z. B. Directed Induction of Retinal Organoids from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (170), e62298, doi:10.3791/62298 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter