Summary
We hebben een methode ontwikkeld die menselijke astrocytenpopulaties verrijkt en isoleert van vers ingevroren weefsel voor gebruik in downstream moleculaire analyses.
Abstract
De complexiteit van menselijke astrocyten blijft slecht gedefinieerd in primair menselijk weefsel, waardoor betere hulpmiddelen nodig zijn voor hun isolatie en moleculaire karakterisering. Fluorescentie-geactiveerde kernensortering (FANS) kan worden gebruikt om menselijke neuronale kernen (NeuN +) populaties met succes te isoleren en te bestuderen uit bevroren archiefweefsel, waardoor problemen in verband met het omgaan met vers weefsel worden vermeden. Pogingen om astroglia op dezelfde manier te isoleren van het niet-neuronale (NeuN-) element ontbreken echter. Een recent ontwikkelde en gevalideerde immunotaggingstrategie maakt gebruik van drie transcriptiefactorantistoffen om tegelijkertijd verrijkte neuronale (NeuN+), astrocyten (gepaard boxeiwit 6 (PAX6)+NeuN-) en oligodendrocytenvoorloper (OLIG2+NeuN-) kernpopulaties te isoleren uit niet-zieke, verse (niet-gefixeerde) snap-bevroren postmortaal humaan humaan humaan neocortexweefsel.
Deze techniek bleek nuttig te zijn voor de karakterisering van celtypespecifieke transcriptoomveranderingen in primaire pathologische epilepsie neocortex. Transcriptomische analyses bevestigden dat PAX6+NeuN-gesorteerde populaties robuust verrijkt zijn voor pan-astrocytenmarkers en astrocyten vangen in zowel rust- als reactieve omstandigheden. Dit artikel beschrijft de FANS-methodologie voor de isolatie van met astrocyten verrijkte kernpopulaties uit vers ingevroren menselijke cortex, inclusief weefseldissociatie in single-nucleus (sn) suspensie; immunotagging van kernen met anti-NeuN en anti-PAX6 fluorescerend geconjugeerde antilichamen; FANS gating strategieën en kwaliteitscontrole statistieken voor het optimaliseren van gevoeligheid en specificiteit tijdens het sorteren en voor het bevestigen van astrocytenverrijking; en aanbevolen inkoop voor downstream transcriptoom- en chromatine-toegankelijkheidssequencing bij bulk- of sn-resolutie. Dit protocol is van toepassing op niet-necrotische, vers ingevroren, menselijke corticale monsters met verschillende pathologieën en aanbevolen postmortale weefselverzameling binnen 24 uur.
Introduction
De moleculaire complexiteit van menselijke astrocyten blijft slecht gedefinieerd in primair weefsel, waardoor betere hulpmiddelen nodig zijn voor hun isolatie en karakterisering met hoge resolutie, zowel in gezondheid als ziekte. Scheiding van intacte menselijke neuronen en glia uit hun niche is moeilijk gebleken vanwege de beperkte toegang tot verse hersenweefselmonsters, de sterk onderling verbonden aard van gliale en neuronale processen en onvermijdelijke cellulaire activering tijdens de verwerking, die allemaal de moleculaire karakterisering van deze celtypen ex vivo beperken 1 . Fluorescentie-geactiveerde kernensortering (FANS) is naar voren gekomen als een alternatief voor het sorteren van levende cellen, waardoor de dissociatie en immunotagging van kernpopulaties uit bevroren weefsel mogelijk wordt. In het afgelopen decennium is FANS op grote schaal gebruikt voor het isoleren en moleculair karakteriseren van menselijke neuronale (NeuN +) kernpopulaties in een verscheidenheid aan hersenspecimens en anatomische regio's 1,2,3,4.
Vergelijkbare methoden voor het isoleren van specifieke gliakernen subpopulaties uit de menselijke cortex zijn echter beperkt, wat leidt tot een relatief gebrek aan verfijning in het begrip van astrocytencomplexiteit in zowel normale als zieke weefsels. Hiertoe werd een eerder gepubliceerd protocol aangepast voor het isoleren van menselijke neuronale populaties met behulp van FANS4, en een methode werd gevalideerd om te verrijken voor astrocyten (en voor oligodendrogliale voorlopers) met behulp van een drievoudige antilichaamcombinatie, waarbij astrocyten werden gevangen in zowel rust- als reactieve omstandigheden5. Om specifiek te verrijken voor astrocyten in de NeuN-fractie, werden antilichamen gebruikt tegen een van de twee transcriptiefactoren waarvan bekend is dat ze differentieel tot expressie komen tussen astrocytenpopulaties, PAX6 of SRY-box transcriptiefactor 9 (SOX9) 6,7. PAX6 komt sterk tot expressie tijdens de vroege foetale ontwikkeling binnen radiale glia-achtige voorlopercellen in germinale zones en draagt bij aan zowel neurogenese als gliogenese 8,9,10,11 en aan retinale neuronale specificatie 12. Bij de volwassene is PAX6 differentieel overexpressie in rustende menselijke astrocyten6 en vertoont eiwitco-expressie met gliaal fibrillair zuur eiwit (GFAP) in menselijke epilepsieweefselastryoten13.
Dit protocol beschrijft de gelijktijdige isolatie van neocorticale neuronale en astrocyten-verrijkte kernpopulaties door FANS. Vers (niet-gefixeerd) snap-bevroren (d.w.z. vers ingevroren) postmortaal weefsel verzameld uit de volwassen cortex wordt eerst mechanisch en chemisch gedissocieerd. Na lysis en ultracentrifugatie in een sucrosegradiënt worden de cytoplasmatische en extracellulaire componenten weggegooid terwijl de kernen worden behouden. Kernen worden vervolgens gelabeld met fluorescerend geconjugeerde nucleaire antilichamen die overeenkomen met de gewenste doellijnen en gesorteerd met behulp van VENTILATOREN. Volgens deze benadering wordt verrijking van astrocyten aangetoond in de verzamelde PAX6+NeuN-populaties, gevalideerd door zowel een gericht qPCR-paneel als door downstream nucleaire RNA-sequencing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Het programma voor de bescherming van menselijke proefpersonen aan de Icahn School of Medicine op de berg Sinaï (ISMMS) en de Institutional Review Board (IRB) verzekert de ethische uitvoering van onderzoek en naleving van federale, staats- en institutionele voorschriften. In deze studie werden alle gebruikte postmortale specimens gedeïdentificeerd, verkregen onder de juiste toestemming via het biorepository en waren vrijgesteld van de aanduiding "menselijk onderzoek" door ismms IRB (HS # 14-01007).
1. Buffervoorbereiding
OPMERKING: Als u downstream RNA-sequencing uitvoert, behandel dan alle werkruimten en tools grondig met RNase Decontamination Solution om mRNA-degradatie te voorkomen.
- Bereid lysisbuffer voor.
- Los het volgende op in gedestilleerd H2O tot 50 ml: 5,47 g sucrose (0,32 M definitief), 250 μL 1 M CaCl2 (5 mM definitief), 150 μL 1 M Mg(CH3COO)2 (3 mM definitief), 10 μL ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) (0,1 mM final), 500 μL 1 M Tris-HCl (pH 8) (10 mM final), 50 μL Triton X-100 (0,1% finale) en 17 μL 3 M dithiothreitol (DTT, 1 mM final, add fresh) (zie de Tabel met materialen).
- Sucrosebuffer voorbereiden
- Los het volgende op in gedestilleerd H2O tot 50 ml: 30,78 g sucrose (1,8 M definitief), 150 μL 1 M Mg(CH3COO)2 (3 mM final), 500 μL 1 M Tris-HCl (pH 8) (10 mM final), 17 μL van 3 M DTT (1 mM final, voeg vers toe).
2. Bevroren weefseldissociatie in single-nucleus suspensie
- Voeg 4 ml ijskoude lysisbuffer toe aan een 7 ml glazen weefseldouncer (grinder) en houd op ijs. Dissecteer ongeveer 200-400 mg vers ingevroren menselijke volwassen cortex, verdubbeling ongeveer 50x, en breng het weefselhomogenaat over naar een 12 ml ultracentrifuge polypropyleen buis.
- Voeg met een pipet van 5 ml 6,5 ml ijskoude sucrosebuffer toe aan de bodem van de ultracentrifugebuis en zorg ervoor dat de laag tussen sucrose en het weefselhomogenaat niet wordt verstoord.
OPMERKING: Als u extra monsters verwerkt, moet u de buizen zorgvuldig op gewicht balanceren door extra lysisbuffer aan het lichtere monster toe te voegen. Nauwkeurige balancering van de ultracentrifugebuizen is essentieel om schade aan de rotor te voorkomen en rotatie op de juiste snelheid te garanderen.
3. Ultracentrifugatie
- Ultracentrifugeer het lysaat bij 24.400 tpm (101.814 × g) gedurende 1 uur bij 4 °C. Zuig het supernatant en puin voorzichtig op zonder de pellet te storen.
OPMERKING: Een pellet is mogelijk niet zichtbaar als deze begint met minder dan 200 mg weefsel. - Voeg 600 μL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (Ca2+, Mg2+ vrij) toe aan de kernenpellet en incubeer gedurende 10 minuten op ijs voordat u resuspendeert.
- Pipetteer 50 keer op en neer om de kernkorrel op ijs te resuspenseren.
- Gebruik een hemocytometer om de intacte kernen onder een microscoop te visualiseren en om ervoor te zorgen dat de concentratie van de resuspensie hoger is dan 105 kernen / ml voordat u doorgaat naar de volgende stap (combineer 10 μL van de geresuspendeerde kernen met 10 μL trypanblauw).
4. Incubatie van antilichamen
- Om het monster voor FANS te immunotaggen, voegt u 500 μL van de geresuspendeerde monsterpellet, 490 μL 1x PBS (Ca2+, Mg2+ vrij), 10 μL van 10% BSA (0,1% final), 1 μL muis anti-NeuN antilichaam geconjugeerd aan AF555 (NeuN-AF555, 1:1000 eindconcentratie) en 1 μL muis anti-PAX6 antilichaam geconjugeerd aan allofycocyanine (PAX6-APC, 1:1000 eindconcentratie).
OPMERKING: Alternatieve antilichamen geconjugeerd aan andere fluoroforen kunnen worden toegevoegd (zie discussie). Hier werd muis anti-OLIG2 geconjugeerd aan AF488 (1:1000 concentratie) gebruikt met gunstige resultaten. - Voer alleen 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI)-only en single-color controles uit om gatingparameters in te stellen, waarbij indien nodig een kleine hoeveelheid van het monster wordt gebruikt.
- Om AF555-controle met één kleur uit te voeren, voegt u 20 μL van de geresuspendeerde monsterpellet, 970 μL 1x PBS (Ca2+, Mg2+ vrij), 10 μL 10% BSA (0,1% definitief) en 1 μL NeuN-AF555-antilichaam (1:1000-concentratie) toe.
- Om APC-controle met één kleur uit te voeren, voegt u 20 μL van de geresuspendeerde monsterpellet, 970 μL 1X PBS (Ca2+, Mg2+ vrij), 10 μL van 10% BSA (0,1% finale) en 1 μL PAX6-APC-antilichaam (1:1000 concentratie) toe.
- Om alleen DAPI-controle uit te voeren, voegt u 20 μL van de geresuspendeerde monsterpellet, 970 μL 1X PBS (Ca2+, Mg2+ vrij) en 10 μL 10% BSA (0,1% definitief) toe (DAPI zal later worden toegevoegd, zie 4.4).
OPMERKING: Als er meer dan twee antilichamen worden gebruikt, wordt het uitvoeren van fluorescentie-minus-één (FMO) controle aanbevolen naast de controles met één kleur.
- Incubeer de monsters en de controles met rotatie in het donker gedurende 1 uur bij 4 °C.
- Voeg DAPI op 1:1000 toe aan alle monsters en controles en ga verder met sorteren.
5. Fluorescentie-geactiveerde kernen sorteren (FANS)
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om een institutionele flowcytometriefaciliteit te gebruiken met hulp van getraind personeel, tenzij u al bekwaam bent in flowcytometrie / sorteertechnieken.
- Poort zoals hieronder weergegeven.
- Ten eerste, en voor elk monster, gate by forward scatter (FSC-A) vs. zijdelingse verstrooiing (SSC-A) om deeltjes op te nemen in het juiste groottebereik voor kernen, dus met uitzondering van rode bloedcellen en puin (figuur 1A).
OPMERKING: Een zeer schoon kernpreparaat kan onderscheid maken tussen een kleinere puincluster en een kerncluster. - Vervolgens, en voor elk monster, poort door FSC-A vs. FSC-W (of FSC-A vs. FSC-H) en SSC-A vs. SSC-W (of SSC-A vs. SSC-H) om alleen singletkernen op te nemen (figuur 1B).
- Vervolgens, en voor elke steekproef, poort door DAPI om intacte kernen singlets (DAPI-high gated populatie), exclusief puin (DAPI-laag, links van gated populatie) en doublets (rechts van gated populatie) op te nemen (figuur 1C).
- Stel verdere gating in op basis van fluorescentiecontroles, visueel bepaald als afzonderlijke clusters op FACS-plots.
- Voer alleen DAPI-controle uit om achtergrondkleuring van populaties te bepalen, in afwezigheid van antilichamen (figuur 1D en figuur 2A).
- Voer de regeling alleen NeuN-AF555 uit om de afsnijding voor NeuN+ kleuring in het kanaal voor AF555 te bepalen (figuur 2B).
- Voer pax6-APC-only controle uit om de cutoff voor PAX6+ kleuring in het APC-kanaal te bepalen (figuur 2C).
- Voer extra besturingselementen voor één kleur uit als u meer antilichamen gebruikt (figuur 2D, E).
OPMERKING: Als u meer dan twee antilichamen gebruikt, wordt een FMO-controle aanbevolen om eventuele verschuivingen in populaties te visualiseren.
- Zodra alle besturingselementen zijn uitgevoerd, trekt u de poorten voor NeuN + - en PAX6 + -collecties boven de vastgestelde drempels.
- Gate de NeuN + -populatie om neuronen te verzamelen (figuur 1E en figuur 2F).
- Gate de PAX6+ populatie van de NeuN-populatie om astrocyten te verzamelen (figuur 1E, F en figuur 2F).
- Poort en verzamel extra gliale populaties (zoals oligodendrocytenvoorlopercellen, zoals hier weergegeven door OLIG2 +) van de NeuN-PAX6-populatie (figuur 1F).
OPMERKING: In het geval dat het bepalen van geschikte gating cutoffs moeilijk is met de flowcytometriesoftware vanwege onduidelijke populaties, kan het nuttig zijn om het aantal gebeurtenissen dat wordt gevisualiseerd te wijzigen (het aantal gebeurtenissen op de FANS-plot verhogen of verminderen).
- Ten eerste, en voor elk monster, gate by forward scatter (FSC-A) vs. zijdelingse verstrooiing (SSC-A) om deeltjes op te nemen in het juiste groottebereik voor kernen, dus met uitzondering van rode bloedcellen en puin (figuur 1A).
- Verzamel monsters op de juiste manier op basis van de beoogde downstream-analyse.
6. Verzameling van FANS-populaties voor downstream moleculaire analyses
- Verzamel voor bulk RNA-sequencing 50.000-500.000 kernen in PBS (zie ook rubriek 7.1).
- Voeg 2 ml sucroseoplossing, 50 μL 1 M CaCl2 en 30 μL 1 M Mg(CH3COO)2 toe en vul met PBS tot 10 ml.
- Omkeren en incuberen op ijs gedurende 15 minuten, en vervolgens centrifugeren bij 900 × g gedurende 10-15 minuten bij 4 °C.
- Aspirateer het supernatant, resuspendeer in 1 ml RNA-extractiereagens, vortex, vries op droogijs en bewaar bij -80 °C.
- U kunt de monsters ook rechtstreeks in 200 μL van het RNA-extracterende reagens verzamelen. Voeg het RNA-extracterende reagens toe tot 1 ml na het sorteren, met behoud van een verhouding van 1:1 van het reagens tot het gesorteerde monster. Vortex, vries in op droogijs en bewaar bij -80 °C.
- Voor bulktest voor transposase-toegankelijk chromatine met behulp van sequencing (ATAC-seq), verzamel 50.000-75.000 kernen in PBS in een microcentrifugebuis bedekt met 5% runderserumalbumine (BSA). Vries kernen in op droogijs/-80 °C of gebruik ze onmiddellijk voor ATAC-bereiding.
- Verzamel voor sn RNA-seq of ATAC-seq kernen in 0,04% BSA in PBS (zie ook rubriek 7.2).
7. Pre-bibliotheek voorbereidingstips
- Bulk nucleaire RNA sequencing bibliotheekvoorbereiding
- Na het verzamelen in RNA-extractiereagens, voert u standaard fenol / chloroform RNA-extractie uit door fenol / chloroform toe te voegen en RNA uit de bovenste waterige laag neer te slaan met ethanol, gevolgd door DNase-vertering op buis (15 min).
- Voer RNA-reiniging uit en concentreer in een laatste volume van 15 μL water.
OPMERKING: Met behulp van deze methode is het representatieve herstel van 300 mg volwassen cortexmonster ~ 300.000 NeuN + -kernen (15-20 ng / μL totaal RNA na opschoning en concentratie) en ~ 250.000 PAX6 + kernen (10-12 ng / μL totaal RNA na opschoning en concentratie). Deze representatieve opbrengst kan sterk variëren op basis van monsterkwaliteit, gating stringency en RNA-herstel. - Kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR) uitvoeren voorafgaand aan sequencing om de verrijking van astrocyten te bevestigen op basis van hoge differentiële expressie van canonieke astrocytenmarkers (GFAP, SOX9), 10-formyltetrahydrofolaatdehydrogenase (ALDH1L1)) en uitputting van neuronale en andere cellijnmarkers (figuur 1G).
OPMERKING: Verzameling van de dubbelnegatieve populatie (NeuN-PAX6-) maakt een nauwkeurigere, meerlagige qPCR-kwaliteitscontroleanalyse mogelijk voor de relatieve verrijking van astrocyten (figuur 2H). - Genereer RNA-seq-bibliotheken met behulp van een kit die wordt aanbevolen voor lage RNA-integriteitswaarden, zoals verwacht van postmortale monsters.
- Single-nucleus sequencing bibliotheekvoorbereiding
- Voer sn-sequencing uit via een institutionele sequencingkern.
- Gebruik voor verwerking en sequencing op basis van nanofluïdica de aanbevolen concentratie van 1 × 106 cellen/ml in ten minste 60 μL 1x PBS + 0,04% BSA voor single-nucleus RNA-sequencing (snRNA-seq) en 3 × 106 cellen/ml in ten minste 20 μL van 1x PBS + 0,04% BSA voor single-nucleus Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing (snATAC-seq).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kernen werden verzameld uit vers (niet-gefixeerd) snap-bevroren temporale neocortexweefsel met een postmortale verzameltijd van 12 uur. Na weefseldissociatie in kernensuspensie werden monsters geïncubeerd met antilichamen tegen NeuN, PAX6 en OLIG2 en gesorteerd volgens de gating in figuur 1 en figuur 2. Kernen werden verzameld uit NeuN+, PAX6+NeuN-, en OLIG2+NeuN- gesorteerde populaties (figuur 1E, F en figuur 2F). Een gericht qPCR-panel onthulde verrijking voor de pan-astrocytenmarkers, GFAP en ALDH1L1, in de PAX6+(NeuN-)populatie (figuur 1G en figuur 2H). Daarnaast werd de OLIG2+ populatie verrijkt voor de oligodendrocyte progenitor cell (OPC) marker PDGFRA (Figuur 1G). Bulk RNA-sequencing van de verzamelde populaties toonde vergelijkende verrijking van astrocytenmarkers en uitputting van neuronale markers in de PAX6+(NeuN-)populatie (figuur 1H). Immunofluorescentie bevestigde de colocalisatie van PAX6 met GFAP in volwassen menselijke corticale astrocyten (figuur 1I).
Onderzoek van controles met één kleur onthult verschillende positieve en negatieve populaties voor elke marker, waardoor nauwkeurige cutoffs voor verzameling konden worden ingesteld (figuur 2A-G). Bovendien werd astrocyten-verrijkte FANS-isolatie vergeleken met twee verschillende antilichamen tegen astrocytenkernmarkers, SOX9 en PAX6. Een hoger percentage kerngebeurtenissen werd vastgelegd door FANS met PAX6 (~ 13,8%) dan door FANS die SOX9 gebruikten (~ 6%) binnen de met astrocyten verrijkte poort (figuur 2F, G). Een gericht qPCR-panel onthulde verrijking voor GFAP-, PAX6- en SOX9-populaties in zowel SOX9+(NeuN-)-populaties als PAX6+(NeuN-)-populaties (figuur 2H). Retroactief vergelijken van de dissociatie en kleuring van verschillende monsters met variërend postmortaal interval (PMI) van weefselverzameling onthulde dat een kortere PMI geassocieerd was met een groter herstel van intacte kernen (figuur 3A). Bevroren weefsel met een PMI van maximaal 24 uur leverde een hoog percentage intacte kernen op, tot 90%; bij 30 h PMI konden echter zeer weinig intacte kernen worden teruggevonden (figuur 3A). Het opnemen van een antilichaam-wash stap in het standaardprotocol (dat deze stap meestal weglaat om het herstel te optimaliseren) onthulde geen significante verschuivingen in de scheiding van verschillende NeuN +/- of PAX6 +/- populaties (figuur 3B).
Af en toe was een slechte scheiding van PAX6+NeuN-populaties te zien, zelfs in monsters met een hoog percentage levensvatbare kernen (figuur 3C), waardoor de weefseldissociatie en het FANS-protocol moesten worden herhaald. Single-nucleus RNA-seq studies gaven verder prioriteit aan PAX6 als een top differentieel tot expressie gebrachte nucleaire transcriptiefactor in zowel protoplasmatische als fibreuze volwassen astrocytensubpopulaties, niet alleen in de neocortex, maar ook in de subventriculaire zone (SVZ) en aangrenzend striatum (figuur 3D). Vergelijking van NEUN/PAX6/OLIG2 triple FANS tussen de neocortex en het striatum afgeleid van hetzelfde hersenmonster toonde regiospecifieke verschillen in de scheiding van PAX6+ kernen (figuur 3E). Dit protocol is momenteel alleen gevalideerd voor de neocortex.
Figuur 1: Validatie van neuron- en astrocyten-verrijkte isolatie door FANS. (A-F) Representatieve voorbeelden van sequentiële FANS gating om puin en doubletten (A-C) uit te sluiten en achtergrondkleuring te definiëren met behulp van (D) een DAPI-only controle voor de verzameling van (E-F) verrijkte neuronale (NeuN+), astrocyten (PAX6+NeuN-) en OPC (OLIG2++NeuN-) kernpopulaties. (G) Minimaal qPCR-paneel met behulp van pan-astrocyten (GFAP, ALDH1L1), neuronale (RBFOX3) en OPC (PDGFRA) markers voor kwaliteitscontrole van de verzamelde populaties (A-G: temporal neocortex autopsiemonster zonder pathologie, 12 h PMI, 100.000 getoonde gebeurtenissen; stippellijnen vertegenwoordigen positief gated sequentiële populaties; vaste lijnen vertegenwoordigen de uiteindelijke verzameling van celtype verrijkte populaties). (H) Heatmap gegenereerd op basis van rijgenormaliseerde bulk RNA-sequencinggegevens die expressie van canonieke astrocyten en neuronale markers laten zien in PAX6 + en NeuN + gesorteerde populaties (n = 3 autopsiegevallen, temporale neocortex zonder pathologie, PMI 12-21 uur). (I) Representatief immunofluorescentiebeeld van PAX6, GFAP en NeuN in menselijke neocortex. Pijlen geven astrocyten aan die PAX6 en GFAP samen tot expressie brengen. Afkortingen: FANS = fluorescentie-activerende kernen sorteren; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindool; NeuN = neuronale kernen; PAX6 = gepaard dooseiwit 6; OLIG2 = oligodendrocytentranscriptiefactor 2; OPC = oligodendrocytenvoorlopercel; qPCR = kwantitatieve polymerasekettingreactie; GFAP = glial fibrillary acidic protein ; ALDH1L1 = 10-formyltetrahydrofolaatdehydrogenase; RBFOX3 = RNA-bindend eiwit FOX-1 homoloog 3; PDGFRA = van bloedplaatjes afgeleide groeifactor alfa; PMI = postmortaal interval; SSC-A = zijstrooiingsgebied; FSC-A = voorwaarts strooigebied; SSC-W = zijdelingse strooibreedte; FSC-W = voorwaartse strooibreedte; NeuN-555 = muis anti-NeuN geconjugeerd aan AF555; PAX6-APC = muis anti-PAX6 geconjugeerd aan allophycocyanine; OLIG2-488 = muis anti-OLIG2 geconjugeerd aan groene fluorescerende kleurstof voor de 488 nm laserlijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Vergelijkende isolatie van met astrocyten verrijkte populaties met PAX6- of SOX9-antilichamen. (A-E) Eenkleurige controles voor DAPI, NeuN, PAX6, SOX9 en OLIG2 definiëren positieve / negatieve cutoffs in de respectieve fluorescentiekanalen. (F-G) Vergelijkende FANS-methode voor met astrocyten verrijkte isolatie met behulp van (F) NeuN/PAX6 of (G) NeuN/SOX9-antilichamen. Een groter percentage van de gebeurtenissen wordt vastgelegd door PAX6 dan door SOX9 binnen de met astrocyten verrijkte poort. (A-G: identiek postmortaal niet-pathologisch niet-pathologisch neocortexmonster dat voor alle experimenten wordt gebruikt; 12 uur PMI; 10.000 waargenomen voorvallen). (H) Kwaliteitscontrole qPCR-analyse bevestigt verrijking van astrocytenmarkers en uitputting van niet-astrocytenmarkers in PAX6 +(NeuN-) en SOX9+(NeuN-) gesorteerde populaties van F-G (gegevens genormaliseerd tot ACTB en gekwantificeerd als vouwverandering van de NeuN+ populatie). Afkortingen: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindool; NeuN = neuronale kernen; PAX6 = gepaard dooseiwit 6; OLIG2 = oligodendrocytentranscriptiefactor 2; SOX9 = SRY-box transcriptiefactor 9; qPCR = kwantitatieve polymerasekettingreactie; GFAP = glial fibrillary acidic protein ; RBFOX3 = RNA-bindend eiwit FOX-1 homoloog 3; PDGFRA = van bloedplaatjes afgeleide groeifactor alfa; PMI = postmortaal interval; NeuN-555 = muis anti-NeuN geconjugeerd aan AF555; PAX6-APC = muis anti-PAX6 geconjugeerd aan allophycocyanine; OLIG2-488 = muis anti-OLIG2 geconjugeerd aan groene fluorescerende kleurstof voor de 488 nm laserlijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Afhankelijke en onafhankelijke statistieken voor succesvolle FANS-experimenten. (A) Effect van pmi voor monsterverzameling op de kwaliteit van kernen: lagere PMI maakt het herstel van een groter aantal intacte kernen mogelijk met adequate resultaten tot 24 uur. (B) De opname van een wasstap na antilichaamincubatie lijkt de FANS-populaties niet visueel te verschuiven. (C) Voorbeeld van een mislukt FANS-experiment met een gebrek aan een duidelijke PAX6+(NeuN-)-populatie (rechts) ondanks de aanwezigheid van intacte kernen en lage achtergrond (links) (postmortale temporale neocortex, niet-pathologisch, 7 h PMI). (D) Heatmap-representatie van volwassen menselijke sn RNA-seq-gegevens die differentiële expressie van PAX6 en twee andere astrocytenkernfactoren, SOX9 en LHX2, laten zien in protoplasmatische en vezelige astrocytensubpopulaties in zowel cortex als SVZ, vergeleken met andere celtypen (rode kleurgradiënt vertegenwoordigt spectrum van log-genormaliseerde gemiddelde genexpressiewaarden; n = 3 verschillende autopsiegevallen, 43.619 totale kernen. (E) Verschillende hersengebieden (temporale neocortex vs. SVZ en subjacent striatum) vertonen verschillende patronen van NeuN/PAX6/OLIG2 scheiding. Afkortingen: FANS = fluorescentie-activerende kernen sorteren; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindool; NeuN = neuronale kernen; PAX6 = gepaard dooseiwit 6; OLIG2 = oligodendrocytentranscriptiefactor 2; GFAP = glial fibrillary acidic protein ; ALDH1L1 = 10-formyltetrahydrofolaatdehydrogenase; LXH2 = LIM homeobox 2; PMI = postmortaal interval; SSC-A = zijstrooiingsgebied; FSC-A = voorwaarts strooigebied; NeuN-555 = muis anti-NeuN geconjugeerd aan AF555; PAX6-APC = muis anti-PAX6 geconjugeerd aan allophycocyanine; OLIG2-488 = muis anti-OLIG2 geconjugeerd aan groene fluorescerende kleurstof voor de 488 nm laserlijn; SVZ = subventriculaire zone; A(p) = protoplasmatische (grijze stof) astrocyten; A(f) = vezelige (witte stof) astrocyten; OL = oligodendrocyten; OPC = oligodendrocytenvoorlopercellen; EN = exciterende neuronen; MSN = medium stekelige neuronen; MG = microglia; BVC = bloedvatcellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Experimenteel ontwerp volgens het geschetste protocol moet worden afgerond na overweging van verschillende biologische en technische factoren. Beginnende weefselmonsters zijn vers ingevroren, zonder te zijn gefixeerd, en hebben bij voorkeur een kort postmortaal verzamelinterval om het herstel van kernen te maximaliseren. Op basis van ervaring zorgt een PMI van maximaal 24 uur voor adequaat kernherstel; een PMI van 12 uur of minder heeft echter de voorkeur om het herstel van intacte kernen te optimaliseren. Bijkomende factoren naast PMI, waaronder de temperatuur van de lichaamsopslag en de pH-waarden van het weefsel, kunnen ook de opbrengst van kernen beïnvloeden, maar werden in deze onderzoeken niet meegenomen14. Uit anekdotische ervaring is gebleken dat het herstel van FANS vergelijkbaar is met hetzelfde weefsel dat tot vijf jaar bij -80 °C wordt opgeslagen, hoewel er geen gecontroleerde experimenten werden uitgevoerd om de variabiliteit van opslag op celtypespecifieke expressie te beoordelen. Het wassen van het monster na incubatie van antilichamen is een andere variabele die mogelijk moet worden overwogen. Over het algemeen vermindert een wasstap de totale opbrengst, maar kan de scheiding van verschillende immunogelabelde populaties verbeteren. In deze onderzoeken werd geen verschil waargenomen in de scheiding van NEUN/PAX6-populaties bij het opnemen of uitsluiten van een post-antilichaamwasstap, maar deze stap kan gunstig zijn bij het gebruik van andere primaire en secundaire antilichamen, vooral als ze niet vooraf zijn geconjugeerd.
Vanwege de variabiliteit in de gevoeligheid van de sorteerapparatuur is het noodzakelijk om bij elke sorteergebeurtenis de juiste controles uit te voeren. Als overmatig extracellulair puin wordt gezien in het geresuspendeerde monster bij het visualiseren op een hemocytometer, kan het monster door een filter van 40 μm worden geleid om alleen de kernen te behouden. Als het monster beperkt is, kunnen kralen die zijn gelabeld met de juiste fluorofoor ook worden gebruikt voor eenkleurige en FMO-controles. Als de monsters niet verrijkt lijken te zijn voor de gewenste astrocytenpopulaties, zoals bepaald door qPCR of sequencingresultaten, kan het nuttig zijn om alle NeuN- en PAX6 + (NeuN-) populaties strikter te sluiten, waardoor er meer ruimte overblijft tussen de gate cutoffs voor positieve en negatieve populaties.
De meeste van de hier beschreven validatiestudies werden uitgevoerd met behulp van OLIG2 naast NeuN en PAX6, om tegelijkertijd te verrijken voor neuronale, astrocyten en oligodendrocyten voorloper (OPC's) kernenpopulaties. Het wordt aanbevolen om OLIG2 op te nemen als een derde afstammingsmarker om corticale astrocyten effectiever te verrijken binnen de NeuN-fractie. De aan- of afwezigheid van FITC-geconjugeerde OLIG2 lijkt de PAX6+ populatie niet te verschuiven; daarom is de veronderstelling dat experimenten exclusief OLIG2 zullen resulteren in vergelijkbare astrocytenverrijking. Van belang is dat de PAX6+ populatie wordt afgeschermd van de NeuN-populatie, omdat sommige neuronale populaties zowel NeuN als PAX615 uitdrukken. Astrocyten kunnen ook worden gesorteerd op SOX9-expressie; kleuren en sorteren met SOX9 leidt echter tot een minder robuuste verrijking van astrocyten in vergelijking met PAX6. Hoewel een duidelijke scheiding werd waargenomen tussen neuronale, astrocytische en OPC-afstammingslijnen in de volwassen cortex, werd een vergelijkbare scheiding niet waargenomen tussen PAX6+ en OLIG2+ populaties in de volwassen SVZ en aangrenzende striatum.
Hoewel het mogelijk is dat sommige astrocyten uit de SVZ lage niveaus van OLIG2 uitdrukken, werden de verzamelde populaties alleen gevalideerd door qPCR (gegevens niet getoond); vandaar dat downstream RNA-sequencing nuttig kan zijn bij het verder definiëren van de zuiverheid van deze populaties. Bovendien kan dit protocol worden aangepast om kernen te isoleren van bevroren foetaal hersenweefsel en hersentumorweefsel met behulp van populatiespecifieke nucleaire markers. Omdat deze weefsels aanzienlijk cellulairer zijn, kan het nuttig zijn om met minder weefsel te beginnen om de aggregatie van kernen te minimaliseren. Bij het sorteren van aneuploïde kernen uit neoplastisch weefsel wordt DAPI-gating aangepast om rekening te houden met mogelijk hogere fluorescentie. Het wordt ten zeerste aanbevolen dat gebruikers een zorgvuldige validatie uitvoeren voordat ze FANS op neoplastisch weefsel uitvoeren, omdat het huidige protocol alleen is gevalideerd voor niet-neoplastische monsters. Over het algemeen stelt het hierboven beschreven protocol een gevalideerde strategie voor het isoleren van verrijkte astrocytenpopulaties voor, aangepast aan eerder vastgestelde protocollen om neuronen te verrijken. Deze methodologie kan worden gebruikt om astrocytenkernpopulaties effectief te isoleren van zowel normale als zieke corticale hersenweefsels voor gebruik in verdere moleculaire analyses.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We willen graag leden in pathologie en neurochirurgie aan de Icahn School of Medicine op de berg Sinaï bedanken voor hulp bij de aanschaf van niet-geïdentificeerd hersenweefsel en ISMMS's Flow Cytometry CORE voor deskundig advies. De studie werd gedeeltelijk gefinancierd door NIH RF1DA048810, R01NS106229, R03NS101581 (naar N.M.T.) en R61DA048207 (naar S.A.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS pH 7.2 | Invitrogen | 70013073 | |
| ANTI-NEUN ANTIBODY CLONE A60 | Millipore | MAB377A5MI | mouse anti-NeuN conjugated to a fluorescent compound AF555 (excitation, 553 nm; emission, 568 nm) |
| ANTI-OLIG2 ANTIBODY CLONE 211 | Millipore | MABN50A4MI | mouse anti-OLIG2 conjugated to a fluorescent compound AF488 (excitation, 499 nm; emission, 520 nm) |
| Bovine Serum Albumin | Fisher | BP9704-100 | |
| Bright-Line Counting Chamber | Hausser Scientific | 3110V | |
| Calcium Chloride Anhydrous | Fisher | C614-3 | |
| Cell Strainers, 40 µM | SP Scienceware | 136800040 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma | 43815-1G | |
| DNA Library Kit | Illumina, Nextera | FC-121–1030 | |
| DNAse I | Worthington | LS002139 | |
| Dounce Tissue Grinder | WHEATON | 357542 | |
| FACS Sorter | BD Biosciences | BD FACSAria III | |
| Magnesium Acetate Tetrahydrate | Fisher | M13-500 | |
| PAX6 (PAX6/496) - 100 TESTS | Novus | NBP234705J | |
| RNA Clean & Concentrator | Zymo Research | R1013 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | |
| SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit Pico Input Mammalian | Clontech Laboratories | 635005 | Fragmentation time of 2.5 minutes, as recommended for low RIN RNA values. |
| Sucrose, crystal certified, ACS, 500 mg | Fisher | S5500 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, Ultrapure | Thermo Scientific | J22638AE | |
| TritonX-100 | Fisher | BP151-500 | non-ionic surfactant in lysis buffer |
| TRIzol LS Reagent | Invitrogen | 10296028 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | reagent for isolation of RNA |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Optima XE-100 | A94516 | |
| Ultracentrifuge tubes PP 9/16 X 3-1/2 | Beckman Coulter | 331372 | |
| UltraPure Distilled Water (RNAse-, DNAse-free) | Invitrogen | 10977023 | referred to as distilled water |
| Ultrapure EDTA | Life Technologies | 15576-028 |
References
- Mitchell, A., Roussos, P., Peter, C., Tsankova, N., Akbarian, S. The future of neuroepigenetics in the human brain. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 128, 199-228 (2014).
- Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. Isolation of neuronal chromatin from brain tissue. BMC Neuroscience. 9, 42 (2008).
- Akbarian, S., et al. The PsychENCODE project. Nature Neuroscience. 18 (12), 1707-1712 (2015).
- Matevossian, A., Akbarian, S. Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (20), e914 (2008).
- Tome-Garcia, J., et al. Cell type-specific isolation and transcriptomic profiling informs glial pathology in human temporal lobe epilepsy. BioRxiv. , (2020).
- Zhang, Y., et al. Purification and characterization of progenitor and mature human astrocytes reveals transcriptional and functional differences with mouse. Neuron. 89 (1), 37-53 (2016).
- Sun, W., et al. SOX9 Is an astrocyte-specific nuclear marker in the adult brain outside the neurogenic regions. Journal of Neuroscience. 37 (17), 4493-4507 (2017).
- Manuel, M. N., Mi, D., Mason, J. O., Price, D. J. Regulation of cerebral cortical neurogenesis by the Pax6 transcription factor. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 70 (2015).
- Sakurai, K., Osumi, N. The neurogenesis-controlling factor, Pax6, inhibits proliferation and promotes maturation in murine astrocytes. Journal of Neuroscience. 28 (18), 4604-4612 (2008).
- Zhong, S., et al. Decoding the development of the human hippocampus. Nature. 577 (7791), 531-536 (2020).
- Pollen, A., et al. Molecular identity of human outer radial glia during cortical development. Cell. 163 (1), 55-67 (2015).
- Cvekl, A., Callaerts, P. PAX6: 25th anniversary and more to learn. Experimental Eye Research. 156, 10-21 (2017).
- Goc, J., Liu, J. Y., Sisodiya, S. M., Thom, M. A spatiotemporal study of gliosis in relation to depth electrode tracks in drug-resistant epilepsy. European Journal of Neuroscience. 39 (12), 2151-2162 (2014).
- Monoranu, C. M., et al. pH measurement as quality control on human post mortem brain tissue: a study of the BrainNet Europe consortium. Neuropathology and Applied Neurobiology. 35 (3), 329-337 (2009).
- Ninkovic, J., et al. The transcription factor Pax6 regulates survival of dopaminergic olfactory bulb neurons via crystallin αA. Neuron. 68 (4), 682-694 (2010).
