Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

İmmobilize Tropomiyozin Kinaz Reseptörü B ile Etkileşime Giren Özel Bitki Metabolitlerini Tanımlamak için Hücresel Membran Afinite Kromatografisi Sütunları

Published: January 19, 2022 doi: 10.3791/63118
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, The University of Alabama, 2Department of Pharmaceutical Botany, Faculty of Pharmacy, Hacettepe University

Summary

Protokol, fonksiyonel transmembran tropomiyozin kinaz reseptörü B proteinlerini içeren immobilize hücre zarı fragmanları ile hücre zarı afinite kromatografisi (CMAC) kolonlarının hazırlanmasını açıklar. CMAC kolonlarının, bu reseptörlerle etkileşime giren ve karmaşık doğal karışımlarda bulunan özel bitki metabolitlerinin tanımlanmasında kullanımı da açıklanmaktadır.

Abstract

Bitkiler, mantarlar, bakteriler ve deniz omurgasızları tarafından sentezlenen kimyasallar, yeni ilaç isabetleri ve kurşunları için zengin bir kaynak olmuştur. Tıbbi uygulamada yaygın olarak kullanılan statinler, penisilin, paklitaksel, rapamisin veya artemisinin gibi ilaçlar ilk önce tanımlanmış ve doğal ürünlerden izole edilmiştir. Bununla birlikte, biyolojik olarak aktif uzmanlaşmış metabolitlerin doğal kaynaklardan tanımlanması ve izole edilmesi zorlu ve zaman alıcı bir süreçtir. Geleneksel olarak, bireysel metabolitler, biyokütlenin ekstraksiyonunu takiben karmaşık karışımlardan izole edilir ve saflaştırılır. Daha sonra, izole moleküller biyolojik aktivitelerini doğrulamak için fonksiyonel testlerde test edilir. Burada, biyolojik olarak aktif bileşikleri doğrudan karmaşık karışımlardan tanımlamak için hücresel membran afinite kromatografisi (CMAC) sütunlarının kullanımını sunuyoruz. CMAC sütunları, doğal fosfolipid çift katmanlı ortamlarına gömülü immobilize fonksiyonel transmembran proteinleri (TMP'ler) ile etkileşime giren bileşiklerin tanımlanmasına izin verir. Bu, aktivitesi yeni tanımlanan küçük moleküllü ilaç adayı ile modüle etmeyi amaçlayan TMP'yi bilmeyi gerektiren hedefli bir yaklaşımdır. Bu protokolde, çok sayıda sinir sistemi bozukluğu için ilaç keşfi için uygun bir hedef olarak ortaya çıkan immobilize tropomiyozin kinaz reseptörü B (TrkB) ile CMAC kolonlarının hazırlanmasına yönelik bir yaklaşım sunuyoruz. Bu makalede, CMAC kolonunu, TrkB reseptörlerini aşırı eksprese eden nöroblastom hücre hatları kullanılarak immobilize TrkB reseptörleri ile birleştirmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Ayrıca, kolonun işlevselliğini ve TrkB reseptörleriyle etkileşime giren özel bitki metabolitlerinin tanımlanmasında kullanımını araştırmak için yaklaşımı sunuyoruz.

Introduction

Botanik karışımlar, farmakolojik olarak aktif bileşikler1 bakımından zengindir ve yeni ilaç isabetlerinin tanımlanması için iyi bir kaynak görevi görür ve 2,3,4,5'e yol açar. Doğal ürünlerden yeni ilaçların keşfi verimli bir yaklaşım olmuştur ve şu anda onaylanmış birçok ilaç, ilk olarak doğada tanımlanan bileşiklerden kaynaklanmaktadır. Doğal bileşiklerin kimyasal çeşitliliğinin, kimyasal olarak sentezlenmiş moleküllerin insan yapımı kütüphaneleri ile eşleştirilmesi zordur. Birçok doğal bileşik, insan protein hedefleriyle etkileşime girer ve modüle eder ve evrimsel olarak optimize edilmiş ilaç benzeri moleküller olarak düşünülebilir6. Bu doğal bileşikler, nörolojik bozukluklarda kullanılmak üzere ilaç kurşun tanımlaması için özellikle uygundur6. Alzheimer hastalığının (AD) yönetimi için şu anda FDA onaylı ilaçlardan ikisi doğal alkaloitlerden türetilmiştir, yani: galantamin ve rivastigmin (fizikostigmin türevi)6. Şu anda Parkinson hastalığı için en sık reçete edilen ilaç olan L-DOPA, ilk olarak geniş fasulyeden (Vicia faba L.) tanımlanmıştır. 7. Pergolid ve lisürid, dopaminerjik reseptör agonistleri, parazitik mantar Claviceps purpurea8'den doğal ergot alkaloidlerinin türevleridir. Hint yılan kökünden izole edilmiş bir alkaloid olan Reserpin (Rauvolfia serpentina (L.) Benth. ex Kurz) ilk antipsikotik ilaçlardan biriydi9. Son zamanlarda, düzensiz immün yanıt ve sistemik inflamasyon, majör depresif bozukluk veya nörodejeneratif hastalıklar gibi çok sayıda nörolojik rahatsızlığın gelişimi ile ilişkilendirilmiştir10. Diğer yaşam tarzı müdahaleleriyle birlikte bitki bazlı bir diyetin yaşlılarda bilişsel ve işlevsel yetenekleri geliştirdiği bulunmuştur 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Triterpenlere ve polifenollere ait bazı elektrofilik moleküllerin hem in vitro hem de in vivo modellerde inflamatuar yanıtları modüle ettiği bulunmuştur12. Örneğin, α.β doymamış karbonil (örneğin, kurkumin, sinnamaldehit) veya izotiyosiyanat grubu (örneğin, sülforafan) içeren doğal bileşikler, murin interlökin-3 bağımlı pro-B hücre hattında pro-inflamatuar sitokinlerin aşağı akış sentezini inhibe eden Toll benzeri reseptör-4 (TLR4) dimerizasyonuna müdahale eder12,22 . Epidemiyolojik kanıtlar, karmaşık gıda matrislerinde bulunan diyet fitokimyasallarının da yeni ilaç kurşunlarının uygulanabilir bir kaynağını oluşturabileceğini güçlü bir şekilde göstermektedir6.

Bitki bazlı gıdalar da dahil olmak üzere bitki özlerinde bulunan biyolojik olarak aktif moleküllerin tanımlanmasındaki en büyük engellerden biri, araştırılan örneklerin karmaşıklığıdır. Geleneksel olarak, bireysel bileşikler izole edilir, saflaştırılır ve daha sonra biyolojik aktivite için test edilir. Bu yaklaşım genellikle en bol ve iyi karakterize edilen bileşiklerin tanımlanmasına yol açar. Tanımlanmış bir moleküler hedef olmadan fenotipik ilaç keşif yaklaşımları, karmaşık karışımların biyo-kılavuzlu fraksiyonasyonuna dayanır23. Bu yaklaşımda, bir ekstrakt, daha sonra fenotipik tahlillerde test edilen daha az karmaşık alt fraksiyonlara bölünür. Aktif bileşiklerin izolasyonu ve saflaştırılması, tahlilde doğrulanan biyolojik aktivite tarafından yönlendirilir. Belirli bir ilaç hedefinin kimliğinin bilinmesi, karmaşık karışımlarda bulunan farmakolojik olarak aktif bileşiklerin tanımlanmasını önemli ölçüde hızlandırabilir. Bu yaklaşımlar genellikle moleküler hedefin, örneğin bir enzimin, manyetik boncuklar gibi katı bir yüzeyde immobilizasyonuna dayanır23. Hareketsiz hedefler daha sonra tarama deneylerinde kullanılır ve hedef ile etkileşime giren bileşiklerin izolasyonu ile sonuçlanır. Bu yaklaşım, sitozolik proteinleri hedef alan bileşiklerin tanımlanmasında yaygın olarak kullanılmasına rağmen, transmembran proteinleri (TMP'ler) ile etkileşime giren kimyasalların tanımlanmasında daha az yaygın olarak uygulanmıştır.23. TMP'lerin immobilizasyonundaki ek bir zorluk, proteinin aktivitesinin hücre zarı fosfolipitleri ve kolesterol23,24 gibi çift katmandaki diğer moleküllerle etkileşimine bağlı olmasından kaynaklanmaktadır. Transmembran hedefini hareketsiz hale getirmeye çalışırken proteinler ve doğal fosfolipid çift katmanlı ortamları arasındaki bu ince etkileşimleri korumak önemlidir.

Hücresel membran afinite kromatografisinde (CMAC) hücre zarı fragmanları ve saflaştırılmış proteinler değil, yapay membran (IAM) sabit faz parçacıkları23 üzerinde hareketsiz hale getirilir. IAM durağan fazları, fosfatidilkolin analoglarının silika üzerine kovalent olarak bağlanmasıyla hazırlanır. Son zamanlarda, serbest amin ve silanol gruplarının uçtan kapatıldığı yeni IAM durağan faz sınıfları geliştirilmiştir (IAM. Kişisel bilgisayar. DD2 parçacıkları). CMAC kolonları sırasında hücre zarı fragmanları hazırlanması, adsorpsiyon yoluyla IAM parçacıklarının yüzeyine hareketsiz hale getirilir.

CMAC sütunları, iyon kanalları (örneğin, nikotinik reseptörler), GPCR'ler (örneğin, opioid reseptörleri), protein taşıyıcıları (örneğin, p-glikoprotein) vb. dahil olmak üzere farklı TMP sınıflarını immobilize etmek için bugüne kadar kullanılmıştır. İmmobilize protein hedefleri, farmakodinamiklerin karakterizasyonunda (örneğin, ayrışma sabiti, Kd) veya hedefle etkileşime giren küçük moleküllü ligandların bağlanma kinetiğinin (kaçık ve kkapalı) belirlenmesinde ve ayrıca karmaşık matrislerde bulunan potansiyel yeni ilaç uçlarının tanımlanması sürecinde kullanılmıştır24 . Burada, çok sayıda sinir sistemi bozukluğu için ilaç keşfi için uygun bir hedef olarak ortaya çıkan immobilize tropomiyozin kinaz reseptörü B (TrkB) ile CMAC kolonlarının hazırlanması sunulmaktadır.

Önceki çalışmalar, beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF) / TrkB yolunun aktivasyonunun, AD veya majör depresif bozukluk25,26,27,28 gibi bazı nörolojik rahatsızlıkların iyileşmesi ile ilişkili olduğunu göstermiştir. BDNF düzeylerinin ve reseptör TrkB ekspresyonunun AD'de azaldığı, benzer azalmaların MS29 hayvan modellerinde hipokampal fonksiyonu bozduğu bildirilmiştir. AD hastalarının serum ve beyninde BDNF düzeylerinde azalma bildirilmiştir30,31,32. Tau aşırı ekspresyonu veya hiperfosforilasyonun, primer nöronlarda BDNF ekspresyonunu aşağı regüle ettiği ve AD hayvan modellerinde33,34,35 olduğu bulunmuştur. Ek olarak, BDNF'nin β-amiloid kaynaklı nörotoksisite in vitro ve in vivo36 üzerinde koruyucu etkileri olduğu bildirilmiştir. Sıçan beynine doğrudan BDNF uygulanmasının bilişsel olarak bozulmuş hayvanlarda öğrenme ve hafızayı arttırdığı gösterilmiştir37. BDNF/TrkB, AD28,38 dahil olmak üzere nörolojik ve psikiyatrik bozuklukların iyileştirilmesinde geçerli bir hedef olarak ortaya çıkmıştır. AD'de tedavilerin geliştirilmesi için BDNF / TrkB sinyal yolunu hedeflemek, potansiyel olarak hastalık hakkındaki anlayışımızı geliştirecektir39. Ne yazık ki, BDNF'nin kendisi zayıf farmakokinetik özellikleri ve olumsuz yan etkileri nedeniyle bir tedavi olarak kullanılamaz40. TrkB/BDNF yolaklarının küçük molekül aktivatörleri potansiyel TrkB ligandları 41,42,43 olarak araştırılmıştır. Test edilen küçük molekül agonistleri arasında, 7,8-dihidroksiflavonun (7,8-DHF), BDNF / TrkB yolunu41,44,45,46 aktive ettiği gösterilmiştir. 7,8-DHF'nin bir türevi (R13; 4-Oxo-2-fenil-4H-kromen-7,8-diyl bis (metilkarbamat)) şu anda AD47 için olası bir ilaç olarak değerlendirilmektedir. Son zamanlarda, birkaç antidepresanın TrkB'ye doğrudan bağlanarak ve BDNF sinyallemesini teşvik ederek çalıştığı ve TrkB'yi çeşitli nörolojik bozuklukları tedavi etmek için geçerli bir hedef olarak takip etmenin önemini vurguladığı gösterilmiştir48.

Protokol, işlevsel TrkB sütunu ve TrkB-NULL negatif kontrol sütununun birleştirilmesi işlemini açıklar. Kolonlar, bilinen bir doğal ürün küçük-moleküler ligand kullanılarak karakterize edilir: 7,8-DHF. Ek olarak, TrkB ile etkileşime giren bileşiklerin tanımlanması için bitki ekstraktını örnek olarak kullanarak karmaşık matrislerin taranması sürecini açıklıyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. SH-SY5Y nöroblastom hücrelerinin hücre kültürü (TrkB ve TrkB-NULL (ebeveyn) hücre hatları)

NOT: Kerafast'tan hücre hatları (SH-SY5Y Hücre Hattı (TrkB, BR6) ve SH-SY5Y Ebeveyn Hücre Hattı (TrkB NULL))49,50 adet satın alınmıştır. Kültürlenmiş hücreler, CMAC kolonlarının hazırlanmasında immobilize edilecek transmembran reseptörlerinin kaynağı olarak kullanılır. Aşağıdaki adımlarda, hücre zarı parçalarının nasıl elde edileceği ve işlevsel CMAC sütunlarının nasıl birleştirileceği açıklanmaktadır.

  1. 450 mL RPMI ortamı, 50 mL FBS, 5 mL penisilin / streptomisin çözeltisi ve 0.3 mg / mL genetikin (G418) karıştırılarak hazırlanan bir hücre kültürü ortamındaki hücreleri, nemli bir atmosferde 37 ° C'de 150 mm'lik bir hücre kültürü kabında% 5 CO2 ile büyütün.

2. Hücre hasadı

  1. Hücre geçişinden 3-4 gün sonra ulaşılan bir mikroskop kullanarak hücre akıcılığını (% 80-90) onaylayın.
  2. Hücre kültürü ortamını hücrelerin üstünden aspire edin ve hücreleri fosfat tamponlu salin (PBS, 1x, pH 7.4) ile iki kez yıkayın. PBS'yi çıkarın ve hücreleri ayırmak için 2 mL düşük konsantre tripsin (% 0.25) ekleyin.
  3. Tüm hücreleri tripsin çözeltisi ile eşit şekilde örtmek için plakayı yavaşça döndürün ve hücreleri% 5 CO 2 ile nemli bir atmosferde 37 ° C'de yaklaşık2 dakika boyunca inkübe edin. Ayrılan hücrelere 8 mL hücre kültürü ortamı ekleyin ve ayrılmış hücreleri 50 mL'lik bir konik tüpe aktarın ve buzun üzerine yerleştirin.
  4. Hücre sayısını tahmin etmek için bir hemositometre kullanın (yaklaşık 3 x 107 hücre). Karışımda eşit hücre yoğunluğu elde etmek için yukarı ve aşağı pipetle pipetleyerek hücre süspansiyonunu karıştırın. Kapak kapağının altına 10 μL hücre süspansiyonu yerleştirin ve hücreleri 40x hedefi kullanarak mikroskop altında sayın.

3. Hücre homojenizasyonu

  1. Aşağıdaki proteaz inhibitörlerinin stok çözeltilerini hazırlayın: benzamidin (200 mM), fenilmetilsülfonil florür (PMSF, 10 mM) ve 4-(2-Aminoetil) benzensülfonil florür hidroklorür (AEBSF), aprotinin, bestatin ve löpeptin içeren ticari olarak temin edilebilen proteaz inhibitörleri kokteyli (100x konsantrasyon).
    DİKKAT: PMSF sadece duman davlumbazının içinde kullanılmalıdır.
    1. 120 mg benzamidini 5 mL ultra saf deiyonize suda çözerek benzamidin stok çözeltisi (200 mM) hazırlayın. 4 ° C'de saklayın ve bir gün içinde kullanın. Her kullanımdan önce taze bir çözelti hazırlayın (önerilir).
    2. 10 mL etanol içinde 0,017 g PMSF'yi çözerek PMSF stok çözeltisini (10 mM) hazırlayın. - 20 °C'de saklayın.
    3. Ticari olarak temin edilebilen proteaz inhibitörü karışımını 1 mL ultra saf deiyonize suda çözerek proteaz inhibitörü kokteyli (100x) hazırlayın. İyice karıştırın ve kokteylin 200-300 μL'sini alın ve kullanmadan önce - 20 ° C'de saklayın.
  2. 55.114 mg ATP disodyum tuzu hidratını 1 mL deiyonize ultra saf suda çözerek ATP stok çözeltisini (100 mM) hazırlayın. İyice karıştırın ve karışımın 100 μL'sini alın ve kullanmadan önce - 20 ° C'de saklayın.
  3. 3.03 g tris (hidroksimetil) aminometan hidroklorür (Tris-HCl, 50 mM), 2.9 g sodyum klorür (NaCl, 100 mM), 0.22 g kalsiyum klorür susuz (CaCl 2, 3 mM), 0.2 g magnezyum klorür hekzahidrat (MgCl2,2 mM) ve 0.19 potasyum klorür (KCl, 5 mM) 500 mL ultra saf deiyonize suda çözerek tampon hazırlayın.
  4. Adım 3.3'te hazırlanan tamponun 17,3 mL'sini 0,3 mL (3 mM) benzamidin stok çözeltisi, 0,2 mL (0,1 mM) PMSF stok çözeltisi, 0,2 mL proteaz inhibitörü kokteyl karışımı, 20 μL (100 μM) ATP stok çözeltisi, 2 mL (%10) gliserol ve 0,029 g (5mM) EDTA ile karıştırarak homojenizasyon tamponunu hazırlayın (Tablo 1). Hidroklorik asit çözeltisi kullanarak pH'ı 7.4'e ayarlayın.
  5. Adım 2.3'te 4 ° C'de toplanan hücreleri 400 x g'de 5 dakika boyunca döndürün. Süpernatantı çıkarın ve kalan hücre peletini 10 mL buz gibi soğuk PBS (1x, pH 7.4) ile yıkayın. Hücreleri 400 x g'da 5 dakika boyunca 4 ° C'de tekrar döndürün.
  6. Süpernatantı atın ve adım 3.4'te hazırlanan 20 mL homojenizasyon tamponu ile değiştirin. Konik tüpü buzun üzerine yerleştirin.
  7. Hücre süspansiyonunu 40 mL Dounce homojenizatör doku öğütücüye aktarın ve buzun üzerine yerleştirin. Süspansiyonu manuel olarak, buz üzerinde, 40 yukarı ve aşağı havane darbesi kullanarak homojenize edin. Homojenize hücre süspansiyonunu 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın.
  8. Homojenatı 4 °C'de 400 x g'de 7 dakika boyunca santrifüj yapın. Peleti atın ve süpernatantı yeni bir konik tüpe aktarın ve 47900 x g'de 30 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüj yapın. Hücre zarı peletini kaydedin ve süpernatanı atın.

4. Hücre zarı çözünürlüğü

  1. Adım 3.3'te yapılan tampon çözeltisinin 8.7 mL'sini 0.1 mL (0.1 mM) PMSF stok çözeltisi, 0.15 mL (3 mM) benzamidin stok çözeltisi, 0.1 mL proteaz inhibitörü kokteyli, 10 μL (100 μM) ATP stok çözeltisi, 1 mL (% 10) gliserol ve 0.2 g (% 2) sodyum kolat ile karıştırarak çözündürme tamponunu hazırlayın (Tablo 2).
  2. Çözündürme tamponunu, adım 3.8'de elde edilen hücre zarı parçaları ile konik tüpe aktarın ve peleti yeniden askıya alın. Elde edilen karışımı 18 saat boyunca 4 °C'de 150 rpm'de döndürün.
    NOT: Bu noktada, deney bir gecede hücre zarı pelet çözünürlüğü için duraklatılabilir.

5. IAM'de hücre zarı immobilizasyonu. Kişisel bilgisayar. DD2 parçacıkları

  1. 18 saat sonra, çözünürleştirme karışımını 4 ° C'de 47900 x g'de 30 dakika boyunca santrifüj edin.
  2. Süpernatantı saklayın ve peleti atın. 100 mg IAM ekleyin. Kişisel bilgisayar. DD2 parçacıkları, süpernatan, vortekse ve elde edilen süspansiyon karışımını 1 saat boyunca 4 °C'de 150 rpm'de döndürün.
  3. IAM üzerindeki hücre zarı parçalarının immobilizasyonunu kolaylaştırmak. Kişisel bilgisayar. DD2 parçacıkları aşağıda özetlendiği gibi diyaliz adımına ilerler.
    1. 24 g tris-HCl (50 mM), 23,4 g NaCl (100 mM), 0,06 g CaCl 2 (0,1 mM), 5,85 g EDTA (5 mM) ve 0,07 g PMSF( 0,1 mM; Tablo 3).
      NOT: PMSF suda çözünmez, bu nedenle önce küçük hacimli etanol içinde çözün ve daha sonra tamponla beherin içine yavaşça ekleyin.
    2. Hidroklorik asit çözeltisi ile pH'ı 7.4'e ayarlayın. Diyaliz adımına geçmeden önce tamponu en az 1 saat boyunca 4 °C'ye yerleştirin.
    3. 10 cm selüloz membran diyaliz tüpünü (10 K MWCO, 35 mm) keserek diyaliz tüpü hazırlayın ve IAM içeren süspansiyonu aktarın. Kişisel bilgisayar. DD2 parçacıkları ve hücre zarı parçaları diyaliz tüpüne girer. Diyaliz tüpünün her iki ucunu kapatmak için diyaliz tüp klipslerini kullanın.
    4. IAM'yi içeren diyaliz tüpünü yerleştirin. Kişisel bilgisayar. Diyaliz tamponunda DD2 sabit faz ve hafifçe karıştırırken 24 saat boyunca 4 ° C'de diyaliz.
    5. 24 saat sonra, diyaliz tüpünü taze hazırlanmış diyaliz tamponuna yerleştirin ve 24 saat daha diyalize devam edin.

6. CMAC sütun ambalajı

  1. IAM'yi yıkamak için kullanılacak amonyum asetat tamponunu (10 mM, pH 7.4) hazırlayın. Kişisel bilgisayar. DD2 partikülleri ve kolon karakterizasyon deneylerinde 0.7708 g amonyum asetat 1 L ultra saf deiyonize suda çözülür. Hidroklorik asit çözeltisi ile pH'ı 7.4'e ayarlayın.
  2. 48 saatlik diyalizden sonra, diyaliz tüpünü diyaliz tamponundan çıkarın ve diyaliz tüpünün içeriğini 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın.
  3. Karışımı 4 ° C'de 400 x g'da 5 dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatantı atın ve kalan peleti 10 mL amonyum asetat tamponu ile üç kez yıkayın, her yıkamadan sonra karışımı 400 x g'da 5 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüj edin.
  4. Üçüncü yıkamadan sonra, kalan peleti 1 mL amonyum asetat tamponunda yeniden askıya alın. İyice karıştırın ve CMAC kromatografi sütunu elde etmek için 5/20 cam sütunu paketlemek için elde edilen bulamacı kullanın.
  5. Sütunu paketlemek için, önce daha önce amonyum asetat tamponu ile ıslatılmış bir alt filtreyi filtre tutucuya yerleştirin. Filtre tutucuyu cam kolona takın ve tutucunun konumunu sabitlemek için kolon kapağını vidalayın. Kolonu dikey olarak bir parmak kelepçesine yerleştirin ve laboratuvar standına sabitleyin. Kolonun altına bir beher yerleştirin.
  6. Tek kanallı pipetleyici kullanarak, adım 6.4'te elde edilen bulamacın küçük bir hacmini cam kolona aktarın. Pipet ucunu cam sütun duvarına karşı tutarak malzemeyi yavaşça dökün. Başka bir bulamaç hacmi dökmeden önce ambalaj malzemesinin yerleşmesine izin verin.
  7. Paketleme işlemini hızlandırmak için, her adım arasında bir mikropipet kullanarak tamponu sabit yatağın üstünden çıkarın. Bulamacın 1 mL'si paketlenene kadar bu adımları tekrarlayın.
  8. Bir üst filtre yerleştirin ve adaptör ünitesini, Şekil 1'de gösterildiği gibi sabit fazın üzerinde kalan tampon kalmayacak şekilde vidalayın. Adaptör ünitesinin konumunu adaptör kilidi ile sabitleyin.
  9. Kolonu yüksek performanslı bir sıvı kromatografisi (HPLC) pompasına bağlayın, akış hızını 0,2 mL/dk'ya ayarlayın ve kolonları gece boyunca amonyum asetat tamponuyla yıkayın. Sütun artık karakterizasyon adımı için hazırdır. Kolonu, kullanana kadar 4 °C'de saklayın.
    NOT: Daha uzun süre depolama için (bir haftadan uzun süre kullanılmayan sütun) kolonu, amonyum asetat tamponunda% 0,05 sodyum azid çözeltisi ile çalıştırın ve 4 ° C'de saklayın.
    DİKKAT: Sodyum azid, ağızdan alındığında veya cilt yoluyla emildiğinde oldukça toksiktir; sadece duman başlığının altında kullanılmalıdır. Sodyum azid ile çalışırken laboratuvar önlüğü, güvenlik gözlükleri ve eldivenler (nitril tercih edilir) giydiğinizden emin olun.

7. CMAC sütun karakterizasyonu

  1. Konfokal mikroskopi ve BDNF bağlama
    1. IAM'yi hazırlayın. Pcc. Adım 1'den adım 6.4'e kadar olan talimatları izleyerek TrkB ve SH-SY5Y TrkB-NULL hücrelerini aşırı eksprese eden SH-SY5Y nöroblastom hücrelerinden ayrı olarak elde edilen immobilize hücre zarı fragmanlarına sahip DD2 sabit faz parçacıkları.
    2. Antikor boyamadan önce BDNF ile inkübe edilecek numuneler için, 10 μg BDNF'yi 100 μL ultra saf deiyonize suda çözerek BDNF stok çözeltisi hazırlayın. Çözeltiyi -20 °C'de saklayın.
      1. Ayrı 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerinde transfer, 100 μL IAM aliquot. Kişisel bilgisayar. TrkB'yi aşırı eksprese eden immobilize SH-SY5Y Nöroblastom hücreleri ve IAM'nin 100 μL aliquot'u ile DD2 kolon ambalaj malzemesi. Kişisel bilgisayar. Amonyum asetat tamponunda asılı duran immobilize SH-SY5Y TrkB-NULL hücreli DD2 kolonlu ambalaj malzemesi.
      2. Her tüpe 390 μL amonyum asetat tamponu, 10 μL BDNF stok çözeltisi ve 0,5 μL ATP stok çözeltisi (adım 3.2'de hazırlanan) ekleyin ve sallanarak oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
    3. Antikor boyamadan önce BDNF ile inkübe edilmeyecek örnekler için, 100 μL IAM aliquot aktarın. Kişisel bilgisayar. Amonyum asetat içinde 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine asılı TrkB'yi aşırı eksprese eden immobilize SH-SY5Y Nöroblastom hücrelerine sahip DD2 kolon ambalaj malzemesi.
    4. Her tüpe 400 μL amonyum asetat tamponu ve 0,5 μL ATP stok çözeltisi (adım 3.2'de hazırlanmış) ekleyin ve sallanarak oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
    5. Adım 7.1.2 ve 7.1.4'te hazırlanan numuneleri 4 ° C'de 10.000 x g'de 1 dakika boyunca döndürün ve süpernatanı atın.
    6. Elde edilen peletleri 10 dakika boyunca 500 μL amonyum asetat tamponu ile yıkayın ve 10.000 x g'da 1 dakika boyunca 4 ° C'de tekrar döndürün ve süpernatanı atın.
    7. Peletlerin her birine, 220 μL amonyum asetat tamponu,% 10 normal keçi serumunun 25 μL'si ve 5 μL primer anti-BDNF antikoru ekleyin. Sallanarak gece boyunca soğuk bir odada (4 ° C) inkübe edin.
    8. Kuluçka adımının tamamlanmasının ardından, karışımı 4 ° C'de 10.000 x g'de 1 dakika boyunca döndürün ve süpernatanı atın.
    9. Elde edilen peleti, 10 dakika boyunca% 1 hafif deterjan (örneğin, sodyum kolat) içeren amonyum asetat tamponu ile 3 kez yıkayın ve karışımları 4 ° C'de 10.000 x g'de 1 dakika boyunca döndürün ve süpernatanı atın.
    10. 900 μL amonyum asetat tamponu, 100 μL% 10 normal keçi serumu ve 1 μL florofor konjuge sekonjuge sekonder antikoru (1:1.000 seyreltme) karıştırarak ikincil antikor çözeltisi hazırlayın. Adım 7.1.9'da elde edilen peletlerin her birine 300 μL ikincil antikor çözeltisi ekleyin. ve sallanarak gece boyunca 4 ° C'de kuluçkaya yatırın.
    11. Karışımı 4 ° C'de 1 dakika boyunca 10.000 x g'de döndürün ve süpernatanı atın.
    12. Elde edilen peleti, 10 dakika boyunca% 1 hafif deterjan (örneğin, sodyum kolat) içeren amonyum asetat tamponu ile 3 kez yıkayın ve karışımı 4 ° C'de 10.000 x g'de 1 dakika boyunca döndürün ve süpernatanı atın.
    13. Elde edilen peletleri 50 μL amonyum asetat tamponunda yeniden askıya alın. Karışımların her birinin 20 μL'sini bir slayt üzerine yerleştirin ve bir kapak kayması ile örtün.
    14. IAM'yi görüntüleyin. Kişisel bilgisayar. Hareketsiz hücre zarı parçacıkları ile DD2 parçacıkları, katı hal lazer sistemi kullanılarak üretilen 488 nm'de uyarma ve 520 nm'de emisyon ile konfokal lazer tarama mikroskobu kullanılarak parçalanır. NA değeri 0,75 ve WD'si 0,35 mm olan 20x hedefi kullanın.
  2. İşaretleyici ligand olarak 7,8-DHF kullanan frontal afinite kromatografisi
    1. Bir CMAC sütununu bir diyot dizisi dedektörü ve/veya kütle spektrometresi ile bir HPLC sistemine bağlayın.
    2. % 5 metanol içeren amonyum asetat tamponunda 500 mL 1 mM 7,8-DHF çözeltisi hazırlayın.
    3. İşaretleyici ligandının (1 mM) sabit konsantrasyonunu CMAC sütunu boyunca oda sıcaklığında 0,4 mL/dak akış hızında pompalayın. Bir diyot dizisi algılama (DAD) (dalga boyu 254 nm) dedektörü veya kütle spektrometresi kullanarak elüsyon profilini izleyin (tek iyon izleme modunu kullanın; negatif iyonizasyon modunda m / z 253).
    4. Çalıştırma tamamlandıktan sonra kolon boyunca amonyum asetat tamponu çalıştırılarak gece boyunca yıkama gerçekleştirin.
    5. 7.2.2 numaralı adımları yineleyin. - 7.2.4. işaretleyici ligandın farklı konsantrasyonlarını (750 nM, 500 nM, 300 nM) kullanarak, sütunları her çalıştırmadan sonra gece boyunca yıkayın. Başka bir yerde ayrıntılı olarak incelendiği gibi, ligand Kd'yi hesaplamak için frontal afinite kromatografisini kullanın. 24,51
  3. Centella asiatica (L.) Urb ile yer değiştirme çalışmaları. (gotu kola) özü
    1. % 5 metanol ve% 0.2 sulu gotu kola ekstresi (10 mg / mL) içeren amonyum asetat tamponunda 500 mL 500 nM 7,8-DHF çözeltisi hazırlayın.
    2. İşaretleyici ligandının (500 nM) sabit konsantrasyonunu, ekstrakt ile kolon boyunca oda sıcaklığında 0,4 mL/dak akış hızında pompalayın. Bir DAD dedektörü (dalga boyu 254 nm) veya bir kütle spektrometresi kullanarak elüsyon profilini izleyin (tek iyon izleme modunu kullanın; negatif iyonizasyon modunda m / z 253).
    3. Çalıştırma tamamlandıktan sonra kolon boyunca amonyum asetat tamponu çalıştırılarak gece boyunca yıkama gerçekleştirin.
    4. 500 nM 7,8-DHF için elüsyon profillerini ve işaretleyici ligand yer değiştirmesini incelemek için çözeltiyi gotu kola özü ile çalıştırdıktan sonra elde edilen profilleri çizin.

8. Gotukola ekstraktından potansiyel TrkB bağlayıcılarını tanımlamak için eksik pik kromatografi yaklaşımı

  1. CMAC sütunlarında gotu kola ekstraktının fraksiyonasyonu
    1. CMAC TrkB ve TrkB-NULL sütunlarını ayrı ayrı bir HPLC sistemine bağlayın ve sütunların her birine 50 μL sulu gotu kola ekstraktı (10 mg / mL) enjekte edin. Oda sıcaklığında 0,4 mL/dak akış hızında kolon boyunca %5 metanol içeren pompa amonyum asetat tamponu (10 mM, pH 7,4).
    2. CMAC TrkB ve TrkB-NULL sütunlarından ayrı kesirleri aşağıdaki gibi toplayın: 0-5 dakika, 5-10 dakika, 10-15 dakika, 15-20 dakika, 20-25 dakika, 25-30 dakika, 30-35 dakika, 35-40 dakika, 40-45 dakika, 45-50 dakika, 50-55 dakika, 55-60 dakika.
    3. Elde edilen fraksiyonları dondurun ve liyofilize edin. Ultra performanslı sıvı kromatografisi ve kütle spektrometresi analizine geçmeden önce 50 μL metanofildeki liyofilize fraksiyonları yeniden askıya alın.
  2. Ultra performanslı sıvı kromatografisi kuadrupol uçuş süresi kütle spektrometresi (UPLC-QTOF-MS) gotu kola CMAC fraksiyonlarının analizi
    1. Madde 8.1.3'te elde edilen tüm kesirleri analiz edin. bir UPLC sistemi ile birleştirilmiş bir kütle spektrometresi kullanarak (UPLC-MSE analiz modu). C18 VanGuard ön sütunu (2,1 mm x 5 mm, 1,7 μm) ile C18 sütunu (2,1 x 50 mm, 1,7 μm) kullanarak kesirleri analiz edin.
    2. Kolonu mobil faz A (% 0.1 formik asitli su) ve B (% 0.1 formik asitli asetonitril) ile 0.3 mL / dak akış hızında kullanarak kolonu: 0.0 dk% 99 A% 1 B, 1.5 dk% 84 A% 16 B, 5.0 dk% 80 A% 20 B, 7.0 dakika% 75 A% 25 B, 10.0 dk %65 A %35 B, 20.0-24.0 dk 1% A %99 B, 25.0-29.0 dk %99 A %1 B.
    3. Her numune için enjeksiyon hacmini 3 μL'ye ayarlayın. MSE'yi çözünürlük pozitif ve negatif iyon modlarında, çarpışma enerjisi düşük enerji için 4V'ta ve yüksek enerji için 20-35 V'ta gerçekleştirin.
    4. Pozitif iyonizasyon modunda aşağıdaki ESI kaynak koşullarını kullanın: kılcal gerilim 1,5 kV, numune alma konisi 40 V, kaynak ofseti 80, kaynak sıcaklığı 100 °C, çözünme sıcaklığı 350 °C, koni gazı akışı 38,0 L/s, çözünme gazı 400 L/s.
    5. Negatif iyonizasyon modunda aşağıdaki ESI kaynak koşullarını kullanın: kılcal gerilim 1,45 kV, numune alma konisi 40 V, kaynak ofseti 80, kaynak sıcaklığı 110 °C, çözünme sıcaklığı 300 °C, koni gazı akışı 50,0 L/s, çözünme gazı akışı 652 L/s.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokolü takiben, iki CMAC kromatografik kolon birleştirildi: biri aşırı eksprese TrkB ile immobilize SH-SY5Y nöroblastom hücre zarı fragmanları ve diğeri SH-SY5Y TrkB-NULL hücre zarı fragmanları ile. Doğru şekilde monte edilmiş CMAC sütunu Şekil 1'de sunulmuştur ve hücre zarı fragmanı immobilizasyonunda yer alan adımlar Şekil 2'de sunulmuştur.

TrkB reseptörlerinin IAM üzerindeki immobilizasyonundan bu yana. Kişisel bilgisayar. DD2 kromatografik sabit faz daha önce denenmemişti, reseptörlerin başarılı immobilizasyonu bir marker ligand: 7,8-DHF kullanılarak antikor boyama ve frontal afinite kromatografisi ile doğrulandı. Antikor boyama deneyinin şematik bir temsili Şekil 2'de sunulmuştur. TrkB reseptörlerini aşırı eksprese eden nöroblastom hücre hattından elde edilen hücre zarı fragmanları ve TrkB reseptörleri (TrkB-NULL)) olmayan ebeveyn hücre hattından elde edilen hücre zarı fragmanları IAM üzerinde immobilize edildi. Kişisel bilgisayar. Optimize edilmiş protokolü kullanan DD2 parçacıkları. Daha sonra, immobilize hücre zarı fragmanlarına sahip parçacıklar BDNF (fizyolojik ligand) ve daha sonra primer ve floresan etiketli sekonder antikorlarla inkübe edildi (Şekil 2). Iam. Kişisel bilgisayar. DD2 partikülleri ile immobilize nöroblastom TrkB hücre zarı fragmanları ve BDNF varlığında floresan etiketli partiküller ile sonuçlanmıştır (Şekil 3C). TrkB-NULL hücre zarı kapsüllenmiş IAM partikülleri araştırıldığında (Şekil 3A) veya TrkB hücre zarı kapsüllenmiş IAM partikülleri durumunda BDNF kullanılmadığında (Şekil 3B) hiçbir floresan (zayıf arka plan floresansı hariç) gözlenmemiştir.

Küçük bir marker ligandın (7,8-DHF) immobilize TrkB reseptörlerine bağlanmasını karakterize etmek için frontal afinite kromatografisi 7,8-DHF'lik farklı konsantrasyonlarda yapıldı. Fonksiyonel bir CMAC sütunu üzerinde 7,8-DHF konsantrasyonlarını artıran tipik bir kromatogram Şekil 4'te sunulmuştur. 7,8-DHF'nin hareketsiz TrkB'ye spesifik bağlanması, marker ligandın retansiyon süresindeki konsantrasyona bağlı azalmalarla doğrulandı. Fonksiyonel olmayan bir CMAC kolonunda elde edilen frontal afinite kromatografisi sonuçları Şekil 5'te sunulmuştur. Marker ligandın tutulmasında konsantrasyona bağlı değişikliklerin olmaması, CMAC preparasyonundaki başarısız girişimi gösterir.

CMAC kolonuna enjekte edilen bileşikler sadece spesifik olarak etkileşime girmekle kalmaz, aynı zamanda IAM ile spesifik olmayan bir şekilde etkileşime girebilir. Kişisel bilgisayar. DD2 parçacıkları, immobilize hücre zarı fragmanlarının fosfolipit çift katmanı ve çift katmanda bulunan diğer proteinler. TrkB bağlayıcıları için karmaşık ekstraktların taranması işlemi sırasında CMAC sütunu ile spesifik olarak etkileşime girmeyen bileşikleri dışlamak için, hedeflenen proteini ifade etmeyen ebeveyn hücre hattının hücre zarı parçalarını hareketsiz hale getirerek CMAC negatif kontrol kolonunun hazırlanması önemlidir (bu durumda TrkB-NULL). Negatif CMAC TrkB-NULL kolonunda elde edilen frontal afinite kromatografisi sonuçları Şekil 6'da sunulmuştur.

Fonksiyonel CMAC sütunları, hedeflenen proteinin karakterizasyonu, bireysel bileşiklerin hareketsiz hedeflerle etkileşimlerinin incelenmesi (örneğin, ayrışma sabiti, Kd) veya bağlayıcı kinetiğin belirlenmesi (kaçık ve kkapalı) vb. gibi farklı amaçlar için kullanılabilir.24. Sütunlar ayrıca, TrkB reseptörlerine bağlanan bileşiklerin varlığı için bitki özleri gibi karmaşık örnekleri taramak için de kullanılabilir, bu nedenle potansiyel olarak TrkB agonistleri veya antagonistleri olarak işlev gören moleküller içerir. Bir ekstraktın potansiyel olarak hareketsiz reseptörlerle etkileşime giren bileşikler içerip içermediğini doğrulamak için basit bir yer değiştirme deneyi gerçekleştirilir. Gotu kola ekstresi ve fonksiyonel bir TrkB sütunu üzerinde 500 nM 7,8-DHF ile yapılan yarışma deneyinin sonucu Şekil 7'de sunulmuştur. % 0.2 sulu gotu kola ekstraktının (10 mg / mL) eklenmesi, agonist bağlanma bölgesi için rakip ligandların varlığını gösteren 7,8-DHF retansiyonunda önemli bir azalma ile sonuçlanmıştır. CMAC negatif TrkB-NULL sütununda gerçekleştirilen yer değiştirme deneyinin sonucu Şekil 8'de sunulmuştur. Bu sütundaki 7,8-DHF retansiyonunun azalmaması, CMAC TrkB-NULL sütunundaki fonksiyonel TrkB reseptörlerinin eksikliğini daha da doğrulamaktadır.

Özellikle hareketsiz hedeflerle etkileşime giren özel metabolitleri tanımlamak için, CMAC sütunları, yer değiştirme deneyini takiben eksik tepe kromatografisi52 adı verilen bir yaklaşımda kullanılır. Bu yaklaşımda, araştırılan ekstraktın küçük bir hacmi, araştırılan immobilize hedef ve CMAC negatif kontrol kolonunu içeren kolon üzerinde paralel olarak kromatografla incelenir. Bu iki sütun hedefin ifadesinde farklılık gösterir, bu nedenle bireysel moleküllerin tutma modellerindeki herhangi bir farklılık, bu TMP'leri içeren CMAC sütunundaki araştırılan hedeflerle etkileşimlerin spesifik doğasından kaynaklanmaktadır. her iki sütundan zamanlanmış fraksiyonlar toplanır, konsantre edilir ve daha sonra bir C18 sütunu üzerinde analiz edilir. Elde edilen kromatogramlar karşılaştırılır ve her iki sütunda benzer şekilde tutulan zirvelerle temsil edilen bileşikler, spesifik olarak etkileşime girmeyen moleküller olarak etiketlenir. İmmobilize reseptörlerle CMAC kolonunda daha sonraki fraksiyonlarda bir pikin varlığı ve CMAC negatif kolonunun erken fraksiyonlarında aynı bileşiği temsil eden bir pikin olmaması, bileşiğin immobilize edilmiş hedef ile spesifik etkileşimini temsil eder. Bu adımda tanımlanan bileşikler, biyo-kılavuzlu fraksiyonasyon yapmaya gerek kalmadan izolasyon ve daha ileri testler için hedeflenebilir. Eksik-tepe kromatografisi yaklaşımı, özellikle gotu kola ekstraktından TrkB reseptörleri ile etkileşime giren bileşikleri tanımlamak için kullanıldı. Gotu kola ekstresi hem TrkB hem de TrkB-NULL kolonlarda fraksiyone edildi ve bu fraksiyonlarda bulunan bileşikler UPLC-QTOF-MS kullanılarak analiz edildi. Fraksiyonların her birinin kromatogramlarının araştırılması, TrkB kolonunda (50-55 dakika fraksiyon) güçlü bir şekilde tutulan bir bileşiğin tanımlanmasına yol açarken, TrkB-NULL kolonunda (0-5 dakika fraksiyon) erken salınırken, hareketsiz TrkB reseptörleri ile spesifik etkileşimi gösterir (Şekil 9). ~ 17.48 dakikada salınan bileşik (Şekil 9) şimdi fonksiyonel tahlillerde izolasyon ve test için hedeflenmiştir.

Figure 1
Şekil 1. Doğru monte edilmiş CMAC kolonu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2. CMAC hazırlama adımları ve immobilize reseptörlerin floresan antikor etiketlemesi. Bir CMAC kolonunun hazırlanmasının (1-4) ve antikor etiketleme deneyinin (5-8) şematik gösterimi. (1) Hedeflenen transmembran proteini içeren homojenize hücre zarı fragmanları, TrkB. (2) Misel yapıda çözünür hücre zarı fragmanları. (3) IAM parçacıklarının yüzeyinde hareketsiz hale getirilmiş hücre zarı parçaları. (4) Bir cam kolon içine paketlenmiş hareketsiz hücre zarı parçalarına sahip IAM parçacıkları. (5) Hücre zarı fragmanlarında immobilize TrkB reseptörü. (6) Doğal ligand BDNF'nin fonksiyonel TrkB reseptörüne bağlanması. (7) Birincil antikorların BDNF moleküllerine bağlanması. (8) Florofor etiketli sekonder antikorların birincil antikorlara bağlanması yeşil floresan ile sonuçlanır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3. Hücre zarı fragmanlarının TrkB reseptörleri ile IAM partikülleri üzerine immobilizasyonu. IAM partikülleri üzerinde fonksiyonel TrkB reseptörleri ile hücre zarı fragmanlarının immobilizasyonunu gösteren konfokal mikroskopi görüntüleri. (A) SH-SY5Y TrkB-NULL hücre hattından hücre zarı fragmanları, BDNF, primer antikor ve florofor etiketli sekonder antikor ile inkübasyondan sonra IAM partikülleri üzerinde hareketsiz hale getirilir. (B) SH-SY5Y Nöroblastom hücre hatlarından TrkB'yi eksprese eden hücre zarı fragmanları, BDNF'siz primer antikor ve florofor etiketli sekonder antikor ile inkübasyondan sonra IAM partikülleri üzerinde hareketsiz hale getirilir. (C) SH-SY5Y nöroblastom hücre hatlarından TrkB'yi eksprese eden hücre zarı fragmanları, BDNF, primer antikor ve florofor etiketli sekonder antikor ile inkübasyondan sonra IAM partikülleri üzerinde hareketsiz hale getirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4. TrkB CMAC sütununda 7,8-DHF'lik frontal afinite kromatogramları. TrkB CMAC sütununda 7,8-DHF'lik artan konsantrasyonların frontal kromatogramı, burada A - 1 mM, B - 750 nM, C - 500 nM ve D - 300 nM. % 5 metanol içeren amonyum asetat tamponu (10 mM, pH 7.4), 0.4 mL / dak akış hızında elüent olarak kullanılmıştır .

Figure 5
Şekil 5. İşlevsel olmayan TrkB CMAC kolonunda 7,8-DHF'lik frontal afinite kromatogramları. İşlevsel olmayan TrkB CMAC sütununda 7,8-DHF'lik farklı konsantrasyonlarda frontal kromatogram, burada A -1 μM, B - 1 μM, C - 750 nM ve D - 500 nM. % 5 metanol içeren amonyum asetat tamponu (10 mM, pH 7.4), 0.4 mL / dak akış hızında elüent olarak kullanılmıştır .

Figure 6
Şekil 6. TrkB-NULL CMAC sütununda 7,8-DHF'lik frontal afinite kromatogramları. TrkB-NULL CMAC sütununda 7,8-DHF'lik artan konsantrasyonların frontal kromatogramı, burada A - 1 mM, B - 750 nM, C - 500 nM ve D - 300 nM. % 5 metanol içeren amonyum asetat tamponu (10 mM, pH 7.4), 0.4 mL / dak akış hızında elüent olarak kullanılmıştır .

Figure 7
Şekil 7. TrkB CMAC sütununda %0.2 gotu kola ekstresi ile 7,8-DHF'lik frontal afinite kromatogramları. CMAC TrkB sütununda (A) 500 nM 7,8-DHF + %0.2 gotu kola ekstresi (10 mg/ml) ve (B) 500 nM 7,8-DHF'nin temsili frontal elüsyon profili. % 5 metanol içeren amonyum asetat tamponu (10 mM, pH 7.4), 0.4 mL / dak akış hızında elüent olarak kullanılmıştır .

Figure 8
Şekil 8. TrkB-NULL CMAC sütununda% 0.2 gotu kola ekstresi ile 7,8-DHF'nin frontal afinite kromatogramları. TrkB-NULL CMAC sütununda (A) 500 nM 7,8-DHF ve (B) 500 nM 7,8-DHF + %0,2 gotu kola ekstraktının (10 mg/mL) temsili frontal elüsyon profili. % 5 metanol içeren amonyum asetat tamponu (10 mM, pH 7.4), 0.4 mL / dak akış hızında elüent olarak kullanılmıştır .

Figure 9
Şekil 9. Gotu kola ekstraktı fraksiyonlarının UPLC-MS kromatogramları. Gotu kola ekstrakt fraksiyonlarının (A) UPLC-MS kromatogramları TrkB-NULL CMAC sütunundan 0-5 dakika arasında ve (C) CMAC TrkB sütunundan 50-55 dakika arasında salınmıştır. Her iki fraksiyonda da 17.48 dakikalık bir tutma süresine sahip bir bileşik, eşleşen kütle spektrumları (B ve D) ile doğrulandığı gibi, potansiyel bir TrkB bağlayıcısı olarak tanımlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Homojenizasyon Tamponu
1 Tris (hidroksimetil) aminometan hidroklorür (Tris-HCl) 50 mM
2 Sodyum klorür (NaCl) 100 mM
3 Kalsiyum klorür susuz (CaCl2) 3 mM
4 Magnezyum klorür hekzahidrat (MgCl2) 2 mM
5 Potasyum klorür (KCl) 5 mM
6 Fenilmetansülfonil florür (PMSF) 0,1 mM
7 Benzamidin 3 mM
8 Proteaz inhibitörü kokteyli (100X) (1/100)
9 Gliserol 10%
10 Adenozin 5'-trifosfat (ATP) disodyum tuzu hidrat 100 μM
11 Etilendiamintetraasetik asit (EDTA) 5mM

Tablo 1. Homojenizasyon tampon bileşimi.

Çözünürlük Tamponu
1 Tris (hidroksimetil) aminometan hidroklorür (Tris-HCl) 50 mM
2 Sodyum klorür (NaCl) 100 mM
3 Kalsiyum klorür susuz (CaCl2) 3 mM
4 Magnezyum klorür hekzahidrat (MgCl2) 2 mM
5 Potasyum klorür (KCl) 5 mM
6 Fenilmetansülfonil florür (PMSF) 0,1 mM
7 Benzamidin 3 mM
8 Proteaz inhibitörü kokteyli (100X) (1/100)
9 Gliserol 10%
10 Adenozin 5'-trifosfat (ATP) disodyum tuzu hidrat 100 μM
11 Sodyum kolat 2%

Tablo 2. Çözünürlük tampon bileşimi.

Diyaliz Tamponu
1 Tris (hidroksimetil) aminometan hidroklorür (Tris-HCl) 50 mM
2 Sodyum klorür (NaCl) 100 mM
3 Kalsiyum klorür susuz (CaCl2) 0,1 mM
4 Etilendiamintetraasetik asit (EDTA) 5 mM
5 Fenilmetansülfonil florür (PMSF) 0,1 mM

Tablo 3. Diyaliz tampon bileşimi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Özel metabolitlerin karmaşık karışımlarında bulunan aktif bileşiklerin tanımlanması çok zor bir görevdir23. Geleneksel olarak, bireysel bileşikler izole edilir ve aktiviteleri farklı tahlillerde test edilir. Bu yaklaşım zaman alıcı ve maliyetlidir ve genellikle en bol ve iyi karakterize edilen bileşiklerin izolasyonuna ve tanımlanmasına yol açar23. Şu anda kullanılan yüksek verimli tarama testleri, halihazırda bilinen hedeflere sahip kombinatoryal kimya kütüphanelerinin taranmasına büyük ölçüde dayanmaktadır ve karmaşık karışımlarda bulunan biyolojik olarak aktif bileşikleri tanımlamak ve izole etmek için tasarlanmamıştır53.

CMAC, TMP'leri 23,24,54'ü hedefleyen bileşiklerin tanımlanmasına izin verir. Bu teknikte TMP'li hücre zarı fragmanları IAM sabit faz partikülleri 23,24'ün yüzeyinde hareketsiz hale getirilir. CMAC, hücre zarı fosfolipit çift katmanlı24'ü taklit eden katı destek üzerinde hedeflenen proteinlerle hücre zarı fragmanlarının immobilizasyonuna izin veren benzersiz bir yaklaşımdır. Bu, hareketsiz protein hedeflerinin işlevselliğinin korunmasına izin verir ve TMP'lerle etkileşime giren küçük molekülleri tanımlamak için CMAC kullanırken fizyolojik koşullara yakın koşullar sağlar. CMAC, şu anda kullanılan tahlillerden başka herhangi biri kullanılarak test edilemeyen benzersiz doğal ürün kütüphanelerinden yeni kimyasal iskelelerin keşfi için fırsatlar avantajı sunar23 . Önerilen yaklaşım, bu etkileşimin doğasını çözmeden TMP'lerle etkileşime giren bileşiklerin tanımlanmasına izin verir. Etkileşim modu (allosterik veya ortoperik etkileşim; inhibisyon veya aktivasyon) fonksiyonel hücre bazlı testler kullanılarak doğrulanmalıdır. İmmobilize protein hedefleri ile CMAC, farmakodinamiğin karakterizasyonunda (örneğin ayrışma sabiti, Kd) veya hedefle etkileşime giren küçük moleküllü ligandların bağlanma kinetiğinin (kaçık ve kkapalı) belirlenmesinde ve ayrıca immobilize protein üzerindeki bağlanma bölgelerinin karakterizasyonu sürecinde de kullanılabilir24 . CMAC sadece TMP'lere bağlanan bileşiklerin tanımlanmasına izin vermesine rağmen, şu anda doğal karışımlardan ilaç keşif sürecinde en büyük darboğaz olan bileşik saflaştırma gerektirmediğinden, ilaç keşif boru hattındaki ilk adımı önemli ölçüde hızlandıran yenilikçi bir yaklaşımdır.

Sunulan protokol bir transmembran reseptörünün (TrkB) immobilizasyonuna odaklansa da, CMAC teknolojisi diğer hedeflerle kolonların hazırlanmasında kullanılabilir. CMAC preparatının en önemli yönlerinden biri, hücre zarı fragmanlarını izole etmek için kullanılan hücre hattı veya doku seçimidir. İmmobilize reseptörlerle etkileşime giren bileşikler için karmaşık karışımların taranmasında sütunlar kullanılıyorsa, hedeflenen proteini aşırı eksprese eden hücre çizgilerinin kullanılması önerilir. Böyle bir hücre hattının kullanılması, daha fazla sayıda hareketsiz hedefe neden olacak ve hedefe veya daha az miktarda moleküle karşı daha düşük bir afiniteye sahip bileşiklerin tanımlanma şansını artıracaktır. İmmobilize proteinin karakterizasyonuna odaklanılırsa, doğal bir hücre hattının kullanılması önerilir, çünkü proteinin geçirdiği translasyonel modifikasyonlar ve fosfolipid ortamı, transfekte hücre hattında önemli ölçüde farklılık gösterebilir.

IAM parçacıkları üzerinde hücre zarı izolasyonu ve immobilizasyonunun bazı yönleri kritiktir ve reseptör tipine veya proteinin kaynağına bağlı olarak modifikasyonlar gerektirebilir. İmmobilize proteinlerin proteolitik bölünmesini önlemek için, homojenizasyon ve çözündürme tamponlarında uygun proteaz inhibitörlerinin kullanılması esastır. Gerekli proteaz inhibitörlerini tanımlamak için bir literatür taraması yapılması önerilir. Protokol optimizasyonu sürecinde, ATP ve gliserol ilavesinin TrkB'yi hareketsiz hale getirirken CMAC kolonlarındaki bağlanma bölgelerinin sayısını (Bmax) artırdığını belirledik. Diğer transmembran hedeflerinin immobilizasyonunu optimize ederken diğer kofaktörler gerekli olabilir24. Şu anda, TrkB immobilizasyonu sürecinde kolesterol ilavesini araştırıyoruz, çünkü son zamanlarda kolesterolün TrkB ligandlarının etkilerini değiştirdiği bulunmuştur48. Daha önce fonksiyonel CMAC kolonları24'ün elde edilmesi için kolesterol ve / veya diğer lipitlerin eklenmesinin gerekli olabileceği bildirilmiştir.

Kolon elüatını izlemek için kromoforlu ligandlar için diyot dizisi dedektörü, kütle spektrometrisi veya radyoaktif ligandlar için radyo akış dedektörü dahil olmak üzere farklı tipte dedektörler kullanılabilir.

CMAC sütunlarının kararlılığının izlenmesi kritik öneme sahiptir. CMAC sütunları, immobilize proteinin türüne, kullanım sıklığına ve depolama koşullarına bağlı olarak birkaç aya kadar stabil olabilir. Kolonun bir haftadan fazla kullanılmaması durumunda kolonun% 0.05 sodyum azid çözeltisi içinde amonyum asetat tamponunda 4 ° C'de saklanması önerilir. Kullanmaya çalışmadan önce kolonu daha uzun süreler sonra amonyum asetat tamponu ile iyice yıkamak önemlidir. Kolonun işlevselliğini, haftalık olarak seçilen bir marker ligand konsantrasyonunu enjekte ederek izlemeniz önerilir.

Çok sayıda avantaja rağmen, CMAC teknolojisinin, ilaç keşif çabalarında sütunları kullanırken dikkate alınması gereken çeşitli sınırlamaları vardır. İlk olarak, immobilize transmembran hedeflerinin sayısı zamanla azalır ve bu nedenle toplam bağlanma bölgesi sayısının haftalık24 izlenmesi önerilir. Bu azalmanın nedenlerinden biri, adsorpsiyona dayanan ve kovalent bağların sokulmasını içermeyen immobilizasyon işleminin sonucudur. Lipofilik bileşikler, IAM yüzeyine ve fosfolipid çift katmanlarına önemli spesifik olmayan bağlanma nedeniyle CMAC kolonlarında güçlü bir şekilde tutulabilir. Bu, analiz süresini önemli ölçüde artırır ve verimi azaltır. CMAC kolon hazırlama işlemi hücre hattına özgüdür ve hareketsiz proteinlerin doğasının tam olarak anlaşılmasını gerektirir, bu da onu daha az karakterize edilen hedefler için daha az uygun hale getirir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Lukasz Ciesla, IAM'nin sağlayıcısı Regis Technologies ile işbirliği yapıyor. Kişisel bilgisayar. DD2 parçacıkları.

Acknowledgments

Z.C.A., Türkiye Bilimsel ve Teknolojik Araştırma Kurumu (TÜBİTAK) 2219- Uluslararası Doktora Sonrası Araştırma Burs Programı tarafından desteklenmiştir. Bu yayında bildirilen araştırmalar, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Ücretsiz ve Bütünleştirici Tıp Merkezi tarafından 1R41AT011716-01 ödül numarası altında desteklenmiştir. Bu çalışma aynı zamanda Amerikan Farmakognozi Araştırma Başlangıç Hibesi Derneği, Regis Technologies tarafından L.C.'ye hibe olarak kısmen desteklenmiştir. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
7-8 Dihydroxyflavone hydrate Sigma-Aldrich D5446-10 mg ≥98% (HPLC)
Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate Sigma-Aldrich A2383-1 g
Ammonium acetate VWR Chemicals BDH BDH9204-500 g
BDNF antibody Invitrogen PA5-15198-400 μL Primary antibody; 2 mg/mL of concentration
Benzamidine hydrochloride hydrate Sigma-Aldrich B6506-25 g
Brain derived neurotrophic factor (BDNF) human Sigma-Aldrich B3795-10 μg Recombinant, expressed in E. coli, lyophilized powder, suitable for cell culture
Calcium chloride VWR Analytical BDH9224-1 kg
Cholic acid sodium salt Alfa Aesar J62050-100 g
Dounce homogenizer VWR 71000-516 40 mL, 285 mm (overall lenght), 32 x 140 mm (O.D. x H)
Ethanol Sigma-Aldrich 493511
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) VWR Analytical BDH-9232-500 g
Fetal bovine serum Sigma-Aldrich F2442-500 mL sterile-filtered, suitable for cell culture
G418 disulfate salt solution Sigma-Aldrich G8168-100 mL 50 mg/mL in H2O, 0.1 μm filtered, suitable for cell culture
Glycerol VWR Life Science E520-100 mL
Immobilized artificial membrane (IAM.PC.DD2) Regis Technologies, Inc. 1-771050-500
Magnesium chloride hexahydrate VWR Analytical BDH9244-500 mL
Methanol Sigma-Aldrich 322425
Nikon C2 DUVb Nikon Confocal laser scanning microscope
Normal goat serum (10%) Life Technologies 50197Z
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333-100 mL
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) Thermo Scientific 36978-5 g
Phosphate buffered saline (PBS) VWR Life Science K812-500 mL 1x
Potassium chloride VWR Chemicals BDH 0395-1 kg
Protease inhibitor cocktail VWR Life Science Ambreso M221-1 mL Proteomics grade, containing 50 mM AEBSF, 30 µM aprotonin, 1 mM bestatin, 1 mM E-64 and 1 mM leupeptin
RPMI-1640 medium Sigma-Aldrich R8758-500 mL with L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Secondary antibody goat anti-rabbit IgG (H+L) Invitrogen Alexa Flour Plus 488 A32731
SH-SY5Y Neuroblastoma cell lines expressing Trk-B Kerafast ECP007
SH-SY5Y Trk-NULL cell line Kerafast ECP005
Snake skin dialysis tubing Thermo Scientific 88245 10K MWCO, 35 mm dry I.D.
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002
Sodium chloride BDH VWR Analytical BDH9286-2.5 kg
Tricorn 5/20 column GE Healthcare 24-4064-08
Tris-HCl VWR Life Science 0497-1 kg
Trypsin-EDTA solution Sigma-Aldrich T4049-500 mL 0.25%, sterile-filtered, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thomford, N. E., et al. Natural Products for Drug Discovery in the 21st Century: Innovations for Novel Drug Discovery. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1578 (2018).
  2. Atanasov, A. G., Zotchev, S. B., Dirsch, V. M. International Natural Product Sciences Taskforce, Supuran, C.T. Natural products in drug discovery: advances and opportunities. Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (3), 200-216 (2021).
  3. Altmann, K. H. Drugs from the Oceans: Marine Natural Products as Leads for Drug Discovery. Chimia. 71 (10), 646-652 (2017).
  4. Bernardini, S., Tiezzi, A., Laghezza Masci, V., Ovidi, E. Natural products for human health: an historical overview of the drug discovery approaches. Natural Product Research. 32 (16), 1926-1950 (2018).
  5. DeCorte, B. L. Underexplored Opportunities for Natural Products in Drug Discovery. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (20), 9295-9304 (2016).
  6. Lee, J., Jo, D. G., Park, D., Chung, H. Y., Mattson, M. P. Adaptive cellular stress pathways as therapeutic targets of dietary phytochemicals: focus on the nervous system. Pharmacological Reviews. 66 (3), 815-868 (2014).
  7. Hornykiewicz, O. L-DOPA: from a biologically inactive amino acid to a successful therapeutic agent. Amino Acids. 23 (1-3), 65-70 (2002).
  8. Hoyer, D. Targeting the 5-HT system: Potential side effects. Neuropharmacology. 179, 108233 (2020).
  9. Nur, S., Adams, C. E. Chlorpromazine versus reserpine for schizophrenia. The Cochrane Database of Systematic Reviews. 4, (2016).
  10. Chung, H. Y., et al. Redefining Chronic Inflammation in Aging and Age-Related Diseases: Proposal of the Senoinflammation Concept. Aging and Disease. 10 (2), 367-382 (2019).
  11. Fitzgerald, K. N., et al. Potential reversal of epigenetic age using a diet and lifestyle intervention: a pilot randomized clinical trial. Aging. 13 (7), 9419-9432 (2021).
  12. Zhao, L., Lee, J. Y., Hwang, D. H. Inhibition of pattern recognition receptor-mediated inflammation by bioactive phytochemicals. Nutrition Reviews. 69 (6), 310-320 (2011).
  13. Corbi, G., et al. Dietary Phytochemicals in Neuroimmunoaging: A New Therapeutic Possibility for Humans? Frontiers in Pharmacology. 7, 364 (2016).
  14. Davinelli, S., et al. Dietary phytochemicals and neuro-inflammaging: from mechanistic insights to translational challenges. Immunity & Ageing: I & A. 13, 16 (2016).
  15. Ostan, R., et al. Inflammaging and cancer: a challenge for the Mediterranean diet. Nutrients. 7 (4), 2589-2621 (2015).
  16. Martucci, M., et al. Mediterranean diet and inflammaging within the hormesis paradigm. Nutrition Reviews. 75 (6), 442-455 (2017).
  17. Szarcvel Szic, K., Declerck, K., Vidakovic, M., Vanden Berghe, W. From inflammaging to healthy aging by dietary lifestyle choices: is epigenetics the key to personalized nutrition. Clinical Epigenetics. 7 (1), 33 (2015).
  18. Dean, E., Gormsen Hansen, R. Prescribing optimal nutrition and physical activity as "first-line" interventions for best practice management of chronic low-grade inflammation associated with osteoarthritis: evidence synthesis. Arthritis. , 560634 (2012).
  19. Ruiz-Núñez, B., Pruimboom, L., Dijck-Brouwer, D. A., Muskiet, F. A. Lifestyle and nutritional imbalances associated with Western diseases: causes and consequences of chronic systemic low-grade inflammation in an evolutionary context. TheJournal of Nutritional Biochemistry. 24 (7), 1183-1201 (2013).
  20. Agarwal, P., et al. MIND Diet Associated with Reduced Incidence and Delayed Progression of Parkinsonism in Old Age. The Journal of Nutrition, Health & Aging. 22 (10), 1211-1215 (2018).
  21. Morris, M. C., et al. MIND diet associated with reduced incidence of Alzheimer's Disease. Alzheimer's & Dementia: The Journal of the Alzheimer's Association. 11 (9), 1007-1014 (2015).
  22. Franceschi, C., Garagnani, P., Parini, P., Giuliani, C., Santoro, A. Inflammaging: a new immune-metabolic viewpoint for age-related diseases. Nature Reviews. Endocrinology. 14 (10), 576-590 (2018).
  23. Ciesla, L., Moaddel, R. Comparison of analytical techniques for the identification of bioactive compounds from natural products. Natural Product Reports. 33 (10), 1131-1145 (2016).
  24. Moaddel, R., Wainer, I. W. The preparation and development of cellular membrane affinity chromatography columns. Nature Protocols. 4 (2), 197-205 (2009).
  25. Ferrer, I., et al. BDNF and full-length and truncated TrkB expression in Alzheimer disease. Implications in therapeutic strategies. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 58 (7), 729-739 (1999).
  26. Numakawa, T., Odaka, H., Adachi, N. Actions of Brain-Derived Neurotrophin Factor in the Neurogenesis and Neuronal Function, and Its Involvement in the Pathophysiology of Brain Diseases. International Journal of Molecular Sciences. 19 (11), 3650 (2018).
  27. Lima Giacobbo, B., et al. Brain-Derived Neurotrophic Factor in Brain Disorders: Focus on Neuroinflammation. Molecular Neurobiology. 56 (5), 3295-3312 (2019).
  28. Wang, Z. H., et al. Deficiency in BDNF/TrkB Neurotrophic Activity Stimulates δ-Secretase by Upregulating C/EBPβ in Alzheimer's Disease. Cell Reports. 28 (3), 655-669 (2019).
  29. Devi, L., Ohno, M. TrkB Reduction Exacerbates Alzheimer's Disease-like Signaling Aberrations and Memory Deficits without Affecting beta-Amyloidosis in 5XFAD Mice. Translational Psychiatry. 5 (5), 562 (2015).
  30. Jiao, S. S., et al. Brain-derived Neurotrophic Factor Protects against Tau-related Neurodegeneration of Alzheimer's Disease. Translational Psychiatry. 6 (10), 907 (2016).
  31. Ng, T., Ho, C., Tam, W., Kua, E., Ho, R. C. Decreased Serum Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) Levels in Patients with Alzheimer's Disease (AD): A Systematic Review and Meta-Analysis. International Journal of Molecular Sciences. 20 (2), 257 (2019).
  32. Amidfar, M., de Oliveira, J., Kucharska, E., Budni, J., Kim, Y. K. The Role of CREB and BDNF in Neurobiology and Treatment of Alzheimer's Disease. Life Sciences. 257, 118020 (2020).
  33. Atasoy, I. L., et al. Both Secreted and the Cellular Levels of BDNF Attenuated due to Tau Hyperphosphorylation in Primary Cultures of Cortical Neurons. Journal of Chemical Neuroanatomy. 80, 19-26 (2017).
  34. Rosa, E., et al. Tau Downregulates BDNF Expression in Animal and Cellular Models of Alzheimer's Disease. Neurobiology of Aging. 48, 135-142 (2016).
  35. Xiang, J., et al. Delta-secretase-cleaved Tau Antagonizes TrkB Neurotrophic Signalings, Mediating Alzheimer's Disease Pathologies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (18), 9094-9102 (2019).
  36. Giuffrida, M. L., Copani, A., Rizzarelli, E. A Promising Connection between BDNF and Alzheimer's Disease. Aging. 10 (8), 1791-1792 (2018).
  37. Ando, S., et al. Animal Model of Dementia Induced by Entorhinal Synaptic Damage and Partial Restoration of Cognitive Deficits by BDNF and Carnitine. Journal of Neuroscience Research. 70 (3), 519-527 (2002).
  38. Fischer, D. L., Sortwell, C. E. BDNF Provides Many Routes Toward STN DBS-Mediated Disease Modification. Movement Disorders. Official Journal of the Movement Disorder Society. 34 (1), 22-34 (2019).
  39. Zhang, F., Kang, Z., Li, W., Xiao, Z., Zhou, X. Roles of Brain-derived Neurotrophic Factor/Tropomyosin-related Kinase B (BDNF/TrkB) Signalling in Alzheimer's Disease. Journal of Clinical Neuroscience: Official Journal of the Neurological Society of Australasia. 19 (7), 946-949 (2012).
  40. Pilakka-Kanthikeel, S., Atluri, V. S., Sagar, V., Saxena, S. K., Nair, M. Targeted Brain Derived Neurotropic Factors (BDNF) Delivery across the Blood-Brain Barrier for Neuro-protection using Magnetic Nano Carriers: An In-vitro Study. PLoS One. 8 (4), 62241 (2013).
  41. Jang, S. W., et al. A Selective TrkB Agonist with Potent Neurotrophic Activities by 7,8-Dihydroxyflavone. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (6), 2687-2692 (2010).
  42. Todd, D., et al. A Monoclonal Antibody TrkB Receptor Agonist as a Potential Therapeutic for Huntington's Disease. Plos One. 9 (2), 87923 (2014).
  43. Liu, X., et al. Optimization of a Small Tropomyosin-Related Kinase B (TrkB) Agonist 7,8-Dihydroxyflavone Active in Mouse Models of Depression. Journal of Medicinal Chemistry. 55 (19), 8524-8537 (2012).
  44. Liu, X., et al. Biochemical and Biophysical Investigation of the Brain-derived Neurotrophic Factor Mimetic 7,8-Dihydroxyflavone in the Binding and Activation of the TrkB Receptor. The Journal of Biological Chemistry. 289 (40), 27571-27584 (2014).
  45. Chen, L., Gao, X., Zhao, S., Hu, W., Chen, J. The Small-Molecule TrkB Agonist 7,8-Dihydroxyflavone Decreases Hippocampal Newborn Neuron Death After Traumatic Brain Injury. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 74 (6), 557-567 (2015).
  46. Liu, X., et al. Optimization of a Small Tropomyosin-related Kinase B (TrkB) Agonist 7,8-Dihydroxyflavone Active in Mouse Models of Depression. Journal of Medicinal Chemistry. 55 (19), 8524-8537 (2012).
  47. Zhang, Z., et al. 7,8-Dihydroxyflavone Prevents Synaptic Loss and Memory Deficits in a Mouse Model of Alzheimer's Disease. Neuropsychopharmacology: Official Publication of the American College of Neuropsychopharmacology. 39 (3), 638-650 (2014).
  48. Casarotto, P. C., et al. Antidepressant Drugs Act by Directly Binding to TRKB Neurotrophin Receptors. Cell. 184 (5), 1299-1313 (2021).
  49. Iyer, R., et al. Entrectinib is a potent inhibitor of Trk-driven neuroblastomas in a xenograft mouse model. Cancer letters. 372 (2), 179-186 (2016).
  50. Iyer, R., et al. Nanoparticle delivery of an SN38 conjugate is more effective than irinotecan in a mouse model of neuroblastoma. Cancer letters. 360 (2), 205-212 (2015).
  51. Ng, E. S., Chan, N. W., Lewis, D. F., Hindsgaul, O., Schriemer, D. C. Frontal Affinity Chromatography-Mass spectrometry. Nature Protocols. 2 (8), 1907-1917 (2007).
  52. Maciuk, A., Moaddel, R., Haginaka, J., Wainer, I. W. Screening of Tobacco Smoke Condensate for Nicotinic Acetylcholine Receptor Ligands using Cellular Membrane Affinity Chromatography Columns and Missing Peak Chromatography. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 48 (2), 238-246 (2008).
  53. Harvey, A. L., Edrada-Ebel, R., Quinn, R. J. The Re-emergence of Natural Products for Drug Discovery in the Genomics Era. Nature Reviews. Drug Discovery. 14 (2), 111-129 (2015).
  54. Ciesla, L., et al. Development and Characterization of the α3β4α5 Nicotinic Receptor Cellular Membrane Affinity Chromatography Column and Its Application for on line Screening of Plant Extracts. Journal of Chromatography A. 1431, 138-144 (2016).

Tags

Biyokimya Sayı 179
İmmobilize Tropomiyozin Kinaz Reseptörü B ile Etkileşime Giren Özel Bitki Metabolitlerini Tanımlamak için Hücresel Membran Afinite Kromatografisi Sütunları
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Arituluk, Z. C., Adhikari, B.,… More

Arituluk, Z. C., Adhikari, B., Maitra, U., Goodman, C., Ciesla, L. M. Cellular Membrane Affinity Chromatography Columns to Identify Specialized Plant Metabolites Interacting with Immobilized Tropomyosin Kinase Receptor B. J. Vis. Exp. (179), e63118, doi:10.3791/63118 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter