Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Prosessutvikling for produksjon og rensing av Adeno-assosiert virus (AAV)2 Vektor ved hjelp av Baculovirus-Insect Cell Culture System

Published: January 13, 2022 doi: 10.3791/62829
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2,3, 1
1Division of Experimental Hematology and Cancer Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2University of Cincinnati College of Medicine, 3Raymond G. Perelman Center for Cellular and Molecular Therapeutics, The Children's Hospital of Philadelphia

Summary

I denne protokollen er AAV2 vektor produsert av co-culturing Spodoptera frugiperda (Sf9) insektceller med baculovirus (BV)-AAV2-grønn fluorescerende protein (GFP) eller terapeutisk gen og BV-AAV2-rep-cap infiserte Sf9 celler i suspensjon kultur. AAV-partikler frigjøres fra cellene ved hjelp av vaskemiddel, avklares, renses av affinitetskolonnekromatografi og konsentreres av tangentiell strømningsfiltrering.

Abstract

Adeno-assosierte virus (AAV) er lovende vektorer for genterapiapplikasjoner. Her produseres AAV2-vektoren av Spodoptera frugiperda (Sf9) celler med Sf9-celler infisert med baculovirus (BV)-AAV2-GFP (eller terapeutisk gen) og BV-AAV2-rep-cap i serumfri suspensjonskultur. Celler dyrkes i en kolbe i en orbital shaker eller Wave bioreactor. For å frigjøre AAV-partiklene lyser produsentceller i buffer som inneholder vaskemiddel, som deretter avklares ved lavhastighets sentrifugering og filtrering. AAV-partikler renses fra cellelysatet ved hjelp av AVB Sepharose kolonnekromatografi, som binder AAV-partikler. Bundne partikler vaskes med PBS for å fjerne forurensninger og unngås fra harpiksen ved hjelp av natriumsitratbuffer ved pH 3.0. Den sure eluate er nøytralisert med alkalisk Tris-HCl buffer (pH 8.0), fortynnet med fosfat-bufret saltvann (PBS), og videre konsentrert med tangentiell strømningsfiltrering (TFF). Protokollen beskriver småskala preklinisk vektorproduksjon som er kompatibel med oppskalering til storskala klinisk AAV-produksjon for humane genterapiapplikasjoner.

Introduction

Adeno-assosierte virus (AAV) er ikke-innhyllede menneskelige parvovirus som inneholder et enkeltstrenget DNA på 4,6 kb. AAV-vektorer har flere fordeler i forhold til andre virusvektorer for genterapiapplikasjoner1,2,3,4. AAVer er naturlig replikeringsinkompetente, og krever dermed et hjelpervirus og vertsmaskiner for replikering. AAVer forårsaker ingen sykdom og har lav immunogenisitet hos den infiserte verten3,5. AAV kan infisere både passiviserende og aktivt dele celler og kan vedvare som episome uten å integrere seg i genomet til vertscellene (AAV integreres sjelden i vertsgenomet)1,3. Disse funksjonene har gjort AAV til et ønskelig verktøy for genterapiapplikasjoner.

For å generere en AAV-genoverføringsvektor klones transgene kassetten, inkludert det terapeutiske genet, mellom to interne terminalrepriser (ITR), som vanligvis er avledet fra AAV-serotypen 2. Maksimal størrelse fra 5' ITR til 3' ITR, inkludert transgenesekvensen, er 4,6 kb6. Ulike capsids kan ha en annen celle eller vev tropisme. Derfor bør capsids velges basert på vevet eller celletypen som er ment å være målrettet med AAV-vektoren7.

Rekombinante AAV-vektorer produseres ofte i pattedyrcellelinjer som humane embryonale nyreceller, HEK293 ved forbigående transfeksjon av AAV-genoverføringsvektoren, AAV rep-cap og hjelpervirusplasmider2,3. Det er imidlertid flere begrensninger for storskala AAV-produksjon ved forbigående transfeksjon av tilhenger HEK293-celler. For det første er det nødvendig med et stort antall cellebunker eller rulleflasker. For det andre er det nødvendig med plasmid DNA og transfeksjonsreagenser av høy kvalitet, noe som øker produksjonskostnadene. Til slutt, når du bruker tilhenger HEK293-celler, er serumet ofte nødvendig for optimal produksjon, noe som kompliserer nedstrøms prosessering1,2,3. En alternativ metode for AAV-produksjon innebærer å bruke insektcellelinjen, Spodoptera frugiperda (Sf9) celler, og et insektvirus kalt rekombinant Autographa californica multicapsid kjernefysisk polyhedrosevirus (AcMNPV eller baculovirus)8,9,10. Sf9-celler dyrkes i serumfri suspensjonskultur som er lett å skalere opp og er kompatibel med dagens god produksjonspraksis (cGMP) produksjon i stor skala, noe som ikke krever plasmid- eller transfeksjonsreagenser. Videre er kostnaden for AAV-produksjonen ved hjelp av Sf9-baculovirus-systemet lavere enn kostnaden ved å bruke forbigående transfeksjon av plasmider i HEK293-celler11.

Det opprinnelige rAAV-produksjonssystemet ved hjelp av baculovirus-Sf9-celler brukte tre baculovirus: ett baculovirus som inneholder genoverføringskassett, det andre baculoviruset som inneholder rep-gen, og det tredje baculoviruset som inneholder serotype-spesifikt kapsidgen12,13. Imidlertid var baculoviruset som inneholder repkonstruksjon genetisk ustabilt ved flere runder med passasjer, noe som forhindret forsterkning av baculoviruset for den store AAV-produksjonen. For å løse dette problemet ble det utviklet et nytt rAAV-vektorsystem, som inneholdt to baculovirus (TwoBac): ett baculovirus som inneholder AAV-genoverføringskassett og et annet baculovirus som inneholder AAV rep-cap-genene sammen som er genetisk mer stabile enn det opprinnelige systemet og mer praktisk å produsere rAAV på grunn av bruk av TwoBac i stedet for tre14, 15. OneBac-systemet bruker AAV-genoverføringskassett og rep-cap-genene i et enkelt baculovirus som er mer praktisk å produsere rAAV på grunn av bruk av ett baculovirus i stedet for å bruke TwoBac eller ThreeBac2,16,17. I vår studie ble TwoBac-systemet brukt til optimalisering.

Baculovirussystemet for AAV-produksjon har også begrensninger: baculoviruspartikler er ustabile for langvarig lagring i serumfritt medium11, og hvis baculovirustitren er lav, er det nødvendig med et stort volum baculovirus supernatant, som kan bli giftig for veksten av Sf9-celler under AAV-produksjon (personlig observasjon). Bruk av titerfrie infiserte celler og oppskaleringsceller (TIPS) eller baculovirusinfiserte insektceller (BIIC), gir et godt alternativ for AAV-produksjon der baculovirusinfiserte Sf9-celler fremstilles, kryopreservert og deretter brukes til infeksjon av friske Sf9-celler. En annen fordel er økt stabilitet av baculovirus (BV) i Sf9 celler etter kryopreservering10,11.

To typer TIPS-celler genereres for å muliggjøre AAV-produksjon: den første ved infeksjon av Sf9-celler med BV-AAV2-GFP eller terapeutisk gen, og den andre ved infeksjon av Sf9-celle med BV-AAV2-rep-cap. TIPS-celler er kryopreservert i små og bruksklare aliquots. AAV-vektorer produseres i serumfri fjæringskultur i en kolbe plassert i en orbital shaker eller Wave bioreactor ved å kokulturere TIPS-celler som produserer baculovirus og friske Sf9-celler. Sf9 celler er infisert av baculovirus som bærer AAV2-GFP vektoren og rep-cap sekvenser for å generere AAV. Fire til fem dager senere, når AAV-utbyttet er det høyeste, lyser produsentcellene med vaskemiddel for å frigjøre AAV-partiklene. Cellelyset avklares deretter ved lavhastighets sentrifugering og filtrering. AAV-partikler renses fra lysatet ved AVB Sepharose kolonnekromatografi. Til slutt er AAV-vektorer konsentrert ved hjelp av TFF. Protokollen beskriver produksjonen av AAV i liten skala, nyttig for forskning og prekliniske studier. Metodene er imidlertid skalerbare og kompatible med produksjon av AAV-vektorer av klinisk kvalitet for genterapiapplikasjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Se figur 1 hvis du vil se en illustrasjon som oppsummerer protokollen.

1. Generering av baculovirus-infiserte TIPS-celler

  1. Tin ett hetteglass med Sf9-celler og frø dem umiddelbart i 50 ml insektcellekulturmedium. Vokse Sf9 celler i en orbital shaker inkubator ved 125 rpm og 28 °C i runde bunnflasker med en løst festet hette for utveksling av luft8,9. Forplant cellene i en 1 L kolbe som inneholder 200 ml medium for å få nok celler til PRODUKSJON av TIPS-celler.
  2. Tilsett 50 ml Sf9-celler ved 2 x 106 celler/ml i to kolber: infiser en kolbe av Sf9-celler med 0,5 ml baculovirus (BV)-AAV2-GFP (eller terapeutisk gen) og den andre kolben av celler med 0,5 ml BV-AAV2-rep-cap.
    MERK: AAV vektor plasmider ble sjenerøst levert av Dr. Robert M. Kotin (NIH). Baculovirusproduksjon fra bacmid-DNA (Bac-to-Bac System) er beskrevet tidligere8,9. Baculovirusstabiliteten under passasjen er et kritisk problem for oppskaleringsproduksjonen av rAAV. Det er bedre å bruke et lavere passasjenummer av baculovirus (opptil passasje nummer 4). Bestem det optimale volumet av baculovirus supernatant empirisk ved å kontrollere baculovirusinfeksjonseffektiviteten ved hjelp av strømningscytometri (figur 2) under TIPS-celleproduksjon.
  3. Overvåk baculovirusinfeksjonen 3-4 dager etter infeksjon ved å fargelegge baculovirus gp64 i infiserte Sf9 celler som følger.
    1. Flekk 2 x 105 Sf9 celler (både uinfiserte og baculovirus-infiserte celler) med 0,5 μg mus anti-baculovirus gp64 antistoff (1:200) som inneholder et fluorescerende fargestoff i 100 μL blokkerende buffer i 30 minutter ved omgivelsestemperatur.
    2. Vask cellene med 1 ml PBS for å fjerne antistoffet og resuspender de fargede cellene i 300 μL PBS som inneholder 0,5% bovint serumalbumin.
    3. Analyser baculovirus gp64-uttrykket på celler ved hjelp av strømningscytometri (figur 2).
      MERK: Bestem gatingstrategien for oppkjøp og analyse av flytcytometri empirisk. Totalt oppnås 10.000 enkelt levende celler. Baculovirus gp64 uttrykk på Sf9 celleoverflater indikerer baculovirusinfeksjon. Etter 3-4 dager blir de fleste Sf9-cellene smittet med baculoviruset, som det fremgår av baculovirus gp64-uttrykk (Figur 2).
  4. Når cellene er 80%-90% levedyktige med en økning i diameteren (Figur 3), høst cellene og kryopreservere 1 x 107 celler i 1 ml insektkulturmedium supplert med 10% foster bovint serum og 10% dimetylsulfoksid i en langsom frysebeholder ved -80 °C. Neste dag overfører du røret som inneholder TIPS-celler, til en flytende nitrogenfryser for langvarig lagring.
    MERK: Utfør cellekultur i et biosikkerhetsskap etter standard aseptisk laboratorieteknikk på Biosafety Level 2 (BSL-2).

2. Produksjon av AAV vektor

  1. Dag 1: Samkultur Sf9 celler med baculovirus-infiserte TIPS celler
    1. Kultur og vokse naive Sf9 celler ved 1 x 106 celler / ml ved 28 °C i flere 2 L kolber som inneholder 400 ml insektcellekultur medium i en shaker inkubator som er nødvendig for AAV produksjon. Etter 3-4 dager økes celletettheten opp til 5 x 106-6 x 106 celler / ml.
      MERK: CO2 og fuktighet er ikke viktige faktorer for veksten av Sf9-celler.
    2. Frø Sf9-cellene enten i risteflasker eller i en bioreaktor som følger.
      1. AAV-produksjon i kolber i en orbital shaker inkubator: Bruk en pipette eller en peristaltisk pumpe til å frø 400 ml Sf9-kultur ved 2 x 106 celler / ml i en 2 L kolbe aseptisk. Sett opp orbital shaker ved 125 rpm og 28 °C.
        MERK Bruk en peristaltisk pumpe eller standard pipette avhengig av vekten av AAV-produksjonen.
      2. AAV-produksjon i bioreaktor: Bruk en peristaltisk pumpe til å frø 1 L Sf9-kultur ved 2 x 106 celler/ml i en 10 L bioreaktorpose aseptisk. Legg posen på Bioreactor-enheten for dyrking ved 28 °C. Tilsett 40% oksygen i bioreaktorposen ved 0,1 psi. Sett opp bioreaktorenheten i 20° vinkel og rist posen ved 25 o/min.
    3. Tine ett hetteglass med hver BV-AAV2-GFP (eller terapeutisk gen) og BV-AAV2-rep-cap TIPS celler. Fortynn cellene med 20 ml insektkulturmedium og utfør et levedyktighetstall av cellene ved hjelp av trypanblå. Inokuler begge TIPS-cellene i et forhold på 1:10.000 i forhold til de naive Sf9-cellene som dyrkes i en shakerflaske eller bioreaktor.
      MERK: Overlevelsen til TIPS-cellene reduseres på grunn av kryopreservering, og utvinningsgraden er ca. 50% når celle levedyktigheten bestemmes med trypan blå farging. Utfør et piloteksperiment for empirisk å bestemme forholdet mellom TIPS-celler og naive Sf9-celler før storskala rAAV-produksjon.
  2. Dag 2: Kulturovervåking
    1. Høst 1 ml Sf9-kultur aseptisk. Flekk med Trypan blå fargestoff for å analysere celleantall, levedyktighet og morfologi.
  3. Dag 3: Kulturovervåking og fôring
    1. Høst 1 ml Sf9-kultur og analyser celleantallet, levedyktigheten og morfologien. Kontroller statusen til baculovirusinfeksjon etter farging av Sf9-cellene som nevnt i trinn 1.3.
      MERK: Økning i cellediameter og cytopatisk effekt er indikasjoner på bakulovirusinfeksjon. Økningen i diameter går foran en reduksjon i celle levedyktighet, og disse parametrene brukes til å bestemme cellehøsttiden under AAV-produksjonen. Bestem det optimale tidspunktet empirisk.
    2. Fôr Sf9-kulturen med friskt insektkulturmedium i et forhold på 1:5 aseptisk.
  4. Dag 4: Kulturovervåking
    1. Høst 1 ml Sf9-kultur og analyser celleantallet, levedyktigheten og morfologien. Koble oksygentilførselen fra bioreaktorposen.
  5. Dag 5: Kulturovervåking og høsting
    1. Høst 1 ml Sf9-kultur og analyser celleantallet, levedyktigheten og morfologien. Høst kulturen middels og celler når Sf9 celle levedyktighet har redusert til rundt 50% (Figur 4).
    2. Snurr cellesuspensjonen ved 2100 x g i 15 min ved 4 °C. Samle supernatant og cellepellet, og lagre dem ved -80 °C.

3. Lysis av celler og frigjøring av AAV

  1. Tine AAV-produsentens cellepellet. Tilsett 100 ml cellelysebuffer (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM natriumklorid, 0,5 % Triton-X-100) til cellepelleten, bland kraftig og inkuber i 30 minutter ved omgivelsestemperatur for å frigjøre AAV-partiklene.
  2. Sentrifuge ved 2100 × g i 30 min ved 4 °C og overfør cellelyset til en ny beholder. Bland cellelyset og cellekulturen supernatant etter opptining.
  3. Tilsett 20 U/ml nuklease og 10 mM MgCl2 i cellelyset for å fordøye DNA og RNA. Inkuber i 2-4 timer ved 37 °C.
  4. Filtrer lysatet gjennom et dobbeltfiltreringssystem på 0,8 μm og 0,2 μmpolyetersulfon ved hjelp av en pumpe.
  5. Oppbevar den klargjorte cellelyset ved 4 °C over natten eller rens AAV umiddelbart.

4. Rensing av AAV vektor ved hjelp av affinitet kolonne kromatografi system

  1. Forbered kromatografiinstrumentet ved å vaske prøven og bufferlinjene sekvensielt med sterilt vann, 1 N natriumhydroksid, vann og fosfatbufret saltvann (PBS, pH 7,4) med en strømningshastighet på 50 ml/min.
  2. Monter AVB Sepharose-kolonnen (10,0 ml) i kromatografisystemet, og kjør 100 ml PBS med en strømningshastighet på 5 ml/min.
    MERK: Bruk et lavere eller høyere volum av AVB Sepharose-kolonnen avhengig av omfanget av AAV-produksjonen og sett opp strømningshastigheten som foreslått av kolonnen eller harpiksprodusenten (se Materialtabell).
  3. For å samle fraksjonene av kolonnepass-gjennomgående løsning, vaskebuffer og elutionbuffer som inneholder AAV-partikler, sett rørene inn i fraksjonssamlersporene til kromatografiinstrumentet.
  4. Likevekt kolonnen med PBS med en strømningshastighet på 5,0 ml/min.
  5. Last den filtrerte cellelysatet som inneholder AAV-partikler på kolonnen ved hjelp av kromatografimaskinen som er utstyrt med en prøvepumpe. Kjør prøven med en strømningshastighet på 3,0 ml per min.
  6. Kjør PBS gjennom AVB Sepharose-kolonnen med en strømningshastighet på 3,0 ml/min til den ultrafiolette (UV) absorbanskurven (280 nm) går tilbake til grunnlinjen og blir stabil.
  7. Elute AAV-partiklene fra kolonnen med 50 mM natriumsitrat (pH 3.0) buffer med en strømningshastighet på 3,0 ml/min (figur 5).
    MERK: Mens AAV-partiklene tar avstand fra harpiksen og passerer gjennom UV-detektoren, kan man se en elution-topp av protein på kromatogrammet.
  8. Fortynn umiddelbart AAV-supernatanten med et femtedels volum på 500 mM Tris-HCl (pH 8.0) for å øke pH-verdien til AAV som inneholder supernatant til omtrent pH 5,5 for å forhindre pH-mediert nedbrytning med sur elutionbuffer. Videre fortynn AAV supernatant 10-fold med PBS for å nøytralisere pH fullt ut.
    MERK: pH-verdien er ca. 5,5 etter nøytralisering av rAAV-oppløsningen. Etter å ha nøytralisert AAV, fortynn rAAV-løsningen 10 ganger med PBS (pH 7.4) slik at AAV er i en fysiolog buffer.
  9. Lagre 1 ml av hver kolonne gjennomkjøringsprøver, vaskebuffer og 100 μL av den eluterte AAV-supernatanten for å evaluere tilstedeværelsen av AAV ved infeksjon av målcellene.
  10. Rengjør AVB Sepharose-kolonnen med 100 ml 100 mM sitronsyre (pH 2,1) og 100 ml PBS (pH7,4) med en strømningshastighet på 5,0 ml/min. Skyll kolonnen med 20% etanol med en strømningshastighet på 5,0 ml / min og lagre ved 4 °C.
  11. Rengjør rørledningene til kromatografiinstrumentet med kolonnens frakoblede posisjon som beskrevet i avsnitt 4.1. Til slutt skyll kromatografisystemet med 200 ml 20% etanol med en strømningshastighet på 50,0 ml / min og lagre i 20% etanol.

5. Konsentrasjon og diafiltrering av AAV vektor ved hjelp av tangentiell strømning filtrering (TFF)

  1. Sett opp TFF-systemet utstyrt med en polysulfonmembranpatron (100 kDa Molecular Weight Cut Off) for å konsentrere AAV.
  2. Likevekt TFF-modul med 200 ml PBS i 10 min.
  3. Last AAV-prøven ved å kontrollere pumpens strømning til prøven reduseres til ønsket volum samtidig som du opprettholder et transmembrantrykk ved 2-3 psi.
  4. Diafiltrate retentate med 100 ml PBS, som brukt i denne studien, eller empirisk definere alternativ buffer som støtter langsiktig stabilitet av AAV.
  5. Etter å ha konsentrert AAV-prøven til ønsket volum, samle AAV-prøven, filtrer den gjennom et 0,2 μm polyethersulfonfilter, aliquot, og lagre det deretter ved -80 °C.

6. Infeksjon av AAV-prøver i målcellene for å evaluere tilstedeværelsen av AAV i rensetrinnene

  1. Inokuler 7 x 104 HT1080 celler/brønn i en 24-brønns plate i 500 μL dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) supplert med 1% L-glutamin, 1% natriumpyromin og 10% foster bovint serum (FBS) dagen før infeksjon. Kultur cellene i en inkubator ved 37 °C og 5 % CO2.
  2. Tell cellene før infeksjon. Legg til den fortynnede uoppgjorte AAV-masseprøven før kolonnekjøringen, kolonnekjøringsprøver, vaskebuffer og unuted renset AAV-prøve.
    MERK: Tell Trypan blåfargede celler med et hemocytometer. Bestem fortynningsfaktoren og volumet (μL) av AAV-prøvene empirisk. Jo høyere AAV-titere, jo mer fortynning er nødvendig. Forsikre deg om at baculoviruspartiklene i den unyttede bulkprøven før kolonnen kjøres, kolonnekjøringsprøver, vaskebufferen varmeaktiveres ved 50 °C i 50 minutter før du infiserer målcellene for å bestemme smittsomme titere av AAV.
  3. To dager etter infeksjon analyserer du proteinuttrykket (f.eks. GFP eller terapeutisk gen) i cellene ved hjelp av et strømningscytometer.
  4. Beregn smittsomme titere av AAV ved hjelp av antall celler på tidspunktet for infeksjon, fortynningsfaktor og prosentandel av GFP + celler med formelen: (Totalt antall celler x Prosenter GFP + celler x Fortynningsfaktor) / Volum av AAV i milliliter.
    MERK: For eksempel er antall celler 1 x 105, prosentandelen av GFP + celler er 3,4%, fortynningsfaktoren er 100, og volumet av AAV lagt til er 2 μL. Titeret til AAV er 1,7 x 108 smittsom enhet (IE)/ml. Den totale mengden rensede AAV-partikler i 25 ml av den eluterte fraksjonen er 4,3 x 109 smittsomme enheter (IE)/ml (figur 6). Totalt antall første uoppgjorte AAV-partikler er 1,09 x 1010 IE/ml, og rensede AAV-partikler er 4,3 x 109 IE/ml. Derfor er prosentandelen av utvinning 39,4%. Prosentandelen av GFP+-celler bør være mellom 1%-30%, noe som tilsvarer et lineært område når det brukes til å beregne den smittsomme titeren til AAV. Hvis mer konsentrerte AAV vektorpartikler er infisert i målcellene; det er en mulighet for at flere kopier av AAV-partiklene kan infisere en enkelt celle som vil vises som en enkelt kopi av vektoren. Fortynn derfor AAV-vektoren supernatant for å oppnå 1% -30% vektorinfeksjon i målcellene. Hvis AAV-vektoren ikke har et reportergen, kan du farge transgene eller det terapeutiske genet uttrykt av AAV-vektoren med et antistoff som inneholder et fluorescerende fargestoff som kan oppdages og kvantiseres ved hjelp av et strømningscytometer. Ikke alle AAV-serotyper kan effektivt infisere HT1080-celler. Derfor, for å utføre infektivitetsanalysen for andre AAV-serotyper, bruk forskjellige cellelinjer. Titer AAV2-GFP-partiklene før rensing og etter rensing på HT1080-celler og mål GFP-uttrykket ved strømningscytometri. Beregn utvinningen (%) ved forholdet mellom antall rensede AAV-partikler og antall AAV-partikler før rensing multiplisert med 100.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Her vises de representative resultatene av prosessutvikling for produksjon og rensing av AAV-vektorer ved hjelp av Sf9 insektcellesystem. Metoden inkluderer samkultur av Sf9-celler med baculovirus-infiserte TIPS-celler, fôring av cellene med vekstmedium, høsting og lysis av produsentcellene for å frigjøre AAV-partiklene, avklaring av cellelyset med nukleasebehandling, sentrifugering og filtrering, rensing av AAV ved hjelp av AVB Sepharose affinitetskromatografi og konsentrasjon med TFF (Figur 1).

TIPS-celler genereres ved infeksjon av BV-AAV2-GFP eller terapeutisk gen og BV-AAV2-rep-cap i Sf9-celler separat. De fleste av Sf9-cellene blir smittet med baculoviruset på 3-4 dager på grunn av flere runder med infeksjon, vist ved baculovirus glykoprotein gp64 uttrykk i (Figur 2) og cellene viser en økning i diameter (Figur 3). TIPS celler høstes 3-4 dager etter infeksjon og kryopreservert. Sf9-celler er samkulturert med TIPS-cellene som skiller ut baculoviruspartikler i kulturmediet som infiserer naive Sf9-celler. Baculovirus er replikerings-kompetent; Derfor øker antall infiserte celler raskt ved flere runde infeksjoner med nyproduserte baculoviruspartikler som utskilles i kulturmediet8,9. Cellene viser en økning i diameter, cytopatisk effekt, og rundt halvparten av cellene dør i 5 dager etter infeksjon, som er tegn på ferdigstillelse av AAV-produksjon (Figur 4).

AAV-produsentcellene høstes av lavhastighets sentrifugering, lysnet med buffer som inneholder vaskemiddel for å slippe AAV inn i cellelyset. Dette behandles deretter med kjernease for fordøyelsen av DNA og RNA for å redusere viskositet, filtreres gjennom en 0,8 μm og 0,2 μm membran, og deretter renset og konsentrert. Cellelyset lastes inn i en AVB Sepharose-kolonne ved hjelp av et kromatografisystem. AVB Sepharose harpiks binder AAV2 partikler på grunn av sin affinitet til capsid proteiner. Vaskebufferen kjøres gjennom AVB Sepharose-kolonnen for å fjerne ubundne og løst bundne materialer til den ultrafiolette (UV) absorbanskurven (280 nm) blir stabil ved grunnlinjen. Siden AAV-partikler sterkt binder AVB Sepharose, oppdages ikke noe betydelig antall AAV2-partikler under vasken. AAV-partiklene elutes med sur buffer (pH 3.0), som dissosierer samspillet mellom AAV-partikler og AVB Sepharose-harpiks. For å forhindre pH-mediert nedbrytning av AAV ved den sure løsningen, nøytraliseres eluanten med en alkalisk buffer (pH 8.0). En topp av protein ses mens elution med sur buffer tilsvarende AAV-fraksjonen (Figur 5 og Figur 6). Renset AAV fortynnes 10 ganger med PBS, konsentrert og buffer utvekslet med et TFF-system. I dette eksemplet er totale AAV-partikler i cellelysat (560 ml) 1,1 x10 14 vektorgenom (vg), etter AVB Sepharose kromatografirensing (25 ml) er 4,1 x 1013 vg, og etter konsentrasjon med TFF (25 ml) er 2,4 x 1013 vg. De rensede AAV-prøvene viser tre distinkte kapsidproteiner, VP1, VP2 og VP3, etter SDS-PAGE og sølvfarging (figur 7)

Figure 1
Figur 1: Et skjematisk diagram for produksjon og rensing av AAV Vector. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Strømningscytometrianalyse av baculovirus gp64-uttrykk i Sf9-celler. Baculovirus infiserte Sf9 celler er farget med en mus anti-baculovirus gp64 antistoff som inneholder en fluorescerende fargestoff, som oppdages ved strømning cytometri. (A) Uinferte Sf9-celler. (B) Baculovirus infiserte Sf9 celler viser gp64 uttrykk i de fleste cellene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Morfologi av de baculovirusinfiserte Sf9 (TIPS)-cellene. Baculovirus er infisert i Sf9-cellene for å produsere TIPS-cellene. (A) Uinferte Sf9-celler. (B) Baculovirus infiserte Sf9 (TIPS)-celler. Celler vises ved 200x forstørrelse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Morfologi av de baculovirus-infiserte Sf9-cellene under AAV-produksjon. TIPS celler utskiller baculovirus som infiserer samkulturerte naive Sf9 celler under AAV produksjon. (A) Uinferte Sf9-celler. (B) Baculovirus infiserte Sf9 celler viser en økning i diameter. Fem dager etter infeksjon dør nesten halvparten av cellene (visualisert under et invertert fasemikroskop etter trypan blå farging). Røde piler angir levende celler, og blå piler angir døde celler. Celler vises ved 200x forstørrelse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: AAV-rensing ved hjelp av AVB Sepharose kolonnekromatografi. Et kromatogram viser absorbansen av proteinprøver ved 280 nm under prøvelasting på søyle, vask og elution. Kromatogrammet er modifisert for å passe inn i figuren. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Antall smittsomme AAV-partikler i gjennomstrømningen under lasting på søylen, vasking og elution. Totalt 560 ml AAV-prøver lastes på en 10 ml AVB Sepharose-kolonne. Brøkvolumet for kolonnebelastningen er 50 ml, kolonnevask er 50 ml, og elution er 25 ml. AAV-titere måles etter infeksjon av HT1080-celler med kolonnekjøringsprøver mens de lastes på kolonne, vask og elution for å undersøke tilstedeværelsen av AAV på hvert trinn av rensingen. Det totale rensede AAV-utbyttet er 4,3 x 109 smittsomme enheter. Hvert diamantformede symbol representerer de smittsomme enhetene (IE) til AAV i hver brøk. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7. SDS-PAGE og sølv farging av ren AAV vektor som viser capsid proteiner. De reduserte AAV-prøvene kjøres på SDS-PAGE, og sølvfarging utføres. Tre forskjellige bånd av AAV capsid proteiner, VP1, VP2 og VP3, er synlige. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Parametrene som brukes i denne protokollen for prosessutvikling av produksjon, rensing og konsentrasjon av AAV-vektorer, kan brukes på både liten og storskala produksjon av AAV-vektorer for genterapiapplikasjoner. Hele oppstrøms- og nedstrømsprosessen kan utføres i et lukket system som er kompatibelt med gjeldende Good Manufacturing Practices (cGMP). De viktigste fordelene med Sf9-baculovirus-systemet er skalerbarhet for storskala GMP-klasse AAV-produksjon til en overkommelig pris. Systemet trenger ikke dyre plasmider og transfeksjonsreagenser, som er nødvendige for produksjon av AAV ved hjelp av HEK293-celler. Det har blitt rapportert at både HEK293 celler og Sf9 celler gir lignende kvalitet AAV vektorer (Eric D. Horowitz, ASGCT 2018, Abstract # 100). Den største utfordringen er at dette systemet krever generering av baculovirus og TIPS-celler som trenger en betydelig tid og krefter.

I denne protokollen ble to typer TIPS-celler (TwoBac-system) brukt: en TIPS-celle som inneholder baculovirus med AAV-genoverføringskassett og en annen TIPS-celle som inneholder AAV-rep-cap. OneBac-systemet2,16,17 kan generere TIPS-celler som inneholder både AAV-genoverføringskassett og rep-cap-gener i et enkelt baculovirus. OneBac-systemet gir en alternativ tilnærming for å produsere rAAV ved hjelp av bare ett sett med TIPS-celler i stedet for to som beskrevet i TwoBac-systemet, noe som ytterligere vil forenkle protokollen.

Denne protokollen beskriver AAV-produksjon i Sf9-celler. Det er viktig å optimalisere forholdet mellom de baculovirus-infiserte TIPS-cellene og produsenten naive Sf9-celler for å oppnå et godt AAV-utbytte. Hvis dette forholdet er sub-optimalt, vil utbyttet av AAV bli redusert11. For eksempel, hvis mer AAV ITR som inneholder genoverføringsvektorer genereres enn capsidene i produsentcellene på grunn av det sub-optimale forholdet mellom TIPS og produsentceller, vil alle tilgjengelige genoverføringsvektorer ikke få nok capsids til å produsere fulle AAV-partikler. På den annen side, hvis flere capsids genereres enn AAV-genoverføringsvektorene i produsentcellene, vil ikke alle capsids få AAV ITR som inneholder genoverføringsvektorer som resulterer i tomme AAV-partikler.

Etter hvert som cellene multipliserer, blir kulturmediets næringsstoffer utmattet, og metabolske avfallsprodukter akkumuleres. Derfor kan tilskudd av 20% frisk vekstmedium i cellekulturen 2 dager etter samkultur av TIPS-celler og Sf9-celler øke AAV-titere betydelig (Amine A. Kamen, National Research Council Canada, personlig kommunikasjon).

Renheten av AAV-partikler er en kritisk faktor for å oppnå effektiv transduksjon av målceller uten cytotoksisitet for både in vitro- og in vivo-studier 3,5. Derfor er det viktig å inkludere et kromatografitrinn som selektivt kan rense AAV-partikler og eliminere urenheter som vertscelleproteiner og rusk, genomisk og bakuloviralt DNA og aggregerte og fragmenterte vektorer. Når du laster AAV supernatant på en AVB Sepharose-kolonne, er det viktig å sjekke gjennomstrømningsprøvene for tilstedeværelsen av AAV-partikler som kan passere gjennom kolonnen uten binding til harpiksen. Hvis det er tilfelle, (1) en lavere kjørehastighet som resulterer i lengre oppholdstid vil være nødvendig for å binde AAV-partiklene, (2) mengden lastet prøve på kolonnen skal reduseres, og / eller (3) volumet av AVB Sepharose bør økes, slik at bindingskapasiteten til kolonnen aldri overstiger antall AAV-partikler. Avb Sepharose-harpiksens evne til å binde AAV-partikler med høy strømningshastighet og med høy affinitet og kapasitet er viktig for å redusere rensetiden. Den største begrensningen av AVB Sepharose er at den binder capsid av AAV serotyper 1, 2 og 5. Derfor bør forskjellige kromatografi harpikser testes og brukes til rensing av andre AAV-serotyper18. Nedstrøms renseprotokollen som er beskrevet her, kan også brukes til å rense AAV produsert i HEK 293-celler.

Denne protokollen kan rense AAV fra cellelysat, men kan ikke fjerne tomme partikler. Noen få artikler har beskrevet metoder som kan skille tomme kontra fulle AAV-partikler i rensede AAV-lagre19,20. Vi mener imidlertid at AAV-produksjonen bør optimaliseres på oppstrøms prosessnivå for å minimere genereringen av tomme partikler. Hvis forholdet mellom AAV-genoverføringsvektor og kapsidproduksjon i produsentceller ikke er optimalt, kan flere tomme partikler generere.

I tillegg til å binde fulle AAV-partikler, binder AVB Sepharose medium fragmenterte AAV-partikler eller kapsidproteiner som kan fjernes ved hjelp av TFF. De fleste partiklene med lav molekylvekt elimineres fra AAV-prøver ved å inkludere TFF-trinnet nedstrøms for kolonnekromatografien. I tillegg brukes TFF til å utføre en bufferutveksling/diafiltrasjon og til å konsentrere AAV10,21.

Selv om ultracentrifugation av AAV lysat med cesiumklorid eller jodoksanol gradient er den foretrukne metoden for småskala og pre-klinisk klasse AAV rensing, er denne metoden ikke skalerbar og mindre egnet for storskala rensing av AAV21,22.

Til slutt vil denne protokollen for prosessutvikling av produksjon og rensing av AAV være nyttig for småskala preklinisk og storskala produksjon av rekombinant AAV for genterapi av arvelige genetiske sykdommer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi vil takke Dr. Robert M. Kotin (National Heart, Blood and Lung Institute, NIH) for sjenerøst å gi oss AAV-plasmidene og Danielle Steele og Rebecca Ernst (Cincinnati Children's Hospital) for deres tekniske assistanse. Dette arbeidet støttes av oppstartsfondet fra Cincinnati Children's Research Foundation til M.N.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 N Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich 1.09137 For Akta Avant cleaning
2 L flasks ThermoFisher Scientific 431281 Flask for suspension culture
50 ml Conical tube ThermoFisher Scientific 14-959-49A For collection of supernatants
24-well plate ThermoFisher Scientific 07-200-80 Adherent cell culture plate
250 mL flasks ThermoFisher Scientific 238071 Flask for suspension culture
Akta Avant 150 with Unicorn Software Cytiva 28976337 Chromatography system
AVB Sepharose High Performance Cytiva 28411210 Chromatography medium
Baculovirus-AAV-2 GFP In-house non-catalog AAV transfer vector
Baculovirus-AAV-2 rep-cap In-house non-catalog AAV packaging vector
Nuclease Sigma-Aldrich E1014 Enzyme to degrade DNA and RNA
Blocking buffer Santa Cruz Biotechnologies 516214 Blocking to prevent non-specific antibody binding to cells
Cell lysis buffer In-house Non-catalog item 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.5 % Titron X-100
Cellbag, 2 L and 10 L Cytiva 28937662 Bioreactor bag
Cleaning buffer In-house Non-catalog item 100 mM citric acid (pH 2.1) 
Cryovial Thomas Scientific 1222C24 For cryopreservation
DMEM Sigma-Aldrich D6429 Growth media for cell lines
Elution buffer In-house Non-catalog item 50 mM sodium citrate buffer (pH 3.0)
Ethanol Sigma-Aldrich E7073 For disinfection and storage of the chromatography
Filtration unit  Pall Corporation 12941 Membrane filter
HT1080 cell line ATCC CCL-121 Fibroblast cell line
HyClone™ SFX-Insect culture media Cytiva SH30278.02 Serum-free insect cell growth medium
Peristaltic Pump Pall Corporation Non-catalog item TFF pump
MaxQ 8000 orbital shaker incubator  ThermoFisher Scientific Non-catalog item Shaker for suspension culture
Microscope Nikon Non-catalog item Cell monitoring and counting 
Mouse anti-baculovirus gp64 PE antibody Santa Cruz Biotechnologies 65498 PE Monitoring baculovirus infection in Sf9 cells
Oxygen tank Praxair Non-catalog item 40 % Oxygen supply is needed for Sf9 cell growth
PBS ThermoFisher Scientific 20012027 Wash buffer
Silver Staining kit ThermoFisher Scientific LC6100 Staining AAV capsid proteins
Sf9 cells ThermoFisher Scientific 11496-015 Insect cells
Steile water In-house Non-catalog item For Akta Avant cleaning
Table top centrifuge ThermoFisher Scientific 75253839/433607 For clarification of Baculovirus supernatant
Tangential Flow Filtration (TFF) cartridge Pall Corporation OA100C12 TFF cartridge to concentrate the AAV
Tris-HCl, pH 8.0 ThermoFisher 15568025 Alkaline buffer to neutralize the eluted AAV
WAVE Bioreactor System 20/50 Cytiva 28-9378-00 Bioreactor

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hildinger, M., Auricchio, A. Advances in AAV-mediated gene transfer for the treatment of inherited disorders. European Journal of Human Genetics. 12 (4), 263-271 (2004).
  2. Wu, Z., Asokan, A., Samulski, R. J. Adeno-associated virus serotypes: vector toolkit for human gene therapy. Molecular Therapy. 14 (3), 316-327 (2006).
  3. Nathwani, A. C., et al. Adenovirus-associated virus vector-mediated gene transfer in hemophilia B. The New England Journal of Medicine. 365 (25), 2357-2365 (2011).
  4. Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
  5. Mingozzi, F., High, K. A. Immune responses to AAV vectors: overcoming barriers to successful gene therapy. Blood. 122 (1), 23-36 (2013).
  6. Grieger, J. C., Samulski, R. J. Packaging capacity of adeno-associated virus serotypes: impact of larger genomes on infectivity and postentry steps. Journal of Virology. 79 (15), 9933-9944 (2005).
  7. Rabinowitz, J. E., et al. Cross-dressing the virion: the transcapsidation of adeno-associated virus serotypes functionally defines subgroups. Journal of Virology. 78 (9), 4421-4432 (2004).
  8. Nasimuzzaman, M., Lynn, D., vander Loo, J. C. M., Malik, P. Purification of baculovirus vectors using heparin affinity chromatography. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 3, 16071 (2016).
  9. Nasimuzzaman, M., vander Loo, J. C. M., Malik, P. Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57019 (2018).
  10. Sandro, Q., Relizani, K., Benchaouir, R. AAV Production Using Baculovirus Expression Vector System. Methods in Molecular Biology. 1937, 91-99 (2019).
  11. Cecchini, S., Virag, T., Kotin, R. M. Reproducible high yields of recombinant adeno-associated virus produced using invertebrate cells in 0.02- to 200-liter cultures. Human Gene Therapy. 22 (8), 1021-1030 (2011).
  12. Urabe, M., Ding, C., Kotin, R. M. Insect cells as a factory to produce adeno-associated virus type 2 vectors. Human Gene Therapy. 13 (16), 1935-1943 (2002).
  13. Urabe, M., et al. Scalable generation of high-titer recombinant adeno-associated virus type 5 in insect cells. Journal of Virology. 80 (4), 1874-1885 (2006).
  14. Chen, H. Intron splicing-mediated expression of AAV Rep and Cap genes and production of AAV vectors in insect cells. Molecular Therapy. 16 (5), 924-930 (2008).
  15. Smith, R. H., Yang, L., Kotin, R. M. Chromatography-based purification of adeno-associated virus. Methods in Molecular Biology. 434, 37-54 (2008).
  16. Aslanidi, G., Lamb, K., Zolotukhin, S. An inducible system for highly efficient production of recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors in insect Sf9 cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (13), 5059-5064 (2009).
  17. Wu, Y., et al. Popularizing recombinant baculovirus-derived OneBac system for laboratory production of all recombinant adeno-associated virus vector serotypes. Current Gene Therapy. 21 (2), 167-176 (2021).
  18. Adams, B., Bak, H., Tustian, A. D. Moving from the bench towards a large scale, industrial platform process for adeno-associated viral vector purification. Biotechnology and Bioengineering. 117 (10), 3199-3211 (2020).
  19. Joshi, P. R. H., et al. Development of a scalable and robust AEX method for enriched rAAV preparations in genome-containing VCs of serotypes 5, 6, 8, and 9. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 21, 341-356 (2021).
  20. Dickerson, R., Argento, C., Pieracci, J., Bakhshayeshi, M. Separating empty and full recombinant adeno-associated virus particles using isocratic anion exchange chromatography. Biotechnology Journal. 16 (1), 2000015 (2021).
  21. Wright, J. F. Manufacturing and characterizing AAV-based vectors for use in clinical studies. Gene Therapy. 15 (11), 840-848 (2008).
  22. Tomono, T., et al. highly efficient ultracentrifugation-free chromatographic purification of recombinant AAV serotype 9. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 11, 180-190 (2018).

Tags

Biologi Utgave 179 AAV baculovirus Sf9 celler bioreaktor kromatografi rensing tangentiell strømningsfiltrering
Prosessutvikling for produksjon og rensing av Adeno-assosiert virus (AAV)2 Vektor ved hjelp av Baculovirus-Insect Cell Culture System
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nasimuzzaman, M., Villaveces, S.,… More

Nasimuzzaman, M., Villaveces, S., van der Loo, J. C. M., Alla, S. Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus (AAV)2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System. J. Vis. Exp. (179), e62829, doi:10.3791/62829 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter