Summary
Dette dokumentet beskriver metoder som demonstrerer tre vanlige biofilmhøstings- og disaggregeringsteknikker på to overflatetyper, robusthetstesting av en høstingsmetode og minimumsinformasjon å vurdere når du velger og optimaliserer høstings- og disaggregatasjonsteknikker for å øke reproduserbarheten.
Abstract
Biofilmmetoder består av fire forskjellige trinn: å dyrke biofilmen i en relevant modell, behandle den modne biofilmen, høste biofilmen fra overflaten og dele opp klumpene og analysere prøven. Av de fire trinnene er høsting og disaggregering minst studert, men likevel kritisk når man vurderer potensialet for testbias. Denne artikkelen demonstrerer ofte brukte høstings- og disaggregeringsteknikker for biofilm dyrket på tre forskjellige overflater. De tre biofilmhøstings- og disaggregatasjonsteknikkene, hentet fra en omfattende litteraturgjennomgang, inkluderer virvel- og sonikering, skraping og homogenisering, og skraping, virveling og sonikering. To overflatetyper vurderes: hard ikke-porøs (polykarbonat og borosilikatglass) og porøst (silikon). I tillegg gir vi anbefalinger for minimumsinformasjonen som bør inkluderes når du rapporterer høstingsteknikken som følges og en tilhørende metode for å se etter skjevheter.
Introduction
Definisjonen av biofilm har utviklet seg de siste tiårene og omfatter mikrobiell tilknytning til en rekke biologiske og/eller ikke-biologiske overflater, inkludering av ikke-cellulære komponenter1 som viser forskjellig vekst og genetisk uttrykk2 i en matrise. Biofilm gir beskyttelse mot miljøbelastninger som tørking og kan gjøre virkningen av kjemiske desinfeksjonsmidler mindre effektiv, noe som resulterer i overlevelse av mikrober. De overlevende i en biofilm kan potensielt gi en kilde til patogene mikroorganismer som er et folkehelseproblem3.
Biofilmmetoder består av fire trinn, vekst, behandling, prøvetaking (høsting og disaggregering) og analyse. Vekst, det første trinnet, hvor brukeren bestemmer organismens vekstforhold, temperatur, media, etc., er det mest gjennomtenkte og rapporterte i biofilmlitteraturen4,5,6,7. Behandlingstrinnet evaluerer antimikrobielle midler (f.eks. desinfeksjonsmidler) for å bestemme effekten enten mot en moden biofilm3,8,9 eller den antimikrobielle kan innlemmes i overflaten for å bestemme produktets evne til å forhindre eller redusere biofilmvekst10. Det tredje trinnet, prøvetaking, inkluderer trinn for å høste biofilmen fra overflaten den vokste på og for å disaggregatere de fjernede klumpene3,8,11. Det fjerde trinnet, analyse, kan omfatte levedyktige celletall, mikroskopi, fluorescensmålinger, molekylære resultater og/eller en matrisekomponentvurdering8,9. Vurdering av data gir informasjon om utfallet av et eksperiment. Av de fire er prøvetaking ofte det mest oversett trinnet fordi det forutsetter at den valgte biofilmhøstings- og / eller disaggregeringsteknikken er 100% effektiv, ofte uten verifisering11.
Planktoniske suspensjoner av bakterier, ofte ansett for å være homogene, krever enkel virveling før analyse. Biofilmer er imidlertid komplekse samfunn som består av mikroorganismer (prokaryote og/eller eukaryote), eksopolysakkarider, proteiner, lipider, ekstracellulært DNA og vertsceller12. Trinn utover tradisjonelle planktoniske mikrobiologiske kulturmetoder er nødvendig for å tilstrekkelig høste biofilm fra en overflate og deretter dele den opp i en homogen encellet suspensjon. En omfattende litteraturgjennomgang (informasjon som ikke er inkludert i denne publikasjonen) viste at valget av fjernings- og de aggregeringsteknikk er avhengig av en rekke faktorer, inkludert arter som er tilstede i biofilmen, overflaten som biofilmen er festet til (ikke-porøs eller porøs), tilgjengelighet til vekstflater (lett avtagbar kupong eller fysisk ødeleggelse av apparater der biofilmen vokser), overflategeometri (areal og form), tetthet av biofilm på vekstflater og tilgjengelig laboratorieutstyr.
Når biofilm høstes fra en overflate, er den resulterende cellefjæringen heterogen. Hvis denne ikke-enhetlige suspensjonen skal nummereres nøyaktig, må den deles opp i enkeltceller. Levedyktige platetall antar at en kolonidannende enhet stammer fra en bakterie. Hvis aggregater av biofilm plasseres på vekstmediet, er det umulig å skille mellom individuelle celler som kan føre til unøyaktige estimater. For eksempel, under desinfiserende effekttesting, hvis en behandling fjerner biofilm veldig effektivt fra en overflate sammenlignet med kontrollen, kan loggreduksjonen virke kunstig stor sammenlignet med kontrollen. På den annen side vil et kjemisk desinfeksjonsmiddel som fikser biofilm på en overflate sammenlignet med kontrollen, se ut til å ha en lavere loggreduksjon11. Denne typen scenario kan føre til partisk tolkning av eksperimentelle data.
Som forberedelse til publikasjonen fastslo en gjennomgang av litteraturen at vanlige tilnærminger til høsting og deaggregating av biofilm inkluderer skraping, swabbing, sonikering, virveling eller en kombinasjon av disse. Skraping er definert som fysisk fjerning av biofilm fra overflater med en steril pinne, spatel eller annet verktøy. Swabbing refererer til fjerning av biofilm fra overflater med en bomullspinne eller annet fast absorberende materiale. Sonikering refererer til forstyrrelse av biofilm fra overflater via ultralydbølger fordelt gjennom vann. Vortexing refererer til bruk av en mikser for å oppnå en flytende virvel av prøven inne i et rør. Homogenisering bruker roterende kniver for å skjære høstede biofilmklumper inn i en enkelt cellefjæring. I dette dokumentet presenterer vi tre høstings- og disaggregatasjonsmetoder for to forskjellige overflatetyper, harde/ikke-porøse og porøse.
Det gis en liste over anbefalt minimumsinformasjon som forskeren bør inkludere i metodedelene i publikasjoner. Vi håper at inkludering av denne informasjonen gjør det mulig for andre forskere å reprodusere sitt arbeid. Det er ingen perfekt høstings- og disaggregeringsmetode, derfor er anbefalinger for hvordan du sjekker teknikken også gitt.
Tre vanlige metoder for å høste og disaggregate biofilm fra vanlige vekstflater er demonstrert i denne artikkelen. Denne informasjonen vil gjøre det mulig for forskere å bedre forstå den generelle presisjonen og skjevheten i en biofilmtestmetode. Metoder beskrevet er som følger: (1) En Pseudomonas aeruginosa biofilm dyrket på polykarbonatkuponger (hard ikke-porøs overflate) under høy væskeskjær i CDC Biofilm Reactor høstes og oppløses etter en femtrinns kombinasjon av virveling og sonikering for å oppnå biofilmhøsting og disaggregation (2) A P. aeruginosa biofilm dyrket på borosilikatglasskuponger (hard ikke-porøs overflate) i dryppstrømreaktoren under lav væskeskjær høstes og demonteres ved hjelp av skraping og homogenisering (3) En Escherichia coli biofilm dyrket i silikonrør (porøs overflate) høstes og deaggregateres ved hjelp av skraping, etterfulgt av sonikering og vortexing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vortexing og sonikering
- Vokse en moden P. aeruginosa ATCC 15442 biofilm dyrket i henhold til ASTM Standard E25622.
- Ved slutten av vekstperioden på 48 timer, forbered deg på å behandle biofilm- og prøvekupongene i henhold til ASTM Standard E28718
- Sett automatisk autoklavede sprutbeskyttelser inn i sterile 50 ml koniske rør ved hjelp av flammesteriliserte tang. Gjenta for alle rør som vil få behandling. Rør for kontrollkuponger trenger ikke en sprutbeskyttelse.
- Fjern en tilfeldig valgt stang fra CDC Biofilm Reactor aseptisk. Skyll kuponger for å fjerne løst vedlagte celler ved å dyppe stangen forsiktig i 30 ml sterilt bufret vann.
- Hold stangen parallelt med benkeplaten, over et tomt, sterilt 50 ml konisk rør og bruk en flammesterilisert unbrakonøkkel, løsne settskruen for å slippe en biofilmbelagt kupong i røret. Gjenta for ønsket antall kuponger. Fjern sprutbeskyttere og legg dem i en separat beholder for sterilisering.
- Bruk en 5 ml serologisk pipette, rør sakte 4 ml av behandlingen eller kontrollen inn i rørene slik at væsken strømmer ned på innsiden av rørets vegg.
- Trykk forsiktig på bunnen av røret slik at eventuelle luftbobler under kupongen forskyves. Tillat 30 - 60 s mellom hvert tillegg.
- På slutten av den angitte kontakttiden ble pipette 36 ml nøytralisator inn i rørene i samme rekkefølge som behandlingen (eller kontrollen) ble påført.
MERK: Det endelige volumet av kombinert behandling og nøytralisator er viktig for nøyaktig å bestemme biofilmloggtettheten. - Virvel hvert rør på høyeste innstilling i 30 ± 5 s. Forsikre deg om at en komplett virvel oppnås.
MERK: Det bør utvises forsiktighet ved virveling av tunge kuponger som rustfritt stål i hetteglass av glass der brudd kan oppstå. - Bestem det optimale antallet rør per bad og plassering i reagensglassstativet før du behandler faktiske prøver. Hvis du behandler flere prøver, må du kontrollere at vanntemperaturen i sonikeringsbadet er 21 ± 2 oC.
- Plasser rørene i rørstativet suspendert i avgasset soniker slik at vannstanden i badekaret er lik væskenivået i rørene. Soniker ved 45 kHz, 100 % effekt og normal funksjon i 30 ± 5 s. Gjenta virvel- og sonikeringssykluser, og avslutt deretter med en endelig virvel (totalt 5 sykluser).
MERK: Disse rørene med høstet og oppløst biofilm er 100 eller 0 fortynning. - Fortynn prøven i bufret vann serielt. Plate på R2A agar ved hjelp av passende plating metode. Inkuber ved 36 ± 2 oC i 24 timer. Telle kolonier etter behov for platingmetoden som brukes, og registrere data.
2. Skraping og homogenisering
- Vokse en moden P. aeruginosa ATCC 15442 biofilm i henhold til ASTM Standard E264713.
- Sett opp prøvetakingsstasjonen til å inkludere prøvetakingsbrett, 95% etanol i et beger, alkoholbrenner, hemostater, kupongfjerningsverktøy, beger med sterilt fortynningsvann og fortynningsrør for skylling av kupongene.
- Slå av pumpen. Fjern et kanaldeksel og bruk et sterilt verktøy for fjerning av kuponger og hemostater for å fjerne kupongen, og vær forsiktig så du ikke forstyrrer biofilmen.
- Skyll kupongen ved forsiktig nedsenking, med en flytende bevegelse, i 45 ml sterilt fortynningsvann (inneholdt i et 50 ml sentrifugerør). Reverser umiddelbart bevegelsen for å fjerne kupongen.
- Plasser kupongen i et beger som inneholder 45 ml sterilt fortynningsvann. Skrap den biofilmdekkede kupongoverflaten i en nedadgående retning i ca. 15 s, ved hjelp av en steril spatel eller skrape. Skyll slikkepotten eller skraperen ved å røre den i begeret. Gjenta skrape- og skylleprosessen 3-4 ganger, og sørg for full dekning av kupongoverflaten.
- Skyll kupongen ved å holde den i en 60° vinkel over det sterile begeret og pipettering 1 ml sterilt fortynningsvann over overflaten av kupongen. Gjenta for totalt 5 skyllinger. Det endelige volumet i begeret er 50 ml.
MERK: Det endelige volumet av kombinert behandling og nøytralisator er viktig for nøyaktig å bestemme biofilmloggtettheten. - Bytt ut hvert kanaldeksel etter hvert som kupongene fjernes.
- Arbeide i biosikkerhetsskapet, homogenisere den skrapede biofilmprøven. Fest en steril homogenisatorsonde til homogenisatoren, plasser sondespissen i væsken, slå på homogenisatoren og rampe opp til 20.500 rpm.
- Homogeniser prøven i 30 s. Skru ned RPMene og slå av homogenisatoren.
- Desinfiser sonden mellom biofilmprøver ved å homogenisere en 9 ml steril fortynning blank ved 20.500 rpm i 30 s som beskrevet ovenfor. Homogeniser et 9 ml rør på 70% etanol i 30 s, løsne sonden og la stå i etanolrøret i 1 min. Homogeniser to ekstra fortynningsemner.
MERK: En homogenisatorprobe til engangsbruk kan brukes til hver prøve. - Fortynn prøvene i bufret vann serielt. Plate på R2A agar ved hjelp av riktig plating metode. Inkuber plater ved 36 ± 2oC i 24 timer, telle kolonier etter behov for plating metode brukt og registrere data.
3. Skraping, vortexing og sonikering
- Voks en moden Escherichia coli ATCC 53498 biofilm i silikonkateterrør10.
- Forbered prøvetakingsmaterialer: skyll rør, sterilt sentrifugerør, tom steril Petri-tallerken, flammesterilisert hemostat i rustfritt stål og saks, timer og linjal.
- Når pumpen er satt på pause, bruker du 70 % etanol til å rengjøre utsiden av slangen. Mål 2 cm fra enden, unngå området som er festet til kontakten, og merk slangen for å bestemme skjæresteder.
- Med flammesterilisert saks, kutt slangen på 2 cm-merket og legg segmentet i tom steril Petri-tallerken. Tørk av slangen med 70 % etanol og koble den distale enden til avfallsslangen igjen.
- Skyll rørsegmentet for å fjerne planktonceller. Med flammesteriliserte tang, senk rørsegmentet forsiktig ned i 20 ml sterilt fortynningsvann og fjern det umiddelbart. Plasser segmentet i 10 ml nøytralisator.
- Med flammesteriliserte tang holder du slangesegmentet og skraper med steril treapplikatorpinne til alle indre områder av slangen er skrapt. Skyll av og til pinnen i nøytralisatorens 10 ml og plasser segmentet tilbake i prøverøret. Det skrapede rørsegmentet er 100 eller 0 fortynning.
MERK: Det endelige volumet av kombinert behandling og nøytralisator er viktig for nøyaktig å bestemme biofilmloggtettheten. - Virvel hvert rør på høyeste innstilling i 30 ± 5 s. Plasser røret i rørstativet suspendert i soniker slik at vannstanden i badekaret er lik væskenivået i rørene. Soniker ved 45 kHz, 100 % effekt og normal funksjon i 30 ± 5 sekunder. Gjenta virvel- og sonikeringssykluser, og avslutt deretter med en endelig virvel.
MERK: Dette røret med den høstede og oppsamlede biofilmen er 100-fortynning. - Fortynn prøvene i bufret vann serielt. Plate på Tryptic Soy Agar ved hjelp av riktig plating metode.
- Inkuber plater ved 36 ± 2 oC i 24 timer. Telle kolonier etter behov for platingmetoden som brukes, registrere data og beregne det aritmetiske gjennomsnittet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Validering/bekreftelse av en innhøstingsmetode
Flere studier som ble utført i laboratoriet vårt undersøkte virvel- og sonikeringsevnen til effektivt å høste biofilm dyrket i biofilmreaktoren (ASTM E2562)2 ved hjelp av Single Tube Method (ASTM E2871)8.
En P. aeruginosa ATCC 15442 biofilm ble dyrket i henhold til ASTM E25622 på borosilikatglasskuponger. Etter 48 timer ble fire kuponger plassert i hetteglass, "behandlet" med 4 ml sterilt bufret vann og nøytralisert med 36 ml 2x D/ E nøytraliserende buljong. Den første sonikeringsinnstillingen på 45 kHz, 10% kraft, Sweep-innstilling, 30 ± 5 s ble brukt til å høste og dele biofilmen fra tre av de fire kupongene. Etter ferdigstillelse av virvel- og sonikeringssyklusen ble hver kupong farget med krystallfiolett og fotografert. Figur 1 viser hvor mye biofilm som gjenstår på de tre kupongene etter virvel- og sonikering sammenlignet med kontrollen.
For å teste dette videre ble en P. aeruginosa ATCC 15442 biofilm dyrket som beskrevet tidligere, og to sonikeringsinnstillinger ble sammenlignet: 1) 45 kHz, 10% strøm, Feieinnstilling, 30 ± 5 sekunder og 2) 45 kHz, 100% strøm, Normal innstilling, 30 ± 5 sekunder. En kupong fra hvert sett av de tre ble farget med BacLight Live / Dead flekk og avbildet ved hjelp av konfokal mikroskopi (CM). De resterende to kupongene fra hvert sett ble fortynnet, belagt og nummerert for levedyktige celler. De levedyktige platetellingsresultatene var 9.230 Log10 CFU / kupong ± 0.007 (SD_R) for innstilling 1 og 9.272 Log10 CFU / kupong ± 0.066 (SD_R) for sonikeringsinnstilling 2. Disse dataene bekreftet en 2015 EPA Single Tube Method Collaborative Study der 9.03 Log10 CFU / kupong ± 0.272 (SD_R) ble oppnådd9. Ifølge de levedyktige platetellingene ser det ut til at alle tre midlene er like nok til ikke å garantere videre undersøkelse av forskjeller mellom de to høstingsmetodene. De mikroskopiske bildene som vises i figur 2, kan imidlertid tyde på at mer biofilm forble etter bruk av innstilling 1 enn innstilling 2. Mens vi observerer at biofilm som gjenstår på kupongene vises død (rød i farge), er tolkning av levedyktighet ved bruk av BacLight Live / Dead-flekk vanskelig14,15. I stedet for å fokusere på levedyktighetsimplikasjoner av den fargede biofilmen, brukte vi denne flekken til å visualisere biofilm som gjenstår på overflatene. I tillegg, mens vi erkjenner at sonikering kan være skadelig for bakteriell levedyktighet, viste en publikasjon fra 2007 av Kobayashi et al.16 at økt sonikeringstid utover 5 minues resulterte i redusert levedyktige platetall. Siden studien vår brukte totalt 1 minutt sonikering, er vi sikre på at få celler ble drept via sonikering som vist av >9.2 LOG10 CFU / kuponger for de to sonikeringsparametrene. Det er interessant at en fullstendig høsting av biofilmen fra overflaten ikke ble oppnådd ved noen av metodene. Dette funnet viser at levedyktige platetall alene ikke er tilstrekkelige til å bestemme høstings- og disaggregeringsbias og derfor må pares med en ekstra metode, mikroskopi, for eksempel.
I tillegg til sonikerinnstillingene undersøkte vi andre viktige faktorer som påvirker sonikering. Disse inkluderte væskevolumet i hetteglassene (10 eller 40 ml), væsketypen i hetteglasset (bufret vann eller 2X D/E Nøytraliserende buljong) og antall hetteglass plassert i badekaret samtidig (3 eller 12 hetteglass)9.
P. aeruginosa biofilmer på CDC Biofilm Reactor kuponger ble sonikert ved hjelp av sonicator innstilling 2 (45 kHz, 100% strøm, Normal innstilling, 30 ± 5 sekunder). Alle prøver ble virvelert enten 3 om gangen eller 6 om gangen ved hjelp av en virvel som er utstyrt med et 6-plassers rørfeste og deretter sonikert som beskrevet i figur 3. En kupong fra hver av følgende kategorier ble avbildet ved hjelp av CM (figur 3).
I den andre studien der sonikeringsparametere ble undersøkt, antyder de mikroskopiske bildene (figur 3) at minimering av volumet i rørene, reduserer antall rør som behandles samtidig og bruk av D / E Neutralizing Broth (som inneholder overflateaktivt middel) bidrar alle til forbedret biofilmhøsting fra kupongene.
Biocider kan positivt eller negativt forbedre høsting og disaggregering. I likhet med å bekrefte at en nøytralisator effektivt stopper det aktive mens det ikke øker drapet før du utfører en effekttest, er det viktig å bekrefte at et biocid ikke differensialt påvirker høsting og disaggregering. For effekttesting resulterer bias hvis og bare hvis det er differensialfjerning for kontrollen vs behandlet biofilmprøver11.
Figur 1: Bilder av kuponger farget med krystallfiolett som demonstrerer gjenværende biofilm. A) Kupong fjernet fra reaktoren og farget med krystallfiolett. B, C, D) Tre replikeringskuponger ble separat "behandlet" med sterilt bufret vann og deretter nøytralisert. For å høste og disaggregatere ble kupongene virvelet (30 ± 5 sekunder) og sonikert (45 kHz, 10% strøm, Sweep-innstilling, 30 ± 5 sekunder) to ganger og mottok deretter en endelig virvel. Bilder gjengitt med tillatelse fra Danielle Orr og Blaine Fritz. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Confocal mikroskopibilder av kuponger som sammenligner to forskjellige sonikeringsinnstillinger. Kuponger (12.5X forstørrelse) behandlet via sonikering innstilling 1 (45 kHz, 10% strøm, Sweep innstilling) på venstre eller sonikering innstilling 2 (45 kHz, 100% strøm, Normal innstilling) til høyre. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3. Confocal mikroskopi bilder av kuponger som sammenligner volumer, sonikering væske og antall rør. Kuponger (12.5X forstørrelse) behandlet i 10 eller 40 ml volumer, i fortynningsvann (DW) eller D / E Nøytraliserende buljong (D / E), 3 eller 12 rør om gangen med optimalisert sonikeringsinnstilling (45 kHz, 100% strøm, normal innstilling). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfil 1: Viktige parametere av betydning for høsting og disaggagregation Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Minimumsinformasjon for innhøstings- og de aggregeringsmetoder
For å lage reproduserbare biofilmdata på tvers av det vitenskapelige samfunnet, er det viktig at forfattere inkluderer så mange detaljer som mulig angående hver av vekst-, behandlings-, prøvetakings- og analysetrinnene i en biofilmmetode. Standardiseringen av biofilmmetoder har bidratt i dette arbeidet, da det gjør det mulig for forskeren å referere til en bestemt metode og eventuelle relevante modifikasjoner. Imidlertid inkluderer mange papirer bare en setning eller to for å beskrive biofilmhøsting og disaggregering. For bedre reproduserbarhet anbefaler vi at minimumsinformasjon for biofilmhøsting inkluderes i publikasjoner. Dette bygger på initiativet Minimum Information About a Biofilm Experiment (MIABiE) presentert av Lourenco et al.17. Ved bruk av sonikering for biofilmhøsting og de aggregeringsparametere bør informasjonen omfatte: plassering av rør i badekaret (produsentens anbefalinger for å unngå å skade transduserne), antall rør sonikert samtidig, rørmateriale, volum og type væske i røret, tilstedeværelse av overflateaktivt middel, væskeposisjon i rør i forhold til flytende nivå av ultralydbad, enheten som brukes til å holde rørene i badekaret (glassbeger vs. reagensrørstativ), avgassing av vannbad før sonikering av prøver (hvis avgassing ikke er et produsentalternativ, vil enkel drift av badekaret før du setter inn prøvene bidra til å fjerne noen oppløste gasser fra badevæsken), temperatur på vannbad (temperaturer kan stige etter lange perioder med sonikering), (for eksempel 25 kHz eller 45 kHz), badefunksjon (for eksempel feie eller normalt) og kraftområde levert til transdusere (for eksempel 10 - 100%). Disse innstillingene bør optimaliseres for biofilmen som studeres, systemet som brukes til å dyrke biofilmen og den spesifikke merke / modell av ultralydbad18.
Lyddemperinnstillinger kan endres for å optimalisere ønskede høsteffekter. Avgassing fjerner oppløst luft i badevæsken og forbedrer dermed rengjøringskraften. Frekvensen kan justeres til en lav eller høy innstilling. En lav innstilling som for eksempel 25 kHz, vil hjelpe til med å høste tøffe prøver, mens en høyere innstilling på 45 kHz vil være mer hensiktsmessig for sensitive prøver. En badefunksjon av feie eller normal tillater distribusjon av kavitasjon. Feiefunksjonen skaper en kontinuerlig forskyvning av lydtrykkmaksimumet. Den normale funksjonen gjør at transduserne kan operere i dobbel halvbølgemodus som kan resultere i døde soner, og dermed gjøre sonikeringen mindre effektiv. Kraftområder kan endres fra 10 - 100% av strømmen som leveres til svingerne19. Det er kjent at sonikering kan skadelig påvirke bakteriell levedyktighet. En studie fra 2008 av Stamper et al.20 utsatte bakteriekulturer for å øke ultralydenergien over tid for å skape bakterielle drapskurver. Vi anbefaler at brukere bekrefter at en bestemt kombinasjon av sonikeringsinnstillinger ikke forårsaker en reduksjon i levedyktige bakterier20.
Det er ingen perfekt metode for å høste og disaggregate biofilm, men spesielle metoder fungerer bedre for noen overflater / mikrobe kombinasjoner enn andre. Vi tar til orde for at leseren skal finne ut hvilke parametere som er viktige for deres spesielle biofilmscenario. Viktige parametere av betydning for høsting og disaggregering er inkludert i tilleggsfil 1.
For sonikeringsstudiene som ble gjort for å vurdere høsting og disaggregeringsbias, fant vi at sonikering er praktisk, effektiv og i stand til å bli standardisert for høsting og deaggregating av biofilm fra overflater. Plassering av kuponger i hetteglass minimerer teknikeren til teknikervariabilitet som vil oppstå i metoder der kuponger fysisk skrapes av laboratoriepersonell, for eksempel. Selv om det virker enkelt nok å plassere hetteglass i et sonikerende vannbad, er det mange parametere som må vurderes for å oppnå optimal høsting av biofilm.
To typer sonikeringsutstyr er tilgjengelige, ultralydbad og ultralydsonder. Dette papiret fokuserer hovedsakelig på ultralydbad der ultralydenergi genereres i området høy (20 - 45 kHz) til normal (40 - 60 Hz) frekvens.
Tre hovedprosesser er i spill når du bruker en ultralydsenhet for å rense en overflate. Elektrisk energi omdannes til akustisk energi når en høyfrekvent strøm sendes til en piezoelektrisk eller magnetostriktiv svinger som svinger som svar på strømmen. Svingningen genererer kompresjonsbølger (sjeldenhet) i væsken. Kavitasjonsbobler dannes på grunn av negativt trykk under sjeldenhet. Boblene vokser til de når en ustabil størrelse og kollapser, og skaper en vannstråle som renser overflater21.
Tre høstings- og disaggregeringsmetoder er demonstrert i denne artikkelen: sonikerings- og virvelmetoder for høsting og deaggregating av biofilm når den dyrkes på polykarbonatkuponger i CDC Biofilm Reactor i henhold til Single Tube Method. Skrape- og homogeniseringsmetoder for høsting og deaggregating av biofilm vises når den dyrkes på glasskuponger ved hjelp av Drip Flow Biofilm Reactor. Skrape-, sonikerings- og virvelmetoder for høsting og deaggregating av biofilm vises når de dyrkes i silikonrør.
Det er ingen perfekt metode for å høste og dele opp biofilmen, men noen tilnærminger er bedre for forskjellige overflater og / eller applikasjoner. Det som er viktig er å ta seg tid til å validere metoden som brukes. I dette dokumentet diskuterte vi bruken av krystallfiolett og mikroskopi, men andre valg eksisterer avhengig av følsomheten som kreves. Hvis forskning inkluderer effekttesting, er det viktig å bekrefte gyldigheten av tilnærmingen i nærvær av antimikrobielle6. Alt utstyr er litt annerledes, så selv om høstings- og disaggregatasjonsmetoden er standardisert, er det fortsatt forsvarlig å bekrefte prosessen for utstyret som brukes. Høstings- og de aggregeringsmetoder er spesifikke for overflaterelaterte og biofilmbakterier. Forskning har vist at uriktige valg kan føre til partiske testresultater. Likevel er høsting og disaggregering den minst studerte av de fire trinnene i biofilmmetoder. Det er generelt også det uvaliderte trinnet (tatt for gitt som arbeid) med minst mulig informasjon til stede i publisert papir, noe som gjør det utfordrende å reprodusere prosessen i et annet laboratorium. Dette papiret og tilhørende video viser tre vanlige tilnærminger for to overflatetyper og foreslår hvordan du validerer en metode for et individuelt laboratorium. Denne informasjonen vil hjelpe forskere med å ta mer informerte beslutninger om hvilken metode som skal brukes, og gir veiledning om hva de skal rapportere for å forbedre reproduserbarheten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen avsløringer.
Acknowledgments
Vi ønsker å anerkjenne Danielle Orr Goveia, Blaine Fritz, Jennifer Summers og Fei San Lee for deres bidrag til denne avisen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL conical vials | Thermo Scientific | 339652 | |
| 100 mL glass beakers | Fisher Scientific | FB102100 | |
| 5 mL serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-12D | For adding treatment to vials containing coupons. |
| 50 mL serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-14C | For adding neutralizer to vials at the end of treatment contact time. |
| Applicator sticks | Puritan | 807 | |
| Hemostats | Fisher Scientific | 16-100-115 | |
| Metal spatula | Fisher Scientific | 14-373 | |
| PTFE policemen | Saint-Gobain | 06369-04 | |
| S 10 N - 10 G - ST Dispersing tool | IKA | 4446700 | For homogenization of biofilm samples. |
| Scissors | Fisher Scientific | 08-951-20 | |
| Silicone Foley catheter, size 16 French | Medline Industries | DYND11502 | |
| Silicone tubing, size 16 | Cole-Parmer | EW96400-16 | |
| Splash Guards | BioSurface Technologies, Inc. | CBR 2232 | |
| T 10 basic ULTRA-TURRAX Disperser | IKA | 3737001 | For homogenization of biofilm samples. |
| Tubing connectors | Cole-Parmer | EW02023-86 | |
| Ultrasonic Cleaner | Elma | TI-H15 | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Vortex-Genie 2 Vertical 50 mL Tube Holder | Scientific Industries | SI-V506 |
References
- Donlan, R. M. Biofilms: microbial life on surfaces. Emerging Infectious Diseases. 8 (9), 881-890 (2002).
- ASTM International. ASTM Standard E2562, 2017, Standard Test Method for Quantification of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown with High Shear and Continuous Flow using CDC Biofilm Reactor. ASTM International. , West Conshohocken, PA. (2017).
- Environmental Protection Agency (USEPA). Efficacy Test Methods, Test Criteria, and Labeling Guidance for Antimicrobial Products with Claims Against Biofilm on Hard, Non-Porous Surfaces. Environmental Protection Agency (USEPA). , Available from: http://www.epa.gov/perticide-analytical-methods/efficacy-test-methods-test-criteria-and-labeling-guidance-antimicrobial (2021).
- Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews In Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).
- Gomes, I. B., et al. Standardized reactors for the study of medical biofilms: a review of the principles and latest modifications. Critical Reviews in Biotechnology. 38 (5), 657-670 (2018).
- Goeres, D. M., et al. Design and fabrication of biofilm reactors. Recent Trends in Biofilm Sciences and Technology. Simoes, M., et al. , Elsevier Science and Technology. 71-88 (2020).
- Goeres, D. M., et al. A method for growing a biofilm under low shear at the air-liquid interface using the drip flow biofilm reactor. Nature Protocols. 4 (5), 783-788 (2009).
- ASTM International. ASTM Standard E2871, Standard Test Method for Determining Disinfectant Efficacy Against Biofilm Grown in the CDC Biofilm Reactor Using the Single Tube Method. ASTM International. , West Conshohocken, PA. (2019).
- Goeres, D. M., et al. Validation of a Biofilm Efficacy Test: The Single Tube Method. Journal of Microbiological Methods. , (2019).
- Summers, J. G. The development and validation of a standard in vitro method to evaluate the efficacy of surface modified urinary catheters. Theses and Dissertations at Montana State University. , Available from: https://scholarworks.montana.edu/xmlui/handle/1/15149 (2019).
- Hamilton, M. A., Buckingham-Meyer, K., Goeres, D. M. Checking the Validity of the harvesting and Disaggregating Steps in Laboratory Tests of Surface Disinfectants. Journal of AOAC International. 92 (6), 1755-1762 (2009).
- Conlon, B. P., Rowe, S. E., Lewis, K. Persister Cells in Biofilm Associated Infections. Biofilm-based Healthcare-associated Infections. Donelli, G. , (2015).
- ASTM International. ASTM Standard E2647, Standard Test Method for Quantification of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown Using Drip Flow Biofilm Reactor with Low Shear and Continuous Flow. ASTM International. , West Conshohocken, PA. (2020).
- Rosenberg, M., Azevedo, N., Ivask, A. Propidium iodide staining underestimates viability of adherent bacterial cells. Scientific Reports. , (2019).
- Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Manuira-Weber, K., Ren, Q. Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide. BMC Microbiology. , (2015).
- Kobayashi, N., Bauer, T. W., Tuohy, M. J., Fujishiro, T., Procop, G. W. Brief Ultrasonication Improves Detection of Biofilm-formative Bacteria Around a Metal Implant. Clinical Orthopaedics and Related Research. 457, 210-213 (2007).
- Lourenco, A., et al. Minimum information about a biofilm experiment (MIABiE), standards for reporting experiments and data on sessile microbial communities living at interfaces. Pathogens and Disease. 0, 1-7 (2014).
- Nascentes, C. C., Korn, M., Sousa, C. S., Arruda, M. A. Z. Use of Ultrasonic Baths for Analytical Applications: A New Approach for Optimisation Conditions. Journal of Brazilian Chemical Society. 12 (1), 57-63 (2001).
- Elma GmbH & Co. KG TI-H Ultrasonic Cleaning Units: Operating Instructions. Elma GmbH & Co. , Singen, Germany. (2009).
- Stamper, D. M., Holm, E. R., Brizzolara, R. A. Exposure times and energy densities for ultrasonic disinfection of Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus avium and sewage. Journal of Environmental Engineering and Science. 7 (2), 139-146 (2008).
- Suslick, K. S.
