Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

प्रतिदीप्ति-सक्रिय नाभिक छंटाई का उपयोग करके ताजा जमे हुए प्रांतस्था से वयस्क मानव एस्ट्रोसाइट आबादी का अलगाव

Published: April 16, 2021 doi: 10.3791/62405
Automatic Translation
1,2, 1,2, 3, 2,4, 1,2
1Department of Pathology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Department of Neuroscience and Friedman Brain Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 3Institutes of Brian Science, Fudan University, 4Department of Psychiatry, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

Summary

हमने एक ऐसी विधि विकसित की है जो डाउनस्ट्रीम आणविक विश्लेषण में उपयोग के लिए ताजा जमे हुए ऊतक से मानव एस्ट्रोसाइट आबादी को समृद्ध और अलग करती है।

Abstract

मानव एस्ट्रोसाइट्स की जटिलता प्राथमिक मानव ऊतक में खराब रूप से परिभाषित रहती है, जिसके लिए उनके अलगाव और आणविक लक्षण वर्णन के लिए बेहतर उपकरण की आवश्यकता होती है। प्रतिदीप्ति-सक्रिय नाभिक छँटाई (एफएएनएस) का उपयोग जमे हुए अभिलेखीय ऊतक से मानव न्यूरोनल नाभिक (न्यूएन +) आबादी को सफलतापूर्वक अलग करने और अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है, जिससे ताजा ऊतक को संभालने से जुड़ी समस्याओं से बचा जा सकता है। हालांकि, गैर-न्यूरोनल (न्यूएन-) तत्व से एस्ट्रोग्लिया को इसी तरह अलग करने के प्रयासों की कमी है। हाल ही में विकसित और मान्य इम्यूनोटैगिंग रणनीति तीन प्रतिलेखन कारक एंटीबॉडी का उपयोग एक साथ समृद्ध न्यूरोनल (न्यूएन +), एस्ट्रोसाइट (युग्मित बॉक्स प्रोटीन 6 (पीएएक्स 6) + न्यूएन-), और ओलिगोडेंड्रोसाइट पूर्वज (ओएलआईजी 2 + न्यूएन-) नाभिक आबादी को गैर-रोगग्रस्त, ताजा (अनफिक्स्ड) स्नैप-फ्रोजन पोस्टमॉर्टम मानव लौकिक नियोकॉर्टेक्स ऊतक से अलग करने के लिए करती है।

इस तकनीक को प्राथमिक पैथोलॉजिकल मिर्गी नियोकॉर्टेक्स में सेल प्रकार-विशिष्ट ट्रांसक्रिप्टोम परिवर्तनों के लक्षण वर्णन के लिए उपयोगी दिखाया गया था। ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण ने पुष्टि की कि पीएएक्स 6 + न्यूएन- सॉर्ट की गई आबादी पैन-एस्ट्रोसाइट मार्करों के लिए मजबूती से समृद्ध है और आराम और प्रतिक्रियाशील दोनों स्थितियों में एस्ट्रोसाइट्स को पकड़ती है। यह पत्र ताजा जमे हुए मानव प्रांतस्था से एस्ट्रोसाइट-समृद्ध नाभिक आबादी के अलगाव के लिए प्रशंसकों की पद्धति का वर्णन करता है, जिसमें एकल-नाभिक (एसएन) निलंबन में ऊतक पृथक्करण शामिल है; एंटी-न्यूएन और एंटी-पैक्स 6 फ्लोरोसेंटली संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ नाभिक का इम्यूनोटैगिंग; सॉर्टिंग के दौरान संवेदनशीलता और विशिष्टता को अनुकूलित करने और एस्ट्रोसाइट संवर्धन की पुष्टि करने के लिए प्रशंसकों गेटिंग रणनीतियों और गुणवत्ता नियंत्रण मैट्रिक्स; और थोक या एसएन रिज़ॉल्यूशन पर डाउनस्ट्रीम ट्रांसक्रिप्टोम और क्रोमैटिन एक्सेसिबिलिटी सीक्वेंसिंग के लिए खरीद की सिफारिश की। यह प्रोटोकॉल विभिन्न विकृतियों के साथ गैर-नेक्रोटिक, ताजा-जमे हुए, मानव कॉर्टिकल नमूनों के लिए लागू होता है और 24 घंटे के भीतर पोस्टमॉर्टम ऊतक संग्रह की सिफारिश की जाती है।

Introduction

मानव एस्ट्रोसाइट्स की आणविक जटिलता प्राथमिक ऊतक में खराब रूप से परिभाषित रहती है, स्वास्थ्य और बीमारी दोनों में उच्च रिज़ॉल्यूशन पर उनके अलगाव और लक्षण वर्णन के लिए बेहतर उपकरण की आवश्यकता होती है। अपने आला से बरकरार मानव न्यूरॉन्स और ग्लिया का पृथक्करण ताजा मस्तिष्क ऊतक के नमूनों की सीमित पहुंच, ग्लियाल और न्यूरोनल प्रक्रियाओं की भारी परस्पर प्रकृति और प्रसंस्करण के दौरान अपरिहार्य सेलुलर सक्रियण के कारण मुश्किल साबित हुआ है, जिनमें से सभी इन सेल प्रकारों के आणविक लक्षण वर्णन को सीमित करते हैं पूर्व विवो1 . प्रतिदीप्ति-सक्रिय नाभिक छंटाई (एफएएनएस) लाइव-सेल सॉर्टिंग के विकल्प के रूप में उभरा है, जो जमे हुए ऊतक से नाभिक आबादी के पृथक्करण और इम्यूनोटैगिंग को सक्षम करता है। पिछले एक दशक में, एफएएनएस का व्यापक रूप से विभिन्न प्रकार के मस्तिष्क के नमूनों और शारीरिक क्षेत्रों 1,2,3,4 में मानव न्यूरोनल (न्यूएन +) नाभिक आबादी को अलग करने और आणविक रूप से चिह्नित करने के लिए उपयोग किया जाता है।

हालांकि, मानव प्रांतस्था से विशिष्ट ग्लियाल नाभिक उप-जनसंख्या को अलग करने के लिए समान तरीके सीमित हैं, जिससे सामान्य और रोगग्रस्त ऊतकों दोनों में एस्ट्रोसाइट जटिलता की समझ में परिष्कार की सापेक्ष कमी हो गई है। यह अंत करने के लिए, एक पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल को एफएएनएस4 का उपयोग करके मानव न्यूरोनल आबादी को अलग करने के लिए अनुकूलित किया गया था, और ट्रिपल-एंटीबॉडी संयोजन का उपयोग करके एस्ट्रोसाइट्स (और ऑलिगोडेंड्रोग्लियल पूर्वजों के लिए) के लिए समृद्ध करने के लिए एक विधि को मान्य किया गया था, आराम और प्रतिक्रियाशील दोनों स्थितियों में एस्ट्रोसाइट्स पर कब्जा करना5. न्यूएन-अंश में एस्ट्रोसाइट्स के लिए विशेष रूप से समृद्ध करने के लिए, एंटीबॉडी का उपयोग दो प्रतिलेखन कारकों में से एक के खिलाफ किया गया था, जिन्हें एस्ट्रोसाइट आबादी, पीएएक्स 6 या एसआरवाई-बॉक्स प्रतिलेखन कारक 9 (एसओएक्स 9) 6,7 में अलग-अलग व्यक्त किया जाता था। पीएएक्स 6 रोगाणु क्षेत्रों में रेडियल ग्लिया जैसे पूर्वजों के भीतर प्रारंभिक भ्रूण के विकास के दौरान अत्यधिक व्यक्त किया जाता है और न्यूरोजेनेसिस औरग्लियोजेनेसिस 8,9,10,11 के साथ-साथ रेटिना न्यूरोनल विनिर्देश12 दोनों की ओर योगदान देता है। वयस्क में, पीएएक्स 6 को मानव एस्ट्रोसाइट्स6 को आराम करने में अलग-अलग अतिरंजित किया जाता है और मानव मिर्गी ऊतक एस्ट्रोसाइट्स13 में ग्लियाल फाइब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन (जीएफएपी) के साथ प्रोटीन सह-अभिव्यक्ति दिखाता है।

