Summary
פיתחנו שיטה המעשירה ומבודדת אוכלוסיות אסטרוציטים אנושיות מרקמה קפואה טרייה לשימוש בניתוחים מולקולריים במורד הזרם.
Abstract
המורכבות של האסטרוציטים האנושיים נותרה לא מוגדרת היטב ברקמה האנושית הראשונית, ודורשת כלים טובים יותר לבידוד ולאפיון המולקולרי שלהם. ניתן להשתמש במיון גרעינים המופעלים על-ידי פלואורסצנציה (FANS) כדי לבודד ולחקור בהצלחה אוכלוסיות גרעינים עצביים אנושיים (NeuN+) מרקמה ארכיונית קפואה, ובכך להימנע מבעיות הקשורות לטיפול ברקמות טריות. עם זאת, חסרים מאמצים לבודד באופן דומה את האסטרוגליה מהאלמנט הלא-עצבי (NeuN-). אסטרטגיית תיוג אימונולוג שפותחה ואומתה לאחרונה משתמשת בשלושה נוגדנים של גורמי שעתוק כדי לבודד בו זמנית אוכלוסיות של גרעינים מועשרים עצביים מועשרים (NeuN+), אסטרוציטים (חלבון קופסה מזווג 6 (PAX6)+NeuN-), וגרעיניטור אוליגודנדרוציטים (OLIG2+NeuN-) מאוכלוסיות גרעינים מועשרים (OLIG2+NeuN-) מרקמת ניאו-קורטקס טמפורלית אנושית לא חולה, טרייה (לא מנוקבת).
טכניקה זו הוכחה כיעילה לאפיון שינויים בתעתיק ספציפי לסוג התא בניאוקורטקס אפילפסיה פתולוגית ראשונית. ניתוחי תעתיק אישרו כי אוכלוסיות ממוינות PAX6+NeuN מועשרות היטב עבור סמני פאן-אסטרוציטים ולוכדות אסטרוציטים הן בתנאי מנוחה והן בתנאים תגובתיים. מאמר זה מתאר את מתודולוגיית FANS לבידוד של אוכלוסיות גרעינים מועשרים באסטרוציטים מקליפת המוח האנושית הקפואה טרייה, כולל דיסוציאציה של רקמות לתרחיף של גרעין יחיד (sn); אימונו-תיוג של גרעינים עם נוגדנים מצומדים פלואורסצנטיים נגד NeuN ו-anti-PAX6; אוהדים מנצלים אסטרטגיות ומדדי בקרת איכות לאופטימיזציה של רגישות וספציפיות במהלך המיון ולאישור העשרת אסטרוציטים; ורכש מומלץ לריצוף תעתיק במורד הזרם ונגישות כרומטין ברזולוציית תפזורת או sn. פרוטוקול זה ישים עבור דגימות קליפת המוח האנושיות שאינן נמקיות, קפואות טריות, עם פתולוגיות שונות ואיסוף רקמות מומלץ לאחר המוות תוך 24 שעות.
Introduction
המורכבות המולקולרית של האסטרוציטים האנושיים נותרה לא מוגדרת היטב ברקמות הראשוניות, ודורשת כלים טובים יותר לבידוד ולאפיון שלהם ברזולוציה גבוהה, הן בבריאות והן במחלות. הפרדת תאי עצב אנושיים וגליה שלמים מהנישה שלהם הוכחה כקשה בשל גישה מוגבלת של דגימות רקמת מוח טריות, האופי המקושר בכבדות של תהליכי גליה ונוירונים, והפעלה תאית בלתי נמנעת במהלך העיבוד, כל אלה מגבילים את האפיון המולקולרי של סוגי תאים אלה ex vivo1 . מיון גרעינים המופעלים על ידי פלואורסצנציה (FANS) התגלה כחלופה למיון תאים חיים, המאפשר דיסוציאציה ואימונו-תיוג של אוכלוסיות גרעינים מרקמה קפואה. בעשור האחרון, FANS הפך לשימוש נרחב לבידוד ואפיון מולקולרי של אוכלוסיות גרעינים עצביים אנושיים (NeuN+) במגוון דגימות מוח ואזורים אנטומיים 1,2,3,4.
עם זאת, שיטות דומות לבידוד תת-אוכלוסיות של גרעיני גליה ספציפיים מקליפת המוח האנושית היו מוגבלות, מה שהוביל לחוסר תחכום יחסי בהבנת מורכבות האסטרוציטים ברקמות נורמליות וחולות כאחד. לשם כך, פרוטוקול שפורסם בעבר הותאם לבידוד אוכלוסיות נוירונים אנושיות באמצעות FANS4, ואומתה שיטה להעשרתם עבור אסטרוציטים (ועבור אבות אוליגודנדרוגליאליים) באמצעות שילוב נוגדנים משולש, לכידת אסטרוציטים הן בתנאי מנוחה והן בתנאים תגובתיים5. כדי להעשיר באופן ספציפי עבור אסטרוציטים בשבר ה-NeuN, נעשה שימוש בנוגדנים כנגד אחד משני גורמי שעתוק הידועים כמבוטאים באופן דיפרנציאלי בין אוכלוסיות אסטרוציטים, PAX6 או גורם שעתוק תיבת SRY 9 (SOX9)6,7. PAX6 מתבטאת מאוד במהלך ההתפתחות המוקדמת של העובר בתוך אבות דמויי גליה רדיאליים באזורי חיידקים ותורמת הן לנוירוגנזה והן לגליוגנזה 8,9,10,11, כמו גם למפרט העצבי ברשתית 12. במבוגר, PAX6 מתבטא יתר על המידה במנוחה של אסטרוציטים אנושיים6 ומראה ביטוי משותף של חלבון עם חלבון חומצי פרפור גלי (GFAP) באסטרוציטים של רקמת אפילפסיה אנושית13.
פרוטוקול זה מתאר בידוד סימולטני של אוכלוסיות גרעינים ניאו-קורטיקליים עצביים ואסטרוציטים מועשרים על ידי FANS. רקמה טרייה (לא קפואה) (כלומר, קפואה-טרייה) לאחר המוות שנאספה מקליפת המוח הבוגרת מנותקת תחילה מכנית וכימית. לאחר תזה ואולטרה-צנטריפוגציה בשיפוע סוכרוז, הרכיבים הציטופלסמיים והחוץ-תאיים מושלכים בעוד הגרעינים נשמרים. לאחר מכן גרעינים מסומנים בנוגדנים גרעיניים מצומדים פלואורסצנטית המתאימים לשושלות המטרה הרצויות וממוינים באמצעות FANS. בעקבות גישה זו, העשרת האסטרוציטים מודגמת באוכלוסיות PAX6+NeuN שנאספו, ומאומתת הן על ידי לוח qPCR ממוקד והן על ידי ריצוף RNA גרעיני במורד הזרם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: התוכנית להגנה על נבדקים אנושיים בבית הספר לרפואה של אייקן בהר סיני (ISMMS) ומועצת הביקורת המוסדית שלה (IRB) מבטיחה את ההתנהלות האתית של מחקר ועמידה בתקנות פדרליות, מדינתיות ומוסדיות. במחקר זה, כל הדגימות שלאחר המוות שבהן נעשה שימוש לא זוהו, התקבלו בהסכמה מתאימה באמצעות הביו-רפוזיטור, והיו פטורות מהסימון "מחקר אנושי" על ידי ה-IRB של ISMMS (HS#14-01007).
1. הכנת מאגר
הערה: אם אתם מבצעים ריצוף RNA במורד הזרם, טפלו ביסודיות בכל סביבות העבודה והכלים עם פתרון הטיהור של RNase כדי למנוע פירוק mRNA.
- הכן מאגר ליזיס.
- ממיסים את הדברים הבאים ב-Hמזוקק 2O עד 50 מ"ל: 5.47 גרם סוכרוז (0.32 מ' סופי), 250 μL של 1 M CaCl2 (5 mM סופי), 150 μL של 1 M Mg(CH3COO)2 (גמר 3 mM), 10 μL של 500 mM חומצה אתילנדיאמינטית-אצטית (EDTA) (גמר 0.1 mM), 500 μL של 1 M Tris-HCl (pH 8) (10 mM סופי), 50 μL של Triton X-100 (0.1% סופי), ו-17 μL של 3 M dithiothreitol (DTT, 1 mM סופי, הוסף רענן) (ראה את טבלת החומרים).
- הכן מאגר סוכרוז
- ממיסים את הדברים הבאים ב-Hמזוקק 2O עד 50 מ"ל: 30.78 גרם סוכרוז (1.8 מ' סופי), 150 μL של 1 M Mg(CH3COO)2 (גמר 3 mM), 500 μL של 1 M Tris-HCl (pH 8) (10 mM סופי), 17 μL של 3 M DTT (1 mM גמר, הוסף רענן).
2. דיסוציאציה של רקמות קפואות לתרחיף גרעין יחיד
- הוסיפו 4 מ"ל של חיץ ליזיס קר כקרח ל-7 מ"ל (מטחנת) של רקמת זכוכית, והמשיכו על קרח. לנתח כ-200-400 מ"ג של קליפת המוח הבוגרת האנושית הקפואה, למדוד בערך פי 50 ולהעביר את הרקמה הומוגנטית לצינור פוליפרופילן אולטרה-צנטריפוג' של 12 מ"ל.
- באמצעות פיפטה של 5 מ"ל, הוסיפו 6.5 מ"ל של חיץ סוכרוז קר כקרח לתחתית הצינור האולטרה-צנטריפוג', תוך הקפדה שלא להפריע לשכבה שבין סוכרוז לרקמה הומוגנטית.
הערה: אם אתם מעבדים דגימות נוספות, אזנו בזהירות את הצינורות לפי משקל על ידי הוספת מאגר ליזיס נוסף לדגימה הקלה יותר. איזון מדויק של צינורות האולטרה-צנטריפוגה חיוני כדי למנוע נזק לרוטור ולהבטיח סיבוב במהירות הנכונה.
3. אולטרה-צנטריפוגציה
- Ultracentrifuge את הליזאט ב-24,400 סל"ד (101,814 × גרם) למשך שעה אחת ב-4 מעלות צלזיוס. יש לשאוף בזהירות את הסופרנטנט ואת הפסולת מבלי להפריע לכדור.
הערה: ייתכן שכדור לא יהיה גלוי אם מתחילים עם פחות מ-200 מ"ג של רקמה. - הוסיפו 600 μL של מי מלח עם מאגר פוספט (PBS) (Ca2+, Mg2+ ללא תשלום) לכדור הגרעינים ודגרו על הקרח במשך 10 דקות לפני ההחייאה.
- פיפטה למעלה ולמטה 50 פעמים כדי להחזיר את גלולת הגרעינים על קרח.
- השתמש בהמוציטומטר כדי לדמיין את הגרעינים השלמים תחת מיקרוסקופ ולהבטיח שריכוז ההחייאה יהיה מעל 105 גרעינים/מ"ל לפני שתמשיך לשלב הבא (שלב 10 μL של הגרעינים המוחזרים עם 10 μL של כחול טריפאן).
4. דגירה של נוגדנים
- כדי לאימונוטג את הדגימה עבור FANS, הוסף 500 μL של גלולת הדגימה המחודשת, 490 μL של 1x PBS (Ca2+, Mg2+ חינם), 10 μL של 10% BSA (0.1% סופי), 1 μL של נוגדן נגד NeuN של עכבר מצומד ל- AF555 (NeuN-AF555, 1:1000 ריכוז סופי), ו- 1 μL של נוגדן עכבר נגד PAX6 המצומד לאלופיקוציאנין (PAX6-APC, 1:1000 ריכוז סופי).
הערה: ניתן להוסיף נוגדנים חלופיים המצומדים לפלואורופורים אחרים (ראו דיון). כאן, עכבר נגד OLIG2 מצומד AF488 (ריכוז 1:1000) שימש עם תוצאות חיוביות. - בצע פקדים של 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) בלבד וצבע יחיד כדי להגדיר פרמטרים של gating, תוך שימוש בכמות קטנה של המדגם לפי הצורך.
- כדי לבצע בקרת צבע יחידה של AF555, הוסף 20 μL של גלולת הדגימה המוחזרת, 970 μL של 1x PBS (Ca2+, Mg2+ ללא), 10 μL של 10% BSA (0.1% סופי) ו-1 μL של נוגדן NeuN-AF555 (ריכוז 1:1000).
- כדי לבצע בקרת צבע יחידה של APC, הוסיפו 20 μL של גלולת הדגימה המחודשת, 970 μL של 1X PBS (Ca2+, Mg2+ חינם), 10 μL של 10% BSA (0.1% סופי) ו-1 μL של נוגדן PAX6-APC (ריכוז של 1:1000).
- כדי לבצע בקרת DAPI בלבד, הוסף 20 μL של גלולת הדגימה המחודשת, 970 μL של 1X PBS (Ca2+, Mg2+ חינם), ו- 10 μL של 10% BSA (0.1% סופי) (DAPI יתווסף מאוחר יותר, ראה 4.4).
הערה: אם נעשה שימוש ביותר משני נוגדנים, מומלץ לבצע בקרת פלואורסצנציה-מינוס-אחת (FMO) בנוסף לבקרות הצבע הבודד.
- דגירה הדגימות והפקדים עם סיבוב בחושך במשך שעה אחת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
- הוסף DAPI בשעה 1:1000 לכל הדוגמאות והפקדים, והמשך במיון.
5. מיון גרעינים המופעלים על ידי פלואורסצנציה (FANS)
הערה: מומלץ להשתמש במתקן ציטומטריה של זרימה מוסדית בסיוע כוח אדם מיומן, אלא אם כן כבר בקיאים בטכניקות ציטומטריה/מיון זרימה.
- שער כפי שמוצג להלן.
- ראשית, ועבור כל דגימה, שער לפי פיזור קדימה (FSC-A) לעומת. פיזור צד (SSC-A) כדי לכלול חלקיקים בטווח הגודל המתאים לגרעינים, ובכך לא לכלול תאי דם אדומים ופסולת (איור 1A).
הערה: הכנת גרעינים נקיים מאוד יכולה להבחין בין אשכול פסולת קטן יותר לבין צביר גרעינים. - לאחר מכן, ועבור כל דגימה, שער על ידי FSC-A לעומת FSC-W (או FSC-A לעומת FSC-H) ו-SSC-A לעומת SSC-W (או SSC-A לעומת SSC-H) כך שיכלול רק גרעיני סינגלט (איור 1B).
- לאחר מכן, ועבור כל דגימה, שער על ידי DAPI שיכלול גרעינים שלמים (אוכלוסייה מגודרת גבוהה ב-DAPI), למעט פסולת (DAPI-נמוכה, משמאל לאוכלוסייה מגודרת) וכפולות (מימין לאוכלוסייה מגודרת) (איור 1C).
- הגדר גידור נוסף המבוסס על בקרות פלואורסצנטיות, שנקבע באופן חזותי כאשכולות נפרדים בחלקות FACS.
- הפעל בקרת DAPI בלבד כדי לקבוע את צביעת הרקע של אוכלוסיות, בהיעדר נוגדנים (איור 1D ואיור 2A).
- הפעל בקרת NeuN-AF555 בלבד כדי לקבוע את הניתוק עבור צביעת NeuN+ בתעלה עבור AF555 (איור 2B).
- הפעל פקד PAX6-APC בלבד כדי לקבוע את הניתוק עבור צביעת PAX6+ בערוץ APC (איור 2C).
- הפעל בקרות נוספות בצבע יחיד אם אתה משתמש בנוגדנים נוספים (איור 2D,E).
הערה: אם משתמשים ביותר משני נוגדנים, מומלץ לבקרת FMO כדי לדמיין שינויים באוכלוסיות.
- לאחר הפעלת כל הפקדים, צייר את השערים עבור אוספי NeuN+ ו- PAX6+ מעל לספים שנקבעו.
- שערו את אוכלוסיית ה-NeuN+ כדי לאסוף נוירונים (איור 1E ואיור 2F).
- שער את אוכלוסיית PAX6+ מאוכלוסיית ה-NeuN כדי לאסוף אסטרוציטים (איור 1E,F ואיור 2F).
- שער ואסוף אוכלוסיות גליה נוספות (כגון תאי אב של אוליגודנדרוציטים, כפי שמוצג כאן על ידי OLIG2+) מאוכלוסיית NeuN-PAX6 - (איור 1F).
הערה: במקרה שקשה לקבוע ניתוקים מתאימים של gating עם תוכנת ציטומטריית הזרימה עקב אוכלוסיות לא ברורות, זה עשוי להיות מועיל לשנות את מספר האירועים המוצגים באופן חזותי (או להגדיל או להקטין את מספר האירועים בעלילת FANS).
- ראשית, ועבור כל דגימה, שער לפי פיזור קדימה (FSC-A) לעומת. פיזור צד (SSC-A) כדי לכלול חלקיקים בטווח הגודל המתאים לגרעינים, ובכך לא לכלול תאי דם אדומים ופסולת (איור 1A).
- אסוף דגימות כראוי על סמך הניתוח המיועד במורד הזרם.
6. איסוף אוכלוסיות אוהדים לניתוחים מולקולריים במורד הזרם
- לריצוף RNA בתפזורת, אספו 50,000-500,000 גרעינים ב-PBS (ראו גם סעיף 7.1).
- הוסף 2 מ"ל של תמיסת סוכרוז, 50 μL של 1 M CaCl2, ו- 30 μL של 1 M Mg(CH3COO)2, ומלא ב- PBS עד 10 מ"ל.
- הפוך ודגירה על קרח במשך 15 דקות, ואז צנטריפוגה ב 900 × גרם במשך 10-15 דקות ב 4 °C (64 °F).
- לשאוף לסופרנאטנט, לשאוף ב-1 מ"ל של ריאגנט מחלץ RNA, מערבולת, להקפיא על קרח יבש ולאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
- לחלופין, אספו את הדגימות ישירות לתוך 200 μL של המגיב המחלץ RNA. הוסף את המגיב המחלץ RNA עד 1 מ"ל לאחר המיון, תוך שמירה על יחס של 1:1 בין המגיב לדגימה ממוינת. מערבולת, להקפיא על קרח יבש, ולאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
- לצורך בדיקה בתפזורת של כרומטין נגיש לטרנספוזה באמצעות ריצוף (ATAC-seq), אספו 50,000-75,000 גרעינים ב-PBS בצינור מיקרוצנטריפוג' המצופה ב-5% אלבומין בסרום בקר (BSA). הקפיאו גרעינים על קרח יבש/-80 מעלות צלזיוס או השתמשו בהם מיד להכנת ATAC.
- עבור sn RNA-seq או ATAC-seq, לאסוף גרעינים ב-0.04% BSA ב-PBS (ראו גם סעיף 7.2).
7. טיפים להכנה לפני הספרייה
- הכנת ספריית ריצוף RNA גרעיני בתפזורת
- לאחר איסוף ריאגנט מיצוי RNA, בצע מיצוי RNA סטנדרטי של פנול/כלורופורם על ידי הוספת פנול/כלורופורם והאצת RNA מהשכבה המימית העליונה עם אתנול, ולאחר מכן עיכול DNase על צינור (15 דקות).
- בצע ניקוי RNA והתרכז בנפח סופי של 15 μL של מים.
הערה: באמצעות שיטה זו, ההתאוששות הייצוגית מ-300 מ"ג של דגימת קליפת המוח הבוגרת היא כ-300,000 גרעיני NeuN+ (15-20 ננוגרם/μL סה"כ RNA לאחר ניקוי וריכוז) וכ-250,000 גרעיני PAX6+ (10-12 ננוגרם/מיקרול סה"כ רנ"א לאחר ניקוי וריכוז). תפוקה מייצגת זו יכולה להשתנות במידה רבה בהתאם לאיכות הדגימה, לתחבולת ה-gating ולהתאוששות ה-RNA. - בצע תגובת שרשרת כמותית של פולימראז (qPCR) לפני ריצוף כדי לאשר העשרה של אסטרוציטים בהתבסס על ביטוי דיפרנציאלי גבוה של סמני אסטרוציטים קנוניים (GFAP, SOX9), 10-פורמילטטרהידרופולאט דהידרוגנאז (ALDH1L1)) ודלדול של סמני שושלת תאים עצביים ואחרים (איור 1G).
הערה: איסוף האוכלוסייה הדו-שלילית (NeuN-PAX6-) מאפשר ניתוח מדויק יותר של בקרת איכות qPCR מרובת קומות להעשרה יחסית של אסטרוציטים (איור 2H). - צור ספריות RNA-seq באמצעות ערכה המומלצת לערכת מספרי שלמות RNA נמוכים, כצפוי מדגימות לאחר המוות.
- הכנת ספריית ריצוף חד-גרעין
- בצע ריצוף sn דרך ליבת ריצוף מוסדית.
- עבור עיבוד וריצוף מבוססי ננו-פלואידיקה, השתמש בריכוז המומלץ של 1 × 106 6 תאים/מ"ל ב-60 μL לפחות של 1x PBS + 0.04% BSA לריצוף RNA של גרעין יחיד (snRNA-seq) ו-3 ×-106 תאים/מ"ל לפחות ב-20 μL של 1x PBS + 0.04% BSA לבדיקה של גרעין יחיד עבור כרומטין נגיש לטרנספוזאז באמצעות ריצוף (snATAC-seq).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
גרעינים נאספו מרקמת ניאוקורטקס טמפורלית טרייה (לא מנוקבת) עם זמן איסוף לאחר המוות של 12 שעות. לאחר דיסוציאציה של רקמות לתרחיף גרעינים, הדגימות הודגמו עם נוגדנים נגד NeuN, PAX6 ו-OLIG2, ומוינו לפי הגידור המוצג באיור 1 ובאיור 2. גרעינים נאספו מאוכלוסיות ממוינות של NeuN+, PAX6+NeuN-, ו-OLIG2+NeuN (איור 1E,F ואיור 2F). פאנל qPCR ממוקד חשף העשרה לסמני הפאן-אסטרוציטים, GFAP ו-ALDH1L1, באוכלוסיית PAX6+(NeuN-) (איור 1G ואיור 2H). בנוסף, אוכלוסיית ה-OLIG2+ הועשרה עבור סמן תאי האב של אוליגודנדרוציטים (OPC) PDFGFRA (איור 1G). ריצוף RNA בתפזורת של האוכלוסיות שנאספו הראה העשרה השוואתית של סמני אסטרוציטים ודלדול של סמנים עצביים באוכלוסיית PAX6+(NeuN-) (איור 1H). אימונופלואורסצנציה אישרה את הקולוקליזציה של PAX6 עם GFAP באסטרוציטים קליפת המוח האנושיים הבוגרים (איור 1I).
בחינת בקרות של צבע יחיד חושפת אוכלוסיות חיוביות ושליליות שונות עבור כל סמן, מה שאיפשר הגדרה של חתכים מדויקים לאיסוף (איור 2A-G). יתר על כן, בידוד מאווררים מועשר באסטרוציטים הושווה לשני נוגדנים שונים נגד סמנים גרעיניים של אסטרוציטים, SOX9 ו- PAX6. אחוז גבוה יותר של אירועי גרעינים נלכד על ידי אוהדים באמצעות PAX6 (~13.8%) מאשר על ידי אוהדים שהשתמשו ב-SOX9 (~6%) בתוך השער המועשר באסטרוציטים (איור 2F,G). פאנל qPCR ממוקד חשף העשרה עבור GFAP, PAX6 ו-SOX9 הן באוכלוסיות SOX9+(NeuN-) והן באוכלוסיות PAX6+(NeuN-) (איור 2H). השוואה רטרואקטיבית של הדיסוציאציה וההכתמה של מספר דגימות עם מרווח משתנה לאחר המוות (PMI) של איסוף רקמות גילתה כי PMI קצר יותר נקשר להתאוששות גרעינים שלמים יותר (איור 3A). רקמה קפואה עם PMI של עד 24 שעות הניבה שיעור גבוה של גרעינים שלמים, עד 90%; עם זאת, ב-PMI של 30 שעות ניתן היה לשחזר מעט מאוד גרעינים שלמים (איור 3A). הכללת שלב שטיפת נוגדנים בפרוטוקול הסטנדרטי (שבדרך כלל משמיט שלב זה כדי לייעל את ההתאוששות) לא חשפה שינויים משמעותיים בהפרדה בין אוכלוסיות NeuN+/- או PAX6+/- נפרדות (איור 3B).
מדי פעם ניתן היה לראות הפרדה לקויה של אוכלוסיות PAX6+NeuN, אפילו בדגימות עם אחוז גבוה של גרעינים בני קיימא (איור 3C), מה שמחייב חזרה על דיסוציאציית הרקמות ופרוטוקול FANS. מחקרי RNA-seq בעלי גרעין יחיד נתנו עדיפות נוספת ל-PAX6 כגורם שעתוק גרעיני בעל ביטוי דיפרנציאלי עליון הן בתת-אוכלוסיות של אסטרוציטים בוגרים פרוטופלסמיים והן בסיביים, לא רק בניאוקורטקס, אלא גם באזור התת-חדרי (SVZ) ובסטריאטום הסמוך (איור 3D). השוואה של מאווררים משולשים של NEUN/PAX6/OLIG2 בין הניאוקורטקס לסטריאטום הנגזרים מאותה דגימת מוח הראתה הבדלים ספציפיים לאזור בהפרדה בין גרעיני PAX6+ (איור 3E). פרוטוקול זה מאומת כיום עבור הניאוקורטקס בלבד.
איור 1: אימות של בידוד מועשר בנוירונים ובאסטרוציטים על-ידי FANS. (A-F) דוגמאות מייצגות של מאווררים רציפים המאפשרים אי-הכללה של פסולת וכפולים (A-C) ולהגדיר צביעת רקע באמצעות (D) בקרת DAPI בלבד עבור אוסף של אוכלוסיות גרעינים מועשרים (NeuN+), אסטרוציטים (PAX6+NeuN-) ו-OPC (OLIG2++NeuN-). (G) לוח qPCR מינימלי באמצעות סמני פאן-אסטרוציטים (GFAP, ALDH1L1), עצביים (RBFOX3) ו-OPC (PDFGFRA) לבקרת איכות של האוכלוסיות שנאספו (A-G: דגימת נתיחה שלאחר המוות של ניאוקורטקס טמפורלי ללא פתולוגיה, 12 שעות PMI, 100,000 אירועים מוצגים; קווים מנוקדים מייצגים אוכלוסיות רצף מגודרות באופן חיובי; קווים מוצקים מייצגים אוסף סופי של אוכלוסיות מועשרות מסוג התא). (H) מפת חום שנוצרה מנתוני ריצוף RNA בתפזורת מנורמלים בשורה, המראים ביטוי של אסטרוציטים קנוניים וסמנים עצביים באוכלוסיות ממוינות PAX6+ ו-NeuN+ (n=3 מקרי נתיחה שלאחר המוות, ניאוקורטקס טמפורלי ללא פתולוגיה, PMI 12-21 שעות). (I) תמונה אימונופלואורסצנטית מייצגת של PAX6, GFAP ו-NeuN בניאוקורטקס אנושי. חיצים מציינים אסטרוציטים המבטאים יחד PAX6 ו-GFAP. קיצורים: FANS = מיון גרעינים פלואורסצנטיים-פעילים; DAPI = 4′,6-diamidino-2-פנילינדול; NeuN = גרעינים עצביים; PAX6 = חלבון קופסה מזווג 6; OLIG2 = גורם שעתוק אוליגודנדרוציטים 2; OPC = תא אבות אוליגודנדרוציטים; qPCR = תגובת שרשרת פולימראז כמותית; GFAP = חלבון חומצי פרפור גליה ; ALDH1L1 = 10-פורמילטטרהידרופולאט דהידרוגנאז; RBFOX3 = חלבון קושר RNA FOX-1 הומולוג 3; PDFGFRA = גורם גדילה אלפא שמקורו בטסיות דם; PMI = מרווח לאחר המוות; SSC-A = אזור פיזור צדדי; FSC-A = אזור פיזור קדימה; SSC-W = רוחב פיזור צד; FSC-W = רוחב פיזור קדימה; NeuN-555 = עכבר נגד NeuN מצומד ל- AF555; PAX6-APC = עכבר נגד PAX6 מצומד לאלופיקוציאנין; OLIG2-488 = עכבר נגד OLIG2 מצומד לצבע פלואורסצנטי ירוק עבור קו הלייזר 488 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: בידוד השוואתי של אוכלוסיות מועשרות באסטרוציטים באמצעות נוגדנים PAX6 או SOX9. (A-E) בקרות בצבע יחיד עבור DAPI, NeuN, PAX6, SOX9 ו-OLIG2 מגדירות ניתוקים חיוביים/שליליים בערוצי הפלואורסצנציה המתאימים. (פ-ג) שיטת FAN השוואתית לבידוד מועשר באסטרוציטים באמצעות (F) נוגדני NeuN/PAX6 או (G) NeuN/SOX9. אחוז גדול יותר מהאירועים נלכדים על ידי PAX6 מאשר על ידי SOX9 בתוך השער המועשר באסטרוציטים. (A-G: דגימת ניאו-קורטקס טמפורלית לא פתולוגית זהה לאחר המוות המשמשת לכל הניסויים; 12 שעות PMI; 10,000 אירועים מוצגים). (H) ניתוח qPCR של בקרת איכות מאשר העשרה של סמני אסטרוציטים ודלדול של סמנים שאינם אסטרוציטים באוכלוסיות ממוינות PAX6+(NeuN-) ו-SOX9+(NeuN-) מ-F-G (נתונים המנורמלים ל-ACTB ומכומתים כשינוי קיפול של אוכלוסיית ה-NeuN+). קיצורים: DAPI = 4′,6-diamidino-2-פנילינדול; NeuN = גרעינים עצביים; PAX6 = חלבון קופסה מזווג 6; OLIG2 = גורם שעתוק אוליגודנדרוציטים 2; SOX9 = גורם שעתוק תיבת SRY 9; qPCR = תגובת שרשרת פולימראז כמותית; GFAP = חלבון חומצי פרפור גליה ; RBFOX3 = חלבון קושר RNA FOX-1 הומולוג 3; PDFGFRA = גורם גדילה אלפא שמקורו בטסיות דם; PMI = מרווח לאחר המוות; NeuN-555 = עכבר נגד NeuN מצומד ל- AF555; PAX6-APC = עכבר נגד PAX6 מצומד לאלופיקוציאנין; OLIG2-488 = עכבר נגד OLIG2 מצומד לצבע פלואורסצנטי ירוק עבור קו הלייזר 488 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: מדדים תלויים ובלתי תלויים לניסויים מוצלחים של FANS. (A) השפעת PMI של איסוף דגימות על איכות הגרעינים: PMI נמוך יותר מאפשר התאוששות של מספר גדול יותר של גרעינים שלמים עם תוצאות נאותות עד 24 שעות. (C) דוגמה לניסוי אוהדים כושל עם היעדר אוכלוסיית PAX6+(NeuN-) מובהקת (מימין) למרות נוכחותם של גרעינים שלמים ורקע נמוך (משמאל) (ניאו-קורטקס טמפורלי לאחר המוות, לא פתולוגי, 7 שעות PMI). (D) ייצוג מפת חום של נתוני sn RNA-seq אנושיים בוגרים המראים ביטוי דיפרנציאלי של PAX6 ושני גורמים גרעיניים אחרים של אסטרוציטים, SOX9 ו-LHX2, על פני תת-אוכלוסיות אסטרוציטים פרוטופלסמיות וסיביות הן בקליפת המוח והן ב-SVZ, בהשוואה לסוגי תאים אחרים (שיפוע צבע אדום מייצג ספקטרום של ערכי ביטוי גנים ממוצעים מנורמלים ביומן; n=3 מקרי נתיחה שלאחר המוות, 43,619 גרעינים כוללים). (E) אזורי מוח מובחנים (ניאוקורטקס טמפורלי לעומת SVZ וסטריאטום תת-ג'סנטי) מראים דפוסים שונים של הפרדת NeuN/PAX6/OLIG2. קיצורים: FANS = מיון גרעינים פלואורסצנטיים-פעילים; DAPI = 4′,6-diamidino-2-פנילינדול; NeuN = גרעינים עצביים; PAX6 = חלבון קופסה מזווג 6; OLIG2 = גורם שעתוק אוליגודנדרוציטים 2; GFAP = חלבון חומצי פרפור גליה ; ALDH1L1 = 10-פורמילטטרהידרופולאט דהידרוגנאז; LXH2 = LIM הומיאובוקס 2; PMI = מרווח לאחר המוות; SSC-A = אזור פיזור צדדי; FSC-A = אזור פיזור קדימה; NeuN-555 = עכבר נגד NeuN מצומד ל- AF555; PAX6-APC = עכבר נגד PAX6 מצומד לאלופיקוציאנין; OLIG2-488 = עכבר נגד OLIG2 מצומד לצבע פלואורסצנטי ירוק עבור קו הלייזר 488 ננומטר; SVZ = אזור תת-חדרי; A(p) = אסטרוציטים פרוטופלסמיים (חומר אפור); A(f) = אסטרוציטים סיביים (חומר לבן); OL = אוליגודנדרוציטים; OPC = תאי אב אוליגודנדרוציטים; EN = נוירונים מעוררים; MSN = נוירונים קוצניים בינוניים; MG = מיקרוגליה; BVC = תאי כלי דם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
יש לסיים את התכנון הניסויי על פי הפרוטוקול המתואר לאחר ששקל מספר גורמים ביולוגיים וטכניים. דגימות הרקמות המתחילות מוקפאות טריות, מבלי שתוקנו, ועדיף שיהיה להן מרווח איסוף קצר לאחר המוות כדי למקסם את התאוששות הגרעינים. בהתבסס על ניסיון, PMI של עד 24 שעות מאפשר התאוששות גרעינים נאותה; עם זאת, PMI של 12 שעות או פחות עדיף כדי לייעל את התאוששות גרעינים שלמים. גורמים נוספים מלבד PMI, כולל טמפרטורת אחסון הגוף ורמות ה-pH של הרקמה, עשויים גם הם להשפיע על תפוקת הגרעינים, אך לא נלקחו בחשבון במחקרים אלה14. מניסיון אנקדוטלי, התאוששות אוהדים נמצאה דומה כאשר אותה רקמה מאוחסנת עד חמש שנים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס, אם כי ניסויים מבוקרים לא בוצעו כדי להעריך את השונות של האחסון בביטוי ספציפי מסוג התא. שטיפת הדגימה לאחר דגירה של נוגדנים היא משתנה נוסף שעשוי להצריך התייחסות. באופן כללי, שלב שטיפה מקטין את התפוקה הכוללת, אך עשוי לשפר את ההפרדה בין אוכלוסיות מובחנות עם תווית חיסונית. במחקרים אלה לא נצפה הבדל בהפרדת אוכלוסיות NEUN/PAX6 כאשר כוללים או לא כוללים שלב שטיפה לאחר נוגדנים, אך שלב זה עשוי להועיל בעת שימוש בנוגדנים ראשוניים ומשניים אחרים, במיוחד אם הם אינם מוגדרים מראש.
בשל השונות ברגישות של ציוד המיון, יש צורך לבצע בקרות מתאימות בכל אירוע מיון. אם פסולת חוץ-תאית מוגזמת נראית בדגימה המחודשת בעת הדמיה על המוציטומטר, ניתן להעביר את הדגימה דרך מסנן של 40 מיקרומטר כדי לשמור רק על הגרעינים. אם הדגימה מוגבלת, חרוזים המתויגים עם הפלואורופור המתאים עשויים לשמש גם עבור בקרות צבע בודד ו- FMO. אם נראה שהדגימות אינן מועשרות עבור אוכלוסיות האסטרוציטים הרצויות, כפי שנקבע על ידי qPCR או תוצאות ריצוף, ייתכן שיהיה זה מועיל לשער את כל אוכלוסיות NeuN- כמו גם PAX6+(NeuN-) בצורה קפדנית יותר, ולהשאיר יותר מקום בין ניתוקי השער לאוכלוסיות חיוביות ושליליות.
רוב מחקרי האימות המתוארים כאן בוצעו באמצעות OLIG2 בנוסף ל- NeuN ו- PAX6, כדי להעשיר בו זמנית עבור אוכלוסיות גרעינים עצביים, אסטרוציטים ואוליגודנדרוציטים (OPCs). מומלץ לכלול את OLIG2 כסמן שושלת שלישי כדי להעשיר עבור אסטרוציטים בקליפת המוח בצורה יעילה יותר בתוך שבר ה- NeuN. נראה כי נוכחותו או היעדרו של OLIG2 מצומד FITC אינו מזיז את אוכלוסיית PAX6+; לכן, ההנחה היא שניסויים שאינם כוללים OLIG2 יגרמו להעשרת אסטרוציטים דומה. יש לציין כי חיוני שאוכלוסיית PAX6+ תהיה מגודרת מאוכלוסיית ה-NeuN, שכן חלק מהאוכלוסיות העצביות מבטאות הן את NeuN והן את PAX615. ניתן גם למיין אסטרוציטים לפי ביטוי SOX9; עם זאת, צביעה ומיון עם SOX9 מובילים להעשרה פחות חזקה של אסטרוציטים בהשוואה ל-PAX6. אף על פי שנצפתה הפרדה ברורה בין שושלות עצביות, אסטרוציטיות ו-OPC בקליפת המוח הבוגרת, לא נצפתה הפרדה דומה בין אוכלוסיות PAX6+ ו-OLIG2+ ב-SVZ הבוגר ובסטריאטום הסמוך.
אמנם ייתכן שחלק מהאסטרוציטים מה-SVZ מבטאים רמות נמוכות של OLIG2, אך האוכלוסיות שנאספו אומתו רק על ידי qPCR (נתונים שלא הוצגו); לפיכך, ריצוף RNA במורד הזרם עשוי לעזור בהגדרה נוספת של טוהר האוכלוסיות הללו. בנוסף, ניתן להתאים פרוטוקול זה לבידוד גרעינים מרקמת מוח עוברית קפואה ומרקמת גידול במוח באמצעות סמנים גרעיניים ספציפיים לאוכלוסייה. מאחר שרקמות אלה הן הרבה יותר תאיות, ייתכן שיהיה מועיל להתחיל עם פחות רקמות כדי למזער את צבירת הגרעינים. בעת מיון גרעינים אנאופלואידים מרקמה ניאופלסטית, גידור DAPI מותאם כדי להסביר פלואורסצנציה גבוהה יותר. מומלץ מאוד למשתמשים לבצע אימות זהיר לפני ביצוע FANS על רקמה ניאופלסטית, שכן הפרוטוקול הנוכחי מאומת עבור דגימות שאינן ניאופלסטיות בלבד. באופן כללי, הפרוטוקול המתואר לעיל מציג אסטרטגיה מתוקנת לבידוד אוכלוסיות אסטרוציטים מועשרות, המותאמת מפרוטוקולים שנקבעו בעבר כדי להעשיר את תאי העצב. ניתן להשתמש במתודולוגיה זו כדי לבודד ביעילות אוכלוסיות גרעיני אסטרוציטים מרקמות מוח קליפת המוח הנורמליות והחולות כאחד לשימוש בניתוחים מולקולריים נוספים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
אנו רוצים להודות לחברים בפתולוגיה ונוירוכירורגיה בבית הספר לרפואה של אייקן בהר סיני על העזרה ברכישת רקמת מוח שלא זוהתה ול-Flow Cytometry CORE של ISMMS על ייעוץ מומחה. המחקר מומן בחלקו על ידי NIH RF1DA048810, R01NS106229, R03NS101581 (ל- N.M.T.) ו- R61DA048207 (ל- S.A.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS pH 7.2 | Invitrogen | 70013073 | |
| ANTI-NEUN ANTIBODY CLONE A60 | Millipore | MAB377A5MI | mouse anti-NeuN conjugated to a fluorescent compound AF555 (excitation, 553 nm; emission, 568 nm) |
| ANTI-OLIG2 ANTIBODY CLONE 211 | Millipore | MABN50A4MI | mouse anti-OLIG2 conjugated to a fluorescent compound AF488 (excitation, 499 nm; emission, 520 nm) |
| Bovine Serum Albumin | Fisher | BP9704-100 | |
| Bright-Line Counting Chamber | Hausser Scientific | 3110V | |
| Calcium Chloride Anhydrous | Fisher | C614-3 | |
| Cell Strainers, 40 µM | SP Scienceware | 136800040 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma | 43815-1G | |
| DNA Library Kit | Illumina, Nextera | FC-121–1030 | |
| DNAse I | Worthington | LS002139 | |
| Dounce Tissue Grinder | WHEATON | 357542 | |
| FACS Sorter | BD Biosciences | BD FACSAria III | |
| Magnesium Acetate Tetrahydrate | Fisher | M13-500 | |
| PAX6 (PAX6/496) - 100 TESTS | Novus | NBP234705J | |
| RNA Clean & Concentrator | Zymo Research | R1013 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | |
| SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit Pico Input Mammalian | Clontech Laboratories | 635005 | Fragmentation time of 2.5 minutes, as recommended for low RIN RNA values. |
| Sucrose, crystal certified, ACS, 500 mg | Fisher | S5500 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, Ultrapure | Thermo Scientific | J22638AE | |
| TritonX-100 | Fisher | BP151-500 | non-ionic surfactant in lysis buffer |
| TRIzol LS Reagent | Invitrogen | 10296028 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | reagent for isolation of RNA |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Optima XE-100 | A94516 | |
| Ultracentrifuge tubes PP 9/16 X 3-1/2 | Beckman Coulter | 331372 | |
| UltraPure Distilled Water (RNAse-, DNAse-free) | Invitrogen | 10977023 | referred to as distilled water |
| Ultrapure EDTA | Life Technologies | 15576-028 |
References
- Mitchell, A., Roussos, P., Peter, C., Tsankova, N., Akbarian, S. The future of neuroepigenetics in the human brain. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 128, 199-228 (2014).
- Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S.
- Akbarian, S., et al.
- Matevossian, A., Akbarian, S. Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (20), e914 (2008).
- Tome-Garcia, J., et al. Cell type-specific isolation and transcriptomic profiling informs glial pathology in human temporal lobe epilepsy. BioRxiv. , (2020).
- Zhang, Y., et al. Purification and characterization of progenitor and mature human astrocytes reveals transcriptional and functional differences with mouse. Neuron. 89 (1), 37-53 (2016).
- Sun, W., et al. SOX9 Is an astrocyte-specific nuclear marker in the adult brain outside the neurogenic regions. Journal of Neuroscience. 37 (17), 4493-4507 (2017).
- Manuel, M. N., Mi, D., Mason, J. O., Price, D. J. Regulation of cerebral cortical neurogenesis by the Pax6 transcription factor. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 70 (2015).
- Sakurai, K., Osumi, N. The neurogenesis-controlling factor, Pax6, inhibits proliferation and promotes maturation in murine astrocytes. Journal of Neuroscience. 28 (18), 4604-4612 (2008).
- Zhong, S., et al.
- Pollen, A., et al. Molecular identity of human outer radial glia during cortical development. Cell. 163 (1), 55-67 (2015).
- Cvekl, A., Callaerts, P. PAX6: 25th anniversary and more to learn. Experimental Eye Research. 156, 10-21 (2017).
- Goc, J., Liu, J. Y., Sisodiya, S. M., Thom, M. A spatiotemporal study of gliosis in relation to depth electrode tracks in drug-resistant epilepsy. European Journal of Neuroscience. 39 (12), 2151-2162 (2014).
- Monoranu, C. M., et al. pH measurement as quality control on human post mortem brain tissue: a study of the BrainNet Europe consortium. Neuropathology and Applied Neurobiology. 35 (3), 329-337 (2009).
- Ninkovic, J., et al. The transcription factor Pax6 regulates survival of dopaminergic olfactory bulb neurons via crystallin αA. Neuron. 68 (4), 682-694 (2010).
