Summary
Das Protokoll beschreibt die Herstellung von CMAC-Säulen (Cell Membrane Affinity Chromatography) mit immobilisierten Zellmembranfragmenten, die funktionelle Transmembran-Tropomyosin-Kinase-Rezeptor-B-Proteine enthalten. Die Verwendung von CMAC-Säulen bei der Identifizierung spezialisierter Pflanzenmetaboliten, die mit diesen Rezeptoren interagieren und in komplexen natürlichen Mischungen vorhanden sind, wird ebenfalls erläutert.
Abstract
Chemikalien, die von Pflanzen, Pilzen, Bakterien und wirbellosen Meerestieren synthetisiert werden, waren eine reiche Quelle für neue Drogen und Blei. Medikamente wie Statine, Penicillin, Paclitaxel, Rapamycin oder Artemisinin, die üblicherweise in der medizinischen Praxis verwendet werden, wurden zuerst identifiziert und aus Naturprodukten isoliert. Die Identifizierung und Isolierung von biologisch aktiven spezialisierten Metaboliten aus natürlichen Quellen ist jedoch ein herausfordernder und zeitaufwendiger Prozess. Traditionell werden einzelne Metaboliten nach der Extraktion von Biomasse aus komplexen Gemischen isoliert und gereinigt. Anschließend werden die isolierten Moleküle in funktionellen Assays getestet, um ihre biologische Aktivität zu überprüfen. Hier stellen wir die Verwendung von CMAC-Säulen (Cellular Membrane Affinity Chromatography) vor, um biologisch aktive Verbindungen direkt aus komplexen Gemischen zu identifizieren. CMAC-Säulen ermöglichen die Identifizierung von Verbindungen, die mit immobilisierten funktionellen Transmembranproteinen (TMPs) interagieren, die in ihre native Phospholipid-Doppelschichtumgebung eingebettet sind. Dies ist ein gezielter Ansatz, der voraussetzt, den TMP zu kennen, dessen Aktivität man mit dem neu identifizierten niedermolekularen Wirkstoffkandidaten modulieren will. In diesem Protokoll stellen wir einen Ansatz zur Herstellung von CMAC-Säulen mit immobilisiertem Tropomyosin-Kinase-Rezeptor B (TrkB) vor, der sich zu einem brauchbaren Ziel für die Wirkstoffforschung bei zahlreichen Erkrankungen des Nervensystems entwickelt hat. In diesem Artikel stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Montage der CMAC-Säule mit immobilisierten TrkB-Rezeptoren unter Verwendung von Neuroblastom-Zelllinien zur Überexpression von TrkB-Rezeptoren vor. Wir stellen ferner den Ansatz vor, die Funktionalität der Säule und ihre Verwendung bei der Identifizierung spezialisierter Pflanzenmetaboliten zu untersuchen, die mit TrkB-Rezeptoren interagieren.
Introduction
Botanische Mischungen sind reich an pharmakologisch aktiven Verbindungen1 und dienen als gute Quelle für die Identifizierung neuer Arzneimittel-Hits und -Leads 2,3,4,5. Die Entdeckung neuer Medikamente aus Naturprodukten war ein fruchtbarer Ansatz, und viele derzeit zugelassene Medikamente stammen aus Verbindungen, die zuerst in der Natur identifiziert wurden. Die chemische Vielfalt von Naturstoffen ist schwer von künstlichen Bibliotheken chemisch synthetisierter Moleküle zu erreichen. Viele natürliche Verbindungen interagieren mit und modulieren menschliche Proteinziele und können als evolutionär optimierte arzneimittelähnliche Molekülebetrachtet werden 6. Diese Naturstoffe eignen sich besonders gut für die Identifizierung von Wirkstoff-Blei zur Verwendung bei neurologischen Erkrankungen6. Zwei der derzeit von der FDA zugelassenen Medikamente zur Behandlung der Alzheimer-Krankheit (AD) stammen aus natürlichen Alkaloiden, nämlich: Galantamin und Rivastigmin (ein Derivat von Physostigmin)6. L-DOPA, derzeit das am häufigsten verschriebene Medikament gegen die Parkinson-Krankheit, wurde zuerst aus der breiten Bohne (Vicia faba L.) identifiziert. 7. Pergolid und Lisurid, dopaminerge Rezeptoragonisten sind die Derivate natürlicher Mutterkornalkaloide aus dem parasitären Pilz Claviceps purpurea8. Reserpine, ein aus der indischen Schlangenwurzel (Rauvolfia serpentina (L.) Benth. ex Kurz) isoliertes Alkaloid, war eines der ersten Antipsychotika9. In jüngster Zeit wurden eine fehlregulierte Immunantwort und eine systemische Entzündung mit der Entwicklung zahlreicher neurologischer Erkrankungen wie schweren depressiven Störungen oder neurodegenerativen Erkrankungen in Verbindung gebracht10. Es wurde festgestellt, dass eine pflanzliche Ernährung zusammen mit anderen Lebensstilinterventionen die kognitiven und funktionellen Fähigkeiten bei älteren Menschen verbessert 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Es wurde festgestellt, dass bestimmte elektrophile Moleküle, die zu Triterpenen und Polyphenolen gehören, Entzündungsreaktionen sowohl in vitro- als auch in vivo-Modellen modulieren 12. Zum Beispiel stören natürliche Verbindungen, die α,β-ungesättigtes Carbonyl (z. B. Curcumin, Zimtaldehyd) oder Isothiocyanatgruppe (z. B. Sulforaphan) enthalten, die Toll-like-Rezeptor-4 (TLR4) -Dimerisierung, die die nachgeschaltete Synthese von proinflammatorischen Zytokinen in einer murinen Interleukin-3-abhängigen Pro-B-Zelllinie hemmt12,22 . Epidemiologische Beweise deuten stark darauf hin, dass diätetische Phytochemikalien, die in komplexen Lebensmittelmatrizen vorhanden sind, auch eine brauchbare Quelle für neue Arzneimittelleitungen darstellenkönnen 6.
Eines der Haupthindernisse bei der Identifizierung biologisch aktiver Moleküle in Pflanzenextrakten, einschließlich pflanzlicher Lebensmittel, ist die Komplexität der untersuchten Proben. Traditionell werden die einzelnen Verbindungen isoliert, gereinigt und anschließend auf biologische Aktivität getestet. Dieser Ansatz führt in der Regel zur Identifizierung der am häufigsten vorkommenden und gut charakterisierten Verbindungen. Phänotypische Wirkstoffforschungsansätze ohne definiertes molekulares Ziel beruhen auf der bio-geführten Fraktionierung komplexer Gemische23. Bei diesem Ansatz wird ein Extrakt in weniger komplexe Unterfraktionen fraktioniert, die anschließend in phänotypischen Assays getestet werden. Die Isolierung und Reinigung von Wirkstoffen wird durch die im Assay verifizierte biologische Aktivität geleitet. Die Kenntnis der Identität eines spezifizierten Wirkstoffziels kann die Identifizierung pharmakologisch aktiver Verbindungen, die in komplexen Gemischen vorhanden sind, erheblich beschleunigen. Diese Ansätze basieren in der Regel auf der Immobilisierung des molekularen Ziels, beispielsweise eines Enzyms, auf einer festen Oberfläche, wie magnetischen Perlen23. Die immobilisierten Targets werden anschließend in den Screening-Experimenten verwendet, was zur Isolierung von Verbindungen führt, die mit dem Target interagieren. Während dieser Ansatz bei der Identifizierung von Verbindungen, die auf zytosolische Proteine abzielen, umfassend verwendet wurde, wurde er bei der Identifizierung von Chemikalien, die mit Transmembranproteinen (TMPs) interagieren, seltener angewendet23. Eine zusätzliche Herausforderung bei der Immobilisierung von TMPs ergibt sich aus der Tatsache, dass die Aktivität des Proteins von seiner Wechselwirkung mit Zellmembranphospholipiden und anderen Molekülen in der Doppelschicht wie Cholesterin23,24 abhängt. Es ist wichtig, diese subtilen Wechselwirkungen zwischen Proteinen und ihrer nativen Phospholipid-Doppelschichtumgebung zu erhalten, wenn versucht wird, das Transmembranziel zu immobilisieren.
In der Zellmembranaffinitätschromatographie (CMAC) werden Zellmembranfragmente und nicht gereinigte Proteine auf den stationären Phasenpartikeln der künstlichen Membran (IAM)immobilisiert 23. Stationäre IAM-Phasen werden durch kovalente Bindung von Phosphatidylcholinanaloga an Siliciumdioxid hergestellt. In jüngster Zeit wurden neuartige Klassen von stationären IAM-Phasen entwickelt, in denen freie Amin- und Silanolgruppen endgekappt sind (IAM. PC. DD2-Partikel). Während der CMAC-Säulenvorbereitung werden Zellmembranfragmente durch Adsorption auf die Oberfläche von IAM-Partikeln immobilisiert.
CMAC-Säulen wurden bisher verwendet, um verschiedene Klassen von TMPs zu immobilisieren, einschließlich Ionenkanäle (z. B. Nikotinrezeptoren), GPCRs (z. B. Opioidrezeptoren), Proteintransporter (z. B. p-Glykoprotein) usw. 24. Die immobilisierten Proteintargets wurden bei der Charakterisierung der Pharmakodynamik (z. B. Dissoziationskonstante, Kd) oder der Bestimmung der Bindungskinetik (kon und koff) von niedermolekularen Liganden, die mit dem Ziel interagieren, sowie bei der Identifizierung potenzieller neuer Wirkstoff-Leads in komplexen Matrizen verwendet24 . Hier stellen wir die Herstellung von CMAC-Säulen mit dem immobilisierten Tropomyosin-Kinase-Rezeptor B (TrkB) vor, der sich als brauchbares Ziel für die Wirkstoffforschung bei zahlreichen Erkrankungen des Nervensystems herausgestellt hat.
Frühere Studien zeigten, dass die Aktivierung des vom Gehirn abgeleiteten neurotrophen Faktors (BDNF) / TrkB-Signalwegs mit der Verbesserung bestimmter neurologischer Erkrankungen wie AD oder schwerer depressiver Störungverbunden ist 25,26,27,28. Es wurde berichtet, dass BDNF-Spiegel und seine Rezeptor-TrkB-Expression bei AD abnehmen, und ähnliche Reduktionen beeinträchtigen die Hippocampus-Funktion in Tiermodellen von AD29. Verminderte BDNF-Spiegel wurden im Serum und im Gehirn von AD-Patienten berichtet 30,31,32. Es wurde festgestellt, dass Tau-Überexpression oder Hyperphosphorylierung die BDNF-Expression in primären Neuronen und AD-Tiermodellen herunterreguliert33,34,35. Darüber hinaus wurde berichtet, dass BDNF in vitro und in vivo36 schützende Wirkungen auf die β-Amyloid-induzierte Neurotoxizität hat. Es wurde gezeigt, dass die direkte BDNF-Verabreichung in das Rattengehirn das Lernen und das Gedächtnis bei kognitiv beeinträchtigten Tierenerhöht 37. BDNF/TrkB erwies sich als gültiges Ziel für die Linderung neurologischer und psychiatrischer Erkrankungen, einschließlich AD28,38. Die Ausrichtung auf den BDNF/TrkB-Signalweg für die Entwicklung von Therapien bei AD wird möglicherweise unser Verständnis der Krankheitverbessern 39. Leider kann BDNF selbst wegen seiner schlechten pharmakokinetischen Eigenschaften und Nebenwirkungen nicht als Behandlung verwendetwerden 40. Kleine Molekülaktivatoren von TrkB/BDNF-Signalwegen wurden als potenzielle TrkB-Liganden41,42,43 untersucht. Unter den getesteten niedermolekularen Agonisten wurde gezeigt, dass 7,8-Dihydroxyflavon (7,8-DHF) den BDNF / TrkB-Signalweg 41,44,45,46 aktiviert. Ein Derivat von 7,8-DHF (R13; 4-Oxo-2-phenyl-4H-chromen-7,8-diylbis(methylcarbamat)) wird derzeit als mögliches Medikament für AD47 in Betracht gezogen. Kürzlich wurde gezeigt, dass mehrere Antidepressiva direkt an TrkB binden und die BDNF-Signalgebung fördern, was die Bedeutung der Verfolgung von TrkB als gültiges Ziel zur Behandlung verschiedener neurologischer Erkrankungenweiter unterstreicht 48.
Das Protokoll beschreibt den Prozess der Zusammenstellung der funktionalen TrkB-Spalte und der TrkB-NULL-Negativkontrollsäule. Die Säulen werden mit einem bekannten Naturprodukt kleinmolekularer Liganden charakterisiert: 7,8-DHF. Darüber hinaus beschreiben wir den Prozess des Screenings komplexer Matrizen am Beispiel von Pflanzenextrakt zur Identifizierung von Verbindungen, die mit TrkB interagieren.
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Protocol
1. Zellkultur von SH-SY5Y-Neuroblastomzellen (TrkB- und TrkB-NULL-Zelllinien (parentale) Zelllinien)
HINWEIS: Zelllinien (SH-SY5Y Cell Line (TrkB, BR6) und SH-SY5Y Parental Cell Line (TrkB NULL))49,50 wurden von Kerafast gekauft. Kultivierte Zellen werden als Quelle der Transmembranrezeptoren verwendet, die für die Herstellung von CMAC-Säulen immobilisiert werden sollen. In den folgenden Schritten wird beschrieben, wie Zellmembranfragmente erhalten und funktionale CMAC-Säulen zusammengesetzt werden.
- Züchten Sie die Zellen in einem Zellkulturmedium, das durch Mischen von 450 ml RPMI-Medien, 50 ml FBS, 5 ml Penicillin/Streptomycin-Lösung und 0,3 mg/ml Genetisch (G418) in einer 150-mm-Zellkulturschale bei 37 °C in feuchter Atmosphäre mit 5%CO2 hergestellt wird.
2. Zellernte
- Bestätigen Sie die Zellkonfluenz (80% -90%) mit einem Mikroskop, das nach 3-4 Tagen nach dem Zellpassing erreicht wird.
- Zellkulturmedium von oberhalb der Zellen aspirieren und die Zellen zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, 1x, pH 7,4) waschen. Entfernen Sie PBS und fügen Sie 2 ml niedrig konzentriertes Trypsin (0,25%) hinzu, um Zellen zu lösen.
- Schwenken Sie die Platte vorsichtig, um alle Zellen gleichmäßig mit Trypsinlösung zu bedecken, und inkubieren Sie die Zellen für ca. 2 min bei 37 °C in einer feuchten Atmosphäre mit 5% CO2. Fügen Sie 8 ml Zellkulturmedium zu ablösenden Zellen hinzu und übertragen Sie abgelöste Zellen in ein 50 ml konisches Röhrchen und legen Sie es auf Eis.
- Verwenden Sie ein Hämozytometer, um die Anzahl der Zellen (ca. 3 x 107 Zellen) zu schätzen. Mischen Sie die Zellsuspension durch Pipettieren nach oben und unten, um eine gleichmäßige Zelldichte in der Mischung zu erhalten. Legen Sie 10 μL Zellsuspension unter das Deckglas und zählen Sie die Zellen unter einem Mikroskop mit einem 40-fachen Objektiv.
3. Zellhomogenisierung
- Bereiten Sie Stammlösungen der folgenden Proteasehemmer vor: Benzamidin (200 mM), Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF, 10 mM) und handelsübliche Proteasehemmer Cocktail (100x Konzentration), die 4-(2-Aminoethyl)benzolsulfonylfluoridhydrochlorid (AEBSF), Aprotinin, Bestatin und Leupeptin enthalten.
ACHTUNG: PMSF sollte nur im Inneren des Abzugs gehandhabt werden.- Bereiten Sie Benzamidin-Stammlösung (200 mM) vor, indem Sie 120 mg Benzamidin in 5 ml ultrareinem entionisiertem Wasser auflösen. Bei 4 °C lagern und innerhalb eines Tages aufbrauchen. Bereiten Sie die Lösung vor jedem Gebrauch frisch vor (empfohlen).
- Bereiten Sie PMSF-Stammlösung (10 mM) vor, indem Sie 0,017 g PMSF in 10 ml Ethanol auflösen. Bei - 20 °C lagern.
- Bereiten Sie einen Proteaseinhibitor-Cocktail (100x) vor, indem Sie die handelsübliche Protease-Inhibitor-Mischung in 1 ml ultrareinem deionisiertem Wasser auflösen. Den Cocktail gründlich und aliquot 200-300 μL vermischen und vor Gebrauch bei - 20 °C lagern.
- Bereiten Sie die ATP-Stammlösung (100 mM) vor, indem Sie 55.114 mg ATP-Dinatriumsalzhydrat in 1 ml entionisiertem Reinstwasser auflösen. Mischen Sie gründlich und aliquot 100 μL der Mischung und lagern Sie sie vor Gebrauch bei - 20 °C.
- Es wird ein Puffer hergestellt, indem 3,03 g Tris(hydroxymethyl)aminomethanhydrochlorid (Tris-HCl, 50 mM), 2,9 g Natriumchlorid (NaCl, 100 mM), 0,22 g wasserfreies Calciumchlorid (CaCl 2, 3 mM), 0,2 g Magnesiumchloridhexahydrat (MgCl2, 2 mM) und 0,19 Kaliumchlorid (KCl, 5 mM) in 500 ml ultrareinem entionisiertem Wasser gelöst werden.
- Es wird ein Homogenisierungspuffer hergestellt, indem 17,3 ml des in Schritt 3.3 hergestellten Puffers mit 0,3 ml (3 mM) Benzamidin-Stammlösung, 0,2 ml (0,1 mM) PMSF-Stammlösung, 0,2 ml Proteaseinhibitor-Cocktailmischung, 20 μL (100 μM) ATP-Stammlösung, 2 ml (10 %) Glycerin und 0,029 g (5 mM) EDTA (Tabelle 1) gemischt werden. Stellen Sie den pH-Wert mit Salzsäurelösung auf 7,4 ein.
- Drehen Sie die in Schritt 2.3 bei 4 °C geernteten Zellen für 5 min bei 400 x g herunter. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie das verbleibende Zellpellet mit 10 ml eiskaltem PBS (1x, pH 7,4). Drehen Sie die Zellen bei 4 °C für 5 min bei 400 x g wieder herunter.
- Der Überstand wird entsorgt und durch 20 ml Homogenisierungspuffer ersetzt, der in Schritt 3.4 vorbereitet wurde. Legen Sie die konische Röhre auf Eis.
- Übertragen Sie die Zellsuspension in einen 40 ml Dounce Homogenisator Tissue Grinder und legen Sie sie auf Eis. Homogenisieren Sie die Suspension manuell auf Eis mit 40 Stößelschlägen nach oben und unten. Homogenisierte Zellsuspension in ein 50 ml konisches Rohr überführen.
- Das Homogenat wird bei 4 °C 7 min bei 400 x g zentrifugiert. Entsorgen Sie das Pellet und geben Sie den Überstand in ein neues konisches Rohr und zentrifugieren Sie es bei 4 ° C für 30 min bei 47900 x g. Speichern Sie das Zellmembranpellet und entsorgen Sie den Überstand.
4. Zellmembran-Solubilisierung
- Es wird ein Lösungsvermittlerpuffer hergestellt, indem 8,7 ml der in Schritt 3.3 hergestellten Pufferlösung mit 0,1 ml (0,1 mM) PMSF-Stammlösung, 0,15 ml (3 mM) Benzamidin-Stammlösung, 0,1 ml Proteaseinhibitor-Cocktail, 10 μL (100 μM) ATP-Stammlösung, 1 ml (10 %) Glycerin und 0,2 g (2 %) Natriumcholat gemischt werden (Tabelle 2).
- Den Solubilisierungspuffer mit den in Schritt 3.8 erhaltenen Zellmembranfragmenten in das konische Rohr überführen und das Pellet resuspendieren. Drehen Sie das resultierende Gemisch bei 150 U/min bei 4 °C für 18 h.
HINWEIS: An diesem Punkt kann das Experiment für die Solubilisierung von Zellmembranpellets über Nacht pausiert werden.
5. Zellmembranimmobilisierung auf IAM. PC. DD2-Partikel
- Nach 18 h zentrifugieren Sie das Lösungsmittel bei 4 °C für 30 min bei 47900 x g.
- Behalten Sie den Überstand und entsorgen Sie das Pellet. Fügen Sie 100 mg IAM hinzu. PC. DD2-Partikel, zum Überstand, wirbeln und drehen das resultierende Suspensionsgemisch bei 150 U/min bei 4 °C für 1 h.
- Um die Immobilisierung von Zellmembranfragmenten auf dem IAM zu erleichtern. PC. DD2-Partikel fahren mit dem Dialyseschritt fort, wie unten beschrieben.
- Dialysepuffer in 4 l hochreinem entionisiertem Wasser unter Zugabe von 24 g Tris-HCl (50 mM), 23,4 g NaCl (100 mM), 0,06 g CaCl2 (0,1 mM), 5,85 g EDTA (5 mM) und 0,07 g PMSF (0,1 mM; Tabelle 3).
HINWEIS: PMSF ist nicht in Wasser löslich, daher lösen Sie es zuerst in einem kleinen Ethanolvolumen auf und fügen Sie es dann langsam in das Becherglas mit dem Puffer hinzu. - Stellen Sie den pH-Wert mit Salzsäurelösung auf 7,4 ein. Stellen Sie den Puffer für mindestens 1 h auf 4 °C, bevor Sie mit dem Dialyseschritt fortfahren.
- Bereiten Sie das Dialyseröhrchen vor, indem Sie 10 cm Zellulosemembran-Dialyseschlauch (10 K MWCO, 35 mm) schneiden und die IAM-haltige Suspension übertragen. PC. DD2-Partikel und Zellmembranfragmente in den Dialyseschlauch. Verwenden Sie Dialyseschlauchclips, um beide Enden der Dialyseröhre zu schließen.
- Platzieren Sie das Dialyseröhrchen, das das IAM enthält. PC. DD2-stationäre Phase im Dialysepuffer und Dialyse bei 4 °C für 24 h unter sanftem Rühren.
- Nach 24 h den Dialyseschlauch in den frisch zubereiteten Dialysepuffer legen und die Dialyse für weitere 24 h fortsetzen.
- Dialysepuffer in 4 l hochreinem entionisiertem Wasser unter Zugabe von 24 g Tris-HCl (50 mM), 23,4 g NaCl (100 mM), 0,06 g CaCl2 (0,1 mM), 5,85 g EDTA (5 mM) und 0,07 g PMSF (0,1 mM; Tabelle 3).
6. CMAC-Säulenverpackung
- Bereiten Sie Ammoniumacetatpuffer (10 mM, pH 7,4) vor, der zum Waschen des IAM verwendet wird. PC. DD2-Partikel und in Säulencharakterisierungsexperimenten durch Lösen von 0,7708 g Ammoniumacetat in 1 L ultrareinem entionisiertem Wasser. Stellen Sie den pH-Wert mit Salzsäurelösung auf 7,4 ein.
- Nach 48 Stunden Dialyse das Dialyseröhrchen aus dem Dialysepuffer nehmen und den Inhalt des Dialyseröhrchens in ein 15 ml konisches Röhrchen überführen.
- Das Gemisch bei 4 °C 5 min bei 400 x g zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie das restliche Pellet dreimal mit 10 ml Ammoniumacetatpuffer, wobei Sie die Mischung nach jeder Wäsche bei 4 °C für 5 min bei 400 x g zentrifugieren.
- Nach der dritten Wäsche suspendieren Sie das verbleibende Pellet in 1 ml Ammoniumacetatpuffer. Mischen Sie es gründlich und verwenden Sie die resultierende Aufschlämmung, um die 5/20-Glassäule zu verpacken, um eine CMAC-Chromatographiesäule zu erhalten.
- Um die Säule zu verpacken, legen Sie zunächst einen zuvor mit Ammoniumacetatpuffer getränkten Bodenfilter in den Filterhalter. Setzen Sie den Filterhalter in die Glassäule ein und schrauben Sie den Säulendeckel an, um die Position des Halters zu sichern. Setzen Sie die Säule vertikal in eine Fingerklemme und befestigen Sie sie im Laborständer. Platzieren Sie ein Becherglas unter der Säule.
- Mit einem Einkanalpipettor wird ein kleines Volumen der in Schritt 6.4 erhaltenen Gülle in die Glassäule überführt. Gießen Sie das Material langsam und halten Sie die Pipettenspitze gegen die Glassäulenwand. Lassen Sie das Verpackungsmaterial absetzen, bevor Sie ein weiteres Volumen Aufschlämmung gießen.
- Um den Verpackungsprozess zu beschleunigen, entfernen Sie den Puffer über dem stationären Bett mit einer Mikropipette zwischen den einzelnen Schritten. Wiederholen Sie diese Schritte, bis 1 ml der Gülle verpackt ist.
- Platzieren Sie einen oberen Filter und schrauben Sie die Adaptereinheit so, dass kein verbleibender Puffer oberhalb der stationären Phase vorhanden ist, wie in Abbildung 1 dargestellt. Sichern Sie die Position der Adaptereinheit mit dem Adapterschloss.
- Schließen Sie die Säule an eine Hochleistungsflüssigkeitschromatographiepumpe (HPLC) an, stellen Sie die Durchflussrate auf 0,2 ml/min ein und waschen Sie die Säule über Nacht mit Ammoniumacetatpuffer. Die Spalte ist nun bereit für den Charakterisierungsschritt. Lagern Sie die Säule bis zum Gebrauch bei 4 °C.
HINWEIS: Bei längerer Lagerung (Säule länger als eine Woche nicht verwendet) die Säule mit 0,05% iger Natriumazidlösung im Ammoniumacetatpuffer laufen lassen und bei 4 °C lagern.
VORSICHT: Natriumazid ist hochgiftig, wenn es oral eingenommen oder über die Haut absorbiert wird; Es sollte nur unter dem Abzug gehandhabt werden. Stellen Sie sicher, dass Sie einen Laborkittel, eine Schutzbrille und Handschuhe (Nitril bevorzugt) tragen, wenn Sie mit Natriumazid arbeiten.
7. CMAC-Spaltencharakterisierung
- Konfokale Mikroskopie und BDNF-Bindung
- Bereiten Sie IAM vor. Pcc. Stationäre DD2-Phasenpartikel mit immobilisierten Zellmembranfragmenten, die getrennt von SH-SY5Y-Neuroblastomzellen erhalten wurden, die TrkB- und SH-SY5Y-TrkB-NULL-Zellen überexprimieren, indem sie die Anweisungen von Schritt 1 bis Schritt 6.4 befolgen.
- Für Proben, die vor der Antikörperfärbung mit BDNF inkubiert werden, ist BDNF-Stammlösung herzustellen, indem 10 μg BDNF in 100 μL ultrareinem entionisiertem Wasser gelöst werden. Lagern Sie die Lösung bei -20 °C.
- Transfer in separaten 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen, 100 μL Aliquot IAM. PC. DD2-Säulenpackungsmaterial mit immobilisierten SH-SY5Y-Neuroblastomzellen, die TrkB und 100 μL Aliquot IAM überexprimieren. PC. DD2-Säulenpackmaterial mit immobilisierten SH-SY5Y TrkB-NULL-Zellen, die in Ammoniumacetatpuffer suspendiert sind.
- 390 μL Ammoniumacetatpuffer, 10 μL BDNF-Stammlösung und 0,5 μL ATP-Stammlösung (hergestellt in Schritt 3.2) in jedes Röhrchen geben und 1 h bei Raumtemperatur mit Schaukeln inkubieren.
- Für Proben, die vor der Antikörperfärbung nicht mit BDNF inkubiert werden, werden 100 μL Aliquot IAM transferiert. PC. DD2-Säulenpackungsmaterial mit immobilisierten SH-SY5Y-Neuroblastomzellen, die TrkB überexprimieren, suspendiert in Ammoniumacetat in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
- 400 μl Ammoniumacetatpuffer und 0,5 μL ATP-Stammlösung (hergestellt in Schritt 3.2) in jedes Röhrchen geben und 1 h bei Raumtemperatur mit Schaukeln inkubieren.
- Die in den Schritten 7.1.2 und 7.1.4 hergestellten Proben werden 1 min lang bei 10.000 x g bei 4 °C gedreht und der Überstand verworfen.
- Die resultierenden Pellets mit 500 μL Ammoniumacetatpuffer für 10 min waschen und bei 4 °C für 1 min bei 10.000 x g erneut durchdrehen und den Überstand entsorgen.
- Zu jedem der Pellets 220 μL Ammoniumacetatpuffer, 25 μL 10% normales Ziegenserum und 5 μL primärer Anti-BDNF-Antikörper hinzufügen. In einem Kühlraum (4 °C) über Nacht mit Schaukeln inkubieren.
- Nach Abschluss des Inkubationsschritts die Mischung für 1 min bei 10.000 x g bei 4 °C drehen und den Überstand verwerfen.
- Waschen Sie das resultierende Pellet 3 Mal mit Ammoniumacetatpuffer, der 1% mildes Reinigungsmittel (z. B. Natriumcholat) enthält, für 10 min und drehen Sie die Mischungen für 1 min bei 10.000 x g bei 4 °C und entsorgen Sie den Überstand.
- Sekundäre Antikörperlösung durch Mischen von 900 μL Ammoniumacetatpuffer, 100 μL 10% normalem Ziegenserum und 1 μL fluorophorkonjugiertem Sekundärantikörper (1:1.000 Verdünnung) herstellen. Jedem der in Schritt 7.1.9 erhaltenen Pellets sind 300 μL sekundäre Antikörperlösung zuzugeben. und über Nacht bei 4 °C mit Schaukeln inkubieren.
- Drehen Sie die Mischung bei 10.000 x g für 1 min bei 4 °C und verwerfen Sie den Überstand.
- Waschen Sie das resultierende Pellet 3 Mal mit Ammoniumacetatpuffer, der 1% mildes Reinigungsmittel (z. B. Natriumcholat) enthält, für 10 min und drehen Sie die Mischung für 1 min bei 10.000 x g bei 4 °C und entsorgen Sie den Überstand.
- Die resultierenden Pellets werden in 50 μL Ammoniumacetatpuffer resuspendiert. Legen Sie 20 μL jeder der Mischungen auf einen Objektträger und decken Sie sie mit einem Deckglas ab.
- Stellen Sie sich das IAM vor. PC. DD2-Partikel mit den immobilisierten Zellmembranfragmenten unter Verwendung eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops mit Anregung bei 488 nm und Emission bei 520 nm, die mit einem Festkörperlasersystem erzeugt werden. Verwenden Sie ein 20-faches Objektiv mit einem NA von 0,75 und WD von 0,35 mm.
- Frontale Affinitätschromatographie mit 7,8-DHF als Markerligand
- Schließen Sie eine CMAC-Säule mit einem HPLC-System mit einem Diodenarray-Detektor und/oder Massenspektrometer an.
- Es werden 500 ml 1 mM Lösung von 7,8-DHF in Ammoniumacetatpuffer mit 5%igem Methanol hergestellt.
- Pumpen Sie konstante Konzentration des Markerliganden (1 mM) durch die CMAC-Kolonne bei 0,4 ml/min Durchfluss bei Raumtemperatur. Überwachen Sie das Elutionsprofil entweder mit einem DAD-Detektor (Diode Array Detection) (Wellenlänge 254 nm) oder einem Massenspektrometer (Einzelionenüberwachungsmodus; m/z 253 im negativen Ionisationsmodus).
- Nach Abschluss des Laufs führen Sie über Nacht eine Wäsche durch, indem Sie den Ammoniumacetatpuffer durch die Säule laufen lassen.
- Wiederholen Sie die Schritte 7.2.2. - 7.2.4. unter Verwendung unterschiedlicher Konzentrationen des Markerliganden (750 nM, 500 nM, 300 nM), Waschen der Säulen über Nacht nach jedem Durchlauf. Verwenden Sie die frontale Affinitätschromatographie, um den Liganden Kd zu berechnen, wie er an anderer Stelle im Detail überprüft wurde. 24,51
- Verdrängungsstudien mit Centella asiatica (L.) Urb. (Gotu Kola) Extrakt
- Es werden 500 ml 500 nM Lösung von 7,8-DHF in Ammoniumacetatpuffer mit 5% Methanol und 0,2% wässrigem Gotu Kola-Extrakt (10 mg/ml) hergestellt.
- Pumpen Sie konstante Konzentration des Markerliganden (500 nM) mit dem Extrakt durch die Säule bei 0,4 ml/min Durchfluss bei Raumtemperatur. Überwachen Sie das Elutionsprofil entweder mit einem DAD-Detektor (Wellenlänge 254 nm) oder einem Massenspektrometer (Einzelionenüberwachungsmodus; m/z 253 im negativen Ionisationsmodus).
- Nach Abschluss des Laufs führen Sie über Nacht eine Wäsche durch, indem Sie den Ammoniumacetatpuffer durch die Säule laufen lassen.
- Zeichnen Sie die Elutionsprofile für 500 nM 7,8-DHF und das nach dem Ausführen der Lösung mit Gotu-Kola-Extrakt erhaltene Profil auf, um die Markerligandenverschiebung zu untersuchen.
8. Fehlender Peak-Chromatographie-Ansatz zur Identifizierung potenzieller TrkB-Bindemittel aus Gotu-Kola-Extrakt
- Fraktionierung von Gotu-Kola-Extrakt auf CMAC-Säulen
- Schließen Sie die CMAC TrkB- und TrkB-NULL-Säulen separat an ein HPLC-System an und injizieren Sie 50 μL des wässrigen Gotu-Kola-Extrakts (10 mg/ml) auf jede der Säulen. Pumpen Sie Ammoniumacetatpuffer (10 mM, pH 7,4), der 5% Methanol enthält, bei Raumtemperatur mit einer Durchflussrate von 0,4 ml/min durch die Säule.
- Sammeln Sie Brüche getrennt von CMAC TrkB- und TrkB-NULL-Säulen wie folgt: 0-5 min, 5-10 min, 10-15 min, 15-20 min, 20-25 min, 25-30 min, 30-35 min, 35-40 min, 40-45 min, 45-50 min, 50-55 min, 55-60 min.
- Die erhaltenen Fraktionen einfrieren und lyophilisieren. Resuspendiert lyophilisierte Fraktionen in 50 μL Methanol, bevor mit der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie und der Massenspektrometrie fortgefahren wird.
- Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographie-Quadrupol-Flugzeit-Massenspektrometrie (UPLC-QTOF-MS) Analyse von Gotu-Kola-CMAC-Fraktionen
- Analysieren Sie alle in Nummer 8.1.3 erhaltenen Brüche. Verwendung eines Massenspektrometers in Verbindung mit einem UPLC-System (UPLC-MSE-Analysemodus ). Analysieren Sie die Brüche mit einer C18-Säule (2,1 x 50 mm, 1,7 μm) mit einer C18 VanGuard-Vorsäule (2,1 mm x 5 mm, 1,7 μm).
- Die Säule wird mit folgenden Gradientenlösungen bei einer Durchflussrate von 0,3 ml/min mit der mobilen Phase A (Wasser mit 0,1% Ameisensäure) und B (Acetonitril mit 0,1% Ameisensäure) elutiert: 0,0 min 99% A 1% B, 1,5 min 84% A 16% B, 5,0 min 80% A 20% B, 7,0 min 75% A 25% B, 10,0 min 65% A 35% B, 20,0-24,0 min 1% A 99% B, 25,0-29,0 min 99% A 1% B.
- Stellen Sie das Injektionsvolumen für jede Probe auf 3 μL ein. Führen Sie MSE in positiven und negativen Ionenmodi mit einer Kollisionsenergie von 4 V für niedrige Energie und 20-35 V für hohe Energie durch.
- Verwenden Sie die folgenden ESI-Quellenbedingungen im positiven Ionisationsmodus: Kapillarspannung 1,5 kV, Abtastkegel 40 V, Quellenoffset 80, Quellentemperatur 100 °C, Desolvationstemp. 350 °C, Kegelgasstrom 38,0 L/h, Desolvationsgas 400 L/h.
- Verwenden Sie die folgenden ESI-Quellenbedingungen im negativen Ionisationsmodus: Kapillarspannung 1,45 kV, Abtastkegel 40 V, Quellenoffset 80, Quellentemperatur 110 °C, Desolvationstemp. 300 °C, Kegelgasstrom 50,0 L/h, Desolvationsgasdurchfluss 652 L/h.
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Representative Results
Nach dem Protokoll wurden zwei CMAC-chromatographische Säulen zusammengesetzt: eine mit den immobilisierten SH-SY5Y-Neuroblastom-Zellmembranfragmenten mit überexprimiertem TrkB und eine mit SH-SY5Y TrkB-NULL-Zellmembranfragmenten. Die korrekt montierte CMAC-Säule ist in Abbildung 1 dargestellt, und die Schritte zur Immobilisierung von Zellmembranfragmenten sind in Abbildung 2 dargestellt.
Seit der Immobilisierung von TrkB-Rezeptoren auf IAM. PC. DD2-chromatographische stationäre Phase zuvor nicht versucht worden war, wurde die erfolgreiche Immobilisierung der Rezeptoren durch Antikörperfärbung und frontale Affinitätschromatographie unter Verwendung eines Markerliganden bestätigt: 7,8-DHF. Eine schematische Darstellung des Antikörperfärbeexperiments ist in Abbildung 2 dargestellt. Zellmembranfragmente, die aus Neuroblastom-Zelllinien erhalten wurden, die TrkB-Rezeptoren überexprimieren, und Zellmembranfragmente aus elterlichen Zelllinien ohne TrkB-Rezeptoren (TrkB-NULL)) wurden auf IAM immobilisiert. PC. DD2-Partikel mit dem optimierten Protokoll. Anschließend wurden die Partikel mit immobilisierten Zellmembranfragmenten mit BDNF (physiologischer Ligand) und anschließend mit primären und fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörpern inkubiert (Abbildung 2). Iam. PC. DD2-Partikel mit immobilisiertem Neuroblastom TrkB-Zellmembranfragmenten und in Gegenwart von BDNF führten zu fluoreszierend markierten Partikeln (Abbildung 3C). Es wurde keine Fluoreszenz (mit Ausnahme der schwachen Hintergrundfluoreszenz) beobachtet, wenn TrkB-NULL-Zellmembran-verkapselte IAM-Partikel untersucht wurden (Abbildung 3A) oder wenn bei TrkB-Zellmembran-gekapselten IAM-Partikeln kein BDNF verwendet wurde (Abbildung 3B).
Zur Charakterisierung der Bindung eines kleinen Markerliganden (7,8-DHF) an die immobilisierten TrkB-Rezeptoren wurde eine frontale Affinitätschromatographie mit unterschiedlichen Konzentrationen von 7,8-DHF durchgeführt. Ein typisches Chromatogramm steigender 7,8-DHF-Konzentrationen auf einer funktionellen CMAC-Säule ist in Abbildung 4 dargestellt. Die spezifische Bindung von 7,8-DHF an das immobilisierte TrkB wurde durch die konzentrationsabhängige Abnahme der Retentionszeit des Markerliganden bestätigt. Die Ergebnisse der frontalen Affinitätschromatographie, die an einer nicht-funktionalen CMAC-Säule erhalten wurden, sind in Abbildung 5 dargestellt. Das Fehlen konzentrationsabhängiger Veränderungen in der Retention des Markerliganden weist auf den erfolglosen Versuch bei der CMAC-Präparation hin.
Verbindungen, die auf die CMAC-Säule injiziert werden, interagieren nicht nur spezifisch, sondern können auch unspezifisch mit IAM interagieren. PC. DD2-Partikel, Phospholipid-Doppelschicht der immobilisierten Zellmembranfragmente und andere Proteine, die in der Doppelschicht vorhanden sind. Um auszuschließen, dass Verbindungen während des Screenings komplexer Extrakte für TrkB-Bindemittel unspezifisch mit der CMAC-Säule interagieren, ist es wichtig, die CMAC-Negativkontrollsäule vorzubereiten, indem Zellmembranfragmente der elterlichen Zelllinie immobilisiert werden, die das Zielprotein nicht exprimieren (in diesem Fall TrkB-NULL). Die Ergebnisse der frontalen Affinitätschromatographie, die an einer negativen CMAC TrkB-NULL-Säule erhalten wurden, sind in Abbildung 6 dargestellt.
Funktionelle CMAC-Säulen können für verschiedene Zwecke verwendet werden, wie z.B. die Charakterisierung des Zielproteins, die Untersuchung von Wechselwirkungen einzelner Verbindungen mit den immobilisierten Zielen (z. B. Erreichen der Dissoziationskonstante, Kd) oder die Bestimmung der Bindungskinetik (kan undk aus) usw.24. Die Säulen können auch verwendet werden, um komplexe Proben wie Pflanzenextrakte auf das Vorhandensein von Verbindungen zu untersuchen, die an TrkB-Rezeptoren binden und daher potenziell Moleküle enthalten, die als TrkB-Agonisten oder Antagonisten wirken. Um zu überprüfen, ob ein Extrakt möglicherweise Verbindungen enthält, die mit den immobilisierten Rezeptoren interagieren, wird ein einfaches Verschiebungsexperiment durchgeführt. Das Ergebnis des Wettbewerbsexperiments, das mit Gotu-Kola-Extrakt und 500 nM 7,8-DHF an einer funktionellen TrkB-Säule durchgeführt wurde, ist in Abbildung 7 dargestellt. Die Zugabe von 0,2% wässrigem Gotu-Kola-Extrakt (10 mg/ml) führte zu einer signifikanten Reduktion der 7,8-DHF-Retention, was auf das Vorhandensein konkurrierender Liganden für die Agonistenbindungsstelle hinweist. Das Ergebnis des Verschiebungsexperiments, das an der CMAC-negativen Spalte TrkB-NULL durchgeführt wurde, ist in Abbildung 8 dargestellt. Die fehlende Reduktion der 7,8-DHF-Retention auf dieser Säule bestätigt das Fehlen funktioneller TrkB-Rezeptoren auf der CMAC TrkB-NULL-Säule.
Um spezialisierte Metaboliten zu identifizieren, die spezifisch mit den immobilisierten Zielen interagieren, werden CMAC-Säulen in einem Ansatz verwendet, der als Missing-Peak-Chromatographie52 nach dem Verschiebungsexperiment bezeichnet wird. Bei diesem Ansatz wird ein kleines Volumen des untersuchten Extrakts parallel auf der Säule chromatographiert, die das untersuchte immobilisierte Ziel und die CMAC-Negativkontrollsäule enthält. Diese beiden Spalten unterscheiden sich in der Expression des Targets, daher sind Unterschiede in den Retentionsmustern einzelner Moleküle auf die spezifische Art der Wechselwirkungen mit den untersuchten Targets auf der CMAC-Säule zurückzuführen, die diese TMPs enthält. Zeitgesteuerte Brüche aus beiden Säulen werden gesammelt, konzentriert und anschließend auf einer C18-Säule analysiert. Die erhaltenen Chromatogramme werden verglichen, und Verbindungen, die durch Peaks dargestellt werden, die auf beiden Säulen ähnlich erhalten bleiben, werden als unspezifisch interagierende Moleküle markiert. Das Vorhandensein eines Peaks in späteren Fraktionen auf der CMAC-Säule mit den immobilisierten Rezeptoren und das Fehlen eines Peaks, der die gleiche Verbindung in frühen Fraktionen der CMAC-negativen Spalte darstellt, stellt eine spezifische Wechselwirkung der Verbindung mit dem immobilisierten Ziel dar. Die in diesem Schritt identifizierten Verbindungen können zur Isolierung und weiteren Prüfung eingesetzt werden, ohne dass eine biogeführte Fraktionierung durchgeführt werden muss. Der Missing-Peak-Chromatographie-Ansatz wurde verwendet, um Verbindungen zu identifizieren, die spezifisch mit TrkB-Rezeptoren aus Gotu-Kola-Extrakt interagieren. Gotu-Kola-Extrakt wurde sowohl auf TrkB- als auch auf TrkB-NULL-Säulen fraktioniert, und Verbindungen, die in diesen Fraktionen vorhanden waren, wurden mit UPLC-QTOF-MS analysiert. Die Untersuchung der Chromatogramme jeder der Fraktionen führte zur Identifizierung einer Verbindung, die stark auf der TrkB-Säule (50-55-minütige Fraktion) zurückgehalten wurde, während sie früh auf der TrkB-NULL-Säule eluierte (0-5 min Fraktion), was auf eine spezifische Wechselwirkung mit den immobilisierten TrkB-Rezeptoren hinweist (Abbildung 9). Die Verbindung eluiert bei ~ 17,48 min (Abbildung 9) ist nun für die Isolierung und Prüfung in funktionellen Assays vorgesehen.
Abbildung 1. Korrekt montierte CMAC-Säule. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2. CMAC-Präparationsschritte und fluoreszierende Antikörpermarkierung der immobilisierten Rezeptoren. Schematische Darstellung der Vorbereitung einer CMAC-Säule (1-4) und des Antikörper-Markierungsexperiments (5-8). (1) Homogenisierte Zellmembranfragmente mit gezieltem Transmembranprotein, TrkB. (2) Gelöste Zellmembranfragmente in einer mizellaren Struktur. (3) Zellmembranfragmente, die auf der Oberfläche der IAM-Partikel immobilisiert sind. (4) IAM-Partikel mit immobilisierten Zellmembranfragmenten, die in eine Glassäule gepackt sind. (5) Immobilisierter TrkB-Rezeptor in den Zellmembranfragmenten. (6) Bindung des natürlichen Liganden BDNF an den funktionellen TrkB-Rezeptor. (7) Bindung der primären Antikörper an BDNF-Moleküle. (8) Bindung fluorophormarkierter sekundärer Antikörper an die primären Antikörper, was zu einer grünen Fluoreszenz führt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3. Immobilisierung von Zellmembranfragmenten mit TrkB-Rezeptoren auf IAM-Partikel. Konfokalmikroskopische Aufnahmen, die die Immobilisierung von Zellmembranfragmenten mit funktionellen TrkB-Rezeptoren auf IAM-Partikeln zeigen. (A) Zellmembranfragmente aus SH-SY5Y TrkB-NULL-Zelllinie, die nach der Inkubation mit BDNF, primärem Antikörper und fluorophormarkiertem Sekundärantikörper auf IAM-Partikeln immobilisiert wurden. (B) Zellmembranfragmente aus SH-SY5Y-Neuroblastom-Zelllinien, die TrkB exprimieren, immobilisiert auf IAM-Partikeln nach Inkubation mit primärem Antikörper und fluorophormarkiertem Sekundärantikörper ohne BDNF. (C) Zellmembranfragmente aus SH-SY5Y-Neuroblastom-Zelllinien, die TrkB exprimieren, immobilisiert auf IAM-Partikeln nach Inkubation mit BDNF, primärem Antikörper und fluorophormarkiertem sekundärem Antikörper. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4. Frontale Affinitätschromatogramme von 7,8-DHF auf der TrkB CMAC-Säule. Frontalchromatogramm steigender Konzentrationen von 7,8-DHF auf der TrkB CMAC-Säule, wobei A - 1 mM, B - 750 nM, C - 500 nM und D - 300 nM. Als Elutionsmittel wurde Ammoniumacetatpuffer (10 mM, pH 7,4) mit 5% Methanol bei einer Durchflussrate von 0,4 ml/min verwendet . Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5. Frontale Affinitätschromatogramme von 7,8-DHF auf nichtfunktionaler TrkB CMAC-Säule. Frontales Chromatogramm verschiedener Konzentrationen von 7,8-DHF auf der nicht-funktionellen TrkB-CMAC-Säule, wobei A -1 μM, B - 1 μM, C - 750 nM und D - 500 nM. Als Elutionsmittel wurde Ammoniumacetatpuffer (10 mM, pH 7,4) mit 5% Methanol bei einer Durchflussrate von 0,4 ml/min verwendet . Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6. Frontale Affinitätschromatogramme von 7,8-DHF auf der TrkB-NULL CMAC-Säule. Frontales Chromatogramm steigender Konzentrationen von 7,8-DHF auf der TrkB-NULL CMAC-Säule, wobei A - 1 mM, B - 750 nM, C - 500 nM und D - 300 nM. Als Elutionsmittel wurde Ammoniumacetatpuffer (10 mM, pH 7,4) mit 5 % Methanol bei einer Durchflussrate von 0,4 ml/min verwendet . Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7. Frontale Affinitätschromatogramme von 7,8-DHF mit 0,2% Gotu-Kola-Extrakt auf der TrkB CMAC-Säule. Repräsentatives frontales Elutionsprofil von (A) 500 nM 7,8-DHF + 0,2% Gotu-Kola-Extrakt (10 mg/ml) und (B) 500 nM 7,8-DHF auf der CMAC TrkB-Säule. Als Elutionsmittel wurde Ammoniumacetatpuffer (10 mM, pH 7,4) mit 5% Methanol bei einer Durchflussrate von 0,4 ml/min verwendet . Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 8. Frontale Affinitätschromatogramme von 7,8-DHF mit 0,2% Gotu-Kola-Extrakt auf der TrkB-NULL CMAC-Spalte. Repräsentatives frontales Elutionsprofil von (A) 500 nM 7,8-DHF und (B) 500 nM 7,8-DHF + 0,2% Gotu-Kola-Extrakt (10 mg/ml) auf der TrkB-NULL CMAC-Säule. Als Elutionsmittel wurde Ammoniumacetatpuffer (10 mM, pH 7,4) mit 5% Methanol bei einer Durchflussrate von 0,4 ml/min verwendet . Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 9. UPLC-MS-Chromatogramme von Gotu-Kola-Extraktfraktionen. UPLC-MS-Chromatogramme von Gotu-Kola-Extraktfraktionen (A) eluiert zwischen 0-5 min aus TrkB-NULL CMAC-Säule und (C) eluiert zwischen 50-55 min aus CMAC TrkB-Säule. Eine Verbindung mit einer Retentionszeit von 17,48 min in beiden Fraktionen, wie durch übereinstimmende Massenspektren (B und D) bestätigt, wurde als potenzielles TrkB-Bindemittel identifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Homogenisierungspuffer | ||||
| 1 | Tris(hydroxymethyl)aminomethanhydrochlorid (Tris-HCl) | 50 mM | ||
| 2 | Natriumchlorid (NaCl) | 100 mM | ||
| 3 | Calciumchlorid wasserfrei (CaCl2) | 3 mM | ||
| 4 | Magnesiumchloridhexahydrat (MgCl2) | 2 mM | ||
| 5 | Kaliumchlorid (KCl) | 5 mM | ||
| 6 | Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) | 0,1 mM | ||
| 7 | Benzamidin | 3 mM | ||
| 8 | Proteasehemmer Cocktail (100X) | (1/100) | ||
| 9 | Glycerin | 10% | ||
| 10 | Adenosin 5'-triphosphat (ATP) Dinatriumsalzhydrat | 100 μM | ||
| 11 | Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) | 5mM | ||
Tabelle 1. Zusammensetzung des Homogenisierungspuffers.
| Lösungsvermittler-Puffer | ||||
| 1 | Tris(hydroxymethyl)aminomethanhydrochlorid (Tris-HCl) | 50 mM | ||
| 2 | Natriumchlorid (NaCl) | 100 mM | ||
| 3 | Calciumchlorid wasserfrei (CaCl2) | 3 mM | ||
| 4 | Magnesiumchloridhexahydrat (MgCl2) | 2 mM | ||
| 5 | Kaliumchlorid (KCl) | 5 mM | ||
| 6 | Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) | 0,1 mM | ||
| 7 | Benzamidin | 3 mM | ||
| 8 | Proteasehemmer Cocktail (100X) | (1/100) | ||
| 9 | Glycerin | 10% | ||
| 10 | Adenosin 5'-triphosphat (ATP) Dinatriumsalzhydrat | 100 μM | ||
| 11 | Natriumcholat | 2% | ||
Tabelle 2. Solubilisierungspufferzusammensetzung.
| Dialysepuffer | ||||
| 1 | Tris(hydroxymethyl)aminomethanhydrochlorid (Tris-HCl) | 50 mM | ||
| 2 | Natriumchlorid (NaCl) | 100 mM | ||
| 3 | Calciumchlorid wasserfrei (CaCl2) | 0,1 mM | ||
| 4 | Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) | 5 mM | ||
| 5 | Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) | 0,1 mM | ||
Tabelle 3. Zusammensetzung des Dialysepuffers.
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Discussion
Die Identifizierung von Wirkstoffen, die in komplexen Mischungen spezialisierter Metaboliten vorhanden sind, ist eine sehr anspruchsvolle Aufgabe23. Traditionell werden einzelne Verbindungen isoliert und ihre Aktivität in verschiedenen Assays getestet. Dieser Ansatz ist zeitaufwendig und kostspielig und führt häufig zur Isolierung und Identifizierung der am häufigsten vorkommenden und gut charakterisierten Verbindungen23. Die derzeit verwendeten Hochdurchsatz-Screening-Assays stützen sich stark auf das Screening kombinatorischer Chemiebibliotheken mit bereits bekannten Zielen und sind nicht darauf ausgelegt, biologisch aktive Verbindungen in komplexen Gemischen zu identifizieren und zu isolieren53.
CMAC ermöglicht die Identifizierung von Verbindungen, die auf TMPs23,24,54 abzielen. Bei dieser Technik werden Zellmembranfragmente mit TMPs auf der Oberfläche von IAM-stationären Phasenteilchenimmobilisiert 23,24. CMAC ist ein einzigartiger Ansatz, der die Immobilisierung von Zellmembranfragmenten mit gezielten Proteinen auf dem festen Träger ermöglicht, der die Zellmembranphospholipid-Doppelschicht24 imitiert. Dies ermöglicht die Erhaltung der Funktionalität von immobilisierten Proteintargets und bietet nahezu physiologische Bedingungen, während CMAC verwendet wird, um kleine Moleküle zu identifizieren, die mit TMPs interagieren. CMAC bietet den Vorteil der Entdeckung neuartiger chemischer Gerüste aus einzigartigen Naturstoffbibliotheken, die mit keinem anderen der derzeit verwendeten Assays getestet werdenkönnen 23 . Der vorgeschlagene Ansatz ermöglicht die Identifizierung von Verbindungen, die mit TMPs interagieren, ohne die Art dieser Wechselwirkung zu entschlüsseln. Der Interaktionsmodus (allosterische oder orthosterische Interaktion; Hemmung oder Aktivierung) muss mit funktionellen zellbasierten Assays verifiziert werden. CMAC mit den immobilisierten Proteintargets kann auch bei der Charakterisierung der Pharmakodynamik (z.B. Dissoziationskonstante, Kd) oder der Bestimmung der Bindungskinetik (kon und koff) von niedermolekularen Liganden, die mit dem Target interagieren, sowie bei der Charakterisierung der Bindungsstellen auf dem immobilisierten Proteinverwendet werden 24 . Obwohl CMAC nur die Identifizierung von Verbindungen ermöglicht, die an TMPs binden, ist es ein innovativer Ansatz, der den ersten Schritt in der Wirkstoffforschungspipeline erheblich beschleunigt, da keine Verbindungsreinigung erforderlich ist, die derzeit der größte Engpass im Arzneimittelentdeckungsprozess von natürlichen Mischungen ist.
Obwohl sich das vorgestellte Protokoll auf die Immobilisierung eines Transmembranrezeptors (TrkB) konzentriert, kann die CMAC-Technologie bei der Herstellung von Säulen mit anderen Zielen eingesetzt werden. Einer der entscheidenden Aspekte der CMAC-Vorbereitung ist die Wahl der Zelllinie oder des Gewebes, das zur Isolierung von Zellmembranfragmenten verwendet wird. Wenn Säulen beim Screening komplexer Mischungen auf Verbindungen verwendet werden, die mit den immobilisierten Rezeptoren interagieren, wird empfohlen, Zelllinien zu verwenden, die das Zielprotein überexprimieren. Die Verwendung einer solchen Zelllinie führt zu einer höheren Anzahl von immobilisierten Zielen und erhöht die Wahrscheinlichkeit der Identifizierung von Verbindungen mit einer geringeren Affinität zum Ziel oder weniger reichlich vorhandenen Molekülen. Konzentriert man sich auf die Charakterisierung des immobilisierten Proteins, empfiehlt sich die Verwendung einer nativen Zelllinie, da sich posttranslationale Modifikationen, die das Protein erfährt, sowie die Phospholipidumgebung in der transfizierten Zelllinie signifikant unterscheiden können.
Einige Aspekte der Zellmembranisolierung und -immobilisierung auf IAM-Partikeln sind kritisch und erfordern möglicherweise Modifikationen, abhängig vom Rezeptortyp oder der Quelle des Proteins. Um eine proteolytische Spaltung der immobilisierten Proteine zu verhindern, ist es wichtig, geeignete Proteasehemmer in den Homogenisierungs- und Solubilisierungspuffern zu verwenden. Eine Literaturrecherche wird empfohlen, um benötigte Proteasehemmer zu identifizieren. Im Prozess der Protokolloptimierung haben wir festgestellt, dass die Zugabe von ATP und Glycerin die Anzahl der Bindungsstellen (Bmax) auf CMAC-Säulen bei der Immobilisierung von TrkB erhöht. Andere Cofaktoren können bei der Optimierung der Immobilisierung anderer Arten von Transmembrantargetserforderlich sein 24. Derzeit untersuchen wir die Zugabe von Cholesterin im Prozess der TrkB-Immobilisierung, da kürzlich festgestellt wurde, dass Cholesterin die Wirkung von TrkB-Liganden48 verändert. Es wurde bereits berichtet, dass die Zugabe von Cholesterin und/oder anderen Lipiden erforderlich sein könnte, um funktionelle CMAC-Säulenzu erhalten 24.
Verschiedene Arten von Detektoren können verwendet werden, um das Säuleneluat zu überwachen, einschließlich Diodenarray-Detektor für Liganden mit Chromophoren, Massenspektrometrie oder Radiostromdetektor für radioaktive Liganden.
Die Überwachung der Stabilität von CMAC-Säulen ist von entscheidender Bedeutung. CMAC-Säulen können bis zu mehreren Monaten stabil sein, abhängig von der Art des immobilisierten Proteins, der Häufigkeit der Verwendung und den Lagerbedingungen. Es wird empfohlen, die Säule in 0,05%iger Natriumazidlösung in Ammoniumacetatpuffer bei 4 °C zu lagern, wenn die Säule länger als eine Woche unbenutzt bleibt. Es ist wichtig, die Säule nach längerer Zeit gründlich mit Ammoniumacetatpuffer zu waschen, bevor Sie versuchen, sie zu verwenden. Es wird empfohlen, die Funktionalität der Säule zu überwachen, indem wöchentlich eine ausgewählte Konzentration eines Markerliganden injiziert wird.
Trotz zahlreicher Vorteile weist die CMAC-Technologie mehrere Einschränkungen auf, die bei der Verwendung der Spalten in der Arzneimittelforschung berücksichtigt werden müssen. Erstens nimmt die Anzahl der immobilisierten Transmembranziele mit der Zeit ab, und daher wird empfohlen, die Gesamtzahl der Bindungsstellen wöchentlichzu überwachen 24. Einer der Gründe für diesen Rückgang ist die Folge des Immobilisierungsprozesses, der auf Adsorption basiert und nicht die Einführung kovalenter Bindungen beinhaltet. Lipophile Verbindungen können aufgrund einer signifikanten unspezifischen Bindung an die IAM-Oberfläche und die Phospholipid-Doppelschichten stark auf CMAC-Säulen zurückgehalten werden. Dies erhöht die Analysezeit erheblich und verringert den Durchsatz. Der Prozess der CMAC-Säulenvorbereitung ist zelllinienspezifisch und erfordert ein gründliches Verständnis der Natur immobilisierter Proteine, wodurch sie für weniger charakterisierte Ziele weniger geeignet sind.
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Disclosures
Lukasz Ciesla arbeitet mit Regis Technologies, dem Anbieter des IAM, zusammen. PC. DD2-Partikel.
Acknowledgments
Z.C.A. wurde vom Scientific and Technological Research Council of Turkey (TUBITAK) 2219- International Postdoctoral Research Fellowship Program unterstützt. Die in dieser Veröffentlichung berichtete Forschung wurde vom National Center for Complementary and Integrative Medicine der National Institutes of Health unter der Preisnummer 1R41AT011716-01 unterstützt. Diese Arbeit wurde auch teilweise durch den American Society of Pharmacognosy Research Starter Grant, den Regis Technologies Grant an L.C. unterstützt. Der Inhalt liegt in der alleinigen Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offiziellen Ansichten der National Institutes of Health dar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7-8 Dihydroxyflavone hydrate | Sigma-Aldrich | D5446-10 mg | ≥98% (HPLC) |
| Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A2383-1 g | |
| Ammonium acetate | VWR Chemicals BDH | BDH9204-500 g | |
| BDNF antibody | Invitrogen | PA5-15198-400 μL | Primary antibody; 2 mg/mL of concentration |
| Benzamidine hydrochloride hydrate | Sigma-Aldrich | B6506-25 g | |
| Brain derived neurotrophic factor (BDNF) human | Sigma-Aldrich | B3795-10 μg | Recombinant, expressed in E. coli, lyophilized powder, suitable for cell culture |
| Calcium chloride | VWR Analytical | BDH9224-1 kg | |
| Cholic acid sodium salt | Alfa Aesar | J62050-100 g | |
| Dounce homogenizer | VWR | 71000-516 | 40 mL, 285 mm (overall lenght), 32 x 140 mm (O.D. x H) |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 493511 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | VWR Analytical | BDH-9232-500 g | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F2442-500 mL | sterile-filtered, suitable for cell culture |
| G418 disulfate salt solution | Sigma-Aldrich | G8168-100 mL | 50 mg/mL in H2O, 0.1 μm filtered, suitable for cell culture |
| Glycerol | VWR Life Science | E520-100 mL | |
| Immobilized artificial membrane (IAM.PC.DD2) | Regis Technologies, Inc. | 1-771050-500 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | VWR Analytical | BDH9244-500 mL | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 322425 | |
| Nikon C2 DUVb | Nikon | Confocal laser scanning microscope | |
| Normal goat serum (10%) | Life Technologies | 50197Z | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100 mL | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Thermo Scientific | 36978-5 g | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | VWR Life Science | K812-500 mL | 1x |
| Potassium chloride | VWR Chemicals BDH | 0395-1 kg | |
| Protease inhibitor cocktail | VWR Life Science Ambreso | M221-1 mL | Proteomics grade, containing 50 mM AEBSF, 30 µM aprotonin, 1 mM bestatin, 1 mM E-64 and 1 mM leupeptin |
| RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R8758-500 mL | with L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
| Secondary antibody goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen Alexa Flour Plus 488 | A32731 | |
| SH-SY5Y Neuroblastoma cell lines expressing Trk-B | Kerafast | ECP007 | |
| SH-SY5Y Trk-NULL cell line | Kerafast | ECP005 | |
| Snake skin dialysis tubing | Thermo Scientific | 88245 | 10K MWCO, 35 mm dry I.D. |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium chloride | BDH VWR Analytical | BDH9286-2.5 kg | |
| Tricorn 5/20 column | GE Healthcare | 24-4064-08 | |
| Tris-HCl | VWR Life Science | 0497-1 kg | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4049-500 mL | 0.25%, sterile-filtered, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA |
References
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