Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

أعمدة كروماتوغرافيا تقارب الغشاء الخلوي لتحديد مستقلبات النباتات المتخصصة التي تتفاعل مع مستقبلات تروبوميوسين كيناز B المجمدة

Published: January 19, 2022 doi: 10.3791/63118
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, The University of Alabama, 2Department of Pharmaceutical Botany, Faculty of Pharmacy, Hacettepe University

Summary

يصف البروتوكول إعداد أعمدة كروماتوغرافيا تقارب غشاء الخلية (CMAC) مع شظايا غشاء الخلية المجمدة التي تحتوي على بروتينات مستقبلات التروبوميوزين كيناز B الوظيفية عبر الغشاء. كما يتم شرح استخدام أعمدة CMAC في تحديد مستقلبات النباتات المتخصصة التي تتفاعل مع هذه المستقبلات والموجودة في المخاليط الطبيعية المعقدة.

Abstract

كانت المواد الكيميائية التي يتم تصنيعها بواسطة النباتات والفطريات والبكتيريا واللافقاريات البحرية مصدرا غنيا لضربات الأدوية الجديدة وخيوطها. تم تحديد الأدوية مثل الستاتين أو البنسلين أو الباكليتاكسيل أو راباميسين أو الأرتيميسينين ، التي يشيع استخدامها في الممارسة الطبية ، لأول مرة وعزلها عن المنتجات الطبيعية. ومع ذلك ، فإن تحديد وعزل المستقلبات المتخصصة النشطة بيولوجيا من المصادر الطبيعية هي عملية صعبة وتستغرق وقتا طويلا. تقليديا ، يتم عزل المستقلبات الفردية وتنقيتها من مخاليط معقدة ، بعد استخراج الكتلة الحيوية. في وقت لاحق ، يتم اختبار الجزيئات المعزولة في اختبارات وظيفية للتحقق من نشاطها البيولوجي. نقدم هنا استخدام أعمدة كروماتوغرافيا تقارب الغشاء الخلوي (CMAC) لتحديد المركبات النشطة بيولوجيا مباشرة من المخاليط المعقدة. تسمح أعمدة CMAC بتحديد المركبات التي تتفاعل مع البروتينات الوظيفية عبر الغشاء (TMPs) المجمدة المضمنة في بيئتها ثنائية الطبقة الفوسفاتية الأصلية. هذا نهج مستهدف ، والذي يتطلب معرفة TMP الذي يعتزم المرء تعديل نشاطه مع مرشح عقار الجزيء الصغير الذي تم تحديده حديثا. في هذا البروتوكول ، نقدم نهجا لإعداد أعمدة CMAC مع مستقبلات التروبوميوسين كيناز B (TrkB) المجمدة ، والتي ظهرت كهدف قابل للتطبيق لاكتشاف الأدوية للعديد من اضطرابات الجهاز العصبي. في هذه المقالة ، نقدم بروتوكولا مفصلا لتجميع عمود CMAC مع مستقبلات TrkB المجمدة باستخدام خطوط خلايا الورم الأرومي العصبي التي تبالغ في التعبير عن مستقبلات TrkB. كما نقدم النهج للتحقيق في وظائف العمود واستخدامه في تحديد مستقلبات النباتات المتخصصة التي تتفاعل مع مستقبلات TrkB.

Introduction

المخاليط النباتية غنية بالمركبات النشطة دوائيا1 ، وتعمل كمصدر جيد لتحديد نتائج الأدوية الجديدة وتؤدي إلى2،3،4،5. كان اكتشاف أدوية جديدة من المنتجات الطبيعية نهجا مثمرا والعديد من الأدوية المعتمدة حاليا نشأت من مركبات تم تحديدها لأول مرة في الطبيعة. من الصعب أن يقابل التنوع الكيميائي للمركبات الطبيعية مكتبات من صنع الإنسان من الجزيئات المصنعة كيميائيا. تتفاعل العديد من المركبات الطبيعية مع أهداف البروتين البشري وتعدل ويمكن اعتبارها جزيئات شبيهة بالأدوية محسنة تطوريا6. هذه المركبات الطبيعية مناسبة بشكل خاص لتحديد الرصاص المخدرات لاستخدامها في الاضطرابات العصبية6. اثنان من الأدوية المعتمدة حاليا من إدارة الأغذية والعقاقير لإدارة مرض الزهايمر (AD) مشتقة من قلويدات طبيعية ، وهي: galantamine و rivastigmine (مشتق من physostigmine)6. تم تحديد L-DOPA ، وهو حاليا الدواء الأكثر شيوعا لمرض باركنسون ، لأول مرة من الفول العريض (Vicia faba L.) 7. Pergolide و lisuride ، ناهضات مستقبلات الدوبامين هي مشتقات قلويدات الإرغوت الطبيعية من الفطريات الطفيلية Claviceps purpurea8. ريسيربين، قلويد معزول من جذر الثعبان الهندي (Rauvolfia serpentina (L.) Benth. ex Kurz) كان واحدا من أوائل الأدوية المضادة للذهان9. في الآونة الأخيرة ، تم ربط الاستجابة المناعية غير المنظمة والالتهاب الجهازي بتطور العديد من الأمراض العصبية ، مثل الاضطراب الاكتئابي الرئيسي أو الأمراض العصبية التنكسية10. تم العثور على نظام غذائي نباتي جنبا إلى جنب مع تدخلات نمط الحياة الأخرى لتحسين القدرات المعرفية والوظيفية لدى كبار السن 11،12،13،14،15،16،17،18،19،20،21 . تم العثور على بعض الجزيئات الكهربية التي تنتمي إلى triterpenes والبوليفينول لتعديل الاستجابات الالتهابية في كل من المختبر وفي النماذج الحية 12. على سبيل المثال ، تتداخل المركبات الطبيعية التي تحتوي على α،β الكربونيل غير المشبع (على سبيل المثال ، الكركمين ، القرفة ، القرفة) ، أو مجموعة الأيزوثيوسيانات (على سبيل المثال ، السلفورافان) مع مستقبلات Toll-4 (TLR4) التي تمنع التوليف النهائي للسيتوكينات المؤيدة للالتهابات في خط الخلايا المؤيدة لل B المعتمد على الفئران12,22 . تشير الأدلة الوبائية بقوة إلى أن المواد الكيميائية النباتية الغذائية ، الموجودة في المصفوفات الغذائية المعقدة ، قد تشكل أيضا مصدرا قابلا للتطبيق لأدوية جديدةتؤدي 6.

واحدة من العقبات الرئيسية في تحديد الجزيئات النشطة بيولوجيا الموجودة في المستخلصات النباتية ، بما في ذلك الأغذية النباتية ، هي تعقيد العينات التي تم التحقيق فيها. تقليديا ، يتم عزل المركبات الفردية وتنقيتها واختبارها لاحقا للنشاط البيولوجي. عادة ما يؤدي هذا النهج إلى تحديد المركبات الأكثر وفرة وتميزا. تعتمد مناهج اكتشاف الأدوية المظهرية بدون هدف جزيئي محدد على التجزئة الموجهة بيولوجيا للمخاليط المعقدة23. في هذا النهج ، يتم تقسيم المستخلص إلى أجزاء فرعية أقل تعقيدا يتم اختبارها لاحقا في اختبارات النمط الظاهري. يسترشد عزل وتنقية المركبات النشطة بالنشاط البيولوجي الذي تم التحقق منه في الفحص. قد تؤدي معرفة هوية هدف دوائي محدد إلى تسريع كبير في تحديد المركبات النشطة دوائيا الموجودة في المخاليط المعقدة. تعتمد هذه الأساليب عادة على تجميد الهدف الجزيئي ، على سبيل المثال ، إنزيم ، على سطح صلب ، مثل الخرز المغناطيسي23. وتستخدم الأهداف المجمدة لاحقا في تجارب الفرز التي تؤدي إلى عزل المركبات المتفاعلة مع الهدف. في حين تم استخدام هذا النهج على نطاق واسع في تحديد المركبات التي تستهدف البروتينات الخلوية ، فقد تم تطبيقه بشكل أقل شيوعا في تحديد المواد الكيميائية المتفاعلة مع البروتينات عبر الغشاء (TMPs)23. ينبع تحد إضافي في تجميد TMPs من حقيقة أن نشاط البروتين يعتمد على تفاعله مع الدهون الفوسفاتية في غشاء الخلية والجزيئات الأخرى في الطبقة الثنائية مثل الكوليسترول23,24. من المهم الحفاظ على هذه التفاعلات الدقيقة بين البروتينات وبيئتها ثنائية الطبقة الفوسفاتية الأصلية عند محاولة شل حركة الهدف عبر الغشاء.

في غشاء التقارب الخلوي ، يتم تجميد شظايا غشاء الخلية (CMAC) ، وليس البروتينات النقية ، على جزيئات الطور الثابت للغشاء الاصطناعي (IAM)23. يتم تحضير المراحل الثابتة IAM عن طريق الترابط التساهمي لنظائر الفوسفاتيديل كولين على السيليكا. تم مؤخرا تطوير فئات جديدة من المراحل الثابتة IAM التي يتم فيها تغطية مجموعات الأمين والسيلانول الحر (IAM. كمبيوتر شخصي. جسيمات DD2). خلال أعمدة CMAC إعداد شظايا غشاء الخلية يتم تجميدها على سطح جزيئات IAM من خلال الامتزاز.

وقد استخدمت أعمدة CMAC حتى الآن لشل حركة فئات مختلفة من TMPs بما في ذلك القنوات الأيونية (على سبيل المثال ، مستقبلات النيكوتين) ، GPCRs (على سبيل المثال ، مستقبلات المواد الأفيونية) ، ناقلات البروتين (على سبيل المثال ، p-glycoprotein) ، إلخ.24. وقد استخدمت أهداف البروتين المجمدة في توصيف الديناميكا الدوائية (على سبيل المثال، ثابت التفكك، Kd) أو تحديد حركيات الربط (kon and koff) لأربطة الجزيئات الصغيرة التي تتفاعل مع الهدف وكذلك في عملية تحديد خيوط الدواء الجديدة المحتملة الموجودة في المصفوفات المعقدة24 . نقدم هنا إعداد أعمدة CMAC مع مستقبل التروبوميوسين كيناز B (TrkB) المتجمد ، والذي ظهر كهدف قابل للتطبيق لاكتشاف الأدوية للعديد من اضطرابات الجهاز العصبي.

أظهرت الدراسات السابقة أن تنشيط مسار عامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ (BDNF) / TrkB يرتبط بتحسين بعض الأمراض العصبية ، مثل AD أو اضطراب الاكتئاب الرئيسي25،26،27،28. وأفيد أن مستويات BDNF وتعبيره عن مستقبلاته TrkB تنخفض في AD ، وتخفيضات مماثلة تضعف وظيفة الحصين في النماذج الحيوانية من AD29. تم الإبلاغ عن انخفاض مستويات BDNF في مصل ودماغ مرضى AD 30،31،32. تم العثور على فرط التعبير عن تاو أو فرط الفسفرة لخفض تنظيم تعبير BDNF في الخلايا العصبية الأولية والنماذج الحيوانية AD33،34،35. بالإضافة إلى ذلك ، تم الإبلاغ عن أن BDNF له آثار وقائية على السمية العصبية الناجمة عن β أميلويد في المختبر وفي الجسم الحي36. وقد تبين أن إعطاء BDNF المباشر في دماغ الفئران يزيد من التعلم والذاكرة في الحيوانات الضعيفة إدراكيا37. ظهرت BDNF / TrkB كهدف صالح لتخفيف الاضطرابات العصبية والنفسية بما في ذلكAD 28,38. إن استهداف مسار إشارات BDNF / TrkB لتطوير العلاجات في AD من المحتمل أن يعزز فهمنا للمرض39. لسوء الحظ ، لا يمكن استخدام BDNF نفسه كعلاج بسبب خصائصه الدوائية السيئة وآثاره الجانبية الضارة40. تم استكشاف منشطات الجزيئات الصغيرة لمسارات TrkB / BDNF كروابط TrkB محتملة41،42،43. من بين ناهضات الجزيئات الصغيرة التي تم اختبارها ، 7,8-dihydroxyflavone (7,8-DHF) ، ثبت أنها تنشط مسار BDNF / TrkB41,44,45,46. ويجري حاليا النظر في مشتق من 7,8-DHF (R13؛ 4-Oxo-2-phenyl-4H-chromene-7,8-diyl bis(methylcarbamate)) كدواء محتمل ل AD47. في الآونة الأخيرة ، تبين أن العديد من مضادات الاكتئاب تعمل من خلال الارتباط المباشر ب TrkB وتعزيز إشارات BDNF ، مما يؤكد على أهمية متابعة TrkB كهدف صالح لعلاج الاضطرابات العصبية المختلفة48.

يصف البروتوكول عملية تجميع عمود TrkB الوظيفي وعمود التحكم السلبي TrkB-NULL. تتميز الأعمدة باستخدام منتج طبيعي معروف رباط جزيئي صغير: 7,8-DHF. بالإضافة إلى ذلك ، نصف عملية فحص المصفوفات المعقدة ، باستخدام المستخلص النباتي كمثال ، لتحديد المركبات التي تتفاعل مع TrkB.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. زراعة الخلايا من خلايا الورم الأرومي العصبي SH-SY5Y (خطوط الخلايا TrkB و TrkB-NULL (الأبوية) )

ملاحظة: تم شراء خطوط الخلايا (خط الخلية SH-SY5Y (TrkB، BR6) وخط الخلية الأبوية SH-SY5Y (TrkB NULL))49,50 من كيرافاست. تستخدم الخلايا المستزرعة كمصدر للمستقبلات عبر الغشاء ليتم تجميدها لإعداد أعمدة CMAC. تصف الخطوات التالية كيفية الحصول على شظايا غشاء الخلية وتجميع أعمدة CMAC الوظيفية.

  1. تنمو الخلايا في وسط زراعة الخلايا المحضر عن طريق خلط 450 مل من وسائط RPMI ، و 50 مل من FBS ، و 5 مل من محلول البنسلين / الستربتومايسين ، و 0.3 ملغ / مل من جينيتيسين (G418) في طبق زراعة الخلايا 150 ملم عند 37 درجة مئوية في جو رطب مع 5٪ CO2.

2. حصاد الخلايا

  1. تأكد من التقاء الخلايا (80٪ -90٪) باستخدام المجهر ، الذي تم الوصول إليه بعد 3-4 أيام من مرور الخلية.
  2. استنشاق وسط زراعة الخلايا من فوق الخلايا واغسل الخلايا مرتين بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS ، 1x ، الرقم الهيدروجيني 7.4). إزالة PBS وإضافة 2 مل من التربسين منخفض التركيز (0.25 ٪) لفصل الخلايا.
  3. قم بتدوير اللوحة بلطف لتغطية جميع الخلايا بالتساوي بمحلول التربسين واحتضان الخلايا لمدة دقيقتين تقريبا عند 37 درجة مئوية في جو رطب مع 5٪ CO2. أضف 8 مل من وسط زراعة الخلايا إلى الخلايا المنفصلة وانقل الخلايا المنفصلة إلى أنبوب مخروطي 50 مل وضعه على الجليد.
  4. استخدم مقياس الدم لتقدير عدد الخلايا (حوالي 3 × 107 خلايا). قم بخلط تعليق الخلايا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل للحصول على كثافة خلية متساوية في الخليط. ضع 10 ميكرولتر من تعليق الخلايا تحت الغطاء وقم بحساب الخلايا تحت المجهر باستخدام هدف 40x.

3. تجانس الخلايا

  1. تحضير محاليل المخزون من مثبطات الأنزيم البروتيني التالية: البنزاميدين (200 ملليمتر)، فلوريد فينيل ميثيل سلفونيل (PMSF، 10 ملليمتر)، وكوكتيل مثبطات الأنزيم البروتيني المتاحة تجاريا (تركيز 100x) الذي يحتوي على 4-(2-أمينو إيثيل) هيدروكلوريد فلوريد البنزين سلفونيل (AEBSF)، الأبروتينين، البيستاتين، واللوبيبتين.
    تنبيه: يجب التعامل مع PMSF فقط داخل غطاء الدخان.
    1. تحضير محلول مخزون البنزاميدين (200 ملليمتر) عن طريق إذابة 120 ملغ من البنزاميدين في 5 مل من الماء منزوع الأيونات فائق النقاء. يخزن على حرارة 4 درجات مئوية ويستخدم في غضون يوم واحد. تحضير محلول طازج قبل كل استخدام (مستحسن).
    2. تحضير محلول مخزون PMSF (10 mM) عن طريق إذابة 0.017 g من PMSF في 10 مل من الإيثانول. يخزن في درجة حرارة 20 درجة مئوية.
    3. تحضير كوكتيل مثبطات الأنزيم البروتيني (100x) عن طريق إذابة خليط مثبطات الأنزيم البروتيني المتوفر تجاريا في 1 مل من الماء منزوع الأيونات فائق النقاء. تخلط جيدا و aliquot 200-300 ميكرولتر من الكوكتيل وتخزن في - 20 درجة مئوية قبل الاستخدام.
  2. تحضير محلول مخزون ATP (100 mM) عن طريق إذابة 55.114 mg من هيدرات ملح الصوديوم ATP في 1 مل من الماء فائق النقاء منزوع الأيونات. تخلط جيدا و aliquot 100 ميكرولتر من الخليط وتخزن في - 20 درجة مئوية قبل الاستخدام.
  3. تحضير المخزن المؤقت عن طريق إذابة 3.03 غرام من ثلاثي (هيدروكسي ميثيل) أمينو إيثان هيدروكلوريد (Tris-HCl ، 50 mM) ، 2.9 غرام من كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم ، 100 mM) ، 0.22 غرام من كلوريد الكالسيوم اللامائي (CaCl 2 ، 3 mM) ، 0.2 g من كلوريد المغنيسيوم سداسي هيدرات (MgCl 2 ،2 mM) و 0.19 من كلوريد البوتاسيوم (KCl ، 5 mM) في 500 مل من الماء منزوع الأيونات فائق النقاء.
  4. قم بإعداد مخزن مؤقت للتجانس عن طريق خلط 17.3 مل من المخزن المؤقت المحضر في الخطوة 3.3 مع 0.3 مل (3 ملليمتر) من محلول مخزون البنزاميدين ، و 0.2 مل (0.1 مل) من محلول مخزون PMSF ، و 0.2 مل من خليط كوكتيل مثبط للأنزيم البروتيني ، و 20 ميكرولتر (100 ميكرومتر) من محلول مخزون ATP ، و 2 مل (10٪) من الجلسرين ، و 0.029 جم (5 ملليمتر) من EDTA (الجدول 1). اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 باستخدام محلول حمض الهيدروكلوريك.
  5. قم بتدوير الخلايا التي تم حصادها في الخطوة 2.3 عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق عند 400 × جم. قم بإزالة السوبرناتانت واغسل حبيبات الخلايا المتبقية ب 10 مل من PBS البارد (1x ، الرقم الهيدروجيني 7.4). قم بتدوير الخلايا مرة أخرى عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق عند 400 × جم.
  6. تخلص من المادة الفائقة واستبدلها ب 20 مل من مخزن التجانس المخزن المؤقت المعد في الخطوة 3.4. ضع الأنبوب المخروطي على الثلج.
  7. انقل تعليق الخلية إلى مطحنة أنسجة مجانسة Dounce سعة 40 مل وضعها على الجليد. قم بتجانس التعليق يدويا ، على الجليد ، باستخدام 40 ضربة مدقة صعودا وهبوطا. انقل تعليق الخلايا المتجانس إلى أنبوب مخروطي 50 مل.
  8. جهاز الطرد المركزي المتجانس عند 4 درجات مئوية لمدة 7 دقائق عند 400 × جم. تخلص من الكريات وانقل السوبرناتانت إلى أنبوب مخروطي جديد وقم بطرده مركزيا عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة عند 47900 × جم. حفظ بيليه غشاء الخلية والتخلص من supernatant.

4. ذوبان غشاء الخلية

  1. قم بإعداد مخزن مؤقت للذوبان عن طريق خلط 8.7 مل من محلول التخزين المؤقت المصنوع في الخطوة 3.3 مع 0.1 مل (0.1 مل) من محلول مخزون PMSF ، و 0.15 مل (3 ملليمتر) من محلول مخزون البنزاميدين ، و 0.1 مل من كوكتيل مثبط الأنزيم البروتيني ، و 10 ميكرولتر (100 ميكرومتر) من محلول مخزون ATP ، و 1 مل (10٪) من الجلسرين و 0.2 جم (2٪) من كولات الصوديوم (الجدول 2).
  2. انقل المخزن المؤقت للذوبان إلى الأنبوب المخروطي مع شظايا غشاء الخلية التي تم الحصول عليها في الخطوة 3.8 وأعد تعليق الكرية. قم بتدوير الخليط الناتج عند 150 دورة في الدقيقة عند 4 درجات مئوية لمدة 18 ساعة.
    ملاحظة: في هذه المرحلة ، يمكن إيقاف التجربة مؤقتا لذوبان حبيبات غشاء الخلية بين عشية وضحاها.

5. تجميد غشاء الخلية على IAM. كمبيوتر شخصي. جسيمات DD2

  1. بعد 18 ساعة ، قم بالطرد المركزي لخليط الذوبان عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة عند 47900 × جم.
  2. حافظ على السوبرناتانت وتخلص من الكريات. أضف 100 ملغ من IAM. كمبيوتر شخصي. جزيئات DD2 ، إلى السوبرناتانت ، دوامة وتدوير خليط التعليق الناتج عند 150 دورة في الدقيقة عند 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة.
  3. لتسهيل تجميد شظايا غشاء الخلية على IAM. كمبيوتر شخصي. تنتقل جزيئات DD2 إلى خطوة غسيل الكلى كما هو موضح أدناه.
    1. تحضير الغسيل الكلوي العازل في 4 لتر من الماء منزوع الأيونات فائق النقاء عن طريق إضافة 24 جم من tris-HCl (50 mM) ، و 23.4 g من كلوريد الصوديوم (100 mM) ، و 0.06 g من CaCl2 (0.1 mM) ، و 5.85 g من EDTA (5 mM) ، و 0.07 g من PMSF (0.1 mM; الجدول 3).
      ملاحظة: PMSF غير قابل للذوبان في الماء ، لذلك قم بإذابته أولا في حجم صغير من الإيثانول ثم أضفه ببطء إلى الكأس باستخدام المخزن المؤقت.
    2. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 باستخدام محلول حمض الهيدروكلوريك. ضع المخزن المؤقت عند 4 درجات مئوية لمدة لا تقل عن 1 ساعة قبل المتابعة إلى خطوة غسيل الكلى.
    3. تحضير أنبوب غسيل الكلى عن طريق قطع 10 سم من أنابيب غسيل الكلى الغشائية السليلوز (10 K MWCO ، 35 مم) ونقل التعليق الذي يحتوي على IAM. كمبيوتر شخصي. جزيئات DD2 وشظايا غشاء الخلية في أنبوب غسيل الكلى. استخدم مشابك أنابيب غسيل الكلى لإغلاق طرفي أنبوب غسيل الكلى.
    4. ضع أنبوب غسيل الكلى الذي يحتوي على IAM. كمبيوتر شخصي. DD2 المرحلة الثابتة في المخزن المؤقت لغسيل الكلى والدياليز عند 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة مع التحريك بلطف.
    5. بعد 24 ساعة، ضع أنبوب غسيل الكلى في المخزن المؤقت لغسيل الكلى المعد حديثا واستمر في غسيل الكلى لمدة 24 ساعة أخرى.

6. CMAC عمود التعبئة والتغليف

  1. قم بإعداد مخزن خلات الأمونيوم العازل (10 mM ، الرقم الهيدروجيني 7.4) الذي سيتم استخدامه لغسل IAM. كمبيوتر شخصي. جسيمات DD2 وفي تجارب توصيف العمود عن طريق إذابة 0.7708 غرام من خلات الأمونيوم في 1 لتر من الماء منزوع الأيونات فائق النقاء. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 باستخدام محلول حمض الهيدروكلوريك.
  2. بعد 48 ساعة من غسيل الكلى ، قم بإزالة أنبوب غسيل الكلى من المخزن المؤقت لغسيل الكلى ونقل محتوى أنبوب غسيل الكلى إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
  3. الطرد المركزي للخليط في 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق عند 400 × غرام. تخلص من السوبرناتانت واغسل الكريات المتبقية ثلاث مرات باستخدام 10 مل من العازل من خلات الأمونيوم ، مع الطرد المركزي للخليط عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق عند 400 × جم ، بعد كل غسل.
  4. بعد الغسيل الثالث ، أعد تعليق الكريات المتبقية في 1 مل من المخزن المؤقت لأسيتات الأمونيوم. امزجها جيدا واستخدم الملاط الناتج لتعبئة العمود الزجاجي 5/20 لإنتاج عمود كروماتوغرافيا CMAC.
  5. لتعبئة العمود ، ضع أولا مرشحا سفليا غارقا سابقا في المخزن المؤقت لأسيتات الأمونيوم ، في حامل الفلتر. قم بتركيب حامل المرشح في العمود الزجاجي وقم بتثبيت غطاء العمود لتأمين موضع الحامل. ضع العمود عموديا في مشبك إصبع وقم بتثبيته في حامل المختبر. ضع دورقا أسفل العمود.
  6. باستخدام ماصة أحادية القناة ، قم بنقل حجم صغير من الملاط الذي تم الحصول عليه في الخطوة 6.4 إلى العمود الزجاجي. صب المادة ببطء ، مع الاحتفاظ بطرف الماصة على جدار العمود الزجاجي. اسمح لمواد التعبئة بالاستقرار قبل صب حجم آخر من الطين.
  7. لتسريع عملية التعبئة ، قم بإزالة المخزن المؤقت من فوق السرير الثابت باستخدام ماصة دقيقة بين كل خطوة. كرر هذه الخطوات حتى يتم تعبئة 1 مل من الملاط.
  8. ضع مرشحا علويا وقم بربط وحدة المحول بحيث لا يوجد مخزن مؤقت متبقي فوق المرحلة الثابتة، كما هو موضح في الشكل 1. قم بتأمين موضع وحدة المحول باستخدام قفل المحول.
  9. قم بتوصيل العمود بمضخة كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء (HPLC) ، واضبط معدل التدفق على 0.2 مل / دقيقة ، واغسل العمود طوال الليل باستخدام مخزن خلات الأمونيوم. العمود جاهز الآن لخطوة التوصيف. يخزن العمود على درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
    ملاحظة: للتخزين لفترة أطول (العمود غير المستخدم لفترة أطول من أسبوع) قم بتشغيل العمود بمحلول أزيد الصوديوم بنسبة 0.05٪ في المخزن المؤقت لأسيتات الأمونيوم وتخزينه عند 4 درجات مئوية.
    تحذير: أزيد الصوديوم شديد السمية عند تناوله عن طريق الفم أو امتصاصه من خلال الجلد. يجب التعامل معها فقط تحت غطاء الدخان. تأكد من ارتداء معطف المختبر ونظارات السلامة والقفازات (يفضل النتريل) عند العمل مع أزيد الصوديوم.

7. توصيف عمود CMAC

  1. المجهر البؤري وربط BDNF
    1. إعداد IAM. PCC. جسيمات الطور الثابت DD2 مع شظايا غشاء الخلية المجمدة التي تم الحصول عليها بشكل منفصل عن خلايا الورم الأرومي العصبي SH-SY5Y التي تبالغ في التعبير عن خلايا TrkB و SH-SY5Y TrkB-NULL باتباع الإرشادات من الخطوة 1 إلى الخطوة 6.4.
    2. بالنسبة للعينات التي سيتم احتضانها باستخدام BDNF قبل تلطيخ الأجسام المضادة ، قم بإعداد محلول مخزون BDNF عن طريق إذابة 10 ميكروغرام من BDNF في 100 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات فائق النقاء. تخزين الحل في -20 درجة مئوية.
      1. نقل في أنابيب منفصلة 1.5 مل أجهزة الطرد المركزي الدقيقة ، 100 ميكرولتر أليكوت من IAM. كمبيوتر شخصي. DD2 عمود مواد التعبئة مع شل حركة خلايا SH-SY5Y الورم الأرومي العصبي overexpression TrkB و 100 ميكرولتر أليكوت من IAM. كمبيوتر شخصي. مواد تعبئة عمود DD2 مع خلايا SH-SY5Y TrkB-NULL المعلقة في المخزن المؤقت لأسيتات الأمونيوم.
      2. أضف 390 ميكرولتر من المخزن المؤقت لأسيتات الأمونيوم ، و 10 ميكرولتر من محلول مخزون BDNF ، و 0.5 ميكرولتر من محلول مخزون ATP (المحضر في الخطوة 3.2) في كل أنبوب واحتضنه لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع الهزاز.
    3. بالنسبة للعينات التي لن يتم احتضانها باستخدام BDNF قبل تلطيخ الأجسام المضادة ، قم بنقل 100 ميكرولتر من IAM. كمبيوتر شخصي. DD2 عمود مواد التعبئة مع شل حركة خلايا SH-SY5Y الورم الأرومي العصبي المبالغة في التعبير عن TrkB معلقة في خلات الأمونيوم في أنابيب الطرد المركزي الدقيق 1.5 مل.
    4. أضف 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت لأسيتات الأمونيوم و 0.5 ميكرولتر من محلول مخزون ATP (المحضر في الخطوة 3.2) في كل أنبوب واحتضنه لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع الهزاز.
    5. قم بتدوير العينات المحضرة في الخطوتين 7.1.2 و 7.1.4 عند 4 درجات مئوية لمدة دقيقة واحدة عند 10000 × g وتخلص من supernatant.
    6. اغسل الكريات الناتجة ب 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لأسيتات الأمونيوم لمدة 10 دقائق وقم بالدوران مرة أخرى عند 4 درجات مئوية لمدة دقيقة واحدة عند 10000 × جم وتخلص من السوبرناتانت.
    7. إلى كل من الكريات ، أضف 220 ميكرولتر من المخزن المؤقت لأسيتات الأمونيوم ، و 25 ميكرولتر من مصل الماعز الطبيعي بنسبة 10٪ ، و 5 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية المضادة ل BDNF. احتضان في غرفة باردة (4 درجة مئوية) بين عشية وضحاها مع هزاز.
    8. عند الانتهاء من خطوة الحضانة ، قم بتدوير الخليط لمدة دقيقة واحدة عند 10000 × جم عند 4 درجات مئوية وتخلص من السوبرناتانت.
    9. اغسل الكريات الناتجة 3 مرات باستخدام مخزن خلات الأمونيوم العازل الذي يحتوي على منظف معتدل بنسبة 1٪ (على سبيل المثال ، كولات الصوديوم) لمدة 10 دقائق وقم بتدوير الخلائط لمدة دقيقة واحدة عند 10000 × جم عند 4 درجات مئوية وتخلص من السوبرناتانت.
    10. تحضير محلول الأجسام المضادة الثانوية عن طريق خلط 900 ميكرولتر من المخزن المؤقت لأسيتات الأمونيوم ، و 100 ميكرولتر من مصل الماعز الطبيعي بنسبة 10٪ ، و 1 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية المترافقة مع الفلوروفور (تخفيف 1: 1000). أضف 300 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوي إلى كل من الكريات التي تم الحصول عليها في الخطوة 7.1.9. وتحضن بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع هزاز.
    11. يقلب الخليط على 10000 × غرام لمدة دقيقة واحدة عند 4 درجات مئوية ويتخلص من السوبرناتانت.
    12. اغسل الكريات الناتجة 3 مرات باستخدام مخزن خلات الأمونيوم العازل الذي يحتوي على منظف معتدل بنسبة 1٪ (على سبيل المثال ، كولات الصوديوم) لمدة 10 دقائق وقم بتدوير الخليط لمدة دقيقة واحدة عند 10000 × g عند 4 درجات مئوية وتخلص من supernatant.
    13. أعد تعليق الكريات الناتجة في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت لأسيتات الأمونيوم. ضع 20 ميكرولتر من كل خليط من الخلائط على شريحة وقم بتغطيتها بغطاء.
    14. صورة IAM. كمبيوتر شخصي. جسيمات DD2 مع شظايا غشاء الخلية المجمدة باستخدام مجهر مسح ليزر متحد البؤرة مع إثارة عند 488 نانومتر وانبعاث عند 520 نانومتر تم توليده باستخدام نظام ليزر الحالة الصلبة. استخدم هدفا 20x مع NA من 0.75 و WD من 0.35mm.
  2. كروماتوغرافيا التقارب الجبهي باستخدام 7,8-DHF كرباط علامة
    1. قم بتوصيل عمود CMAC بنظام HPLC باستخدام كاشف صفيف الصمام الثنائي و / أو مطياف الكتلة.
    2. تحضير 500 مل من محلول 1 mM من 7,8-DHF في المخزن المؤقت لأسيتات الأمونيوم الذي يحتوي على 5٪ من الميثانول.
    3. ضخ تركيز ثابت من رباط العلامة (1 mM) من خلال عمود CMAC بمعدل تدفق 0.4 مل / دقيقة في درجة حرارة الغرفة. راقب ملف تعريف الاستخلاص باستخدام كاشف الكشف عن صفيف الصمام الثنائي (DAD) (الطول الموجي 254 نانومتر) أو مطياف الكتلة (استخدم وضع مراقبة أيون واحد ؛ m / z 253 في وضع التأين السلبي).
    4. بعد الانتهاء من تشغيل أداء غسل بين عشية وضحاها عن طريق تشغيل المخزن المؤقت خلات الأمونيوم من خلال العمود.
    5. كرر الخطوات 7.2.2. - 7.2.4. باستخدام تركيزات مختلفة من رابطة العلامة (750 نانومتر ، 500 نانومتر ، 300 نانومتر) ، وغسل الأعمدة بين عشية وضحاها بعد كل تشغيل. استخدم كروماتوغرافيا التقارب الأمامي لحساب الليجند Kd، كما تمت مراجعته بالتفصيل، في مكان آخر. 24,51
  3. دراسات الإزاحة مع Centella asiatica (L.) Urb. (غوتو كولا) استخراج
    1. تحضير 500 مل من محلول 500 نانومتر من 7,8-DHF في المخزن المؤقت لخلات الأمونيوم الذي يحتوي على 5٪ ميثانول و 0.2٪ مستخلص غوتو كولا مائي (10 ملغ / مل).
    2. ضخ تركيز ثابت من رباط العلامة (500 نانومتر) مع المستخلص من خلال العمود بمعدل تدفق 0.4 مل / دقيقة في درجة حرارة الغرفة. راقب ملف تعريف الاستخلاص باستخدام كاشف DAD (الطول الموجي 254 نانومتر) أو مقياس الطيف الكتلي (استخدم وضع مراقبة الأيون الواحد ؛ m / z 253 في وضع التأين السالب).
    3. بعد الانتهاء من تشغيل أداء غسل بين عشية وضحاها عن طريق تشغيل المخزن المؤقت خلات الأمونيوم من خلال العمود.
    4. ارسم ملفات تعريف الاستخلاص ل 500 نانومتر 7,8-DHF وتلك التي تم الحصول عليها بعد تشغيل المحلول باستخدام مستخلص غوتو كولا لفحص إزاحة رباط العلامة.

8. نهج كروماتوغرافيا الذروة المفقود لتحديد روابط TrkB المحتملة من مستخلص غوتو كولا

  1. تجزئة مستخلص غوتو كولا على أعمدة CMAC
    1. قم بتوصيل عمودي CMAC TrkB و TrkB-NULL بشكل منفصل بنظام HPLC وحقن 50 ميكرولتر من مستخلص غوتو كولا المائي (10 ملغ / مل) على كل عمود من الأعمدة. مضخة خلات الأمونيوم العازلة (10 mM ، الرقم الهيدروجيني 7.4) التي تحتوي على 5٪ من الميثانول من خلال العمود بمعدل تدفق 0.4 مل / دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    2. اجمع الكسور بشكل منفصل عن أعمدة CMAC TrkB و TrkB-NULL على النحو التالي: 0-5 دقيقة ، 5-10 دقائق ، 10-15 دقيقة ، 15-20 دقيقة ، 20-25 دقيقة ، 25-30 دقيقة ، 30-35 دقيقة ، 35-40 دقيقة ، 40-45 دقيقة ، 45-50 دقيقة ، 50-55 دقيقة ، 55-60 دقيقة.
    3. تجميد وتجميد الكسور التي تم الحصول عليها. أعد تعليق الكسور المجففة بالتجميد في 50 ميكرولتر من الميثانول قبل الشروع في تحليل الكروماتوغرافيا السائلة فائقة الأداء وقياس الطيف الكتلي.
  2. تحليل الطيف الكتلي الرباعي لوقت الطيران الكروماتوغرافي السائل فائق الأداء (UPLC-QTOF-MS) لكسور غوتو كولا CMAC
    1. تحليل جميع الكسور التي تم الحصول عليها في النقطة 8.1.3. باستخدام مطياف الكتلة إلى جانب نظام UPLC (وضع تحليل UPLC-MS E). قم بتحليل الكسور باستخدام عمود C18 (2.1 × 50 مم ، 1.7 ميكرومتر) باستخدام عمود C18 VanGuard المسبق (2.1 مم × 5 مم ، 1.7 ميكرومتر).
    2. قم بإلغاء العمود باستخدام المحاليل المتدرجة التالية بمعدل تدفق 0.3 مل / دقيقة مع المرحلة المتنقلة A (الماء مع 0.1٪ حمض الفورميك) و B (الأسيتونيتريل مع 0.1٪ حمض الفورميك): 0.0 دقيقة 99٪ A 1٪ B ، 1.5 دقيقة 84٪ A 16٪ B ، 5.0 دقيقة 80٪ A 20٪ B ، 7.0 دقيقة 75٪ A 25٪ B ، 10.0 دقيقة 65٪ A 35٪ B، 20.0-24.0 دقيقة 1٪ A 99٪ B، 25.0-29.0 دقيقة 99٪ A 1٪ B.
    3. اضبط حجم الحقن لكل عينة على 3 ميكرولتر. قم بإجراء MSE في أوضاع الأيونات الموجبة والسالبة ذات الدقة ، مع طاقة تصادم عند 4 فولت للطاقة المنخفضة و 20-35 فولت للطاقة العالية.
    4. استخدم شروط مصدر ESI التالية في وضع التأين الإيجابي: الجهد الشعري 1.5 كيلو فولت ، مخروط أخذ العينات 40 فولت ، إزاحة المصدر 80 ، درجة حرارة المصدر 100 درجة مئوية ، درجة حرارة الذوبان 350 درجة مئوية ، تدفق الغاز المخروطي 38.0 لتر / ساعة ، غاز الذوبان 400 لتر / ساعة.
    5. استخدم شروط مصدر ESI التالية في وضع التأين السلبي: الجهد الشعري 1.45 كيلو فولت ، مخروط أخذ العينات 40 فولت ، إزاحة المصدر 80 ، درجة حرارة المصدر 110 درجة مئوية ، درجة حرارة الذوبان 300 درجة مئوية ، تدفق الغاز المخروطي 50.0 لتر / ساعة ، تدفق غاز الذوبان 652 لتر / ساعة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

بعد البروتوكول ، تم تجميع عمودين كروماتوغرافيين CMAC: أحدهما مع شظايا غشاء خلية الورم الأرومي العصبي SH-SY5Y المجمدة مع TrkB المعبر عنه بشكل مفرط والآخر مع شظايا غشاء خلية SH-SY5Y TrkB-NULL. يتم عرض عمود CMAC الذي تم تجميعه بشكل صحيح في الشكل 1 ويتم عرض الخطوات التي ينطوي عليها تجميد شظايا غشاء الخلية في الشكل 2.

منذ تجميد مستقبلات TrkB على IAM. كمبيوتر شخصي. لم تتم محاولة المرحلة الثابتة الكروماتوغرافية DD2 من قبل ، وتم تأكيد التجميد الناجح للمستقبلات من خلال تلطيخ الأجسام المضادة وكروماتوغرافيا التقارب الأمامي باستخدام رباط علامة: 7,8-DHF. يتم تقديم تمثيل تخطيطي لتجربة تلطيخ الأجسام المضادة في الشكل 2. تم تجميد شظايا غشاء الخلية التي تم الحصول عليها من خط خلية الورم الأرومي العصبي الذي يبالغ في التعبير عن مستقبلات TrkB وشظايا غشاء الخلية من خط الخلية الأبوي بدون مستقبلات TrkB (TrkB-NULL)) على IAM. كمبيوتر شخصي. جسيمات DD2 باستخدام البروتوكول الأمثل. في وقت لاحق ، تم تحضين الجسيمات ذات شظايا غشاء الخلية المجمدة باستخدام BDNF (الرباط الفسيولوجي) ثم مع الأجسام المضادة الثانوية الأولية والفلورسنت (الشكل 2). IAM. كمبيوتر شخصي. أدت جسيمات DD2 ذات شظايا غشاء الخلايا العصبية TrkB المجمدة وفي وجود BDNF إلى جزيئات موسومة بالفلورسنت (الشكل 3C). لم يلاحظ أي تألق (باستثناء التألق الخلفي الضعيف) عندما تم التحقيق في جسيمات IAM المغلفة بغشاء خلية TrkB-NULL (الشكل 3A) أو عندما لم يتم استخدام BDNF في حالة جسيمات IAM المغلفة بغشاء خلية TrkB (الشكل 3B).

لتوصيف ربط رباط علامة صغير (7,8-DHF) بمستقبلات TrkB المجمدة ، تم إجراء كروماتوغرافيا التقارب الأمامي بتركيزات مختلفة من 7,8-DHF. ويرد في الشكل 4 كروماتوجرام نموذجي لزيادة تركيزات 7,8-DHF على عمود CMAC وظيفي. تم تأكيد الارتباط المحدد ل 7,8-DHF ب TrkB المتجمد من خلال الانخفاضات المعتمدة على التركيز في وقت الاحتفاظ برباط العلامة. يتم عرض نتائج كروماتوغرافيا التقارب الأمامي التي تم الحصول عليها على عمود CMAC غير وظيفي في الشكل 5. يشير عدم وجود تغييرات تعتمد على التركيز في الاحتفاظ برباط العلامة إلى المحاولة غير الناجحة في إعداد CMAC.

المركبات التي يتم حقنها على عمود CMAC لا تتفاعل فقط على وجه التحديد ولكن يمكن أيضا أن تتفاعل بشكل غير محدد مع IAM. كمبيوتر شخصي. جسيمات DD2 ، الطبقة الثنائية الفوسفاتية من شظايا غشاء الخلية المجمدة ، والبروتينات الأخرى الموجودة في الطبقة الثنائية. لاستبعاد المركبات التي لا تتفاعل بشكل خاص مع عمود CMAC أثناء عملية فحص المستخلصات المعقدة لروابط TrkB ، من المهم إعداد عمود التحكم السلبي CMAC عن طريق شل شظايا غشاء الخلية من خط الخلية الأبوي الذي لا يعبر عن البروتين المستهدف (في هذه الحالة TrkB-NULL). يتم عرض نتائج كروماتوغرافيا التقارب الأمامي التي تم الحصول عليها في عمود CMAC TrkB-NULL سلبي في الشكل 6.

يمكن استخدام أعمدة CMAC الوظيفية لأغراض مختلفة ، مثل توصيف البروتين المستهدف ، ودراسة تفاعلات المركبات الفردية مع الأهداف المجمدة (على سبيل المثال ، الحصول على ثابت التفكك ، Kd) أو تحديد حركية الربط (kon and koff) وما إلى ذلك .24. يمكن أيضا استخدام الأعمدة لفحص العينات المعقدة ، مثل المستخلصات النباتية لوجود مركبات مرتبطة بمستقبلات TrkB ، وبالتالي يحتمل أن تحتوي على جزيئات تعمل كناهضات TrkB أو خصوم. للتحقق مما إذا كان المستخلص يحتمل أن يحتوي على مركبات تتفاعل مع المستقبلات المجمدة ، يتم إجراء تجربة إزاحة بسيطة. يتم عرض نتيجة تجربة المنافسة التي أجريت مع مستخلص غوتو كولا و 500 نانومتر من 7,8-DHF على عمود TrkB وظيفي في الشكل 7. أدت إضافة 0.2٪ من مستخلص غوتو كولا المائي (10 ملغم / مل) إلى انخفاض كبير قدره 7,8-DHF مما يشير إلى وجود روابط (روابط) متنافسة لموقع ربط الناهض. يتم عرض نتيجة تجربة الإزاحة التي أجريت على عمود TrkB-NULL السلبي CMAC في الشكل 8. يؤكد عدم وجود انخفاض في الاحتفاظ ب 7,8-DHF على هذا العمود عدم وجود مستقبلات TrkB وظيفية في عمود CMAC TrkB-NULL.

لتحديد المستقلبات المتخصصة التي تتفاعل على وجه التحديد مع الأهداف المجمدة ، يتم استخدام أعمدة CMAC في نهج يسمى كروماتوغرافيا الذروة المفقودة52 بعد تجربة الإزاحة. في هذا النهج ، يتم كروماتوغراف حجم صغير من المستخلص الذي تم التحقيق فيه بالتوازي مع العمود الذي يحتوي على الهدف المعطل الذي تم التحقيق فيه وعمود التحكم السلبي CMAC. يختلف هذان العمودان في التعبير عن الهدف ، وبالتالي فإن أي اختلافات في أنماط الاحتفاظ بالجزيئات الفردية ترجع إلى الطبيعة المحددة للتفاعلات مع الأهداف التي تم التحقيق فيها على عمود CMAC الذي يحتوي على هذه TMPs. يتم جمع الكسور الموقوتة من كلا العمودين وتركيزها وتحليلها لاحقا على عمود C18. تتم مقارنة الكروماتوغرام الذي تم الحصول عليه ، ويتم تصنيف المركبات التي تمثلها القمم المحتفظ بها بالمثل على كلا العمودين على أنها جزيئات متفاعلة غير محددة. يمثل وجود ذروة في الكسور اللاحقة على عمود CMAC مع المستقبلات المجمدة وعدم وجود قمة تمثل نفس المركب في الكسور المبكرة من العمود السلبي CMAC تفاعلا محددا للمركب مع الهدف المجمد. يمكن استهداف المركبات المحددة في هذه الخطوة للعزل والمزيد من الاختبارات ، دون الحاجة إلى إجراء تجزئة موجهة بيولوجيا. تم استخدام نهج كروماتوغرافيا الذروة المفقودة لتحديد المركبات التي تتفاعل على وجه التحديد مع مستقبلات TrkB من مستخلص غوتو كولا. تم تجزئة مستخلص غوتو كولا على كل من أعمدة TrkB و TrkB-NULL وتم تحليل المركبات الموجودة في هذه الكسور باستخدام UPLC-QTOF-MS. أدى التحقيق في الكروماتوغرام لكل من الكسور إلى تحديد مركب تم الاحتفاظ به بقوة على عمود TrkB (كسر 50-55 دقيقة) ، بينما تم التخلص منه مبكرا على عمود TrkB-NULL (كسر 0-5 دقائق) ، مما يشير إلى تفاعل محدد مع مستقبلات TrkB المجمدة (الشكل 9). يتم الآن استهداف المركب الذي يبلغ طوله حوالي 17.48 دقيقة (الشكل 9) للعزل والاختبار في الفحوصات الوظيفية.

Figure 1
الشكل 1. عمود CMAC تم تجميعه بشكل صحيح. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2. خطوات إعداد CMAC ووضع العلامات على الأجسام المضادة الفلورية للمستقبلات المجمدة. تمثيل تخطيطي لإعداد عمود CMAC (1-4) وتجربة وضع العلامات على الأجسام المضادة (5-8). (1) شظايا غشاء الخلية المتجانسة التي تحتوي على بروتين عبر الغشاء المستهدف ، TrkB. (2) شظايا غشاء الخلية القابلة للذوبان في بنية micellar. (3) شظايا غشاء الخلية المجمدة على سطح جسيمات IAM. (4) جزيئات IAM مع شظايا غشاء الخلية المجمدة معبأة في عمود زجاجي. (5) مستقبلات TrkB المجمدة في شظايا غشاء الخلية. (6) ربط الرباط الطبيعي BDNF بمستقبل TrkB الوظيفي. (7) ربط الأجسام المضادة الأولية بجزيئات BDNF. (8) ربط الأجسام المضادة الثانوية الموسومة بالفلوروفور بالأجسام المضادة الأولية مما يؤدي إلى التألق الأخضر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3. شل شظايا غشاء الخلية مع مستقبلات TrkB على جزيئات IAM. صور مجهرية متحدة البؤرة تظهر تجميد شظايا غشاء الخلية مع مستقبلات TrkB الوظيفية على جزيئات IAM. (أ) شظايا غشاء الخلية من خط الخلية SH-SY5Y TrkB-NULL التي تم تجميدها على جزيئات IAM بعد الحضانة باستخدام BDNF ، والأجسام المضادة الأولية ، والأجسام المضادة الثانوية التي تحمل علامة الفلوروفور. (ب) شظايا غشاء الخلية من خطوط خلايا الورم الأرومي العصبي SH-SY5Y التي تعبر عن TrkB التي تم تجميدها على جزيئات IAM بعد الحضانة بالأجسام المضادة الأولية والأجسام المضادة الثانوية التي تحمل علامة الفلوروفور بدون BDNF. (ج) شظايا غشاء الخلية من خطوط خلايا الورم الأرومي العصبي SH-SY5Y التي تعبر عن TrkB التي تم تجميدها على جزيئات IAM بعد الحضانة باستخدام BDNF ، والأجسام المضادة الأولية ، والأجسام المضادة الثانوية التي تحمل علامة الفلوروفور. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4. كروماتوغرام التقارب الأمامي من 7,8-DHF على عمود TrkB CMAC. كروماتوجرام أمامي بتركيزات متزايدة من 7,8-DHF على عمود TrkB CMAC ، حيث A - 1 mM ، B - 750 nM ، C - 500 nM ، و D - 300 nM. تم استخدام المخزن المؤقت لأسيتات الأمونيوم (10 mM ، الرقم الهيدروجيني 7.4) مع 5٪ من الميثانول كعامل إلغاء بمعدل تدفق 0.4 مل / دقيقة .

Figure 5
الشكل 5. كروماتوغرام التقارب الأمامي من 7,8-DHF على عمود TrkB CMAC غير الوظيفي. كروماتوجرام أمامي بتركيزات مختلفة من 7,8-DHF على عمود TrkB CMAC غير الوظيفي ، حيث A -1 μM ، B - 1 μM ، C - 750 nM ، و D - 500 nM. تم استخدام المخزن المؤقت لأسيتات الأمونيوم (10 mM ، الرقم الهيدروجيني 7.4) مع 5٪ من الميثانول كعامل إلغاء بمعدل تدفق 0.4 مل / دقيقة .

Figure 6
الشكل 6. كروماتوغرام التقارب الأمامي من 7,8-DHF على عمود TrkB-NULL CMAC. كروماتوجرام أمامي لزيادة تركيزات 7,8-DHF على عمود TrkB-null CMAC ، حيث A - 1 mM ، B - 750 nM ، C - 500 nM ، و D - 300 nM. تم استخدام المخزن المؤقت لأسيتات الأمونيوم (10 mM ، الرقم الهيدروجيني 7.4) مع 5٪ من الميثانول كعامل إغراق بمعدل تدفق 0.4 مل / دقيقة .

Figure 7
الشكل 7. كروماتوغرام التقارب الأمامي من 7,8-DHF مع 0.2٪ غوتو كولا استخراج على عمود TrkB CMAC. ملف تعريف الاستخلاص الجبهي التمثيلي ل (A) 500 نانومتر 7,8-DHF + 0.2٪ مستخلص غوتو كولا (10 ملغ / مل) و (B) 500 نانومتر 7,8-DHF على عمود CMAC TrkB. تم استخدام المخزن المؤقت لأسيتات الأمونيوم (10 mM ، الرقم الهيدروجيني 7.4) مع 5٪ من الميثانول كعامل إلغاء بمعدل تدفق 0.4 مل / دقيقة .

Figure 8
الشكل 8. كروماتوغرام التقارب الأمامي من 7,8-DHF مع 0.2٪ غوتو كولا استخراج على عمود TrkB-null CMAC. ملف تعريف التفريغ الأمامي التمثيلي ل (A) 500 نانومتر 7,8-DHF و (B) 500 نانومتر 7,8-DHF + 0.2٪ مستخلص غوتو كولا (10 ملغ / مل) على عمود TrkB-null CMAC. تم استخدام المخزن المؤقت لأسيتات الأمونيوم (10 mM ، الرقم الهيدروجيني 7.4) مع 5٪ من الميثانول كعامل إلغاء بمعدل تدفق 0.4 مل / دقيقة .

Figure 9
الشكل 9. UPLC-MS كروماتوغرام من كسور استخراج غوتو كولا. UPLC-MS كروماتوغرام من كسور استخراج غوتو كولا (A) منزوعة بين 0-5 دقائق من عمود TrkB-null CMAC و (C) مطفأة بين 50-55 دقيقة من عمود CMAC TrkB. تم تحديد مركب له وقت احتفاظ قدره 17.48 دقيقة موجود في كلا الكسرين ، كما هو مؤكد من خلال مطابقة أطياف الكتلة (B و D) كموثق TrkB محتمل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المخزن المؤقت للتجانس
1 تريس (هيدروكسي ميثيل) أمينوميثان هيدروكلوريد (تريس هيدروكلورايد) 50 مللي متر
2 كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) 100 مللي متر
3 كلوريد الكالسيوم اللامائي (CaCl2) 3 مللي متر
4 سداسي هيدرات كلوريد المغنيسيوم (MgCl2) 2 مللي متر
5 كلوريد البوتاسيوم (KCl) 5 مللي متر
6 فلوريد فينيل ميثان سلفونيل (PMSF) 0.1 مللي متر
7 بن زامدين 3 مللي متر
8 كوكتيل مثبط للأنزيم البروتيني (100X) (1/100)
9 الجلسرين 10%
10 الأدينوسين 5'-ثلاثي الفوسفات (ATP) هيدرات ملح الصوديوم 100 ميكرومتر
11 حمض الإيثيلين ديامين تتراسيتيك (EDTA) 5 مللي متر

الجدول 1. تكوين المخزن المؤقت للتجانس.

المخزن المؤقت للذوبان
1 تريس (هيدروكسي ميثيل) أمينوميثان هيدروكلوريد (تريس هيدروكلورايد) 50 مللي متر
2 كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) 100 مللي متر
3 كلوريد الكالسيوم اللامائي (CaCl2) 3 مللي متر
4 سداسي هيدرات كلوريد المغنيسيوم (MgCl2) 2 مللي متر
5 كلوريد البوتاسيوم (KCl) 5 مللي متر
6 فلوريد فينيل ميثان سلفونيل (PMSF) 0.1 مللي متر
7 بن زامدين 3 مللي متر
8 كوكتيل مثبط للأنزيم البروتيني (100X) (1/100)
9 الجلسرين 10%
10 الأدينوسين 5'-ثلاثي الفوسفات (ATP) هيدرات ملح الصوديوم 100 ميكرومتر
11 كولات الصوديوم 2%

الجدول 2. تكوين المخزن المؤقت للذوبان.

المخزن المؤقت لغسيل الكلى
1 تريس (هيدروكسي ميثيل) أمينوميثان هيدروكلوريد (تريس هيدروكلورايد) 50 مللي متر
2 كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) 100 مللي متر
3 كلوريد الكالسيوم اللامائي (CaCl2) 0.1 مللي متر
4 حمض الإيثيلين ديامين تتراسيتيك (EDTA) 5 مللي متر
5 فلوريد فينيل ميثان سلفونيل (PMSF) 0.1 مللي متر

الجدول 3. تكوين المخزن المؤقت لغسيل الكلى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

إن تحديد المركبات النشطة الموجودة في مخاليط معقدة من المستقلبات المتخصصة مهمة صعبة للغاية23. تقليديا ، يتم عزل المركبات الفردية ، ويتم اختبار نشاطها في فحوصات مختلفة. هذا النهج يستغرق وقتا طويلا ومكلفا وغالبا ما يؤدي إلى عزل وتحديد المركبات الأكثر وفرة وتميزا23. تعتمد فحوصات الفحص عالية الإنتاجية المستخدمة حاليا بشكل كبير على فحص مكتبات الكيمياء التوافقية ذات الأهداف المعروفة بالفعل وغير المصممة لتحديد وعزل المركبات النشطة بيولوجيا الموجودة في المخاليط المعقدة53.

يسمح CMAC بتحديد المركبات التي تستهدف TMPs23,24,54. في هذه التقنية ، يتم تجميد شظايا غشاء الخلية مع TMPs على سطح جزيئات الطور الثابت IAM23,24. CMAC هو نهج فريد من نوعه يسمح بتجميد شظايا غشاء الخلية مع البروتينات المستهدفة على الدعم الصلب الذي يقلد غشاء الخلية الفوسفوليبيد ثنائي الطبقة24. وهذا يسمح بالحفاظ على وظائف أهداف البروتين المجمدة ويوفر ما يقرب من الظروف الفسيولوجية أثناء استخدام CMAC لتحديد الجزيئات الصغيرة التي تتفاعل مع TMPs. يوفر CMAC ميزة الفرص لاكتشاف سقالات كيميائية جديدة من مكتبات المنتجات الطبيعية الفريدة ، والتي لا يمكن اختبارها باستخدام أي من الفحوصات الأخرى المستخدمة حاليا23 . يسمح النهج المقترح بتحديد المركبات التي تتفاعل مع TMPs دون الكشف عن طبيعة هذا التفاعل. يجب التحقق من طريقة التفاعل (التفاعل الألوستيري أو التقويمي ؛ التثبيط أو التنشيط) باستخدام الفحوصات الوظيفية القائمة على الخلايا. يمكن أيضا استخدام CMAC مع أهداف البروتين المجمدة في توصيف الديناميكا الدوائية (مثل ثابت التفكك ، Kd) أو تحديد حركية الربط (kon and koff) لروابط الجزيئات الصغيرة التي تتفاعل مع الهدف وكذلك في عملية توصيف مواقع الربط على البروتين المثبت24 . على الرغم من أن CMAC يسمح فقط بتحديد المركبات المرتبطة ب TMPs ، إلا أنه نهج مبتكر يسرع بشكل كبير الخطوة الأولى في خط أنابيب اكتشاف الأدوية ، لأنه لا يتطلب تنقية المركبات ، والتي كانت حاليا عنق الزجاجة الرئيسي في عملية اكتشاف الأدوية من المخاليط الطبيعية.

على الرغم من أن البروتوكول المقدم يركز على تجميد مستقبل واحد عبر الغشاء (TrkB) ، إلا أنه يمكن استخدام تقنية CMAC في إعداد أعمدة ذات أهداف أخرى. أحد الجوانب الحاسمة لإعداد CMAC هو اختيار خط الخلية أو الأنسجة التي تستخدم لعزل شظايا غشاء الخلية. إذا تم استخدام الأعمدة في فحص المخاليط المعقدة للمركبات التي تتفاعل مع المستقبلات المجمدة ، ينصح باستخدام خطوط الخلايا التي تبالغ في التعبير عن البروتين المستهدف. سيؤدي استخدام مثل هذا الخط الخلوي إلى عدد أكبر من الأهداف المجمدة ويزيد من فرصة تحديد المركبات ذات التقارب الأقل نحو الهدف أو الجزيئات الأقل وفرة. إذا ركز المرء على توصيف البروتين المعطل ، فمن المستحسن استخدام خط خلية أصلي ، حيث قد تختلف التعديلات اللاحقة للترجمة التي يخضع لها البروتين وكذلك بيئة الدهون الفوسفاتية اختلافا كبيرا في خط الخلية المنقولة.

بعض جوانب عزل غشاء الخلية وتثبيته على جزيئات IAM حاسمة وقد تتطلب تعديلات اعتمادا على نوع المستقبل أو مصدر البروتين. لمنع الانقسام البروتيني للبروتينات المجمدة ، من الضروري استخدام مثبطات الأنزيم البروتيني المناسبة في مخازن التجانس والذوبان. يوصى بإجراء بحث في الأدبيات لتحديد مثبطات الأنزيم البروتيني المطلوبة. في عملية تحسين البروتوكول ، قررنا أن إضافة ATP و glycerol تزيد من عدد مواقع الربط (Bmax) على أعمدة CMAC عند شل TrkB. قد تكون العوامل المساعدة الأخرى ضرورية عند تحسين تجميد أنواع أخرى من الأهداف عبر الغشاء24. حاليا ، نحن نحقق في إضافة الكوليسترول في عملية تجميد TrkB ، حيث تم العثور مؤخرا على الكوليسترول لتعديل آثار روابط TrkB48. تم الإبلاغ سابقا عن أن إضافة الكوليسترول و / أو الدهون الأخرى قد تكون مطلوبة للحصول على أعمدة CMAC الوظيفية24.

يمكن استخدام أنواع مختلفة من أجهزة الكشف لمراقبة عمود اللواء بما في ذلك كاشف صفيف الصمام الثنائي للروابط ذات الكروموفورات أو مطياف الكتلة أو كاشف التدفق الراديوي للروابط المشعة.

تعد مراقبة استقرار أعمدة CMAC ذات أهمية حاسمة. قد تكون أعمدة CMAC مستقرة لمدة تصل إلى عدة أشهر ، اعتمادا على نوع البروتين المثبت ، وتكرار الاستخدام ، وظروف التخزين. يوصى بتخزين العمود في محلول أزيد الصوديوم بنسبة 0.05٪ في مخزن خلات الأمونيوم المخزن المؤقت عند 4 درجات مئوية إذا ظل العمود غير مستخدم لأكثر من أسبوع. من المهم غسل العمود جيدا باستخدام مخزن خلات الأمونيوم المخزن المؤقت بعد فترات أطول قبل محاولة استخدامه. ينصح بمراقبة وظائف العمود عن طريق حقن تركيز محدد من رباط علامة أسبوعيا.

على الرغم من المزايا العديدة ، فإن تقنية CMAC لديها العديد من القيود التي يجب مراعاتها عند استخدام الأعمدة في مساعي اكتشاف الأدوية. أولا ، يتناقص عدد الأهداف عبر الغشاء المجمدة بمرور الوقت ، وبالتالي يوصى بمراقبة العدد الإجمالي لمواقع الربط أسبوعيا24. أحد أسباب هذا الانخفاض هو نتيجة لعملية التجميد التي تستند إلى الامتزاز ولا تنطوي على إدخال روابط تساهمية. يمكن الاحتفاظ بالمركبات المحبة للدهون بقوة على أعمدة CMAC بسبب الارتباط غير المحدد الكبير بسطح IAM والطبقات الثنائية الفوسفاتية. هذا يزيد بشكل كبير من وقت التحليل الذي يقلل من الإنتاجية. عملية إعداد عمود CMAC خاصة بخط الخلية وتتطلب فهما شاملا لطبيعة البروتينات المجمدة ، مما يجعلها أقل ملاءمة للأهداف الأقل تميزا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

تتعاون Lukasz Ciesla مع Regis Technologies ، مزود IAM. كمبيوتر شخصي. جسيمات DD2.

Acknowledgments

تم دعم Z.C.A. من قبل مجلس البحوث العلمية والتكنولوجية في تركيا (TUBITAK) 2219- برنامج زمالة أبحاث ما بعد الدكتوراه الدولي. تم دعم الأبحاث الواردة في هذا المنشور من قبل المركز الوطني للطب التكميلي والتكاملي التابع للمعاهد الوطنية للصحة تحت رقم الجائزة 1R41AT011716-01. كما تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل الجمعية الأمريكية لمنحة بدء أبحاث العقاقير ، ومنحة ريجيس تكنولوجيز إلى L.C. المحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحدهم ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
7-8 Dihydroxyflavone hydrate Sigma-Aldrich D5446-10 mg ≥98% (HPLC)
Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate Sigma-Aldrich A2383-1 g
Ammonium acetate VWR Chemicals BDH BDH9204-500 g
BDNF antibody Invitrogen PA5-15198-400 μL Primary antibody; 2 mg/mL of concentration
Benzamidine hydrochloride hydrate Sigma-Aldrich B6506-25 g
Brain derived neurotrophic factor (BDNF) human Sigma-Aldrich B3795-10 μg Recombinant, expressed in E. coli, lyophilized powder, suitable for cell culture
Calcium chloride VWR Analytical BDH9224-1 kg
Cholic acid sodium salt Alfa Aesar J62050-100 g
Dounce homogenizer VWR 71000-516 40 mL, 285 mm (overall lenght), 32 x 140 mm (O.D. x H)
Ethanol Sigma-Aldrich 493511
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) VWR Analytical BDH-9232-500 g
Fetal bovine serum Sigma-Aldrich F2442-500 mL sterile-filtered, suitable for cell culture
G418 disulfate salt solution Sigma-Aldrich G8168-100 mL 50 mg/mL in H2O, 0.1 μm filtered, suitable for cell culture
Glycerol VWR Life Science E520-100 mL
Immobilized artificial membrane (IAM.PC.DD2) Regis Technologies, Inc. 1-771050-500
Magnesium chloride hexahydrate VWR Analytical BDH9244-500 mL
Methanol Sigma-Aldrich 322425
Nikon C2 DUVb Nikon Confocal laser scanning microscope
Normal goat serum (10%) Life Technologies 50197Z
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333-100 mL
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) Thermo Scientific 36978-5 g
Phosphate buffered saline (PBS) VWR Life Science K812-500 mL 1x
Potassium chloride VWR Chemicals BDH 0395-1 kg
Protease inhibitor cocktail VWR Life Science Ambreso M221-1 mL Proteomics grade, containing 50 mM AEBSF, 30 µM aprotonin, 1 mM bestatin, 1 mM E-64 and 1 mM leupeptin
RPMI-1640 medium Sigma-Aldrich R8758-500 mL with L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Secondary antibody goat anti-rabbit IgG (H+L) Invitrogen Alexa Flour Plus 488 A32731
SH-SY5Y Neuroblastoma cell lines expressing Trk-B Kerafast ECP007
SH-SY5Y Trk-NULL cell line Kerafast ECP005
Snake skin dialysis tubing Thermo Scientific 88245 10K MWCO, 35 mm dry I.D.
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002
Sodium chloride BDH VWR Analytical BDH9286-2.5 kg
Tricorn 5/20 column GE Healthcare 24-4064-08
Tris-HCl VWR Life Science 0497-1 kg
Trypsin-EDTA solution Sigma-Aldrich T4049-500 mL 0.25%, sterile-filtered, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thomford, N. E., et al. Natural Products for Drug Discovery in the 21st Century: Innovations for Novel Drug Discovery. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1578 (2018).
  2. Atanasov, A. G., Zotchev, S. B., Dirsch, V. M. International Natural Product Sciences Taskforce, Supuran, C.T. Natural products in drug discovery: advances and opportunities. Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (3), 200-216 (2021).
  3. Altmann, K. H. Drugs from the Oceans: Marine Natural Products as Leads for Drug Discovery. Chimia. 71 (10), 646-652 (2017).
  4. Bernardini, S., Tiezzi, A., Laghezza Masci, V., Ovidi, E. Natural products for human health: an historical overview of the drug discovery approaches. Natural Product Research. 32 (16), 1926-1950 (2018).
  5. DeCorte, B. L. Underexplored Opportunities for Natural Products in Drug Discovery. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (20), 9295-9304 (2016).
  6. Lee, J., Jo, D. G., Park, D., Chung, H. Y., Mattson, M. P. Adaptive cellular stress pathways as therapeutic targets of dietary phytochemicals: focus on the nervous system. Pharmacological Reviews. 66 (3), 815-868 (2014).
  7. Hornykiewicz, O. L-DOPA: from a biologically inactive amino acid to a successful therapeutic agent. Amino Acids. 23 (1-3), 65-70 (2002).
  8. Hoyer, D. Targeting the 5-HT system: Potential side effects. Neuropharmacology. 179, 108233 (2020).
  9. Nur, S., Adams, C. E. Chlorpromazine versus reserpine for schizophrenia. The Cochrane Database of Systematic Reviews. 4, (2016).
  10. Chung, H. Y., et al. Redefining Chronic Inflammation in Aging and Age-Related Diseases: Proposal of the Senoinflammation Concept. Aging and Disease. 10 (2), 367-382 (2019).
  11. Fitzgerald, K. N., et al. Potential reversal of epigenetic age using a diet and lifestyle intervention: a pilot randomized clinical trial. Aging. 13 (7), 9419-9432 (2021).
  12. Zhao, L., Lee, J. Y., Hwang, D. H. Inhibition of pattern recognition receptor-mediated inflammation by bioactive phytochemicals. Nutrition Reviews. 69 (6), 310-320 (2011).
  13. Corbi, G., et al. Dietary Phytochemicals in Neuroimmunoaging: A New Therapeutic Possibility for Humans? Frontiers in Pharmacology. 7, 364 (2016).
  14. Davinelli, S., et al. Dietary phytochemicals and neuro-inflammaging: from mechanistic insights to translational challenges. Immunity & Ageing: I & A. 13, 16 (2016).
  15. Ostan, R., et al. Inflammaging and cancer: a challenge for the Mediterranean diet. Nutrients. 7 (4), 2589-2621 (2015).
  16. Martucci, M., et al. Mediterranean diet and inflammaging within the hormesis paradigm. Nutrition Reviews. 75 (6), 442-455 (2017).
  17. Szarcvel Szic, K., Declerck, K., Vidakovic, M., Vanden Berghe, W. From inflammaging to healthy aging by dietary lifestyle choices: is epigenetics the key to personalized nutrition. Clinical Epigenetics. 7 (1), 33 (2015).
  18. Dean, E., Gormsen Hansen, R. Prescribing optimal nutrition and physical activity as "first-line" interventions for best practice management of chronic low-grade inflammation associated with osteoarthritis: evidence synthesis. Arthritis. , 560634 (2012).
  19. Ruiz-Núñez, B., Pruimboom, L., Dijck-Brouwer, D. A., Muskiet, F. A. Lifestyle and nutritional imbalances associated with Western diseases: causes and consequences of chronic systemic low-grade inflammation in an evolutionary context. TheJournal of Nutritional Biochemistry. 24 (7), 1183-1201 (2013).
  20. Agarwal, P., et al. MIND Diet Associated with Reduced Incidence and Delayed Progression of Parkinsonism in Old Age. The Journal of Nutrition, Health & Aging. 22 (10), 1211-1215 (2018).
  21. Morris, M. C., et al. MIND diet associated with reduced incidence of Alzheimer's Disease. Alzheimer's & Dementia: The Journal of the Alzheimer's Association. 11 (9), 1007-1014 (2015).
  22. Franceschi, C., Garagnani, P., Parini, P., Giuliani, C., Santoro, A. Inflammaging: a new immune-metabolic viewpoint for age-related diseases. Nature Reviews. Endocrinology. 14 (10), 576-590 (2018).
  23. Ciesla, L., Moaddel, R. Comparison of analytical techniques for the identification of bioactive compounds from natural products. Natural Product Reports. 33 (10), 1131-1145 (2016).
  24. Moaddel, R., Wainer, I. W. The preparation and development of cellular membrane affinity chromatography columns. Nature Protocols. 4 (2), 197-205 (2009).
  25. Ferrer, I., et al. BDNF and full-length and truncated TrkB expression in Alzheimer disease. Implications in therapeutic strategies. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 58 (7), 729-739 (1999).
  26. Numakawa, T., Odaka, H., Adachi, N. Actions of Brain-Derived Neurotrophin Factor in the Neurogenesis and Neuronal Function, and Its Involvement in the Pathophysiology of Brain Diseases. International Journal of Molecular Sciences. 19 (11), 3650 (2018).
  27. Lima Giacobbo, B., et al. Brain-Derived Neurotrophic Factor in Brain Disorders: Focus on Neuroinflammation. Molecular Neurobiology. 56 (5), 3295-3312 (2019).
  28. Wang, Z. H., et al. Deficiency in BDNF/TrkB Neurotrophic Activity Stimulates δ-Secretase by Upregulating C/EBPβ in Alzheimer's Disease. Cell Reports. 28 (3), 655-669 (2019).
  29. Devi, L., Ohno, M. TrkB Reduction Exacerbates Alzheimer's Disease-like Signaling Aberrations and Memory Deficits without Affecting beta-Amyloidosis in 5XFAD Mice. Translational Psychiatry. 5 (5), 562 (2015).
  30. Jiao, S. S., et al. Brain-derived Neurotrophic Factor Protects against Tau-related Neurodegeneration of Alzheimer's Disease. Translational Psychiatry. 6 (10), 907 (2016).
  31. Ng, T., Ho, C., Tam, W., Kua, E., Ho, R. C. Decreased Serum Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) Levels in Patients with Alzheimer's Disease (AD): A Systematic Review and Meta-Analysis. International Journal of Molecular Sciences. 20 (2), 257 (2019).
  32. Amidfar, M., de Oliveira, J., Kucharska, E., Budni, J., Kim, Y. K. The Role of CREB and BDNF in Neurobiology and Treatment of Alzheimer's Disease. Life Sciences. 257, 118020 (2020).
  33. Atasoy, I. L., et al. Both Secreted and the Cellular Levels of BDNF Attenuated due to Tau Hyperphosphorylation in Primary Cultures of Cortical Neurons. Journal of Chemical Neuroanatomy. 80, 19-26 (2017).
  34. Rosa, E., et al. Tau Downregulates BDNF Expression in Animal and Cellular Models of Alzheimer's Disease. Neurobiology of Aging. 48, 135-142 (2016).
  35. Xiang, J., et al. Delta-secretase-cleaved Tau Antagonizes TrkB Neurotrophic Signalings, Mediating Alzheimer's Disease Pathologies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (18), 9094-9102 (2019).
  36. Giuffrida, M. L., Copani, A., Rizzarelli, E. A Promising Connection between BDNF and Alzheimer's Disease. Aging. 10 (8), 1791-1792 (2018).
  37. Ando, S., et al. Animal Model of Dementia Induced by Entorhinal Synaptic Damage and Partial Restoration of Cognitive Deficits by BDNF and Carnitine. Journal of Neuroscience Research. 70 (3), 519-527 (2002).
  38. Fischer, D. L., Sortwell, C. E. BDNF Provides Many Routes Toward STN DBS-Mediated Disease Modification. Movement Disorders. Official Journal of the Movement Disorder Society. 34 (1), 22-34 (2019).
  39. Zhang, F., Kang, Z., Li, W., Xiao, Z., Zhou, X. Roles of Brain-derived Neurotrophic Factor/Tropomyosin-related Kinase B (BDNF/TrkB) Signalling in Alzheimer's Disease. Journal of Clinical Neuroscience: Official Journal of the Neurological Society of Australasia. 19 (7), 946-949 (2012).
  40. Pilakka-Kanthikeel, S., Atluri, V. S., Sagar, V., Saxena, S. K., Nair, M. Targeted Brain Derived Neurotropic Factors (BDNF) Delivery across the Blood-Brain Barrier for Neuro-protection using Magnetic Nano Carriers: An In-vitro Study. PLoS One. 8 (4), 62241 (2013).
  41. Jang, S. W., et al. A Selective TrkB Agonist with Potent Neurotrophic Activities by 7,8-Dihydroxyflavone. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (6), 2687-2692 (2010).
  42. Todd, D., et al. A Monoclonal Antibody TrkB Receptor Agonist as a Potential Therapeutic for Huntington's Disease. Plos One. 9 (2), 87923 (2014).
  43. Liu, X., et al. Optimization of a Small Tropomyosin-Related Kinase B (TrkB) Agonist 7,8-Dihydroxyflavone Active in Mouse Models of Depression. Journal of Medicinal Chemistry. 55 (19), 8524-8537 (2012).
  44. Liu, X., et al. Biochemical and Biophysical Investigation of the Brain-derived Neurotrophic Factor Mimetic 7,8-Dihydroxyflavone in the Binding and Activation of the TrkB Receptor. The Journal of Biological Chemistry. 289 (40), 27571-27584 (2014).
  45. Chen, L., Gao, X., Zhao, S., Hu, W., Chen, J. The Small-Molecule TrkB Agonist 7,8-Dihydroxyflavone Decreases Hippocampal Newborn Neuron Death After Traumatic Brain Injury. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 74 (6), 557-567 (2015).
  46. Liu, X., et al. Optimization of a Small Tropomyosin-related Kinase B (TrkB) Agonist 7,8-Dihydroxyflavone Active in Mouse Models of Depression. Journal of Medicinal Chemistry. 55 (19), 8524-8537 (2012).
  47. Zhang, Z., et al. 7,8-Dihydroxyflavone Prevents Synaptic Loss and Memory Deficits in a Mouse Model of Alzheimer's Disease. Neuropsychopharmacology: Official Publication of the American College of Neuropsychopharmacology. 39 (3), 638-650 (2014).
  48. Casarotto, P. C., et al. Antidepressant Drugs Act by Directly Binding to TRKB Neurotrophin Receptors. Cell. 184 (5), 1299-1313 (2021).
  49. Iyer, R., et al. Entrectinib is a potent inhibitor of Trk-driven neuroblastomas in a xenograft mouse model. Cancer letters. 372 (2), 179-186 (2016).
  50. Iyer, R., et al. Nanoparticle delivery of an SN38 conjugate is more effective than irinotecan in a mouse model of neuroblastoma. Cancer letters. 360 (2), 205-212 (2015).
  51. Ng, E. S., Chan, N. W., Lewis, D. F., Hindsgaul, O., Schriemer, D. C. Frontal Affinity Chromatography-Mass spectrometry. Nature Protocols. 2 (8), 1907-1917 (2007).
  52. Maciuk, A., Moaddel, R., Haginaka, J., Wainer, I. W. Screening of Tobacco Smoke Condensate for Nicotinic Acetylcholine Receptor Ligands using Cellular Membrane Affinity Chromatography Columns and Missing Peak Chromatography. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 48 (2), 238-246 (2008).
  53. Harvey, A. L., Edrada-Ebel, R., Quinn, R. J. The Re-emergence of Natural Products for Drug Discovery in the Genomics Era. Nature Reviews. Drug Discovery. 14 (2), 111-129 (2015).
  54. Ciesla, L., et al. Development and Characterization of the α3β4α5 Nicotinic Receptor Cellular Membrane Affinity Chromatography Column and Its Application for on line Screening of Plant Extracts. Journal of Chromatography A. 1431, 138-144 (2016).

Tags

الكيمياء الحيوية ، العدد 179 ،
أعمدة كروماتوغرافيا تقارب الغشاء الخلوي لتحديد مستقلبات النباتات المتخصصة التي تتفاعل مع مستقبلات تروبوميوسين كيناز B المجمدة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Arituluk, Z. C., Adhikari, B.,… More

Arituluk, Z. C., Adhikari, B., Maitra, U., Goodman, C., Ciesla, L. M. Cellular Membrane Affinity Chromatography Columns to Identify Specialized Plant Metabolites Interacting with Immobilized Tropomyosin Kinase Receptor B. J. Vis. Exp. (179), e63118, doi:10.3791/63118 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter