Summary
プロトコールは、機能的な膜貫通型トロポミオシンキナーゼ受容体Bタンパク質を含む固定化細胞膜断片を用いた細胞膜アフィニティークロマトグラフィー(CMAC)カラムの調製を記載しています。これらの受容体と相互作用し、複雑な天然混合物中に存在する特殊な植物代謝産物の同定におけるCMACカラムの使用についても説明します。
Abstract
植物、真菌、細菌、海洋無脊椎動物によって合成された化学物質は、新薬のヒットとリードの豊富な供給源となっています。医療現場で一般的に使用されるスタチン、ペニシリン、パクリタキセル、ラパマイシン、またはアルテミシニンなどの医薬品は、最初に同定され、天然物から単離されています。しかし、天然源からの生物学的に活性な特殊代謝産物の同定および単離は、困難で時間のかかるプロセスである。伝統的に、個々の代謝産物は、バイオマスの抽出に続いて、複雑な混合物から単離および精製される。続いて、単離された分子を機能アッセイにおいて試験し、それらの生物学的活性を検証する。ここでは、複雑な混合物から直接生物学的に活性な化合物を同定するための細胞膜アフィニティークロマトグラフィー(CMAC)カラムの使用を紹介します。CMACカラムは、天然のリン脂質二重層環境に埋め込まれた固定化機能性膜貫通タンパク質(TMP)と相互作用する化合物の同定を可能にします。これは標的を絞ったアプローチであり、新たに同定された小分子薬物候補で活性を調節しようとするTMPを知る必要がある。このプロトコルでは、多数の神経系疾患に対する創薬の実行可能な標的として浮上している固定化トロポミオシンキナーゼ受容体B(TrkB)を有するCMACカラムを調製するアプローチを提示する。この記事では、TrkB受容体を過剰発現する神経芽細胞腫細胞株を使用して、固定化されたTrkB受容体を有するCMACカラムを組み立てるための詳細なプロトコルを提供する。我々はさらに、カラムの機能性を調査するためのアプローチと、TrkB受容体と相互作用する特殊な植物代謝産物の同定におけるその使用を提示する。
Introduction
植物混合物は、薬理学的に活性な化合物1に富んでおり、新薬ヒットおよびリード2、3、4、5の同定のための良好な供給源として役立つ。天然物からの新薬の発見は実り多いアプローチであり、現在承認されている多くの薬は、自然界で最初に同定された化合物に由来しています。天然化合物の化学的多様性は、化学的に合成された分子の人工ライブラリに匹敵することは困難です。多くの天然化合物は、ヒトタンパク質標的と相互作用し、調節し、進化的に最適化された薬物様分子と考えることができる6。これらの天然化合物は、神経学的障害6において使用する薬物鉛同定に特に適している。アルツハイマー病(AD)の管理のために現在FDAが承認している2つの薬は、天然アルカロイド、すなわちガランタミンとリバスチグミン(フィゾスチグミンの誘導体)に由来しています6。L-DOPA, 現在、パーキンソン病のための最も一般的に処方薬, 最初にソラマメから同定されました (Vicia faba L.)ペルゴリドおよびリスリド、ドーパミン作動性受容体アゴニストは、寄生菌クラビセプス・プルプレア由来の天然麦角アルカロイドの誘導体である8.レセルピンは、インドのヘビの根(Rauvolfia serpentina(L.ベンス、元クルツ)から単離されたアルカロイドであり、最初の抗精神病薬9の1つであった。近年、調節不全の免疫応答および全身性炎症は、大うつ病性障害または神経変性疾患などの多数の神経学的疾患の発症に関連している10。植物ベースの食事療法と他のライフスタイル介入は、高齢者の認知能力および機能的能力を改善することが見出されている11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21.トリテルペンおよびポリフェノールに属するある種の求電子性分子は、インビトロおよびインビボモデルの両方において炎症応答を調節することが見出されている12。例えば、α,β−不飽和カルボニル(例えば、クルクミン、シンナムアルデヒド)、またはイソチオシアネート基(例えば、スルフォラファン)を含む天然化合物は、マウスインターロイキン−3依存性プロB細胞株における炎症誘発性サイトカインの下流合成を阻害するToll様受容体−4(TLR4)二量体化を妨害する12、22.疫学的証拠は、複雑な食品マトリックス中に存在する食事性植物化学物質も、新薬リードの実行可能な供給源を構成する可能性があることを強く指摘している6。
植物ベースの食品を含む植物抽出物中に存在する生物学的に活性な分子の同定における主要な障害の1つは、調査されたサンプルの複雑さである。伝統的に、個々の化合物は単離され、精製され、続いて生物学的活性について試験される。このアプローチは、通常、最も豊富で十分に特徴付けられた化合物の同定につながる。定義された分子標的を伴わない表現型創薬アプローチは、複雑な混合物のバイオガイド分画に依存する23。このアプローチでは、抽出物は、より複雑でないサブフラクションに分画され、その後、表現型アッセイで試験される。活性化合物の単離および精製は、アッセイにおいて検証された生物学的活性によって導かれる。特定の薬物標的の同一性の知識は、複雑な混合物中に存在する薬理学的に活性な化合物の同定を有意にスピードアップし得る。これらのアプローチは、通常、分子標的、例えば酵素の固定化に基づいており、固体表面上の、磁気ビーズ23などが挙げられる。固定化された標的は、その後、スクリーニング実験において使用され、標的と相互作用する化合物の単離をもたらす。このアプローチは、細胞質ゾルタンパク質を標的とする化合物の同定に広く使用されてきたが、膜貫通タンパク質(TMP)と相互作用する化学物質の同定にはあまり一般的に適用されていない23。TMPsの固定化におけるさらなる課題は、タンパク質の活性が、細胞膜リン脂質およびコレステロール23,24などの二重層中の他の分子との相互作用に依存するという事実に由来する。膜貫通標的を固定化しようとする場合、タンパク質と天然のリン脂質二重層環境との間のこれらの微妙な相互作用を保存することが重要です。
細胞膜アフィニティークロマトグラフィー(CMAC)では、精製されていないタンパク質と細胞膜断片が、人工膜(IAM)固定相粒子23に固定化される。IAM固定相は、ホスファチジルコリン類似体をシリカ上に共有結合することによって調製される。最近、遊離アミン基およびシラノール基が末端キャップされているIAM固定相の新規クラスが開発されている(IAM.パソコン。DD2粒子)。CMACカラム調製中、細胞膜断片は吸着によってIAM粒子の表面に固定化されます。
CMACカラムは、イオンチャネル(例えば、ニコチン性受容体)、GPCR(例えば、オピオイド受容体)、タンパク質トランスポーター(例えば、p-糖タンパク質)などを含む、異なるクラスのTMPを固定化するために今日まで使用されてきた24。固定化タンパク質標的は、標的と相互作用する小分子リガンドの薬力学(例えば、解離定数、Kd)の特性評価または結合動態(kon およびkoff)の決定、ならびに複合体マトリックス中に存在する潜在的な新薬リードの同定の過程において使用されてきた24.ここでは、多数の神経系疾患の創薬の実行可能な標的として浮上している固定化トロポミオシンキナーゼ受容体B(TrkB)を用いたCMACカラムの調製法を紹介します。
これまでの研究では、脳由来神経栄養因子(BDNF)/TrkB経路の活性化が、ADや大うつ病性障害などの特定の神経学的疾患の改善と関連していることが示されました25,26,27,28。ADのBDNFレベルおよびその受容体TrkB発現の減少、および同様の低下がAD29の動物モデルにおいて海馬機能を損なうことが報告された。BDNFのレベルの低下は、AD患者30、31、32の血清および脳において報告された。タウ過剰発現または過剰リン酸化は、初代ニューロンおよびAD動物モデルにおけるBDNF発現をダウンレギュレートすることが見出された33、34、35。さらに、BDNFは、インビトロおよびインビボでβアミロイド誘導神経毒性に対して保護効果を有することが報告された36。ラット脳へのBDNFの直接投与は、認知障害のある動物における学習および記憶を増加させることが示された37。BDNF/TrkBは、AD28,38を含む神経学的および精神医学的障害を改善するための有効な標的として浮上した。ADにおける治療法の開発のためにBDNF/TrkBシグナル伝達経路を標的にすることは、この疾患の理解を潜在的に強化するであろう39。残念なことに、BDNF自体は、その貧弱な薬物動態学的特性および有害な副作用のために治療として使用することができない40。TrkB/BDNF経路の小分子活性化剤が、潜在的なTrkBリガンドとして探索されている41、42、43。試験された低分子アゴニストのうち、7,8-ジヒドロキシフラボン(7,8-DHF)はBDNF/TrkB経路41,44,45,46を活性化することが示されている。7,8-DHFの誘導体(R13;4-オキソ-2-フェニル-4H-クロメン-7,8-ジイルビス(メチルカルバメート))は、AD47の可能性のある薬物として現在検討されている。最近、いくつかの抗うつ薬がTrkBに直接結合し、BDNFシグナル伝達を促進することによって作用することが示され、様々な神経学的障害を治療するための有効な標的としてTrkBを追求することの重要性をさらに強調する48。
このプロトコルは、機能的なTrkBカラムおよびTrkB-NULLネガティブコントロールカラムをアセンブルするプロセスを記述している。カラムは、既知の天然物小分子リガンドである7,8-DHFを使用して特徴付けられます。さらに、TrkBと相互作用する化合物の同定のために、植物抽出物を例に挙げて複雑なマトリックスをスクリーニングするプロセスについて説明する。
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Protocol
SH-SY5Y神経芽細胞腫細胞(TrkBおよびTrkB-NULL(親)細胞株)の細胞培養
注:細胞株(SH-SY5Y細胞株(TrkB、BR6)およびSH-SY5Y親細胞株(TrkB NULL))49,50をケラファストから購入した。培養細胞は、CMACカラムの調製のために固定化される膜貫通受容体の供給源として使用される。以下のステップでは、細胞膜フラグメントを取得し、機能的な CMAC カラムを組み立てる方法について説明します。
- 450 mLのRPMI培地、50 mLのFBS、5 mLのペニシリン/ストレプトマイシン溶液、および0.3 mg/mLのジェネチシン(G418)を混合した細胞培養培地中で、5%CO2の湿潤雰囲気下で37°Cの150 mm細胞培養皿中で細胞を増殖させる。
2. 細胞採取
- 顕微鏡を用いて細胞コンフルエンシー(80%〜90%)を確認し、細胞継代後3〜4日後に到達した。
- 細胞の上方から細胞培養培地を吸引し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS、1x、pH7.4)で細胞を2回洗浄する。PBSを除去し、2mLの低濃縮トリプシン(0.25%)を加えて細胞を剥離する。
- プレートを静かに旋回させて、トリプシン溶液ですべての細胞を均等に覆い、5%CO2を含む湿潤雰囲気下で37°Cで約2分間細胞をインキュベートする。剥離細胞に8 mLの細胞培養培地を加え、剥離した細胞を50 mL円錐管に移し、氷上に置く。
- 血球計数器を使用して、細胞数(約3 x107 細胞)を推定します。混合細胞懸濁液を上下にピペッティングすることによって、混合物中の均一な細胞密度を得る。10μLの細胞懸濁液をカバースリップの下に置き、40倍の対物レンズを用いて顕微鏡下で細胞を計数した。
3. 細胞均質化
- ベンズアミジン(200mM)、フェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF、10mM)、および4-(2-アミノエチル)ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩(AEBSF)、アプロチニン、ベスタチン、およびロイペプチンを含む市販のプロテアーゼ阻害剤カクテル(100倍濃度)のプロテアーゼ阻害剤のストック溶液を調製する。
警告: PMSF はヒュームフード内でのみ取り扱ってください。- ベンズアミジン原液(200mM)を5mLの超高純度脱イオン水に溶解してベンズアミジン原液(200mM)を調製する。4°Cで保存し、1日以内に使用してください。各使用前に溶液を新たに調製する(推奨)。
- 0.017 gのPMSFを10 mLのエタノールに溶解してPMSFストック溶液(10 mM)を調製する。-20°Cで保管してください。
- 市販のプロテアーゼ阻害剤混合液を1mLの超純イオン交換水に溶解してプロテアーゼ阻害剤カクテル(100x)を調製する。十分に混合し、200〜300μLのカクテルをアリコートし、使用前に-20°Cで保存する。
- ATP二ナトリウム塩水和物55.114 mgを脱イオン超純水1 mLに溶解してATP原液(100 mM)を調製する。十分に混合し、混合物のアリコート100 μLと使用前に-20°Cで保存する。
- 3.03gのトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩酸塩(Tris-HCl、50mM)、2.9gの塩化ナトリウム(NaCl、100mM)、0.22gの塩化カルシウム無水物(CaCl2、3mM)、0.2gの塩化マグネシウム六水和物(MgCl2、2mM)および0.19の塩化カリウム(KCl、5mM)を500mLの超高純度脱イオン水に溶解して緩衝液を調製する。
- ステップ3.3で調製した緩衝液17.3 mLを0.3 mL(3 mM)のベンズアミジン原液、0.2 mL(0.1 mM)のPMSF原液、0.2 mLのプロテアーゼ阻害剤カクテル混合物、20 μL(100 μM)のATP原液、2 mL(10%)のグリセロール、および0.029 g(5mM)のEDTAと混合してホモジナイズバッファーを調製する(表1)。塩酸溶液を用いてpHを7.4に調整する。
- ステップ2.3で回収した細胞を4°Cで400 x gで5分間スピンダウンします。上清を除去し、残りの細胞ペレットを10mLの氷冷PBS(1x、pH7.4)で洗浄する。細胞を再び4°Cで400 x gで5分間スピンダウン します。
- 上清を廃棄し、ステップ3.4で調製した20mLのホモジナイズバッファーと交換する。円錐形のチューブを氷の上に置きます。
- 細胞懸濁液を40mLのDounceホモジナイザー組織グラインダーに移し、氷の上に置きます。懸濁液を手動で氷上で均質化し、40回の上下の乳棒ストロークを使用します。均質化した細胞懸濁液を50mL円錐管に移す。
- ホモジネートを4°Cで400 x gで7分間遠心分離 する。ペレットを廃棄し、上清を新しい円錐管に移し、4°Cで47900 x gで30分間遠心分離する。細胞膜ペレットを保存し、上清を捨てる。
4. 細胞膜可溶化
- ステップ3.3で作製した緩衝液8.7 mLをPMSF原液0.1 mL(0.1 mM)、ベンズアミジン原液0.15 mL(3 mM)、プロテアーゼ阻害剤カクテル0.1 mL、ATP原液10 μL(100 μM)、グリセロール1 mL(10%)、コール酸ナトリウム0.2 g(2%)と混合して可溶化緩衝液を調製する(表2)。
- ステップ3.8で得られた細胞膜断片を含む可溶化緩衝液を円錐形チューブに移し、ペレットを再懸濁する。得られた混合物を4°Cで150rpmで18時間回転させる。
注:この時点で、実験は一晩細胞膜ペレット可溶化のために一時停止することができる。
5. IAMへの細胞膜固定化。パソコン。DD2パーティクル
- 18時間後、可溶化混合物を4°Cで47900 x gで30分間遠心分離 する。
- 上清を保管し、ペレットを捨てる。100mgのIAMを加える。パソコン。DD2粒子は、上清に対して、渦巻き、得られた懸濁液混合物を4°Cで150rpmで1時間回転させる。
- IAM上の細胞膜断片の固定化を容易にする。パソコン。DD2粒子は、以下に概説するように透析ステップに進む。
- 24gのトリス塩酸(50mM)、23.4gのNaCl(100mM)、0.06gのCaCl2(0.1mM)、5.85gのEDTA( 5mM)、および0.07gのPMSF(0.1mM; 表3)。
注:PMSFは水に溶けないため、まず少量のエタノールに溶解し、次に緩衝液でビーカーにゆっくりと加えます。 - 塩酸溶液でpHを7.4に調整します。透析ステップに進む前に、緩衝液を4°Cで最低1時間置く。
- 10cmのセルロース膜透析チューブ(10K MWCO、35mm)を切断して透析チューブを作製し、IAMを含む懸濁液を移す。パソコン。DD2粒子および細胞膜断片を透析チューブに入れる。透析チューブクリップを使用して、透析チューブの両端を閉じます。
- IAMを入れた透析チューブを置く。パソコン。DD2固定相を透析バッファーに入れ、穏やかに攪拌しながら4°Cで24時間透析する。
- 24時間後、新しく調製した透析バッファーに透析チューブを入れ、さらに24時間透析を続けます。
- 24gのトリス塩酸(50mM)、23.4gのNaCl(100mM)、0.06gのCaCl2(0.1mM)、5.85gのEDTA( 5mM)、および0.07gのPMSF(0.1mM; 表3)。
6. CMACカラムパッキング
- IAMを洗浄するために使用する酢酸アンモニウム緩衝液(10 mM、pH 7.4)を調製する。パソコン。DD2粒子およびカラム内特性評価実験は、0.7708gの酢酸アンモニウムを1Lの超高純度脱イオン水に溶解して行う。塩酸溶液でpHを7.4に調整します。
- 透析の48時間後、透析バッファーから透析チューブを取り出し、透析チューブの内容物を15mL円錐管に移す。
- 混合物を4°Cで400 x gで5分間遠心分離 する。上清を捨て、残りのペレットを10mLの酢酸アンモニウム緩衝液で3回洗浄し、混合物を400 x gで4°Cで5分間遠心分離し、各洗浄を行った。
- 3回目の洗浄後、残りのペレットを1mLの酢酸アンモニウム緩衝液に再懸濁する。それを十分に混合し、得られたスラリーを使用して5/20ガラスカラムを充填し、CMACクロマトグラフィーカラムを得た。
- カラムを充填するには、まず、酢酸アンモニウム緩衝液で予め浸した底部フィルターをフィルターホルダーに入れます。フィルターホルダーをガラスカラムに嵌め込み、カラムキャップをねじ込んでホルダーの位置を固定します。カラムをフィンガークランプに垂直に置き、ラボスタンドに固定します。ビーカーを柱の下に置きます。
- 単流路ピペッターを使用して、ステップ6.4で得られた少量のスラリーをガラスカラムに移送する。ピペットチップをガラス柱壁に当てて、材料をゆっくりと注ぎます。別の量のスラリーを注ぐ前に、梱包材が沈降するのを許してください。
- パッキングプロセスをスピードアップするために、各ステップの間にマイクロピペットを使用して固定床の上から緩衝液を除去する。1mLのスラリーが充填されるまで、これらの手順を繰り返します。
- 図 1 に示すように、上部フィルターを配置し、固定相の上にバッファーが残らないようにアダプター・ユニットをねじ込みます。アダプター・ロックでアダプター装置の位置を固定します。
- カラムを高速液体クロマトグラフィー (HPLC) ポンプに接続し、流速を 0.2 mL/minに設定し、酢酸アンモニウムバッファーでカラムを一晩洗浄します。これで、列は特性評価ステップの準備が整いました。使用時までカラムを4°Cで保存する。
注: 長期間保存する場合 (カラムは 1 週間以上使用しない場合)、酢酸アンモニウムバッファー中の 0.05% アジ化ナトリウム溶液でカラムをランディングし、4 °C で保存します。
注意: アジ化ナトリウムは、経口摂取または皮膚を通して吸収されると非常に有毒です;それはヒュームフードの下でのみ取り扱われるべきです。アジ化ナトリウムを使用するときは、ラボコート、安全メガネ、手袋(ニトリルが好ましい)を着用してください。
7. CMACカラムの特性評価
- 共焦点顕微鏡とBDNF結合
- IAM を準備します。PCC.DD2固定相粒子を固定化した細胞膜断片を用いて、工程1~工程6.4の指示に従ってTrkBおよびSH-SY5Yを過剰発現する神経芽細胞腫細胞およびSH-SY5Y神経芽細胞とは別に得た。
- 抗体染色の前にBDNFと共にインキュベートされるサンプルについては、10μgのBDNFを100μLの超純粋な脱イオン水に溶解してBDNFストック溶液を調製する。溶液を-20°Cで保存する。
- 別の1.5 mL微量遠心チューブ、IAMの100 μLアリコートに移す。パソコン。DD2カラム充填材は、TrkBおよびIAMの100μLアリコートを過剰発現する固定化SH−SY5Y神経芽細胞腫細胞を有する。パソコン。DD2カラム充填剤を固定化したSH-SY5Y TrkB-NULL細胞を酢酸アンモニウム緩衝液に懸濁した。
- 390 μLの酢酸アンモニウム緩衝液、10 μLのBDNFストック溶液、および0.5 μLのATPストック溶液(ステップ3.2で調製)を各チューブに追加し、ロッキングしながら室温で1時間インキュベートする。
- 抗体染色前にBDNFとインキュベートされないサンプルについては、IAMの100μLアリコートを移す。パソコン。DD2カラム充填剤を固定化したSH-SY5Y神経芽細胞腫細胞を酢酸アンモニウムに懸濁して1.5mL微量遠心チューブに懸濁したTrkBを過剰発現させた。
- 400 μLの酢酸アンモニウム緩衝液および0.5 μLのATPストック溶液(ステップ3.2で調製)を各チューブに加え、ロッキングしながら室温で1時間インキュベートする。
- ステップ7.1.2および7.1.4で調製したサンプルを4°Cで10,000 x g で1分間スピンし、上清を捨てた。
- 得られたペレットを500 μLの酢酸アンモニウム緩衝液で10分間洗浄し、4°Cで10,000 x g で1分間再びスピンさせ、上清を捨てる。
- 各ペレットに、220 μLの酢酸アンモニウム緩衝液、25 μLの10%ヤギ血清、および5 μLの一次抗BDNF抗体を加える。低温室(4°C)で一晩ロッキングしながらインキュベートする。
- インキュベーション工程の完了時に、混合物を4°Cで10,000 x g で1分間スピンさせ、上清を捨てた。
- 得られたペレットを1%中性洗剤(例えば、コール酸ナトリウム)を含む酢酸アンモニウム緩衝液で10分間3回洗浄し、混合物を4°Cで10,000 x g で1分間スピンさせ、上清を廃棄する。
- 900 μLの酢酸アンモニウム緩衝液、100 μLの10%ノルマルヤギ血清、および1 μLのフルオロフォア結合二次抗体(1:1,000希釈)を混合して二次抗体溶液を調製する。ステップ7.1.9で得られたペレットのそれぞれに300μLの二次抗体溶液を加える。揺動しながら4°Cで一晩インキュベートした。
- 混合物を10,000 x g で4°Cで1分間スピンさせ、上清を捨てる。
- 得られたペレットを1%の中性洗剤(例えば、コール酸ナトリウム)を含む酢酸アンモニウム緩衝液で10分間3回洗浄し、混合物を4°Cで10,000 x g で1分間スピンさせ、上清を捨てる。
- 得られたペレットを50μLの酢酸アンモニウム緩衝液に再懸濁する。各混合物を20μLをスライドの上に置き、カバースリップで覆う。
- IAM をイメージします。パソコン。固体レーザーシステムを用いて生成された488nmでの励起および520nmでの発光を有する共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて固定化された細胞膜断片を有するDD2粒子。NA が 0.75 で WD が 0.35 mm の 20 倍の対物レンズを使用します。
- マーカーリガンドとして7,8-DHFを用いた正面アフィニティークロマトグラフィー
- CMACカラムをダイオードアレイ検出器および/または質量分析計を備えたHPLCシステムに接続します。
- 5%メタノールを含む酢酸アンモニウム緩衝液中の7,8-DHFの1 mM溶液500 mLを調製する。
- マーカーリガンド(1 mM)の一定濃度をCMACカラムに室温で0.4 mL/minの流速でポンプで送ります。ダイオードアレイ検出(DAD)(波長254nm)検出器または質量分析計(シングルイオンモニタリングモードを使用、マイナスイオン化モードでm/z 253を使用)を使用して溶出プロファイルを監視します。
- ラン終了後、カラムを通して酢酸アンモニウム緩衝液を流して一晩洗浄を行う。
- 手順 7.2.2 を繰り返します。- 7.2.4.異なる濃度のマーカーリガンド(750nM、500nM、300nM)を用いて、各ラン後にカラムを一晩洗浄した。正面アフィニティークロマトグラフィーを使用して、詳細にレビューされたリガンドKdを他の場所で計算します。24,51の
- ツボクサ・アジアティカ(L.)ウルブによる変位研究(ゴツコラ)エキス
- 5%メタノールおよび0.2%水性ゴツコラ抽出物(10mg/mL)を含む酢酸アンモニウム緩衝液中に7,8-DHFの500nM溶液500mLを調製する。
- マーカーリガンド(500 nM)の一定濃度をポンプで抽出し、室温で0.4 mL/minの流速でカラムを通す。DAD検出器(波長254nm)または質量分析計(シングルイオンモニタリングモードを使用、マイナスイオン化モードでm/z 253を使用)のいずれかを使用して溶出プロファイルを監視します。
- ラン終了後、カラムを通して酢酸アンモニウム緩衝液を流して一晩洗浄を行う。
- 500nM 7,8-DHFの溶出プロファイルと、ゴツコラ抽出物で溶液を実行した後に得られたものをプロットし、マーカーリガンド変位を検査する。
8. ゴツコラ抽出物から潜在的なTrkB結合剤を同定するためのピーククロマトグラフィーアプローチの欠落
- CMACカラムでのゴツコラ抽出物の分画
- CMAC TrkB カラムと TrkB-NULL カラムを別々に HPLC システムに接続し、各カラムに 50 μL の水性ゴツコラ抽出物 (10 mg/mL) を注入します。5% メタノールを含む酢酸アンモニウム緩衝液 (10 mM, pH 7.4) を室温で 0.4 mL/分の流速でカラムにポンプで通します。
- CMAC TrkB および TrkB-NULL カラムとは別に、0 ~ 5 分、5 ~ 10 分、10 ~ 15 分、15 ~ 20 分、20 ~ 25 分、25 ~ 30 分、30 ~ 35 分、35 ~ 40 分、40 ~ 45 分、45 ~ 50 分、50 ~ 55 分、55 ~ 60 分。
- 得られた画分を凍結し凍結乾燥する。凍結乾燥画分を50 μLのメタノールに再懸濁してから、超高速液体クロマトグラフィーおよび質量分析分析に進みます。
- 超高速液体クロマトグラフィー四重極飛行時間質量分析(UPLC-QTOF-MS)分析
- ポイント8.1.3で得られたすべての分画を分析します。UPLCシステムと結合された質量分析計を使用する(UPLC-MSE 分析モード)。C18 カラム (2.1 x 50 mm, 1.7 μm) と C18 VanGuard プレカラム (2.1 mm x 5 mm, 1.7 μm) を使用してフラクションを分析します。
- 移動相A(0.1%ギ酸を含む水)およびB(0.1%ギ酸を含むアセトニトリル)を用いて、以下のグラジエント溶液を用いて0.3mL/minの流速でカラムを溶出する:0.0分99%A 1%B、1.5分84%A 16%B、5.0分80%A 20%B、7.0分75%A 25%B、 10.0分 65% A 35% B, 20.0-24.0 分 1% A 99% B, 25.0-29.0 分 99% A 1% B.
- 各サンプルの注入量を 3 μL に設定します。MSE を分解能の正イオンモードと負イオンモードで実行し、衝突エネルギーは低エネルギーの場合は 4V、高エネルギーの場合は 20 ~ 35 V にします。
- 陽イオン化モードでは、キャピラリー電圧1.5kV、サンプリングコーン40V、ソースオフセット80、ソース温度100°C、脱溶媒温度350°C、コーンガス流量38.0L/h、脱溶媒和ガス400L/hのESIソース条件を使用します。
- 負イオン化モードでは、キャピラリー電圧1.45kV、サンプリングコーン40V、ソースオフセット80、ソース温度110°C、脱溶媒温度300°C、コーンガス流量50.0L/h、脱溶媒和ガス流量652L/hのESIソース条件を使用します。
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Representative Results
プロトコールに従って、2つのCMACクロマトグラフィーカラムを組み立てました:1つは過剰発現TrkBを有する固定化SH-SY5Y神経芽腫細胞膜断片、もう1つはSH-SY5Y TrkB-NULL細胞膜断片を有する。正しく組み立てられたCMACカラムを図 1 に、細胞膜断片の固定化に関与するステップを 図2に示します。
IAM上のTrkB受容体の固定化以来。パソコン。DD2クロマトグラフィー固定相はこれまで試みられていなかったが、受容体の固定化の成功は、マーカーリガンド:7,8-DHFを用いた抗体染色および正面アフィニティークロマトグラフィーによって確認された。抗体染色実験の概略図を 図2に示す。TrkB受容体を過剰発現する神経芽細胞腫細胞株から得られた細胞膜断片およびTrkB受容体を有さない親細胞株からの細胞膜断片(TrkB-NULL))をIAMに固定化した。パソコン。最適化されたプロトコルを使用したDD2粒子。続いて、固定化細胞膜断片を有する粒子をBDNF(生理学的リガンド)と共にインキュベートし、次いで一次抗体および蛍光標識二次抗体と共にインキュベートした(図2)。IAM.パソコン。DD2粒子は、固定化された神経芽細胞腫TrkB細胞膜断片およびBDNFの存在下で、蛍光標識された粒子をもたらした(図3C)。TrkB-NULL細胞膜内包IAM粒子を調査した場合(図3A)、またはTrkB細胞膜内包IAM粒子の場合にBDNFを使用しない場合(図3B)に蛍光(弱いバックグラウンド蛍光を除く)は観察されなかった。
固定化されたTrkB受容体への小さなマーカーリガンド(7,8−DHF)の結合を特徴付けるために、正面アフィニティークロマトグラフィーを、異なる濃度の7,8−DHFを用いて行った。機能的なCMACカラム上で7,8-DHF濃度を上昇させた典型的なクロマトグラムを 図4に示します。固定化TrkBへの7,8-DHFの特異的結合は、マーカーリガンドの保持時間の低下を濃度依存的に確認した。非機能性CMACカラム上で得られた正面アフィニティークロマトグラフィーの結果を 図5に示す。マーカーリガンドの保持における濃度依存的な変化の欠如は、CMAC調製における失敗した試みを示す。
CMACカラムに注入された化合物は、特異的に相互作用するだけでなく、IAMと非特異的に相互作用することもできる。パソコン。DD2粒子、固定化された細胞膜断片のリン脂質二重層、および二重層に存在する他のタンパク質。TrkB結合剤の複合体抽出物のスクリーニングプロセス中にCMACカラムと非特異的に相互作用する化合物を除外するには、標的タンパク質を発現していない親細胞株(この場合はTrkB-NULL)の細胞膜断片を固定化することによってCMACネガティブコントロールカラムを調製することが重要です。陰性CMAC TrkB-NULLカラム上で得られた正面アフィニティークロマトグラフィーの結果を 図6に提示する。
機能的 CMAC カラムは、標的タンパク質の特性評価、個々の化合物と固定化標的との相互作用の研究 (例えば、解離定数 Kd の取得)、結合動態の決定 (k on および koff) など、さまざまな目的に使用できます。このカラムは、TrkB受容体に結合する化合物の存在について植物抽出物などの複雑なサンプルをスクリーニングするためにも使用でき、したがって、TrkBアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する分子を含む可能性があります。抽出物が固定化受容体と相互作用する化合物を潜在的に含むかどうかを検証するために、単純な置換実験が行われる。機能的なTrkBカラム上で7,8-DHFのゴツコラ抽出物と500nMで行った競合実験の結果を図7に提示する。0.2%水性ゴツコラ抽出物(10mg/mL)の添加は、アゴニスト結合部位に対する競合リガンドの存在を示す7,8-DHF保持の有意な減少をもたらした。CMAC陰性のTrkB-NULLカラムに対して行った変位実験の結果を図8に示します。そのカラムにおける7,8-DHF保持の減少の欠如は、CMAC TrkB-NULLカラム上の機能的なTrkB受容体の欠如をさらに確認する。
固定化ターゲットと特異的に相互作用する特殊な代謝産物を同定するために、CMACカラムは、置換実験後のミッシングピーククロマトグラフィー52 と呼ばれるアプローチで使用されます。このアプローチでは、調査された抽出物の少量が、調査された固定化標的およびCMACネガティブコントロールカラムを含むカラム上で並行してクロマトグラフィー処理される。これら 2 つのカラムはターゲットの発現が異なるため、個々の分子の保持パターンの違いは、これらの TMP を含む CMAC カラムで調査されたターゲットとの相互作用の特定の性質によるものです。両方のカラムからタイミングが設定された画分が収集、濃縮され、その後 C18 カラムで分析されます。得られたクロマトグラムを比較し、両カラムに同様に保持されたピークで表される化合物を非特異的に相互作用する分子として標識する。固定化受容体を有するCMACカラム上の後の画分におけるピークの存在およびCMAC陰性カラムの初期画分における同じ化合物を表すピークの欠如は、化合物と固定化標的との特異的相互作用を表す。この工程で同定された化合物は、生体誘導分画を行うことなく、単離およびさらなる試験の標的とすることができる。ミッシングピーククロマトグラフィーアプローチは、ゴツコラ抽出物からTrkB受容体と特異的に相互作用する化合物を同定するために使用された。ゴツコラ抽出物をTrkBおよびTrkB-NULLカラムの両方で分画し、これらの画分中に存在する化合物をUPLC-QTOF-MSを用いて分析した。各画分のクロマトグラムの調査は、TrkBカラム(50〜55分画分)に強く保持された化合物の同定につながり、TrkB−NULLカラム(0〜5分画分)では早期に溶出し、固定化されたTrkB受容体との特異的相互作用を示した(図9)。~17.48分で溶出する化合物(図9)は、機能アッセイにおける単離および試験の標的とされるようになりました。
図1.CMACカラムを正しく組み立てた。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2.CMAC調製工程および固定化受容体の蛍光抗体標識。 CMACカラムの調製(1-4)および抗体標識実験(5-8)の模式図。(1)標的膜貫通タンパク質を含むホモジナイズされた細胞膜断片、TrkB.(3)細胞膜断片をIAM粒子の表面に固定化する。(4)細胞膜断片を固定化したIAM粒子をガラスカラムに充填する。(5)TrkB受容体を細胞膜断片に固定化する工程。(6)機能的TrkB受容体への天然リガンドBDNFの結合。(7)BDNF分子に対する一次抗体の結合。(8)緑色蛍光を生じる一次抗体に対するフルオロフォア標識二次抗体の結合。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3.TrkB受容体を有する細胞膜断片をIAM粒子上に固定化する。 IAM粒子上の機能的TrkB受容体を有する細胞膜断片の固定化を示す共焦点顕微鏡画像。(a)BDNF、一次抗体、およびフルオロフォア標識二次抗体とのインキュベーション後にIAM粒子に固定化されたSH-SY5Y TrkB-NULL細胞株由来の細胞膜断片。(b)BDNFを含まない一次抗体および蛍光色素標識二次抗体とのインキュベーション後にIAM粒子に固定化されたTrkBを発現するSH-SY5Y神経芽腫細胞株由来の細胞膜断片。(c)BDNF、一次抗体、およびフルオロフォア標識二次抗体とのインキュベーション後にIAM粒子上に固定化されたTrkBを発現するSH-SY5Y神経芽腫細胞株由来の細胞膜断片。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4.TrkB CMACカラム上の7,8-DHFの正面親和性クロマトグラム。 TrkB CMACカラム上の7,8-DHFの濃度増加の正面クロマトグラム(ここで、A-1 mM、B - 750 nM、C - 500 nM、およびD - 300 nM)。酢酸アンモニウム緩衝液 (10 mM, pH 7.4) と 5% メタノールを溶離液として 0.4 mL/minの流速で使用 しました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5.非機能TrkB CMACカラム上の7,8-DHFの正面親和性クロマトグラム。 非機能的TrkB CMACカラム上の異なる濃度の7,8-DHFのフロンタルクロマトグラム(A-1 μM、B - 1 μM、C - 750 nM、およびD - 500 nM)。酢酸アンモニウム緩衝液 (10 mM, pH 7.4) と 5% メタノールを溶離液として 0.4 mL/minの流速で使用 しました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6.TrkB-NULL CMACカラム上の7,8-DHFの正面アフィニティークロマトグラム。 TrkB-NULL CMAC カラム上の 7,8-DHF 濃度の増加を示す正面クロマトグラム (A - 1 mM、B - 750 nM、C - 500 nM、および D - 300 nM)。5 % メタノールを含む酢酸アンモニウム緩衝液 (10 mM、pH 7.4) を溶離液として 0.4 mL/minの流速で使用 しました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7.TrkB CMACカラム上の0.2%ゴツコラ抽出物を含む7,8-DHFの前頭親和性クロマトグラム。 CMAC TrkBカラム上の(A)500nM 7,8-DHF+0.2%ゴツコラ抽出物(10mg/ml)および(B)500nM 7,8-DHFの代表的な前頭溶出プロファイル。酢酸アンモニウム緩衝液 (10 mM, pH 7.4) と 5% メタノールを溶離液として 0.4 mL/minの流速で使用 しました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図8.TrkB-NULL CMACカラム上の0.2%ゴトゥコラ抽出物を含む7,8-DHFの前頭親和性クロマトグラム。 TrkB-NULL CMACカラム上の(A)500 nM 7,8-DHFおよび(B)500 nM 7,8-DHF+0.2%ゴツコラ抽出物(10mg/mL)の代表的な正面溶出プロファイル。酢酸アンモニウム緩衝液 (10 mM, pH 7.4) と 5% メタノールを溶離液として 0.4 mL/minの流速で使用 しました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図9.ゴツコラ抽出物画分のUPLC-MSクロマトグラム。 (A)TrkB-NULL CMACカラムから0〜5分間溶出したゴツコラ抽出物画分および(C)CMAC TrkBカラムから50〜55分間溶出したゴツコラ抽出物画分のUPLC−MSクロマトグラム。両方の画分に存在する17.48分の保持時間を有する化合物を、一致した質量スペクトルによって確認されるように(B および D)、潜在的なTrkB結合剤として同定した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| ホモジナイズバッファー | ||||
| 1 | トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩酸塩(トリス塩酸塩) | 50ミリオンメートル | ||
| 2 | 塩化ナトリウム(NaCl) | 100ミリアンペア月間 | ||
| 3 | 無水塩化カルシウム(CaCl2) | 3ミリオン | ||
| 4 | 塩化マグネシウム六水和物(MgCl2) | 2ミリオンユーロ | ||
| 5 | 塩化カリウム(KCl) | 5ミリオン | ||
| 6 | フェニルメタンスルホニルフルオリド(PMSF) | 0.1 ミリアンペア時 | ||
| 7 | ベンザミジン | 3ミリオン | ||
| 8 | プロテアーゼ阻害剤カクテル(100X) | (1/100) | ||
| 9 | グリセロール | 10% | ||
| 10 | アデノシン5'-三リン酸(ATP)二ナトリウム塩水和物 | 100 μM | ||
| 11 | エチレンジアミン四酢酸(EDTA) | 5ミリオンユーロ | ||
表 1.均質化緩衝液組成。
| 可溶化バッファー | ||||
| 1 | トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩酸塩(トリス塩酸塩) | 50ミリオンメートル | ||
| 2 | 塩化ナトリウム(NaCl) | 100ミリアンペア月間 | ||
| 3 | 無水塩化カルシウム(CaCl2) | 3ミリオン | ||
| 4 | 塩化マグネシウム六水和物(MgCl2) | 2ミリオンユーロ | ||
| 5 | 塩化カリウム(KCl) | 5ミリオン | ||
| 6 | フェニルメタンスルホニルフルオリド(PMSF) | 0.1 ミリアンペア時 | ||
| 7 | ベンザミジン | 3ミリオン | ||
| 8 | プロテアーゼ阻害剤カクテル(100X) | (1/100) | ||
| 9 | グリセロール | 10% | ||
| 10 | アデノシン5'-三リン酸(ATP)二ナトリウム塩水和物 | 100 μM | ||
| 11 | コール酸ナトリウム | 2% | ||
表 2.可溶化緩衝液組成物。
| 透析バッファー | ||||
| 1 | トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩酸塩(トリス塩酸塩) | 50ミリオンメートル | ||
| 2 | 塩化ナトリウム(NaCl) | 100ミリアンペア月間 | ||
| 3 | 無水塩化カルシウム(CaCl2) | 0.1 ミリアンペア時 | ||
| 4 | エチレンジアミン四酢酸(EDTA) | 5ミリオン | ||
| 5 | フェニルメタンスルホニルフルオリド(PMSF) | 0.1 ミリアンペア時 | ||
表 3.透析用緩衝液組成物。
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Discussion
特殊な代謝産物の複雑な混合物中に存在する活性化合物の同定は、非常に困難な作業である23。伝統的に、個々の化合物は単離され、その活性は異なるアッセイで試験される。このアプローチは、時間と費用がかかり、しばしば、最も豊富で十分に特徴付けられた化合物23の単離および同定をもたらす。現在使用されているハイスループットスクリーニングアッセイは、すでに既知の標的を有するコンビナトリアルケミストリーライブラリーのスクリーニングに大きく依存しており、複雑な混合物中に存在する生物学的に活性な化合物を同定および単離するようには設計されていない53。
CMACは、TMPs23、24、54を標的とする化合物の同定を可能にする。この技術ではTMPsを有する細胞膜断片がIAM固定相粒子23、24の表面に固定化される。CMACは、細胞膜リン脂質二重層24を模倣する固体支持体上の標的タンパク質を有する細胞膜断片の固定化を可能にするユニークなアプローチである。これにより、固定化タンパク質標的の機能性を維持し、CMACを使用してTMPと相互作用する小分子を同定しながら、生理学的条件に近い状態を提供することができます。CMACは、現在使用されている他のアッセイでは試験できない、独自の天然物ライブラリーからの新規化学足場を発見する機会という利点を提供します23。.提案されたアプローチは、TMPsと相互作用する化合物の同定を可能にし、この相互作用の性質を解明するものではない。相互作用の様式(アロステリックまたはオルソステリック相互作用;阻害または活性化)は、機能的な細胞ベースのアッセイを用いて検証する必要がある。固定化タンパク質標的を有するCMACはまた、標的と相互作用する小分子リガンドの薬力学(例えば解離定数、Kd)の特性評価または結合動態(konおよびkoff)の決定、ならびに固定化タンパク質24上の結合部位の特性評価の過程において使用され得る。.CMACはTMPに結合する化合物の同定のみを可能にするが、天然混合物からの創薬プロセスにおける現在主要なボトルネックとなっている化合物精製を必要としないため、創薬パイプラインの最初のステップを大幅にスピードアップする革新的なアプローチである。
提示されたプロトコルは、1つの膜貫通受容体(TrkB)の固定化に焦点を当てていますが、CMAC技術は、他の標的を有するカラムの調製に利用することができる。CMAC調製の重要な側面の1つは、細胞膜断片を単離するために使用される細胞株または組織の選択である。固定化受容体と相互作用する化合物の複雑な混合物のスクリーニングにカラムを使用する場合は、標的タンパク質を過剰発現する細胞株を使用することをお勧めします。このような細胞株を使用すると、固定化標的の数が増え、標的に対する親和性が低いか、または分子が豊富でない化合物を同定する機会が増えます。固定化タンパク質の特性評価に焦点を当てる場合、タンパク質が受ける翻訳後修飾およびリン脂質環境がトランスフェクトされた細胞株で有意に異なる可能性があるため、天然細胞株の使用が推奨される。
細胞膜単離およびIAM粒子への固定化のいくつかの態様は重要であり、受容体タイプまたはタンパク質の供給源に応じて修飾を必要とする場合がある。固定化タンパク質のタンパク質分解的切断を防止するために、ホモジナイゼおよび可溶化緩衝液中で適切なプロテアーゼ阻害剤を使用することが不可欠である。文献検索は、必要なプロテアーゼ阻害剤を同定するために推奨される。プロトコル最適化の過程で、我々は、ATPおよびグリセロールの添加が、TrkBを固定化する際にCMACカラム上の結合部位の数(Bmax)を増加させることを決定した。他のタイプの膜貫通標的24の固定化を最適化する際に他の補因子が必要であり得る。現在、我々はTrkB固定化の過程でコレステロールの付加を研究しており、最近コレステロールがTrkBリガンド48の効果を修飾することが判明した。機能的なCMACカラム24を得るためには、コレステロールおよび/または他の脂質の添加が必要であり得ることが以前に報告されていた。
異なるタイプの検出器は、発色団を有するリガンド用のダイオードアレイ検出器、質量分析、または放射性リガンド用の無線流検出器を含むカラム溶出液を監視するために使用され得る。
CMAC カラムの安定性を監視することは非常に重要です。CMAC カラムは、固定化タンパク質の種類、使用頻度、および保存条件に応じて、最大数ヶ月間安定である可能性があります。カラムが 1 週間以上使用されていない場合は、カラムを 4 °C の酢酸アンモニウムバッファー中の 0.05% アジ化ナトリウム溶液に保存することをお勧めします。カラムの使用を試みる前に、より長い期間が経過した後、酢酸アンモニウム緩衝液でカラムを徹底的に洗浄することが重要です。マーカーリガンドの選択された濃度を毎週注入することによって、カラムの機能性を監視することをお勧めします。
多くの利点にもかかわらず、CMAC技術には、創薬努力でカラムを使用する際に考慮する必要があるいくつかの制限があります。第一に、固定化された膜貫通標的の数は時間とともに減少するため、結合部位の総数を毎週24回モニターすることが推奨される。この減少の理由の1つは、吸着に基づいており、共有結合の導入を伴わない固定化プロセスの結果である。親油性化合物は、IAM表面およびリン脂質二重層への有意な非特異的結合のために、CMACカラム上に強く保持され得る。これにより、分析時間が大幅に増加し、スループットが低下します。CMACカラム調製のプロセスは細胞株特異的であり、固定化タンパク質の性質を完全に理解する必要があるため、特性の低いターゲットには適していません。
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Disclosures
Lukasz CieslaはIAMのプロバイダーであるRegis Technologiesと協力しています。パソコン。DD2 パーティクル。
Acknowledgments
Z.C.A.は、トルコ科学技術研究評議会(TUBITAK)2219-国際ポスドク研究フェローシッププログラムの支援を受けました。この出版物で報告された研究は、国立衛生研究所の国立補完統合医療センターによって、賞番号1R41AT011716-01の下で支援されました。この研究は、米国生薬学会のスターターグラント、L.C.へのレジステクノロジーズ助成金によって部分的に支援されました。コンテンツは著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7-8 Dihydroxyflavone hydrate | Sigma-Aldrich | D5446-10 mg | ≥98% (HPLC) |
| Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A2383-1 g | |
| Ammonium acetate | VWR Chemicals BDH | BDH9204-500 g | |
| BDNF antibody | Invitrogen | PA5-15198-400 μL | Primary antibody; 2 mg/mL of concentration |
| Benzamidine hydrochloride hydrate | Sigma-Aldrich | B6506-25 g | |
| Brain derived neurotrophic factor (BDNF) human | Sigma-Aldrich | B3795-10 μg | Recombinant, expressed in E. coli, lyophilized powder, suitable for cell culture |
| Calcium chloride | VWR Analytical | BDH9224-1 kg | |
| Cholic acid sodium salt | Alfa Aesar | J62050-100 g | |
| Dounce homogenizer | VWR | 71000-516 | 40 mL, 285 mm (overall lenght), 32 x 140 mm (O.D. x H) |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 493511 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | VWR Analytical | BDH-9232-500 g | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F2442-500 mL | sterile-filtered, suitable for cell culture |
| G418 disulfate salt solution | Sigma-Aldrich | G8168-100 mL | 50 mg/mL in H2O, 0.1 μm filtered, suitable for cell culture |
| Glycerol | VWR Life Science | E520-100 mL | |
| Immobilized artificial membrane (IAM.PC.DD2) | Regis Technologies, Inc. | 1-771050-500 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | VWR Analytical | BDH9244-500 mL | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 322425 | |
| Nikon C2 DUVb | Nikon | Confocal laser scanning microscope | |
| Normal goat serum (10%) | Life Technologies | 50197Z | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100 mL | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Thermo Scientific | 36978-5 g | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | VWR Life Science | K812-500 mL | 1x |
| Potassium chloride | VWR Chemicals BDH | 0395-1 kg | |
| Protease inhibitor cocktail | VWR Life Science Ambreso | M221-1 mL | Proteomics grade, containing 50 mM AEBSF, 30 µM aprotonin, 1 mM bestatin, 1 mM E-64 and 1 mM leupeptin |
| RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R8758-500 mL | with L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
| Secondary antibody goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen Alexa Flour Plus 488 | A32731 | |
| SH-SY5Y Neuroblastoma cell lines expressing Trk-B | Kerafast | ECP007 | |
| SH-SY5Y Trk-NULL cell line | Kerafast | ECP005 | |
| Snake skin dialysis tubing | Thermo Scientific | 88245 | 10K MWCO, 35 mm dry I.D. |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium chloride | BDH VWR Analytical | BDH9286-2.5 kg | |
| Tricorn 5/20 column | GE Healthcare | 24-4064-08 | |
| Tris-HCl | VWR Life Science | 0497-1 kg | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4049-500 mL | 0.25%, sterile-filtered, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA |
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