Summary
이 논문에서는 두 가지 표면 유형에서 세 가지 일반적인 생물막 수확 및 분해 기술, 수확 방법의 견고성 테스트 및 재현성을 높이기 위해 수확 및 분해 기술을 선택하고 최적화 할 때 고려해야 할 최소 정보를 시연하는 방법에 대해 자세히 설명합니다.
Abstract
생물막 방법은 네 가지 별개의 단계로 구성됩니다: 관련 모델에서 생물막을 성장시키고, 성숙한 생물막을 처리하고, 표면으로부터 생물막을 수확하고, 덩어리를 분해하고, 샘플을 분석한다. 네 단계 중 수확과 분해는 가장 적게 연구되었지만 그럼에도 불구하고 테스트 편향의 가능성을 고려할 때 중요합니다. 이 기사는 세 가지 다른 표면에서 자란 생물막에 일반적으로 사용되는 수확 및 분해 기술을 보여줍니다. 광범위한 문헌 검토에서 수집 된 세 가지 생물막 수확 및 분해 기술에는 볼텍싱 및 초음파 처리, 긁기 및 균질화, 긁기, 볼텍싱 및 초음파 처리가 포함됩니다. 두 가지 표면 유형이 고려됩니다 : 경질 비 다공성 (폴리 카보네이트 및 붕규산염 유리)과 다공성 (실리콘). 또한 우리는 수확 기술을 보고 할 때 포함되어야하는 최소 정보에 대한 권장 사항과 편향을 검사하기위한 동반 방법을 제공합니다.
Introduction
생물막의 정의는 지난 수십 년 동안 진화해 왔으며 다양한 생물학적 및/또는 비생물학적 표면과의 미생물 연관성을 포함하며, 매트릭스 내에서 서로 다른 성장과 유전자 발현을 나타내는 비세포 성분1을 포함한다2. 생물막은 건조와 같은 환경 스트레스로부터 보호를 제공하며 화학 소독제의 작용을 덜 효과적으로 만들어 미생물의 생존을 초래할 수 있습니다. 생물막 내의 생존자들은 잠재적으로 공중 보건 관심사인 병원성 미생물의 공급원을 제공할 수 있다3.
생물막 방법은 성장, 처리, 샘플링 (수확 및 분해) 및 분석의 네 단계로 구성됩니다. 사용자가 유기체 성장 조건, 온도, 배지 등을 결정하는 첫 번째 단계인 성장은 생물막 문헌4,5,6,7에서 가장 많이 고려되고 보고된다. 처리 단계는 성숙한 생물막3,8,9에 대한 그들의 효능을 결정하기 위해 항미생물제 (예를 들어, 소독제)를 평가하거나 항미생물이 생물막 성장을 예방하거나 감소시키는 생성물의 능력을 결정하기 위해 표면에 혼입될 수 있다10. 세 번째 단계, 샘플링은, 그것이 성장하던 표면으로부터 생물막을 수확하고 제거된 덩어리를 분해하는 단계3,8,11를 포함한다. 네 번째 단계인 분석은 실행 가능한 세포 계수, 현미경, 형광 측정, 분자 결과, 및/또는 매트릭스 성분 평가8,9를 포함할 수 있다. 데이터 평가는 실험 결과에 대한 정보를 제공합니다. 네 가지 중 샘플링은 종종 가장 간과되는 단계인데, 이는 선택된 생물막 수확 및/또는 분해 기술이 100% 효과적이며, 종종 검증 없이 효과적이라고 가정하기 때문이다11.
종종 균질한 것으로 간주되는 박테리아의 플랑크톤 현탁액은 분석 전에 간단한 볼텍싱이 필요합니다. 그러나 생물막은 미생물(원핵 및/또는 진핵생물), 외래다당류, 단백질, 지질, 세포외 DNA 및 숙주 세포로 구성된 복잡한 군집이다12. 전통적인 플랑크톤 미생물 배양 방법을 넘어서는 단계는 표면에서 생물막을 적절하게 수확 한 다음 균질 한 단일 세포 현탁액으로 분해하기 위해 필요합니다. 광범위한 문헌 검토 (이 간행물에 포함되지 않은 정보)는 제거 및 응집 기술의 선택이 생물막에 존재하는 종, 생물막이 부착되는 표면 (비다공성 또는 다공성), 성장 표면에 대한 접근성 (쉽게 제거 가능한 쿠폰 또는 생물막이 성장하는 장치의 물리적 파괴)을 포함한 여러 요인에 의존한다는 것을 입증했습니다. 표면 기하학 (면적 및 모양), 성장 표면의 생물막 밀도 및 사용 가능한 실험실 장비.
생물막이 표면으로부터 수확될 때, 생성된 세포 현탁액은 이질적이다. 이러한 불균일한 현탁액이 정확하게 열거되려면, 개별 세포로 분해되어야 한다. 실행 가능한 플레이트 카운트는 콜로니 형성 단위가 하나의 박테리아에서 유래했다고 가정합니다. 생물막의 응집체가 성장 배지 상에 놓여진다면, 부정확한 추정으로 이어질 수 있는 개별 세포를 구별하는 것은 불가능하다. 예를 들어, 소독제 효능 시험 동안, 만약 치료가 대조군에 비해 표면으로부터 생물막을 매우 효과적으로 제거한다면, 로그 감소는 대조군에 비해 인위적으로 크게 나타날 수 있다. 한편, 생물막을 표면에 고정시키는 화학적 소독제는 대조군에 비해 더 낮은 로그 감소를 갖는 것으로 보일 것이다11. 이러한 유형의 시나리오는 실험 데이터에 대한 편향된 해석으로 이어질 수 있습니다.
출판을 준비하면서, 문헌의 검토는 생물막을 수확하고 분해하는 일반적인 접근법이 긁힘, 면봉, 초음파 처리, 볼텍싱 또는 이들의 조합을 포함한다는 것을 결정했다. 긁는 것은 멸균 스틱, 주걱 또는 기타 도구가있는 표면에서 생물막을 물리적으로 제거하는 것으로 정의됩니다. 면봉은 면이 기울어진 스틱 또는 다른 고정 흡수성 물질로 표면으로부터 생물막을 제거하는 것을 말한다. 초음파 처리는 물을 통해 분포 된 초음파를 통해 표면에서 생물막이 파괴되는 것을 말합니다. 볼텍싱은 튜브 내부의 샘플의 액체 와류를 달성하기 위해 믹서를 사용하는 것을 말합니다. 균질화는 회전 블레이드를 사용하여 수확된 생물막 덩어리를 단일 세포 현탁액으로 전단합니다. 이 논문에서는 경질 / 비 다공성 및 다공성의 두 가지 표면 유형에 대한 세 가지 수확 및 분해 방법을 제시합니다.
연구자가 출판물의 방법 섹션에 포함시켜야하는 권장 최소 정보 목록이 제공됩니다. 우리는이 정보를 포함하면 다른 연구자가 자신의 연구를 재현 할 수 있기를 바랍니다. 완벽한 수확 및 분해 방법이 없으므로 기술을 확인하는 방법에 대한 권장 사항도 제공됩니다.
일반적인 성장 표면에서 생물막을 수확하고 분해하는 세 가지 일반적인 방법이 이 기사에서 입증된다. 이 정보를 통해 연구원은 생물막 테스트 방법의 전반적인 정밀도와 편향성을 더 잘 이해할 수 있습니다. 기술된 방법은 다음과 같다: (1) CDC 생물막 반응기에서 높은 유체 전단 하에서 폴리카보네이트 쿠폰(경질 비다공성 표면) 상에서 성장한 슈도모나스 aeruginosa 생물막은 생물막 수확 및 붕산을 달성하기 위해 볼텍싱과 초음파 처리의 다섯 단계 조합에 따라 수확 및 분해된다 (2) A P. aeruginosa 저유체 전단 하에서 점적 유동 반응기에서 붕규산염 유리 쿠폰 (경질 비다공성 표면) 상에서 성장한 생물막은 스크래핑 및 균질화를 사용하여 수확 및 분해된다 (3) 실리콘 튜빙 (다공성 표면)에서 성장한 에스케리치아 콜리 생물막은 스크래핑을 사용하여 수확 및 분해되고, 이어서 초음파 처리 및 볼텍싱된다.
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Protocol
1. 소용돌이 및 초음파 처리
- 성숙한 P. aeruginosa ATCC 15442 생물막을 ASTM 표준 E25622에 따라 성장시켰다.
- 48 시간의 성장 기간이 끝나면 ASTM 표준 E28718에 따라 생물막 및 샘플 쿠폰을 처리 할 준비를하십시오.
- 무균적으로 오토클레이브 스플래시 가드를 화염 멸균된 포셉을 사용하여 멸균된 50mL 코니컬 튜브에 삽입합니다. 치료를받을 모든 튜브에 대해 반복하십시오. 제어 쿠폰 용 튜브에는 스플래시 가드가 필요하지 않습니다.
- CDC 생물막 반응기로부터 무작위로 선택된 막대를 무균적으로 제거한다. 쿠폰을 헹구어 막대를 멸균 완충수 30mL에 부드럽게 담그어 느슨하게 부착된 세포를 제거합니다.
- 막대를 벤치 상단과 평행하게 잡고 비어있는 멸균 된 50mL 원뿔형 튜브 위에 놓고 화염 살균 된 Allen 렌치를 사용하여 세트 나사를 풀어 바이오 필름 코팅 쿠폰을 튜브에 떨어 뜨립니다. 원하는 쿠폰 수에 대해 반복하십시오. 스플래시 가드를 제거하고 살균을 위해 별도의 용기에 넣으십시오.
- 5 mL 혈청학적 피펫을 사용하여, 4 mL의 피펫을 천천히 피펫으로 처리하거나 튜브 내로 제어하여 액체가 튜브 벽의 내부로 흐르도록 한다.
- 쿠폰 아래의 기포가 옮겨지도록 튜브 바닥을 부드럽게 누릅니다. 각 추가 사이에 30 - 60초를 허용합니다.
- 지정된 접촉 시간의 끝에서, 피펫 36 mL의 중화제를 처리(또는 대조군)가 적용된 것과 동일한 순서로 튜브에 넣었다.
참고: 복합 처리 및 중화제의 최종 부피는 생물막 로그 밀도를 정확하게 결정하는 데 중요합니다. - 30 ± 5 초 동안 가장 높은 설정에서 각 튜브를 소용돌이치십시오. 완전한 소용돌이가 달성되었는지 확인하십시오.
참고: 파손이 발생할 수 있는 유리 바이알에 스테인레스 스틸과 같은 무거운 쿠폰을 볼텍싱할 때는 주의해야 합니다. - 욕조당 최적의 튜브 수를 결정하고 실제 샘플을 처리하기 전에 시험관 랙 내에 배치하십시오. 여러 샘플을 처리하는 경우 초음파 처리조의 수온이 21 ± 2oC인지 확인하십시오.
- 욕조의 수위가 튜브의 액체 수준과 같도록 탈기 된 초음파 처리기에 현탁 된 튜브 랙에 튜브를 놓습니다. 45kHz에서 초음파 처리, 100 % 전력 및 30 ± 5 초 동안 정상 기능. 소용돌이 및 초음파 처리 사이클을 반복 한 다음 최종 소용돌이 (총 5 사이클)로 끝납니다.
참고: 수확되고 분해된 생물막을 갖는 이들 튜브는 the100 또는 0 희석물이다. - 샘플을 완충된 물에 연속적으로 희석한다. 적절한 도금 방법을 사용하여 R2A 한천에 플레이트하십시오. 36 ± 2 oC에서 24 h 동안 인큐베이션한다. 사용 된 도금 방법에 따라 콜로니를 계산하고 데이터를 기록하십시오.
2. 긁기 및 균질화
- 성숙한 P. aeruginosa ATCC 15442 생물막을 ASTM 표준 E264713에 따라 성장시킨다.
- 샘플링 보드, 비이커의 95 % 에탄올, 알코올 버너, 지혈제, 쿠폰 제거 도구, 멸균 희석수가 함유 된 비커 및 쿠폰을 헹구기위한 희석 튜브를 포함하도록 샘플링 스테이션을 설정하십시오.
- 펌프를 끕니다. 채널 커버를 제거하고 멸균 쿠폰 제거 도구 및 지혈제를 사용하여 쿠폰을 제거하고 생물막을 방해하지 않도록주의하십시오.
- 45 mL의 멸균 희석수 (50 mL 원심분리 튜브에 담김)에 유체 운동으로 부드럽게 침지하여 쿠폰을 헹구십시오. 쿠폰을 제거하기 위해 즉시 움직임을 반전시킵니다.
- 쿠폰을 멸균 희석수 45 mL가 들어있는 비이커에 넣으십시오. 멸균 주걱 또는 스크레이퍼를 사용하여 생물막으로 덮인 쿠폰 표면을 약 15초 동안 아래쪽 방향으로 긁어냅니다. 주걱이나 스크레이퍼를 비이커에서 저어서 헹구십시오. 긁어 모으고 헹굼하는 과정을 3-4 번 반복하여 쿠폰 표면이 완전히 커버되도록하십시오.
- 쿠폰을 멸균 비이커 위에 60° 각도로 잡고 쿠폰 표면에 멸균 희석수 1mL를 피펫팅하여 쿠폰을 헹구십시오. 총 5 번의 헹굼을 반복하십시오. 비이커의 최종 부피는 50 mL이다.
참고: 복합 처리 및 중화제의 최종 부피는 생물막 로그 밀도를 정확하게 결정하는 데 중요합니다. - 쿠폰이 분리되면 각 채널 덮개를 교체합니다.
- 생물 안전 캐비닛에서 작업하면서 스크랩 된 생물막 샘플을 균질화하십시오. 멸균 균질기 프로브를 균질 기에 부착하고 프로브 팁을 액체에 넣고 균질 기를 켜고 20,500 rpm까지 램프하십시오.
- 샘플을 30초 동안 균질화한다. RPM을 끄고 균질기를 끕니다.
- 상기와 같이 9 mL의 멸균 희석 블랭크를 20,500 rpm에서 30 s 동안 균질화하여 생물막 샘플 사이의 프로브를 살균한다. 70% 에탄올로 된 9 mL 튜브를 30초 동안 균질화하고, 프로브를 분리하고, 에탄올 튜브에 1분 동안 방치한다. 두 개의 추가 희석 블랭크를 균질화한다.
참고: 일회용 호모게나이저 프로브가 각 샘플에 사용될 수 있습니다. - 샘플을 완충된 물에 연속적으로 희석한다. 적절한 도금 방법을 사용하여 R2A 한천 상에 플레이트한다. 플레이트를 36± 2oC에서 24시간 동안 인큐베이션하고, 사용된 도금 방법에 따라 콜로니를 계수하고 데이터를 기록한다.
3. 긁기, 소용돌이 및 초음파 처리
- 성숙한 에스케리치아 콜리 ATCC 53498 바이오필름을 실리콘 카테터 튜빙에서 성장10.
- 샘플링 재료를 준비하십시오 : 헹굼 튜브, 멸균 원심 분리 튜브, 빈 멸균 페트리 접시, 화염 멸균 된 스테인레스 스틸 지혈제 및 가위, 타이머 및 통치자.
- 펌프를 일시 중지 한 상태에서 70 % 에탄올을 사용하여 튜브 외부를 청소하십시오. 끝에서 2cm를 측정하여 커넥터에 부착된 영역을 피하고 튜브에 표시하여 절단 위치를 결정합니다.
- 화염 살균 가위로 튜브를 2cm 마크로 자르고 빈 멸균 페트리 접시에 세그먼트를 놓습니다. 튜브를 70% 에탄올로 닦아내고 원위 단부를 폐튜브에 다시 연결합니다.
- 튜브 세그먼트를 헹구어 플랑크톤 세포를 제거하십시오. 화염 멸균 포셉으로 튜브 세그먼트를 멸균 희석수 20mL에 부드럽게 담근 다음 즉시 제거하십시오. 세그먼트를 중화제 10mL에 넣습니다.
- 화염 살균 포셉으로 튜브 세그먼트를 잡고 튜브의 모든 내부 영역이 긁힐 때까지 멸균 된 목재 어플리케이터 스틱으로 긁어 내십시오. 때때로 중화제 10mL에 스틱을 헹구고 세그먼트를 다시 샘플 튜브에 넣습니다. 스크랩된 튜빙 세그먼트는 100 또는 0 희석이다.
참고: 복합 처리 및 중화제의 최종 부피는 생물막 로그 밀도를 정확하게 결정하는 데 중요합니다. - 30 ± 5 초 동안 가장 높은 설정에서 각 튜브를 소용돌이치십시오. 욕조의 수위가 튜브의 액체 수준과 같도록 초음파 발생기에 현탁 된 튜브 랙에 튜브를 놓습니다. 45kHz에서 초음파 처리, 100 % 전력 및 30 ± 5 초 동안 정상 기능. 소용돌이 및 초음파 처리 사이클을 반복 한 다음 최종 소용돌이로 끝납니다.
참고: 수확되고 분해된 바이오필름을 갖는 이 튜브는 100 희석액이다. - 샘플을 완충된 물에 연속적으로 희석한다. 적절한 도금 방법을 사용하여 트립틱 콩 한천 상에 플레이트.
- 플레이트를 36± 2 °C에서 24시간 동안 인큐베이션한다. 사용 된 도금 방법에 따라 콜로니를 계산하고 데이터를 기록하며 산술 평균을 계산하십시오.
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Representative Results
수확 방법의 검증/확인
우리 실험실에서 수행 된 여러 연구는 단일 튜브 방법 (ASTM E2871)8을 사용하여 생물막 반응기 (ASTM E2562)2에서 자란 생물막을 효과적으로 수확하기 위해 볼텍싱 및 초음파 처리 능력을 조사했습니다.
P. aeruginosa ATCC 15442 생물막을 보로실리케이트 유리 쿠폰 상에서 ASTM E25622에 따라 성장시켰다. 48시간 후, 4개의 쿠폰을 바이알에 넣고, 4 mL 멸균 완충수로 "처리"하고, 36 mL의 2x D/E 중화 브로스로 중화시켰다. 45kHz, 10% 전력, 스윕 설정, 30 ± 5 s의 초기 초음파 처리 설정을 사용하여 4개의 쿠폰 중 세 개로부터 생물막을 수확하고 분해하였다. 소용돌이 및 초음파 처리 사이클이 완료되면, 각 쿠폰을 크리스탈 바이올렛으로 염색하고 촬영하였다. 도 1은 대조군과 비교하여 볼텍싱 및 초음파 처리 후 세 개의 쿠폰 상에 남아있는 생물막의 양을 보여준다.
이를 추가로 시험하기 위해, P. aeruginosa ATCC 15442 생물막이 앞서 기술한 바와 같이 성장하였고, 두 개의 초음파 처리 설정을 비교하였다: 1) 45kHz, 10% 전력, 스윕 설정, 30 ± 5초 및 2) 45kHz, 100% 전력, 정상 설정, 30 ± 5초. 세 세트의 각 세트에서 하나의 쿠폰을 BacLight Live/Dead 얼룩으로 염색하고 공초점 현미경 (CM)을 사용하여 이미지화했습니다. 각 세트로부터의 나머지 두 개의 쿠폰을 희석하고, 플레이팅하고, 생존 가능한 세포에 대해 열거하였다. 실행 가능한 플레이트 카운트 결과는 설정 1의 경우 9.230 Log10 CFU/쿠폰 ± 0.007(SD_R), 초음파 처리 설정 2의 경우 9.272 Log10 CFU/쿠폰 ± 0.066(SD_R)이었습니다. 이 데이터는 9.03 Log10 CFU/쿠폰 ± 0.272 (SD_R)가 달성된 2015년 EPA 단일 튜브 방법 협업 연구를 확증했습니다9. 실행 가능한 플레이트 카운트에 따르면, 세 가지 수단 모두 두 가지 수확 방법의 차이점에 대한 추가 조사를 보증하지 않을 정도로 유사 한 것으로 보입니다. 그러나, 도 2에 도시된 현미경 이미지는 설정 2보다 설정 1의 사용 후에 더 많은 생물막이 남아 있음을 시사할 수 있다. 쿠폰에 남아있는 생물막이 죽은 것처럼 보이는 것을 관찰하는 동안 (빨간색), BacLight Live / Dead stain을 사용할 때 생존 가능성에 대한 해석은 어렵습니다.14,15. 염색된 생물막의 생존 가능성에 초점을 맞추기보다는, 우리는 이 얼룩을 사용하여 표면에 남아있는 생물막을 시각화했습니다. 또한, 우리는 초음파 처리가 박테리아 생존력에 해로울 수 있음을 인정하지만, Kobayashi et al.16의 2007 년 간행물은 초음파 처리 시간이 5 미누에 이상으로 증가하면 실행 가능한 플레이트 수가 감소한다는 것을 보여주었습니다. 우리의 연구는 총 1 분의 초음파 처리를 사용했기 때문에 두 가지 초음파 처리 매개 변수에 대한 >9.2 LOG10 CFU / 쿠폰에서 볼 수 있듯이 초음파 처리를 통해 사망 한 세포가 거의 없다고 확신합니다. 표면에서 생물막의 완전한 수확이 어느 방법으로도 달성되지 않았다는 것은 흥미 롭습니다. 이 발견은 실행 가능한 플레이트 수만으로는 수확 및 분해 편향을 결정하기에 적절하지 않으므로 예를 들어 현미경과 같은 추가 방법과 쌍을 이루어야한다는 것을 보여줍니다.
초음파 처리 장치 설정 외에도 초음파 처리에 영향을 미치는 다른 중요한 요소를 조사했습니다. 여기에는 바이알의 액체 부피 (10 또는 40 mL), 바이알의 액체 유형 (완충 된 물 또는 2X D / E 중화 브로스) 및 동시에 욕조에 놓인 바이알 수 (3 또는 12 바이알)9가 포함됩니다.
CDC 바이오필름 반응기 쿠폰 상의 P. aeruginosa 바이오필름은 초음파 처리기 설정 2(45kHz, 100% 전력, 정상 설정, 30± 5초)를 사용하여 초음파 처리하였다. 모든 샘플은 도 3에 설명된 바와 같이 초음파 처리한 후 6-장소 튜브 부착물이 장착된 볼텍서를 사용하여 한 번에 3개 또는 한 번에 6개씩 볼텍싱하였다. 다음 각 카테고리의 쿠폰 하나는 CM을 사용하여 이미지화되었습니다(그림 3).
초음파 처리 파라미터를 조사한 두 번째 연구에서, 현미경 이미지(그림 3)는 튜브의 부피를 최소화하고, 한 번에 처리되는 튜브 수를 줄이며, D/E 중화 브로스(계면활성제 포함)를 사용하는 것이 모두 쿠폰에서 향상된 생물막 수확에 기여한다는 것을 암시합니다.
살생물제는 긍정적으로 또는 부정적으로 수확 및 분해를 향상시킬 수 있습니다. 중화제가 효능 시험을 수행하기 전에 사멸을 증가시키지 않으면서 활성을 효과적으로 정지시킨다는 것을 확인하는 것과 유사하게, 살생물제가 수확 및 분해에 차별적으로 영향을 미치지 않는다는 것을 확인하는 것이 중요하다. 효능 시험을 위해, 바이어스 결과는 대조군 대 처리된 생물막 샘플에 대한 차등 제거가 있는 경우에만 결과11이다.
그림 1: 잔여 생물막을 보여주는 크리스탈 바이올렛으로 염색된 쿠폰 사진. A) 쿠폰을 반응기에서 제거하고 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. B, C, D) 세 개의 복제 쿠폰을 멸균 완충수로 개별적으로 "처리"한 후 중화시켰다. 수확 및 분해하기 위해, 쿠폰을 볼텍싱(30± 5초) 초음파 처리(45kHz, 10% 전력, 스윕 설정, 30± 5초)한 다음 최종 소용돌이를 받았다. 이미지 제공: Danielle Orr와 Blaine Fritz. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 두 개의 서로 다른 초음파 처리 설정을 비교하는 쿠폰의 공초점 현미경 이미지. 쿠폰 (12.5X 배율)은 왼쪽의 초음파 설정 1 (45kHz, 10 % 전력, 스윕 설정) 또는 오른쪽의 초음파 처리 설정 2 (45kHz, 100 % 전력, 일반 설정)를 통해 처리됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 부피, 초음파 처리 액체 및 튜브 수를 비교하는 쿠폰의 공초점 현미경 이미지. 쿠폰 (12.5X 배율)은 희석수 (DW) 또는 D / E 중화 국물 (D / E), 최적화 된 초음파 처리 설정 (45kHz, 100 % 전력, 정상 설정)으로 한 번에 3 개 또는 12 개의 튜브에서 10 또는 40 mL 볼륨으로 처리됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1 : 수확 및 분해에 중요한 주요 매개 변수는이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
수확 및 분해 방법에 대한 최소 정보
과학계에 걸쳐 재현 가능한 생물막 데이터를 작성하려면 저자가 생물막 방법의 성장, 치료, 샘플링 및 분석 단계에 대해 가능한 한 많은 세부 사항을 포함시켜야합니다. 생물막 방법의 표준화는 연구자가 특정 방법과 관련 수정을 참조 할 수있게 해주기 때문에 이러한 노력에 도움이되었습니다. 그러나 많은 논문에는 생물막 수확 및 분해를 설명하는 한 두 문장 만 포함되어 있습니다. 더 나은 재현성을 위해, 우리는 생물막 수확에 대한 최소한의 정보가 출판물에 포함되도록 권장합니다. 이것은 Lourenco et al.17이 제시 한 생물막 실험 (MIABiE)에 대한 최소 정보를 기반으로합니다. 생물막 수확 및 분해 매개 변수에 초음파 처리를 사용하는 경우 정보에는 욕조 내의 튜브 위치 (트랜스 듀서의 손상을 방지하기위한 제조업체의 권장 사항), 동시에 초음파 처리 된 튜브 수, 튜브 재료, 튜브 내 액체의 부피 및 유형, 계면 활성제의 존재, 초음파 욕조의 액체 수준에 비해 튜브의 액체 위치, 욕조에 튜브를 고정시키는 데 사용되는 장치 (유리 비커 대 시험관 랙), 샘플의 초음파 처리 전에 수조의 가스 제거 (가스 제거가 제조업체 옵션이 아닌 경우 샘플을 삽입하기 전에 욕조를 간단히 작동하면 욕조 액체에서 용해 된 가스를 제거하는 데 도움이됩니다), 수조의 온도 (장시간 초음파 처리 후 온도가 상승 할 수 있음), 주파수(예: 25kHz 또는 45kHz), 배스 기능(예: 스윕 또는 노멀) 및 트랜스듀서에 전달되는 전력 범위(예: 10 - 100%). 이러한 설정은 연구되는 생물막, 생물막을 성장시키는 데 사용되는 시스템 및 초음파 욕조의 특정 제조 / 모델에 최적화되어야합니다18.
원하는 수확 효과를 최적화하기 위해 초음파 설정을 변경할 수 있습니다. 탈기는 욕조 액체 내의 용해 된 공기를 제거하여 세척력을 향상시킵니다. 주파수는 낮거나 높은 설정으로 조정할 수 있습니다. 예를 들어, 25kHz와 같은 낮은 설정은 끈질긴 샘플을 수확하는 데 도움이 되는 반면, 45kHz의 높은 설정은 민감한 샘플에 더 적합합니다. 스윕 또는 노멀의 목욕 기능은 캐비테이션의 분포를 허용합니다. 스윕 기능은 음압 최대치의 지속적인 시프트를 생성합니다. 정상적인 기능을 통해 트랜스듀서는 이중 반파 모드에서 작동하여 데드 존을 초래할 수 있으므로 초음파 처리의 효율성이 떨어집니다. 전력 범위는 트랜스듀서에 전달되는 전력의 10 - 100%에서 변경될 수 있습니다19. 초음파 처리는 박테리아의 생존력에 해로운 영향을 줄 수 있다고 알려져 있습니다. Stamper et al.20의 2008 년 연구에 따르면 박테리아 배양은 박테리아 킬 곡선을 만들기 위해 시간이 지남에 따라 울트라 소니스 에너지를 증가시킵니다. 우리는 사용자가 초음파 처리 설정의 특정 조합이 생존 가능한 박테리아의 감소를 일으키지 않는다는 것을 확인하는 것이 좋습니다20.
생물막을 수확하고 분해하는 완벽한 방법은 없지만 특정 방법은 일부 표면 / 미생물 조합에서 다른 방법보다 더 잘 작동합니다. 우리는 독자가 특정 생물막 시나리오에 어떤 매개 변수가 중요한지 결정하도록 옹호합니다. 수확 및 분해에 중요한 주요 매개 변수는 보충 파일 1에 포함되어 있습니다.
수확 및 분해 편향을 평가하기 위해 수행 된 초음파 처리 연구의 경우, 우리는 초음파 처리가 편리하고 효율적이며 표면에서 생물막을 수확하고 분해하기 위해 표준화 될 수 있음을 발견했습니다. 바이알에 쿠폰을 배치하면 예를 들어 실험실 직원이 쿠폰을 물리적으로 긁어내는 방법에서 발생할 수있는 기술자의 변동성을 최소화 할 수 있습니다. 초음파 처리 수조에 바이알을 놓을 수있을만큼 단순 해 보이지만 생물막의 최적 수확을 달성하기 위해 고려해야 할 많은 매개 변수가 있습니다.
초음파 처리 장비의 두 가지 유형, 초음파 욕조와 초음파 프로브를 사용할 수 있습니다. 이 논문은 주로 높은 (20 - 45kHz)에서 정상 (40 - 60Hz) 주파수 범위에서 초음파 에너지가 생성되는 초음파 욕조에 중점을 둡니다.
초음파 장치를 사용하여 표면을 청소할 때 세 가지 주요 프로세스가 작동합니다. 전기 에너지는 고주파 전류가 전류에 반응하여 진동하는 압전 또는 자기 변형기로 보내질 때 음향 에너지로 변환됩니다. 진동은 액체에 압축 (희귀) 파동을 생성합니다. 캐비테이션 버블은 희귀 한 동안 음압으로 인해 형성됩니다. 거품은 불안정한 크기에 도달하고 붕괴 될 때까지 성장하여 표면을 청소하는 워터 제트를 만듭니다21.
이 기사에서 세 가지 수확 및 분해 접근법이 입증됩니다 : 단일 튜브 방법에 따라 CDC Biofilm Reactor의 폴리 카보네이트 쿠폰에서 자랄 때 생물막을 수확하고 분해하기위한 초음파 처리 및 볼텍싱 방법. 생물막을 수확 및 분해하기 위한 스크래핑 및 균질화 방법은 드립 플로우 바이오필름 반응기를 사용하여 유리 쿠폰 상에서 성장시킬 때 보여진다. 실리콘 튜브에서 성장했을 때 생물막을 수확하고 분해하기 위한 스크래핑, 초음파 처리 및 볼텍싱 방법이 표시됩니다.
생물막을 수확하고 분해하는 완벽한 방법은 없지만 일부 접근법은 다른 표면 및 / 또는 응용 분야에 더 좋습니다. 중요한 것은 사용 된 방법의 유효성을 검사하는 데 시간을 할애하는 것입니다. 이 논문에서는 크리스탈 바이올렛과 현미경의 사용에 대해 논의했지만 필요한 감도에 따라 다른 선택이 존재합니다. 연구에 효능 테스트가 포함 된 경우 항균제6가있는 상태에서 접근법의 유효성을 확인하는 것이 중요합니다. 모든 장비는 약간 다르므로 수확 및 분해 방법이 표준화 되더라도 사용 된 장비의 공정을 확인하는 것이 현명합니다. 수확 및 분해 방법은 표면 관련 및 생물막 박테리아에 특이적이다. 연구에 따르면 부적절한 선택은 편향된 테스트 결과로 이어질 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 수확 및 분해는 생물막 방법의 네 단계 중 가장 적게 연구된 것이다. 또한 일반적으로 출판된 논문에 최소한의 정보가 있는 검증되지 않은 단계(작업으로 당연하게 여겨짐)이므로 다른 실험실에서 프로세스를 재현하기가 어렵습니다. 이 백서와 함께 제공되는 비디오에서는 두 가지 표면 유형에 대한 세 가지 일반적인 접근 방식을 보여 주며 개별 실험실에 대한 방법의 유효성을 검사하는 방법을 제안합니다. 이 정보는 연구자가 어떤 방법을 사용할지에 대한 정보에 입각 한 결정을 내리는 데 도움이되며 재현성을 향상시키기 위해보고 할 내용에 대한 지침을 제공합니다.
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Disclosures
저자는 공개가 없습니다.
Acknowledgments
우리는 Danielle Orr Goveia, Blaine Fritz, Jennifer Summers 및 Fei San Lee가이 논문에 기여한 것을 인정하고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL conical vials | Thermo Scientific | 339652 | |
| 100 mL glass beakers | Fisher Scientific | FB102100 | |
| 5 mL serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-12D | For adding treatment to vials containing coupons. |
| 50 mL serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-14C | For adding neutralizer to vials at the end of treatment contact time. |
| Applicator sticks | Puritan | 807 | |
| Hemostats | Fisher Scientific | 16-100-115 | |
| Metal spatula | Fisher Scientific | 14-373 | |
| PTFE policemen | Saint-Gobain | 06369-04 | |
| S 10 N - 10 G - ST Dispersing tool | IKA | 4446700 | For homogenization of biofilm samples. |
| Scissors | Fisher Scientific | 08-951-20 | |
| Silicone Foley catheter, size 16 French | Medline Industries | DYND11502 | |
| Silicone tubing, size 16 | Cole-Parmer | EW96400-16 | |
| Splash Guards | BioSurface Technologies, Inc. | CBR 2232 | |
| T 10 basic ULTRA-TURRAX Disperser | IKA | 3737001 | For homogenization of biofilm samples. |
| Tubing connectors | Cole-Parmer | EW02023-86 | |
| Ultrasonic Cleaner | Elma | TI-H15 | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Vortex-Genie 2 Vertical 50 mL Tube Holder | Scientific Industries | SI-V506 |
References
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