यह प्रोटोकॉल प्रशंसकों द्वारा नियोकोर्टिकल न्यूरोनल और एस्ट्रोसाइट-समृद्ध नाभिक आबादी के एक साथ अलगाव का वर्णन करता है। वयस्क प्रांतस्था से एकत्र ताजा (अनफिक्स्ड) स्नैप-फ्रोजन (यानी, ताजा-जमे हुए) पोस्टमॉर्टम ऊतक पहले यांत्रिक और रासायनिक रूप से अलग हो जाते हैं। सुक्रोज ढाल में लिसिस और अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, साइटोप्लाज्मिक और बाह्य घटकों को त्याग दिया जाता है जबकि नाभिक को बनाए रखा जाता है। नाभिक को तब वांछित लक्ष्य वंशों के अनुरूप फ्लोरोसेंटली संयुग्मित परमाणु एंटीबॉडी के साथ लेबल किया जाता है और प्रशंसकों का उपयोग करके क्रमबद्ध किया जाता है। इस दृष्टिकोण के बाद, एस्ट्रोसाइट्स के संवर्धन को एकत्रित पैक्स 6 + न्यूएन- आबादी में प्रदर्शित किया जाता है, जो लक्षित क्यूपीसीआर पैनल के साथ-साथ डाउनस्ट्रीम परमाणु आरएनए अनुक्रमण दोनों द्वारा मान्य है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

नोट: माउंट सिनाई (आईएसएमएमएस) और इसके संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) में इकान स्कूल ऑफ मेडिसिन में मानव विषयों के संरक्षण के लिए कार्यक्रम संघीय, राज्य और संस्थागत नियमों के साथ अनुसंधान और अनुपालन के नैतिक आचरण का आश्वासन देता है। इस अध्ययन में, उपयोग किए गए सभी पोस्टमॉर्टम नमूनों को डी-पहचाना गया था, बायोरिपोजिटरी के माध्यम से उचित सहमति के तहत प्राप्त किया गया था, और आईएसएमएमएस के आईआरबी (एचएस # 14-01007) द्वारा "मानव अनुसंधान" पदनाम से छूट दी गई थी।

1. बफर तैयारी

नोट: यदि डाउनस्ट्रीम आरएनए अनुक्रमण कर रहे हैं, तो एमआरएनए गिरावट को रोकने के लिए आरनेस परिशोधन समाधान के साथ सभी कार्यस्थानों और उपकरणों का अच्छी तरह से इलाज करें।

  1. लाइसिस बफर तैयार करें।
    1. आसुत एच2ओ में 50 एमएल तक निम्नलिखित को भंग करें: 5.47 ग्राम सुक्रोज (0.32 एम अंतिम), 1 एम सीएसीएल2 (5 एमएम फाइनल) का 250 μL, 1 एम एमजी (सीएच3सीओओ) 2 (3 एमएम फाइनल), 500 एमएम एथिलीनडियामाइनेटेट्राएसेटिक एसिड (ईडीटीए) (ईडीटीए) के 10 μL ट्राइटन एक्स -100 (0.1% अंतिम) के 50 μL, और 3 एम डाइथियोथ्रिटोल के 17 μL (डीटीटी, 1 एमएम अंतिम, ताजा जोड़ें) (सामग्री की तालिका देखें)।
  2. सुक्रोज बफर तैयार करें
    1. आसुत एच2ओ में 50 एमएल तक निम्नलिखित को भंग करें: 30.78 ग्राम सुक्रोज (1.8 एम अंतिम), 1 एम एमजी (सीएच3सीओओ) 2 (3 एमएम फाइनल) के 150 μL, 1 एम ट्रिस-एचसीएल (पीएच 8) (10 एमएम फाइनल) के 500 μL, 3 एम डीटीटी के 17 μL (1 एमएम अंतिम, ताजा जोड़ें)।

2. एकल-नाभिक निलंबन में जमे हुए ऊतक पृथक्करण

  1. 7 एमएल ग्लास टिशू डौंसर (ग्राइंडर) में 4 एमएल बर्फ-ठंडा लाइसिस बफर जोड़ें, और बर्फ पर रखें। लगभग 200-400 मिलीग्राम ताजा जमे हुए मानव वयस्क प्रांतस्था को विच्छेदित करें, लगभग 50x को डुबोएं, और ऊतक होमोजेनेट को 12 एमएल अल्ट्रासेंट्रिफ्यूज पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  2. 5 एमएल पिपेट का उपयोग करके, अल्ट्रासेंट्रिफ्यूज ट्यूब के तल पर बर्फ-ठंडा सुक्रोज बफर के 6.5 मिलीलीटर जोड़ें, सुक्रोज और ऊतक होमोजेनेट के बीच की परत को परेशान न करने का ध्यान रखें।
    नोट: यदि अतिरिक्त नमूनों को संसाधित करते हैं, तो हल्के नमूने में अतिरिक्त लाइसिस बफर जोड़कर वजन से ट्यूबों को सावधानीपूर्वक संतुलित करें। अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूबों का सटीक संतुलन रोटर को नुकसान को रोकने और उचित गति से रोटेशन सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है।

3. अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन

  1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 24,400 आरपीएम (101,814 × ग्राम) पर लाइसेट को अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज करें। ध्यान से गोली परेशान किए बिना सतह पर तैरनेवाला और मलबे की आकांक्षा।
    नोट: एक गोली दिखाई नहीं दे सकती है यदि 200 मिलीग्राम से कम ऊतक से शुरू होती है।
  2. नाभिक गोली के लिए फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) (सीए2 +, मिलीग्राम2 + मुक्त) के 600 μL जोड़ें और पुन: निलंबन से पहले 10 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं।
  3. बर्फ पर नाभिक गोली को फिर से निलंबित करने के लिए 50 बार पिपेट ऊपर और नीचे।
  4. माइक्रोस्कोप के तहत बरकरार नाभिक की कल्पना करने के लिए एक हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करें और यह सुनिश्चित करने के लिए कि पुन: निलंबन की एकाग्रता अगले चरण में आगे बढ़ने से पहले 105 नाभिक / एमएल से ऊपर है (ट्रिपैन ब्लू के 10 μL के साथ पुन: निलंबित नाभिक के 10 μL को संयोजित करें)।

4. एंटीबॉडी इनक्यूबेशन

  1. प्रशंसकों के लिए नमूना इम्यूनोटैग करने के लिए, पुन: निलंबित नमूना गोली के 500 μL, 1x पीबीएस (सीए2 +, मिलीग्राम2 + मुक्त) के 490 μL, 10% बीएसए (0.1% अंतिम) के 10 μL, एएफ 555 (न्यून-AF555, 1: 1000 अंतिम एकाग्रता) के लिए संयुग्मित माउस एंटी-न्यूएन एंटीबॉडी के 1 μL जोड़ें, और माउस एंटी-PX6 एंटीबॉडी के 1 μL
    नोट: अन्य फ्लोरोफोरस के लिए संयुग्मित वैकल्पिक एंटीबॉडी को जोड़ा जा सकता है (चर्चा देखें)। यहां, एएफ 488 (1: 1000 एकाग्रता) के लिए संयुग्मित माउस एंटी-ओएलआईजी 2 का उपयोग अनुकूल परिणामों के साथ किया गया था।
  2. आवश्यकतानुसार नमूने की एक छोटी मात्रा का उपयोग करके गेटिंग पैरामीटर स्थापित करने के लिए 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलिंडोल (डीएपीआई) -केवल और एकल-रंग नियंत्रण करें।
    1. एएफ 555 एकल रंग नियंत्रण करने के लिए, पुन: निलंबित नमूना गोली के 20 μL, 1x पीबीएस (सीए2 +, मिलीग्राम 2+ मुक्त) के 970 μL, 10% बीएसए (0.1% अंतिम), और न्यूएन-एएफ 555 एंटीबॉडी (1: 1000 एकाग्रता) के 1 μL जोड़ें।
    2. एपीसी एकल रंग नियंत्रण करने के लिए, पुन: निलंबित नमूना गोली के 20 μL, 1X पीबीएस (सीए2 +, मिलीग्राम 2+ मुक्त) के 970 μL, 10% बीएसए (0.1% अंतिम), और पैक्स 6-एपीसी एंटीबॉडी (1: 1000 एकाग्रता) के 1 μL जोड़ें।
    3. डीएपीआई-केवल नियंत्रण करने के लिए, पुन: निलंबित नमूना गोली के 20 μL, 1X पीबीएस (सीए2 +, मिलीग्राम 2+ मुक्त) के 970 μL, और 10% बीएसए (0.1% अंतिम) के 10 μL जोड़ें (डीएपीआई बाद में जोड़ा जाएगा, 4.4 देखें)।
      नोट: यदि दो से अधिक एंटीबॉडी का उपयोग किया जाता है, तो एकल-रंग नियंत्रण के अलावा प्रतिदीप्ति-माइनस-वन (एफएमओ) नियंत्रण करने की सिफारिश की जाती है।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए अंधेरे में रोटेशन के साथ नमूने और नियंत्रण सेते हैं।
  4. सभी नमूनों और नियंत्रणों के लिए 1: 1000 पर डीएपीआई जोड़ें, और सॉर्टिंग के साथ आगे बढ़ें।

5. प्रतिदीप्ति-सक्रिय नाभिक छँटाई (प्रशंसकों)

नोट: प्रशिक्षित कर्मियों की सहायता से एक संस्थागत प्रवाह साइटोमेट्री सुविधा का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है जब तक कि पहले से ही प्रवाह साइटोमेट्री / सॉर्टिंग तकनीकों में कुशल न हो।

  1. गेट जैसा कि नीचे दिखाया गया है।
    1. सबसे पहले, और प्रत्येक नमूने के लिए, फॉरवर्ड स्कैटर (एफएससी-ए) बनाम गेट द्वारा गेट। साइड स्कैटर (एसएससी-ए) नाभिक के लिए उपयुक्त आकार सीमा में कणों को शामिल करने के लिए, इस प्रकार लाल रक्त कोशिकाओं और मलबे (चित्रा 1 ए) को छोड़कर।
      नोट: एक बहुत साफ नाभिक तैयारी एक छोटे मलबे क्लस्टर और एक नाभिक क्लस्टर के बीच अंतर कर सकती है।
    2. अगला, और प्रत्येक नमूने के लिए, एफएससी-ए बनाम एफएससी-डब्ल्यू (या एफएससी-ए बनाम एफएससी-एच) और एसएससी-ए बनाम एसएससी-डब्ल्यू (या एसएससी-ए बनाम एसएससी-एच) द्वारा गेट केवल सिंगलेट नाभिक (चित्रा 1 बी) को शामिल करने के लिए।
    3. अगला, और प्रत्येक नमूने के लिए, डीएपीआई द्वारा गेट बरकरार नाभिक सिंगलेट्स (डीएपीआई-उच्च गेटेड आबादी) को शामिल करने के लिए, मलबे को छोड़कर (डीएपीआई-कम, गेटेड आबादी के बाईं ओर) और डबलेट्स (गेटेड आबादी के दाईं ओर) (चित्रा 1 सी)।
    4. प्रतिदीप्ति नियंत्रण के आधार पर आगे गेटिंग सेट करें, एफएसीएस भूखंडों पर अलग-अलग समूहों के रूप में नेत्रहीन रूप से निर्धारित किया गया है।
      1. एंटीबॉडी (चित्रा 1 डी और चित्रा 2 ए) की अनुपस्थिति में आबादी की पृष्ठभूमि धुंधला निर्धारित करने के लिए डीएपीआई-केवल नियंत्रण चलाएं।
      2. एएफ 555 (चित्रा 2 बी) के लिए चैनल में न्यूएन + धुंधला के लिए कटऑफ निर्धारित करने के लिए न्यूएन-एएफ 555-केवल नियंत्रण चलाएं।
      3. एपीसी चैनल (चित्रा 2 सी) में पैक्स 6 + धुंधला के लिए कटऑफ निर्धारित करने के लिए पैक्स 6-एपीसी-केवल नियंत्रण चलाएं।
      4. अधिक एंटीबॉडी (चित्रा 2 डी, ई) का उपयोग करते समय अतिरिक्त एकल-रंग नियंत्रण चलाएं।
        नोट: यदि दो से अधिक एंटीबॉडी का उपयोग कर रहे हैं, तो आबादी में किसी भी बदलाव की कल्पना करने के लिए एक एफएमओ नियंत्रण की सिफारिश की जाती है।
    5. एक बार जब सभी नियंत्रण चलाए जाते हैं, तो स्थापित थ्रेसहोल्ड से ऊपर न्यूएन + और पीएएक्स 6 + संग्रह के लिए फाटकों को आकर्षित करें।
      1. न्यूरॉन्स (चित्रा 1 ई और चित्रा 2 एफ) इकट्ठा करने के लिए न्यूएन + आबादी गेट।
      2. एस्ट्रोसाइट्स (चित्रा 1 ई, एफ और चित्रा 2 एफ) इकट्ठा करने के लिए न्यूएन- आबादी से पैक्स 6 + आबादी गेट करें।
      3. गेट और न्यून-पैक्स 6- आबादी (चित्रा 1 एफ) से अतिरिक्त ग्लियाल आबादी (जैसे ओलिगोडेंड्रोसाइट पूर्वज कोशिकाओं, जैसा कि ओएलआईजी 2 + द्वारा यहां दिखाया गया है) एकत्र करें।
        नोट: यदि अस्पष्ट आबादी के कारण प्रवाह साइटोमेट्री सॉफ़्टवेयर के साथ उचित गेटिंग कटऑफ का निर्धारण करना मुश्किल है, तो कल्पना की जा रही घटनाओं की संख्या को संशोधित करना सहायक हो सकता है (या तो प्रशंसकों की साजिश पर घटनाओं की संख्या में वृद्धि या कमी)।
  2. इच्छित डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के आधार पर उचित रूप से नमूने एकत्र करें।

6. डाउनस्ट्रीम आणविक विश्लेषण के लिए प्रशंसकों की आबादी का संग्रह

  1. थोक आरएनए अनुक्रमण के लिए, पीबीएस में 50,000-500,000 नाभिक एकत्र करें (अनुभाग 7.1 भी देखें)।
    1. सुक्रोज समाधान के 2 मिलीलीटर, 1 एम सीएसीएल2 के 50 μL, और 1 एम मिलीग्राम (सीएच 3 सीओओ) 2 के30μL जोड़ें, और 10 एमएल तक पीबीएस के साथ भरें।
    2. उल्टा और 15 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं, तो 4 डिग्री सेल्सियस पर 10-15 मिनट के लिए 900 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
    3. सतह पर तैरनेवाला की आकांक्षा करें, आरएनए-निकालने वाले अभिकर्मक, भंवर के 1 मिलीलीटर में फिर से निलंबित करें, सूखी बर्फ पर फ्रीज करें, और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    4. वैकल्पिक रूप से, नमूनों को सीधे आरएनए-निकालने वाले अभिकर्मक के 200 μL में एकत्र करें। सॉर्ट किए गए नमूने के लिए अभिकर्मक के 1: 1 अनुपात को बनाए रखते हुए, सॉर्ट करने के बाद 1 एमएल तक आरएनए-निकालने वाले अभिकर्मक को जोड़ें। भंवर, सूखी बर्फ पर फ्रीज, और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. अनुक्रमण (एटीएसी-सेक) का उपयोग करके ट्रांसपोसेस-सुलभ क्रोमैटिन के लिए थोक परख के लिए, 5% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) के साथ लेपित माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में पीबीएस में 50,000-75,000 नाभिक एकत्र करें। -80 डिग्री सेल्सियस पर नाभिक फ्रीज करें या तुरंत एटीएसी तैयारी के लिए उनका उपयोग करें।
  3. एसएन आरएनए-सेक या एटीएसी-सेक के लिए, पीबीएस में 0.04% बीएसए में नाभिक एकत्र करें (धारा 7.2 भी देखें)।

7. प्री-लाइब्रेरी तैयारी युक्तियाँ

  1. थोक परमाणु आरएनए अनुक्रमण पुस्तकालय तैयारी
    1. आरएनए निष्कर्षण अभिकर्मक में इकट्ठा करने के बाद, इथेनॉल के साथ ऊपरी जलीय परत से फिनोल /क्लोरोफॉर्म और अवक्षेपित आरएनए जोड़कर मानक फिनोल / क्लोरोफॉर्म आरएनए निष्कर्षण करें, इसके बाद ट्यूब (15 मिनट) पर डीएनए पाचन करें।
    2. आरएनए सफाई करें और 15 μL पानी की अंतिम मात्रा में ध्यान केंद्रित करें।
      नोट: इस पद्धति का उपयोग करते हुए, वयस्क प्रांतस्था नमूने के 300 मिलीग्राम से प्रतिनिधि वसूली ~ 300,000 न्यूएन + नाभिक (सफाई और एकाग्रता के बाद 15-20 एनजी / μL कुल आरएनए) और ~ 250,000 पैक्स 6 + नाभिक (सफाई और एकाग्रता के बाद 10-12 एनजी / यह प्रतिनिधि उपज नमूना गुणवत्ता, गेटिंग स्ट्रिंगेंसी और आरएनए रिकवरी के आधार पर बहुत भिन्न हो सकती है।
    3. विहित एस्ट्रोसाइट मार्करों (जीएफएपी, एसओएक्स 9), 10-फॉर्मिल्टेट्राहाइड्रोफोलेट डिहाइड्रोजनेज (एएलडीएच 1 एल 1)) और न्यूरोनल और अन्य सेल वंश मार्करों (चित्रा 1 जी) की कमी के उच्च अंतर अभिव्यक्ति के आधार पर एस्ट्रोसाइट्स के संवर्धन की पुष्टि करने के लिए अनुक्रमण से पहले मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (क्यूपीसीआर) करें।
      नोट: डबल-नकारात्मक आबादी (न्यून-पैक्स 6-) का संग्रह एस्ट्रोसाइट्स (चित्रा 2 एच) के सापेक्ष संवर्धन के लिए अधिक सटीक, बहुआयामी क्यूपीसीआर गुणवत्ता नियंत्रण विश्लेषण की अनुमति देता है।
    4. पोस्टमार्टम नमूनों से अपेक्षित कम आरएनए अखंडता संख्या मूल्यों के लिए अनुशंसित किट का उपयोग करके आरएनए-सेक पुस्तकालयों को उत्पन्न करें।
  2. एकल-नाभिक अनुक्रमण पुस्तकालय तैयारी
    1. एक संस्थागत अनुक्रमण कोर के माध्यम से एसएन अनुक्रमण करें।
    2. नैनोफ्लुइडिक्स-आधारित प्रसंस्करण और अनुक्रमण के लिए, एकल-नाभिक आरएनए-अनुक्रमण (एसएनआरएनए-सेक) के लिए 1 एक्स पीबीएस + 0.04% बीएसए के कम से कम 60 μL में 1 × 10 6 कोशिकाओं / एमएल की अनुशंसित एकाग्रता का उपयोग करें और ट्रांसपोस के लिए एकल-नाभिक परख के लिए 1x पीबीएस + 0.04% बीएसए के कम से कम 20 μL में 3 × 106 कोशिकाओं /

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

नाभिक को 12 घंटे के पोस्टमॉर्टम संग्रह समय के साथ ताजा (अनफिक्स्ड) स्नैप-जमे हुए अस्थायी नियोकॉर्टेक्स ऊतक से एकत्र किया गया था। नाभिक निलंबन में ऊतक पृथक्करण के बाद, नमूनों को न्यूएन, पैक्स 6 और ओएलआईजी 2 के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन किया गया था, और चित्रा 1 और चित्रा 2 में दिखाए गए गेटिंग के अनुसार क्रमबद्ध किया गया था। नाभिक न्यूएन +, पैक्स 6 + न्यूएन-, और ओएलआईजी 2 + न्यूएन- सॉर्ट की गई आबादी (चित्रा 1 ई, एफ और चित्रा 2 एफ) से एकत्र किए गए थे। एक लक्षित क्यूपीसीआर पैनल ने पैन-एस्ट्रोसाइट मार्करों, जीएफएपी और एएलडीएच 1 एल 1 के लिए संवर्धन का खुलासा किया, पैक्स 6 + (न्यूएन-) आबादी (चित्रा 1 जी और चित्रा 2 एच) में। इसके अतिरिक्त, ओएलआईजी 2 + आबादी को ओलिगोडेंड्रोसाइट पूर्वज सेल (ओपीसी) मार्कर पीडीजीएफआरए (चित्रा 1 जी) के लिए समृद्ध किया गया था। एकत्रित आबादी के थोक आरएनए अनुक्रमण ने एस्ट्रोसाइट मार्करों के तुलनात्मक संवर्धन और पीएएक्स 6 + (न्यूएन-) आबादी (चित्रा 1 एच) में न्यूरोनल मार्करों की कमी दिखाई। इम्यूनोफ्लोरेसेंस ने वयस्क मानव कॉर्टिकल एस्ट्रोसाइट्स (चित्रा 1 आई) में जीएफएपी के साथ पैक्स 6 के कोलोकलाइजेशन की पुष्टि की।

एकल-रंग नियंत्रण की जांच करने से प्रत्येक मार्कर के लिए अलग-अलग सकारात्मक और नकारात्मक आबादी का पता चलता है, जिसने संग्रह (चित्रा 2 ए-जी) के लिए सटीक कटऑफ की सेटिंग को सक्षम किया। इसके अलावा, एस्ट्रोसाइट-समृद्ध एफएएनएस अलगाव की तुलना एस्ट्रोसाइट परमाणु मार्करों, एसओएक्स 9 और पीएएक्स 6 के खिलाफ दो अलग-अलग एंटीबॉडी के साथ की गई थी। एस्ट्रोसाइट-समृद्ध गेट (चित्रा 2 एफ, जी) के भीतर एसओएक्स 9 (~ 6%) का उपयोग करके प्रशंसकों की तुलना में पीएएक्स 6 (~ 13.8%) का उपयोग करके प्रशंसकों द्वारा नाभिक घटनाओं का एक उच्च प्रतिशत कैप्चर किया गया था। एक लक्षित क्यूपीसीआर पैनल ने एसओएक्स 9 + (न्यूएन-) और पैक्स 6 + (न्यून-) आबादी (चित्रा 2 एच) दोनों में जीएफएपी, पैक्स 6 और एसओएक्स 9 के लिए संवर्धन का खुलासा किया। ऊतक संग्रह के अलग-अलग पोस्टमॉर्टम अंतराल (पीएमआई) के साथ कई नमूनों के पृथक्करण और धुंधला होने की पूर्वव्यापी तुलना से पता चला कि एक छोटा पीएमआई अधिक बरकरार नाभिक वसूली (चित्रा 3 ए) से जुड़ा था। 24 घंटे तक के पीएमआई के साथ जमे हुए ऊतक ने बरकरार नाभिक की उच्च दर, 90% तक उपज दी; 30 घंटे पीएमआई पर, हालांकि, बहुत कम बरकरार नाभिक (चित्रा 3 ए) बरामद किया जा सकता है। मानक प्रोटोकॉल में एंटीबॉडी-वॉश चरण सहित (जो आमतौर पर वसूली को अनुकूलित करने के लिए इस कदम को छोड़ देता है) ने अलग-अलग न्यूएन +/- या पीएएक्स 6 +/- आबादी (चित्रा 3 बी) के पृथक्करण में महत्वपूर्ण बदलाव प्रकट नहीं किए।

कभी-कभी, PAX6 + NeuN- आबादी के गरीब पृथक्करण देखा जा सकता है, यहां तक कि व्यवहार्य नाभिक (चित्रा 3 सी) का एक उच्च प्रतिशत के साथ नमूनों में, ऊतक पृथक्करण और प्रशंसकों प्रोटोकॉल की पुनरावृत्ति की आवश्यकता है। एकल-नाभिक आरएनए-सेक अध्ययनों ने पीएएक्स 6 को प्रोटोप्लाज्मिक और रेशेदार वयस्क एस्ट्रोसाइट उप-जनसंख्या दोनों में एक शीर्ष विभेदक रूप से व्यक्त परमाणु प्रतिलेखन कारक के रूप में प्राथमिकता दी, न केवल नियोकॉर्टेक्स में, बल्कि सबवेंट्रिकुलर ज़ोन (एसवीजेड) और आसन्न स्ट्रिएटम (चित्रा 3 डी) में भी। ओएलआईजी 2 ट्रिपल प्रशंसकों की तुलना एक ही मस्तिष्क के नमूने से प्राप्त नियोकॉर्टेक्स और स्ट्रिएटम के बीच पीएएक्स 6 + नाभिक (चित्रा 3 ई) के पृथक्करण में क्षेत्र-विशिष्ट अंतर दिखाती है। यह प्रोटोकॉल वर्तमान में केवल नियोकॉर्टेक्स के लिए मान्य है।

Figure 1
चित्रा 1: एफएएनएस द्वारा न्यूरॉन- और एस्ट्रोसाइट-समृद्ध अलगाव का सत्यापन ( ए-एफ ) मलबे और डबलेट्स (ए-सी) को बाहर करने के लिए अनुक्रमिक प्रशंसकों गेटिंग के प्रतिनिधि उदाहरण और (डी) (ई-एफ) समृद्ध न्यूरोनल (न्यूएन +), एस्ट्रोसाइट (पीएएक्स 6 + न्यूएन-), और ओपीसी (ओएलआईजी 2 + + न्यूएन) के संग्रह के लिए डीएपीआई-केवल नियंत्रण का उपयोग करके पृष्ठभूमि धुंधला को परिभाषित करते हैं। (जी) एकत्रित आबादी के गुणवत्ता नियंत्रण के लिए पैन-एस्ट्रोसाइट (जीएफएपी, एएलडीएच 1 एल 1), न्यूरोनल (आरबीएफओएक्स 3), और ओपीसी (पीडीजीएफआरए) मार्करों का उपयोग करके न्यूनतम क्यूपीसीआर पैनल (ए-जी: पैथोलॉजी के बिना अस्थायी नियोकॉर्टेक्स शव परीक्षा नमूना, 12 एच पीएमआई, 100,000 घटनाएं दिखाई गईं; बिंदीदार रेखाएं सकारात्मक गेटेड अनुक्रमिक आबादी का प्रतिनिधित्व करती हैं; ठोस लाइनें सेल-प्रकार के अंतिम संग्रह का प्रतिनिधित्व करती हैं) (एच) पंक्ति-सामान्यीकृत थोक आरएनए अनुक्रमण डेटा से उत्पन्न हीटमैप पीएएक्स 6 + और न्यून + सॉर्ट की गई आबादी (एन = 3 शव परीक्षा के मामले, पैथोलॉजी के बिना अस्थायी नियोकॉर्टेक्स, पीएमआई 12-21 एच) में विहित एस्ट्रोसाइट और न्यूरोनल मार्करों की अभिव्यक्ति दिखा रहा है। (I) मानव नियोकॉर्टेक्स में पैक्स 6, जीएफएपी और न्यूएन की प्रतिनिधि इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवि। तीर पैक्स 6 और जीएफएपी को सह-व्यक्त करने वाले एस्ट्रोसाइट्स को इंगित करते हैं। संक्षिप्त नाम: प्रशंसकों = प्रतिदीप्ति-सक्रिय नाभिक छंटाई; डीएपीआई = 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलिंडोल; न्यून = न्यूरोनल नाभिक; पैक्स 6 = युग्मित बॉक्स प्रोटीन 6; ओएलआईजी 2 = ऑलिगोडेंड्रोसाइट प्रतिलेखन कारक 2; ओपीसी = ऑलिगोडेंड्रोसाइट पूर्वज सेल; क्यूपीसीआर = मात्रात्मक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया; जीएफएपी = ग्लियाल फाइब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन; एएलडीएच 1 एल 1 = 10-फॉर्मिलटेट्राहाइड्रोफोलेट डिहाइड्रोजनेज; आरबीएफओएक्स 3 = आरएनए-बाध्यकारी प्रोटीन फॉक्स -1 होमोलॉग 3; पीडीजीएफआरए = प्लेटलेट-व्युत्पन्न विकास कारक अल्फा; पीएमआई = पोस्टमॉर्टम अंतराल; एसएससी-ए = साइड स्कैटर-एरिया; एफएससी-ए = फॉरवर्ड स्कैटर क्षेत्र; एसएससी-डब्ल्यू = साइड स्कैटर चौड़ाई; एफएससी-डब्ल्यू = फॉरवर्ड स्कैटर चौड़ाई; न्यून -555 = माउस एंटी-न्यून एएफ 555 के लिए संयुग्मित; पैक्स 6-एपीसी = माउस एंटी-पैक्स 6 एलोफाइकोसायनिन के लिए संयुग्मित; ओएलआईजी 2-488 = माउस एंटी-ओएलआईजी 2 488 एनएम लेजर लाइन के लिए हरे फ्लोरोसेंट डाई के लिए संयुग्मित। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: पैक्स 6 या एसओएक्स 9 एंटीबॉडी का उपयोग करके एस्ट्रोसाइट-समृद्ध आबादी का तुलनात्मक अलगाव( ए-ई) डीएपीआई, न्यून, पैक्स 6, एसओएक्स 9 और ओएलआईजी 2 के लिए एकल-रंग नियंत्रण संबंधित प्रतिदीप्ति चैनलों में सकारात्मक / (एफ-जी) (एफ) न्यूएन / पैक्स 6 या (जी) न्यून / एसओएक्स 9 एंटीबॉडी का उपयोग करके एस्ट्रोसाइट-समृद्ध अलगाव के लिए तुलनात्मक प्रशंसक विधि। एस्ट्रोसाइट-समृद्ध गेट के भीतर एसओएक्स 9 की तुलना में पैक्स 6 द्वारा घटनाओं का एक बड़ा प्रतिशत कब्जा कर लिया जाता है। (ए-जी: सभी प्रयोगों के लिए उपयोग किए जाने वाले समान पोस्टमॉर्टम गैर-पैथोलॉजिकल टेम्पोरल नियोकॉर्टेक्स नमूना; 12 एच पीएमआई; 10,000 घटनाएं दिखाई गईं)। (एच) गुणवत्ता नियंत्रण क्यूपीसीआर विश्लेषण एफ-जी से पीएएक्स 6 + (न्यूएन-) और एसओएक्स 9 + (न्यूएन-) सॉर्ट की गई आबादी में एस्ट्रोसाइट मार्करों के संवर्धन और गैर-एस्ट्रोसाइट मार्करों की कमी की पुष्टि करता है (डेटा एसीटीबी के लिए सामान्यीकृत और न्यूएन + आबादी के गुना परिवर्तन के रूप में मात्रा निर्धारित)। संक्षिप्त नाम: डीएपीआई = 4',6-डायमिडिनो-2-फेनिलिंडोल; न्यून = न्यूरोनल नाभिक; पैक्स 6 = युग्मित बॉक्स प्रोटीन 6; ओएलआईजी 2 = ऑलिगोडेंड्रोसाइट प्रतिलेखन कारक 2; एसओएक्स 9 = एसआरवाई-बॉक्स प्रतिलेखन कारक 9; क्यूपीसीआर = मात्रात्मक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया; जीएफएपी = ग्लियाल फाइब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन; आरबीएफओएक्स 3 = आरएनए-बाध्यकारी प्रोटीन फॉक्स -1 होमोलॉग 3; पीडीजीएफआरए = प्लेटलेट-व्युत्पन्न विकास कारक अल्फा; पीएमआई = पोस्टमॉर्टम अंतराल; न्यून -555 = माउस एंटी-न्यून एएफ 555 के लिए संयुग्मित; पैक्स 6-एपीसी = माउस एंटी-पैक्स 6 एलोफाइकोसायनिन के लिए संयुग्मित; ओएलआईजी 2-488 = माउस एंटी-ओएलआईजी 2 488 एनएम लेजर लाइन के लिए हरे फ्लोरोसेंट डाई के लिए संयुग्मित। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: सफल प्रशंसकों प्रयोगों के लिए निर्भर और स्वतंत्र मैट्रिक्स( ए) नाभिक की गुणवत्ता पर नमूना संग्रह पीएमआई का प्रभाव: कम पीएमआई 24 घंटे तक पर्याप्त परिणामों के साथ बरकरार नाभिक की एक बड़ी संख्या की वसूली को सक्षम बनाता है( बी) एंटीबॉडी इनक्यूबेशन के बाद एक धोने के कदम का समावेश नेत्रहीन रूप से प्रशंसकों की आबादी को स्थानांतरित करने के लिए प्रकट नहीं होता है। (सी) बरकरार नाभिक और कम पृष्ठभूमि (बाईं ओर) (पोस्टमॉर्टम टेम्पोरल नियोकॉर्टेक्स, गैर-पैथोलॉजिकल, 7 एच पीएमआई) की उपस्थिति के बावजूद अलग-अलग पैक्स 6 + (न्यूएन-) आबादी (दाईं ओर) की कमी के साथ एक असफल प्रशंसकों के प्रयोग का उदाहरण। (डी) वयस्क मानव एसएन आरएनए-सेक डेटा का हीटमैप प्रतिनिधित्व पैक्स 6 और दो अन्य एस्ट्रोसाइट परमाणु कारकों, एसओएक्स 9 और एलएचएक्स 2 की अंतर अभिव्यक्ति दिखाता है, कॉर्टेक्स और एसवीजेड दोनों में प्रोटोप्लाज्मिक और रेशेदार एस्ट्रोसाइट उप-जनसंख्या में, अन्य सेल प्रकारों की तुलना में (लाल रंग ढाल लॉग-सामान्यीकृत औसत जीन अभिव्यक्ति मूल्यों के स्पेक्ट्रम का प्रतिनिधित्व करता है; एन = 3 अलग शव परीक्षा मामले, 43,619 कुल नाभिक) (ई) अलग-अलग मस्तिष्क क्षेत्र (लौकिक नियोकॉर्टेक्स बनाम) एसवीजेड और सबजेसेंट स्ट्रिएटम) न्यूएन / पैक्स 6 / ओएलआईजी 2 पृथक्करण के विभिन्न पैटर्न दिखाते हैं। संक्षिप्त नाम: प्रशंसकों = प्रतिदीप्ति-सक्रिय नाभिक छंटाई; डीएपीआई = 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलिंडोल; न्यून = न्यूरोनल नाभिक; पैक्स 6 = युग्मित बॉक्स प्रोटीन 6; ओएलआईजी 2 = ऑलिगोडेंड्रोसाइट प्रतिलेखन कारक 2; जीएफएपी = ग्लियाल फाइब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन; एएलडीएच 1 एल 1 = 10-फॉर्मिलटेट्राहाइड्रोफोलेट डिहाइड्रोजनेज; एलएक्सएच 2 = एलआईएम होमोबॉक्स 2; पीएमआई = पोस्टमॉर्टम अंतराल; एसएससी-ए = साइड स्कैटर-एरिया; एफएससी-ए = फॉरवर्ड स्कैटर क्षेत्र; न्यून -555 = माउस एंटी-न्यून एएफ 555 के लिए संयुग्मित; पैक्स 6-एपीसी = माउस एंटी-पैक्स 6 एलोफाइकोसायनिन के लिए संयुग्मित; OLIG2-488 = माउस विरोधी OLIG2 488 एनएम लेजर लाइन के लिए हरी फ्लोरोसेंट डाई के लिए संयुग्मित; एसवीजेड = सबवेंट्रिकुलर ज़ोन; ए (पी) = प्रोटोप्लाज्मिक (ग्रे मैटर) एस्ट्रोसाइट्स; ए (एफ) = रेशेदार (सफेद पदार्थ) एस्ट्रोसाइट्स; ओएल = ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स; ओपीसी = ऑलिगोडेंड्रोसाइट पूर्वज कोशिकाएं; एन = उत्तेजक न्यूरॉन्स; एमएसएन = मध्यम स्पाइनी न्यूरॉन्स; एमजी = माइक्रोग्लिया; बीवीसी = रक्त वाहिका कोशिकाएं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

उल्लिखित प्रोटोकॉल के बाद प्रायोगिक डिजाइन को कई जैविक और तकनीकी कारकों पर विचार करने के बाद अंतिम रूप दिया जाना चाहिए। ऊतक के नमूने शुरू करने से ताजा जमे हुए होते हैं, बिना तय किए, और अधिमानतः नाभिक वसूली को अधिकतम करने के लिए एक छोटा पोस्टमॉर्टम संग्रह अंतराल होता है। अनुभव के आधार पर, 24 घंटे तक का पीएमआई पर्याप्त नाभिक वसूली की अनुमति देता है; हालांकि, बरकरार नाभिक वसूली को अनुकूलित करने के लिए 12 घंटे या उससे कम का पीएमआई बेहतर है। पीएमआई के अलावा अतिरिक्त कारक, जिसमें शरीर के भंडारण का तापमान और ऊतक का पीएच स्तर शामिल है, नाभिक उपज को भी प्रभावित कर सकता है, लेकिन इन अध्ययनों में इसका हिसाब नहीं दिया गया था14. उपाख्यानात्मक अनुभव से, प्रशंसकों की वसूली को -80 डिग्री सेल्सियस पर पांच साल तक संग्रहीत किए जा रहे एक ही ऊतक के साथ तुलनीय पाया गया है, हालांकि सेल-प्रकार विशिष्ट अभिव्यक्ति पर भंडारण की परिवर्तनशीलता का आकलन करने के लिए नियंत्रित प्रयोग नहीं किए गए थे। एंटीबॉडी इनक्यूबेशन के बाद नमूने को धोना एक और चर है जिस पर विचार करने की आवश्यकता हो सकती है। सामान्य तौर पर, एक धोने का कदम समग्र उपज को कम करता है, लेकिन अलग-अलग इम्यूनोलेबल आबादी के पृथक्करण में सुधार कर सकता है। इन अध्ययनों में, पोस्ट-एंटीबॉडी वॉश स्टेप को शामिल करने या छोड़ने पर एनईयूएन / पीएएक्स 6 आबादी के पृथक्करण में कोई अंतर नहीं देखा गया था, लेकिन अन्य प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग करते समय यह कदम फायदेमंद हो सकता है, खासकर यदि वे पूर्व-संयुग्मित नहीं हैं।

छँटाई उपकरण की संवेदनशीलता में परिवर्तनशीलता के कारण, प्रत्येक सॉर्टिंग इवेंट में उचित नियंत्रण करना आवश्यक है। यदि हेमोसाइटोमीटर पर कल्पना करते समय पुन: निलंबित नमूने में अत्यधिक बाह्य मलबे को देखा जाता है, तो नमूने को केवल नाभिक को बनाए रखने के लिए 40 μm फिल्टर के माध्यम से पारित किया जा सकता है। यदि नमूना सीमित है, तो उपयुक्त फ्लोरोफोर के साथ टैग किए गए मोतियों का उपयोग एकल-रंग और एफएमओ नियंत्रण के लिए भी किया जा सकता है। यदि नमूने वांछित एस्ट्रोसाइट आबादी के लिए समृद्ध नहीं दिखाई देते हैं, जैसा कि क्यूपीसीआर या अनुक्रमण परिणामों द्वारा निर्धारित किया जाता है, तो यह सभी न्यूएन- साथ ही पैक्स 6 + (न्यूएन-) आबादी को अधिक सख्ती से गेट करने में सहायक हो सकता है, सकारात्मक और नकारात्मक आबादी के लिए गेट कटऑफ के बीच अधिक जगह छोड़कर।

यहां वर्णित अधिकांश सत्यापन अध्ययन न्यूएन और पैक्स 6 के अलावा ओएलआईजी 2 का उपयोग करके किए गए थे, साथ ही न्यूरोनल, एस्ट्रोसाइट और ऑलिगोडेंड्रोसाइट पूर्वज (ओपीसी) नाभिक आबादी के लिए समृद्ध करने के लिए। न्यूएन-अंश के भीतर कॉर्टिकल एस्ट्रोसाइट्स के लिए अधिक प्रभावी ढंग से समृद्ध करने के लिए ओएलआईजी 2 को तीसरे वंश मार्कर के रूप में शामिल करने की सिफारिश की जाती है। एफआईटीसी-संयुग्मित ओएलआईजी 2 की उपस्थिति या अनुपस्थिति पैक्स 6 + आबादी को स्थानांतरित करने के लिए प्रकट नहीं होती है; इसलिए, धारणा यह है कि ओएलआईजी 2 को छोड़कर प्रयोगों के परिणामस्वरूप समान एस्ट्रोसाइट संवर्धन होगा। ध्यान दें, यह आवश्यक है कि पैक्स 6 + आबादी को न्यूएन- आबादी से गेट किया जाए, क्योंकि कुछ न्यूरोनल आबादी न्यूएन और पीएएक्स 615 दोनों को व्यक्त करती है। एस्ट्रोसाइट्स को एसओएक्स 9 अभिव्यक्ति के अनुसार भी क्रमबद्ध किया जा सकता है; हालांकि, एसओएक्स 9 के साथ धुंधला और छंटाई पैक्स 6 की तुलना में एस्ट्रोसाइट्स के कम मजबूत संवर्धन की ओर जाता है। यद्यपि वयस्क प्रांतस्था में न्यूरोनल, एस्ट्रोसाइटिक और ओपीसी वंशावली के बीच स्पष्ट पृथक्करण देखा गया था, वयस्क एसवीजेड और आसन्न स्ट्रिएटम में पैक्स 6 + और ओएलआईजी 2 + आबादी के बीच एक समान अलगाव नहीं देखा गया था।

हालांकि यह संभव है कि एसवीजेड से कुछ एस्ट्रोसाइट्स ओएलआईजी 2 के निम्न स्तर को व्यक्त करते हैं, एकत्र की गई आबादी को केवल क्यूपीसीआर (डेटा नहीं दिखाया गया है) द्वारा मान्य किया गया था; इसलिए, डाउनस्ट्रीम आरएनए अनुक्रमण इन आबादी की शुद्धता को और परिभाषित करने में सहायक हो सकता है। इसके अतिरिक्त, इस प्रोटोकॉल को जनसंख्या-विशिष्ट परमाणु मार्करों का उपयोग करके जमे हुए भ्रूण मस्तिष्क ऊतक और मस्तिष्क ट्यूमर ऊतक से नाभिक को अलग करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। क्योंकि ये ऊतक काफी अधिक सेलुलर हैं, नाभिक के एकत्रीकरण को कम करने के लिए कम ऊतक से शुरू करना सहायक हो सकता है। नियोप्लास्टिक ऊतक से एन्यूप्लोइड नाभिक को छांटते समय, डीएपीआई गेटिंग को संभावित रूप से उच्च प्रतिदीप्ति के लिए समायोजित किया जाता है। यह दृढ़ता से अनुशंसा की जाती है कि उपयोगकर्ता नियोप्लास्टिक ऊतक पर प्रशंसकों को करने से पहले सावधानीपूर्वक सत्यापन करें, क्योंकि वर्तमान प्रोटोकॉल केवल गैर-नियोप्लास्टिक नमूनों के लिए मान्य है। कुल मिलाकर, उपर्युक्त वर्णित प्रोटोकॉल न्यूरॉन्स के लिए समृद्ध करने के लिए पहले से स्थापित प्रोटोकॉल से अनुकूलित समृद्ध एस्ट्रोसाइट आबादी को अलग करने के लिए एक मान्य रणनीति को आगे बढ़ाता है। इस पद्धति का उपयोग आगे आणविक विश्लेषण में उपयोग के लिए सामान्य और रोगग्रस्त कॉर्टिकल मस्तिष्क के ऊतकों दोनों से एस्ट्रोसाइट नाभिक आबादी को प्रभावी ढंग से अलग करने के लिए किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम विशेषज्ञ सलाह के लिए डी-पहचाने गए मस्तिष्क के ऊतकों और आईएसएमएमएस के फ्लो साइटोमेट्री कोर की खरीद में मदद के लिए माउंट सिनाई में इकान स्कूल ऑफ मेडिसिन में पैथोलॉजी और न्यूरोसर्जरी में सदस्यों को धन्यवाद देना चाहते हैं। अध्ययन आंशिक रूप से एनआईएच आरएफ 1 डीए 048810, आर 01 एनएस 106229, आर 03 एनएस 101581 (एनएमटी के लिए), और आर 61 डीए 048207 (एसए के लिए) द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x PBS pH 7.2 Invitrogen 70013073
ANTI-NEUN ANTIBODY CLONE A60 Millipore MAB377A5MI mouse anti-NeuN conjugated to a fluorescent compound AF555 (excitation, 553 nm; emission, 568 nm)
ANTI-OLIG2 ANTIBODY CLONE 211 Millipore MABN50A4MI mouse anti-OLIG2 conjugated to a fluorescent compound AF488 (excitation, 499 nm; emission, 520 nm)
Bovine Serum Albumin Fisher BP9704-100
Bright-Line Counting Chamber Hausser Scientific 3110V
Calcium Chloride Anhydrous Fisher C614-3
Cell Strainers, 40 µM SP Scienceware 136800040
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Invitrogen D1306
DL-Dithiothreitol Sigma 43815-1G
DNA Library Kit Illumina, Nextera FC-121–1030
DNAse I Worthington LS002139
Dounce Tissue Grinder WHEATON 357542
FACS Sorter BD Biosciences BD FACSAria III
Magnesium Acetate Tetrahydrate Fisher M13-500
PAX6 (PAX6/496) - 100 TESTS Novus NBP234705J
RNA Clean & Concentrator Zymo Research R1013
RNaseZap RNase Decontamination Solution Invitrogen AM9780
SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit Pico Input Mammalian Clontech Laboratories 635005 Fragmentation time of 2.5 minutes, as recommended for low RIN RNA values.
Sucrose, crystal certified, ACS, 500 mg Fisher S5500
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor Beckman Coulter 331362
Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, Ultrapure Thermo Scientific J22638AE
TritonX-100 Fisher BP151-500 non-ionic surfactant in lysis buffer
TRIzol LS Reagent Invitrogen 10296028
TRIzol Reagent Invitrogen 15596026 reagent for isolation of RNA
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco 15250061
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima XE-100 A94516
Ultracentrifuge tubes PP 9/16 X 3-1/2 Beckman Coulter 331372
UltraPure Distilled Water (RNAse-, DNAse-free) Invitrogen 10977023 referred to as distilled water
Ultrapure EDTA Life Technologies 15576-028

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mitchell, A., Roussos, P., Peter, C., Tsankova, N., Akbarian, S. The future of neuroepigenetics in the human brain. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 128, 199-228 (2014).
  2. Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. Isolation of neuronal chromatin from brain tissue. BMC Neuroscience. 9, 42 (2008).
  3. Akbarian, S., et al. The PsychENCODE project. Nature Neuroscience. 18 (12), 1707-1712 (2015).
  4. Matevossian, A., Akbarian, S. Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (20), e914 (2008).
  5. Tome-Garcia, J., et al. Cell type-specific isolation and transcriptomic profiling informs glial pathology in human temporal lobe epilepsy. BioRxiv. , (2020).
  6. Zhang, Y., et al. Purification and characterization of progenitor and mature human astrocytes reveals transcriptional and functional differences with mouse. Neuron. 89 (1), 37-53 (2016).
  7. Sun, W., et al. SOX9 Is an astrocyte-specific nuclear marker in the adult brain outside the neurogenic regions. Journal of Neuroscience. 37 (17), 4493-4507 (2017).
  8. Manuel, M. N., Mi, D., Mason, J. O., Price, D. J. Regulation of cerebral cortical neurogenesis by the Pax6 transcription factor. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 70 (2015).
  9. Sakurai, K., Osumi, N. The neurogenesis-controlling factor, Pax6, inhibits proliferation and promotes maturation in murine astrocytes. Journal of Neuroscience. 28 (18), 4604-4612 (2008).
  10. Zhong, S., et al. Decoding the development of the human hippocampus. Nature. 577 (7791), 531-536 (2020).
  11. Pollen, A., et al. Molecular identity of human outer radial glia during cortical development. Cell. 163 (1), 55-67 (2015).
  12. Cvekl, A., Callaerts, P. PAX6: 25th anniversary and more to learn. Experimental Eye Research. 156, 10-21 (2017).
  13. Goc, J., Liu, J. Y., Sisodiya, S. M., Thom, M. A spatiotemporal study of gliosis in relation to depth electrode tracks in drug-resistant epilepsy. European Journal of Neuroscience. 39 (12), 2151-2162 (2014).
  14. Monoranu, C. M., et al. pH measurement as quality control on human post mortem brain tissue: a study of the BrainNet Europe consortium. Neuropathology and Applied Neurobiology. 35 (3), 329-337 (2009).
  15. Ninkovic, J., et al. The transcription factor Pax6 regulates survival of dopaminergic olfactory bulb neurons via crystallin αA. Neuron. 68 (4), 682-694 (2010).

Tags

तंत्रिका विज्ञान अंक 170 एस्ट्रोसाइट्स प्रशंसकों नाभिक अलगाव ग्लिया कॉर्टेक्स मानव
प्रतिदीप्ति-सक्रिय नाभिक छंटाई का उपयोग करके ताजा जमे हुए प्रांतस्था से वयस्क मानव एस्ट्रोसाइट आबादी का अलगाव
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mussa, Z., Tome-Garcia, J., Jiang,… More

Mussa, Z., Tome-Garcia, J., Jiang, Y., Akbarian, S., Tsankova, N. M. Isolation of Adult Human Astrocyte Populations from Fresh-Frozen Cortex Using Fluorescence-Activated Nuclei Sorting. J. Vis. Exp. (170), e62405, doi:10.3791/62405 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter