Summary
İki tırmanma elyafına bağımlı ilişkisel öğrenme görevi sırasında hayvan davranışlarını izlemek için tek bir platform geliştirdik. Düşük maliyetli tasarım, fiber ile ilişkili serebellar aktiviteye tırmanmaya yönelik optogenetik veya görüntüleme deneyleriyle entegrasyona izin verir.
Abstract
Purkinje hücrelerine fiber girişlerinin tırmanması, beyinciğe bağımlı ilişkisel öğrenme için kritik olan öğretici sinyaller sağlar. Bu sinyallerin kafaya sabitlenmiş farelerde incelenmesi, görüntüleme, elektrofizyolojik ve optogenetik yöntemlerin kullanımını kolaylaştırır. Burada, bir koşu tekerleğinde serbestçe lokomote yapan kafa sabit farelerde ilişkisel öğrenmenin izlenmesine izin veren düşük maliyetli bir davranışsal platform (~ 1000 $) geliştirilmiştir. Platform iki ortak ilişkisel öğrenme paradigmasını içerir: göz kırpma koşullandırması ve gecikmiş dokunsal irkilme koşullandırması. Davranış bir kamera kullanılarak ve tekerlek hareketi bir dedektör tarafından izlenir. Bileşenleri ve kurulumu açıklıyoruz ve eğitim ve veri analizi için ayrıntılı bir protokol sağlıyoruz. Bu platform, optogenetik stimülasyon ve floresan görüntülemenin dahil edilmesine izin verir. Tasarım, tek bir ana bilgisayarın aynı anda birden fazla hayvanı eğitmek için birden fazla platformu kontrol etmesini sağlar.
Introduction
Koşullu bir yanıt ortaya çıkarmak için uyaranlar arasındaki saniyenin altındaki ilişkinin Pavlovian koşullandırılması, serebellara bağımlı öğrenmeyi araştırmak için uzun zamandır kullanılmaktadır. Örneğin, klasik gecikmeli göz kırpma koşullandırmasında (DEC), hayvanlar, her zaman bir refleks yanıp sönmesini ortaya çıkaran koşulsuz bir uyaranla (ABD; örneğin, korneaya uygulanan bir hava üflenmesi) tekrar tekrar eşleştirildiğinde, nötr bir koşullu uyarana (CS; örneğin, bir ışık parlaması veya işitsel ton) yanıt olarak iyi zamanlanmış bir koruyucu göz kırpma yapmayı öğrenirler. ve CS'nin sonunda veya yakınında gelir. Öğrenilen yanıt koşullu yanıt (CR) olarak adlandırılırken, refleks yanıt koşulsuz yanıt (UR) olarak adlandırılır. Tavşanlarda, beyinciğe özgü lezyonlar bu öğrenme biçimini bozar 1,2,3,4. Ayrıca, tırmanan fiber girdileri5 tarafından yönlendirilen Purkinje hücre kompleksi sivri uçları, uygun şekilde zamanlanmış CR'lerin elde edilmesi için gerekli bir 6,7 ve yeterli 8,9 sinyali sağlar.
Daha yakın zamanlarda, kafa sabit fareler için fiber bağımlı ilişkisel öğrenme paradigmalarına tırmanmak geliştirilmiştir. DEC, bu konfigürasyona uyarlanan ilk ilişkisel öğrenme paradigması10,11'dir. Kafaya sabitlenmiş farelerde DEC, serebellar bölgeleri tanımlamak için kullanılmıştır 11,12,13,14,15,16,17 ve devre elemanları 11,1 2,13,14,15,18,19 görev edinimi ve neslinin tükenmesi için gerekli olanlar. Bu yaklaşım aynı zamanda görev parametrelerinin hücresel düzeydeki fizyolojik temsilinin13,15,16 öğrenme ile nasıl geliştiğini göstermek için de kullanılmıştır.
Göz kırpmaya ek olarak, gecikmiş irkilme dokunsal koşullandırma (DTSC) paradigması yakın zamanda kafaya sabitlenmiş fareler20 için yeni bir ilişkisel öğrenme görevi olarak geliştirilmiştir. Kavramsal olarak DEC'e benzer şekilde, DTSC, nötr bir CS'nin bir ABD ile sunumunu, UR olarak21,22'lik bir irkilme refleksini devreye sokmak için yeterli yoğunlukta yüze bir dokunuşu içerir. DTSC paradigmasında, hem UR hem de CR, bir tekerlek üzerinde geriye doğru hareket olarak okunur. DTSC şimdi ilişkisel öğrenmenin serebellar aktiviteyi ve gen ekspresyonu kalıplarını nasıl değiştirdiğini ortaya çıkarmak için kullanılmıştır20.
Bu çalışmada, DEC veya DTSC'nin tek bir platformda esnek bir şekilde uygulanması için bir yöntem geliştirilmiştir. Uyaran ve platform öznitelikleri Şekil 1'de şematize edilmiştir. Tasarım, bir kamera ile hayvan davranışını izleme kapasitesinin yanı sıra bir tekerlek üzerindeki fare hareketini izlemek için bir döner kodlayıcı içerir. Veri kaydı ve deneme yapısının tüm yönleri, eşleştirilmiş mikrodenetleyiciler (Arduino) ve tek kartlı bir bilgisayar (SBC; Ahududu Pi). Bu cihazlara sağlanan bir grafik kullanıcı arayüzü üzerinden erişilebilir. Burada kurulum, deneme hazırlama ve yürütme için bir iş akışı ve veri görselleştirme için özelleştirilmiş bir analiz işlem hattı sunuyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada açıklanan hayvan protokolleri, Princeton Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri tarafından onaylanmıştır.
1. SBC'yi ayarlama
- Fotoğraf makinesi seri arabirimi (CSI) kablosunu Raspberry NoIR V2 fotoğraf makinesine ve SBC'deki kamera bağlantı noktasına bağlayın.
- SBC işletim sistemini ana bilgisayara indirin. İşletim sistemi görüntüsünü mikro güvenli dijital (microSD) bir karta yazın.
NOT: Raspberry Pi SBC için bu prosedürlerle ilgili ayrıntılı talimatlar başka bir yerde bulunabilir23. Sistem aşağıdaki işletim sistemleri kullanılarak test edilmiştir: Stretch, Buster, Bullseye. - Güvenli kabuk iletişimini etkinleştirmek için, microSD kartın önyükleme bölümünde "ssh" adlı uzantısız bir dosya oluşturun. Bu yapıldıktan sonra, microSD kartı ana makineden çıkarın ve SBC microSD kart yuvasına takın. SBC'ye güç kaynağını takarak güç verin.
- SBC'yi ana bilgisayara kablolu bir bağlantıyı kabul edecek şekilde hazırlayın.
- SBC'ye uygun bir kabloyla bir monitör takın. Bir terminal açın, ifconfig komutunu yazın ve SBC'nin ethernet IP adresini kaydedin.
NOT: Raspberry Pi model 3B+ bir HDMI ekran bağlantı noktasına sahipken, model 4B'de bir mikro-HDMI bağlantı noktası vardır. - Raspberry Pi yapılandırma ayarının Arabirim sekmesine gidin ve Kamera, güvenli kabuk ağ protokolü (SSH) ve Sanal Ağ Bilgi İşlem (VNC) seçeneklerini etkinleştirin.
- SBC'ye uygun bir kabloyla bir monitör takın. Bir terminal açın, ifconfig komutunu yazın ve SBC'nin ethernet IP adresini kaydedin.
- Ana bilgisayar ile SBC arasında kablolu bir bağlantı kurun.
- SBC'deki ethernet bağlantı noktasına ve bir ana bilgisayara bir ethernet kablosu bağlayın. Bu kabloların diğer ucunu bir ethernet anahtarına takın.
- VNC görüntüleyici24 gibi bir sanal ağ bilgi işlem istemcisi kullanın ve SBC IP adresini ve varsayılan kimlik doğrulamasını (kullanıcı = "pi", parola = "ahududu") kullanarak masaüstüne erişin.
- Protokol adımlarında bulunan gerekli yazılımları indirin.
DİKKAT: SBC'ye yetkisiz erişimi önlemek için varsayılan kullanıcı adını ve parolayı değiştirin.- Makine yazılımını indirmek için SBC terminaline aşağıdaki komutu girin:
git klonu --derinlik=1 https://github.com/gerardjb/assocLearnRig - Gerekli python kütüphanelerini indirmek için aşağıdaki komutları girin.
cd assocLearnRig
python3 setup.py - Mikrodenetleyici üzerinde doğrudan kontrole izin vermek için, SBC'ye bağlanın ve 1.6.4-1.6.7 adımlarını izleyerek mikrodenetleyici tümleşik geliştirme ortamını (IDE) indirin.
- SBC masaüstünde web tarayıcısını açın ve https://arduino.cc/en/software'a gidin. IDE'nin en son Linux ARM 32 bit sürümünü indirin.
- SBC masaüstünde bir terminal penceresi açın ve cd Downloads/ yazarak indirilenler dizinine gidin
- IDE'yi yüklemek için, terminale aşağıdaki komutları yazın:
tar -xf arduino--linuxarm.tar.xz
sudo mv arduino-/opt
sudo /opt/arduino-/install.sh
(buradaindirilen IDE'nin sürümüdür) - SBC masaüstünde mikrodenetleyici IDE'nin bir örneğini açın. Araçlar > Kitaplıkları Yönet menü seçeneğini belirleyin. Paul Stoffregen'den "Encoder" kütüphanesini yükleyin.
- Makine yazılımını indirmek için SBC terminaline aşağıdaki komutu girin:
- SBC yerleşik belleği bir USB flash sürücüyle genişletin.
- SBC'deki bir USB bağlantı noktasına bir başparmak sürücü takın. Varsa bir USB 3.0 bağlantı noktası kullanın.
- Başparmak sürücüsünü ve benzersiz başvurusunu ( UUID) bulmak için ls -l /dev/disk/by-uuid/ terminalini yazın. UUID'yi kaydedin.
- Pi kullanıcısının USB aygıtına yazmasına izin vermek için, aşağıdaki komutları terminale tek tek yazın:
sudo mkdir /media/usb
sudo chown -R pi:pi /media/usb
sudo mount /dev/sda1 /media/usb -o uid=pi,gid=pi
NOT: Başparmak sürücü, SBC yeniden başlatıldığında /etc/fstab konumundaki fstab dosyasının sonuna aşağıdaki satır eklenerek otomatik olarak bağlanacak bir aygıt olarak eklenebilir:
UUID=/media/usb vfat auto,nofail,noatime,users,rw,uid=pi,gid=pi 0 0
2. Kablolama uyaran donanım ve montaj aşaması
- Mikrodenetleyicileri bağlayın ve hazırlayın.
- SBC'yi mikrodenetleyicinin programlama portuna (Arduino Due) USB2 tip A - USB2 mikro kablosuyla bağlayın.
NOT: Düzgün çalışmasını sağlamak için Malzeme Tablosundaki ürün gibi yüksek kaliteli bir kablo kullanın. - İndirilen proje deposunda "dueAssocLearn.ino" dosyasını bulun. Mikrodenetleyici IDE ile çizimi açın ve SBC'ye bağlı mikrodenetleyiciye yükleyin.
- Ana bilgisayara Arduino IDE'nin uygun sürümünü indirin ve yükleyin.
- Ana bilgisayarı USB2 tip B - USB2 tip A kablosuyla mikrodenetleyiciye (Arduino Uno) bağlayın.
- GitHub deposuna (https://github.com/gerardjb/assocLearnRig) gidin ve "DTSC_US.ino" çizimini ana bilgisayara indirin.
- Ana bilgisayarda, mikrodenetleyici IDE'sini çalıştırın ve "DTSC_US.ino" çizimini açın, ardından mikrodenetleyiciye yükleyin.
- SBC'yi mikrodenetleyicinin programlama portuna (Arduino Due) USB2 tip A - USB2 mikro kablosuyla bağlayın.
- Mikrodenetleyicilere, breadboard'a, LED'lere, döner kodlayıcıya, sürücülü step motora ve sürücülü solenoid valfe Şekil 2'deki Fritzing diyagramında gösterildiği gibi kabloları bağlayın.
- Step motora ve solenoid valfe güç verin.
- Bir güç kaynağının bir kanalını step motor sürücüsünün +V ve GND pimlerine düzgün bir şekilde bağlayın.
- Güç kaynağını açın ve bağlı kanal voltajını 25 V'a ayarlayın.
NOT: Step motor, sürücü ve güç kaynağı arasındaki bağlantılar doğru yapılandırılmışsa, step motor sürücüsündeki yeşil gösterge LED'i yanar. - Bir güç kaynağının pozitif kablosunu solenoid valf sürücüsü tutma voltajı pimine ve diğer pozitif kabloyu ani voltaj pimine düzgün bir şekilde bağlayın.
- Negatif uçları kontrol sinyaliyle paylaşılan bir zemine takın.
- Güç kaynağını açın ve tutma voltajına bağlı kanalı yaklaşık 2,5 V'a ve ani voltaja bağlı kanalı yaklaşık 12 V'a ayarlayın.
- Luer adaptörünü kullanarak ~20 PSI basınca ayarlanmış bir hava kaynağını solenoid valfe bağlayın.
- Tüm uyaran bileşenlerinin ve kameranın düzgün çalışıp çalışmadığını test edin.
- SBC'de bir terminal açın ve klonlanan GitHub deposuna gitmek için cd ~/assocLearnRig yazın.
- Terminalde, kontrol grafiği kullanıcı arabirimini başlatmak için python3 assocLearnRig_app.py yazın.
- Akış düğmesine basarak kamera akışını başlatın.
- DEC Radyo düğmesini seçin, mikrodenetleyiciye yükleyin ve Oturumu Başlat düğmesine basarak varsayılan parametrelerle bir oturum başlatın.
NOT: Bu adımdan sonra, terminalde veri günlüğünün bir çıktısı görünmeli, kamera akışındaki mesaj kaybolmalı ve LED CS ve solenoid valf US her deneme sırasında uygun zamanlarda açılıp kapanmalıdır. - Oturum sona erdikten sonra, DTSC Radyo düğmesi seçili olarak önceki adımları tekrarlayın.
NOT: GitHub deposundaki çizimler ("testStepper.ino", "testRotary.ino" ve "testSolenoid.ino"), yukarıdaki adımlar tatmin edici sonuçlar sağlamazsa tek tek bileşenleri test etmek için kullanılabilir.
- Koşu tekerleğini yapın.
- Bir köpük silindirinden 3 inçlik bir tekerlek kesin. Tam tekerlek merkezinde 1/4 inçlik bir delik açın, böylece tekerlek farenin hareketi tarafından çevrildiğinde sallanmayacaktır.
- Tekerleğe 1/4 inçlik bir şaft yerleştirin ve tekerleğin her iki tarafına yerleştirilmiş sıkma göbeklerini kullanarak yerine sabitleyin.
- Döner kodlayıcıyı bir M3 cıvata kullanarak 4,5" alüminyum kanala takın. Alüminyum breadboard üzerindeki alüminyum kanalı, gösterildiği gibi 1/4" cıvata, somun ve yıkayıcı ile dik açılı bir braket kullanarak stabilize edin.
- Tekerleği ve döner kodlayıcıyı bir şaft kaplin manşonu kullanarak takın.
- Tekerlek milinin serbest tarafını, breadboard montajlı optik direğe monte edilmiş dik açılı bir uç kelepçesine yerleştirilmiş bir rulman ile stabilize edin.
NOT: Tekerleğin elle döndürülürken sallanmadan serbestçe döndüğünden emin olun. - Uyaran donanımını, kafa kısıtlamasını, kızılötesi ışık dizisini ve pikamerayı monte edilmiş tekerleğin etrafına yerleştirin.
- Optik direkleri ve dik açılı direk kelepçelerini kullanarak koltuk başlıklarını, kafa direkleri tekerlek aksının 1,5 cm önünde ve tekerlek yüzeyinin 2 cm yukarısında olacak şekilde konumlandırın. (Değerler 20 g'lık bir fare içindir).
- DEC US için kullanılan CS LED ve solenoid valf çıkışını, DEC için kullanılan gözden 1 cm'den daha az uzağa yerleştirin.
- DTSC US için kullanılan step motoru monte edin
- Picamera'yı hayvanın olacağı yerden ~ 10 cm uzaklıktaki optik bir direğe monte edin.
NOT: Picamera montajının tasarımı, GitHub deposundaki "RaspPiCamMount1_1.stl" dosyasından bir 3D yazıcıda yapılabilir. - Kızılötesi ışık dizisini biraz yukarıya ve doğrudan pikamera ile aynı taraftaki yüzün konumuna bakacak şekilde yerleştirin.
- Bir sıkma göbeği kullanarak 1/4" şafta monte edilmiş bir akrilik parçasının kenarına köpük bantlayarak DTSC için dokunsal bir uyaran yapın. Dokunsal uyaranı step motor miline takın.
NOT: Akrilik parçanın tasarımı, GitHub deposundaki "TactileStimDesign.pdf" deseni izlenerek lazerle kesilebilir.
3. Davranış deneylerinin hazırlanması ve çalıştırılması
- Fare kafa plakasının implante edilmesi.
- Stereotaktik bir çerçevede% 2 izofluran ve kafa sabiti kullanarak bir fareyi anestezi altına alın.
- Gözlere oftalmik merhem uygulayın.
- Sabunlu su ve steril bir neşter kullanarak kafa derisini tıraş edin. Doğrudan insizyon bölgesinin derisinin altına lidokain enjekte edin ve cerrahi bölgeyi povidon ile temizleyin.
- Kafa derisinin orta çizgisi boyunca gözlerin arka kenarından kafatasının arka kenarına kadar bir neşter ile bir kesi yapın, kafatasına çok sert basmamaya dikkat edin.
- Kesisi açın ve açık tutmak için her iki tarafı steril hemostatlarla kelepçeleyin. Etanol ile batırılmış bir pamuklu çubuk kullanarak periostu yavaşça çıkarın ve açıkta kalan kafatasının yüzeyinin kurumasını bekleyin.
- Kafa plakası seviyesini kafatası üzerine yerleştirin ve kafa plakasının ön tarafını gözlerin arkasına yerleştirdiğinizden emin olun. Kafa plakasını kafatasına tutturmak için siyanoakrilat yapıştırıcı kullanın ve yapıştırıcının tamamen kurumasını bekleyin.
- Diş çimento tozunu (1 kepçe), çözücüyü (2 damla) ve katalizörü (1 damla) bir karıştırma kabında karıştırın ve maruz kalan kemiğin tüm bölgelerine uygulayın. Yüzey, kafa plakasının üst kenarı ile aynı hizaya gelene kadar katmanlar ekleyin ve başlık plakasının kafatasına sıkıca tutturulduğundan emin olun.
- Gerekirse cildi başlığın arkasına ve önüne kapatarak dikin.
- Hayvanın en az 5 gün boyunca iyileşmesine izin verirken, kurumsal kılavuzlara göre carprofen gibi ameliyat sonrası analjezi enjekte edin.
- Davranış oturumlarına hazırlanma.
- Test hayvanlarının, deneylerden önceki 5 gün boyunca 30 dakikalık seanslar boyunca baş dayanağına monte ederek platforma alışmalarına izin verin.
NOT: Alışkanlık seanslarının sonunda, hayvanlar tekerlek üzerinde rahatça koşmalıdır. - (Yalnızca DEC) Seanslardan önce, solenoid valf çıkışının >1 cm uzaklıktaki hedef göze ortalandığından emin olun.
- (Yalnızca DEC) Basmalı düğmeyi kullanarak bir hava pufunu manuel olarak harekete geçirin. Farenin, kambur bir duruş benimsemek veya etkilenen perioküler bölgeyi ipsilateral ön pençe ile tutmak gibi açık stres belirtileri göstermeden derhal bir göz kırpması oluşturduğundan emin olun.
- (Yalnızca DTSC) Seanslardan önce, dokunsal uyaranın ~ 1,5 cm uzağa yerleştirilmiş hayvanın burnuna ortalandığından emin olun.
NOT: DTSC davranışsal oturumu çalışmadığında, el ile yeniden konumlandırmaya izin vermek için step motor otomatik olarak devre dışı bırakılır. - (Yalnızca DTSC) SBC terminalinde, GUI'yi başlatmak için python3 assocLearnRig_app.py yazın.
- (Yalnızca DTSC) GUI'deki Oturumu Başlat düğmesine basarak varsayılan parametrelerle üç denemeden oluşan bir test oturumu çalıştırın.
- (Yalnızca DTSC) Terminale yazdırılan günlüğe kaydedilen verilerin, her denemede ABD'yi takiben döner kodlayıcıda 20'den büyük, ancak 100 adımdan daha az bir sapma gösterdiğinden emin olun.
DİKKAT: Zarar görmemek ve hayvana stresi azaltmak için, uyaranı hayvandan daha uzağa başlatın ve gerekli koşullar yerine getirilene kadar yaklaştırın.
- Test hayvanlarının, deneylerden önceki 5 gün boyunca 30 dakikalık seanslar boyunca baş dayanağına monte ederek platforma alışmalarına izin verin.
- Veri günlüğü ile davranışsal oturumlar çalıştırma.
- Baş kısıtlamasına bir fare takın.
- SBC'nin terminalinde, GUI'yi başlatmak için python3 assocLearnRig_app.py yazın.
- Davranışsal denemeler sırasında kamera kayıtlarına izin vermek için Akış düğmesine basın.
NOT: Oturumlar kamera olmadan çalıştırılabilir. Bu durumda, yalnızca döner kodlayıcıdan gelen veriler ve uyaran sunum zaman damgaları günlüğe kaydedilir. - Hayvan kimliği alanına hayvan için tanımlayıcı bilgileri girin ve Set düğmesine basın.
- Hangi davranışsal paradigmanın istendiğine bağlı olarak Oturum Türü başlığı altındaki radyo düğmesinden DEC veya DTSC'yi seçin.
- İstediğiniz deney parametrelerini Hayvan Kimliği alanının altındaki alanlara girin ve Arduino'ya Yükle düğmesine basın.
NOT: Deneme parametrelerinin ayrıntıları GitHub deposu README bölümünde bulunabilir. - Oturumu başlatmak için Oturumu Başlat düğmesine basın.
- Bir oturum başlatıldığında, veriler SBC başparmak sürücü bağlama noktasındaki "/media/usb" dizininde oluşturulan yeni bir dizinde günlüğe kaydetmeye başlar.
4. Verileri dışa aktarma ve analiz etme
- Kaydedilen tüm oturumları ana bilgisayara aktarmak için bir komut istemi açın ve pscp -r pi@Pi_IP_address:/media/usb* komutunu host_computer_destination girin, ardından SBC parolasıyla kimliğinizi doğrulayın.
NOT: Yukarıdaki komut bir Windows makinesi içindir. Mac ve Linux makinelerde terminali kullanın ve "pscp" yerine "scp" yazın. - Ana bilgisayara Anaconda25 veya başka bir python paket yöneticisi (PPM) yükleyin.
- GitHub deposuna gidin ve "analyzeSession.py", "summarizeSessions.py", "session2mp4s.py" ve "requirementsHost.txt" indir.
- Bir PPM istemi açın ve Python paket yüklemesinin gerekli python kitaplıklarına sahip olduğundan emin olmak için conda install --file directory_containing_requirementsHostrequirements Host.txt yazın.
- "directory_containing_analyzeData" ve "analyzeData.py" içeren dizine gitmek için istemde cd session2mp4s.py yazın. python analyzeSession.py yazarak analiz programını çalıştırın
NOT: Python 2 sürümü Python olarak kullanılıyorsa bir hata mesajı oluşturulur. Sürümü denetlemek için, istemde python -V yazın. - İstendiğinde verileri içeren dizini seçin. Birden çok alt dizine sahip dizinler sırayla analiz edilecektir.
- DEC oturumları için, analiz edilen her oturum dizini için, deneme ortalaması görüntüsünden farenin gözünü içeren bir ilgi alanı (ROI) seçin.
NOT: Son analiz veri dosyaları ve özet grafikler, analiz edilen her oturum dizininin bir alt dizinine doldurulur. - Birden çok oturumda özet veriler oluşturmak için python summarizeSessions.py yazın.
- Görüntüleme veri dosyalarını görüntülenebilir session2mp4s.py dosyalarına dönüştürmek için python .mp4 yazın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DEC deneyleri ve analizleri için iş akışı
Doğru deneysel parametre seçimi, başarılı gecikmeli göz kırpma koşullandırma (DEC) eğitimi için önemlidir. Burada sunulan veriler için, GUI 350 ms'lik bir CS süresi ve 50 ms'lik bir ABD süresi seçmek için kullanılmıştır. Bu eşleştirme, 300 ms'lik bir uyarıcılar arası aralıkla sonuçlanır: düşük genlikli CR üretimini önlemek için yeterince uzun10 ve zayıf öğrenme veya iz koşullandırma rejimine girmekten kaçınmak için yeterince kısa, ek beyin bölgelerini meşgul eden bir süreç11. Denemeler arasındaki süre, ITI düşük ve yüksek alanları kullanılarak 5-15 s'lik bir aralıktan eşit olarak rastgele seçilecek şekilde ayarlandı. Denemeler arası aralıkların randomizasyonu, hayvan deneklerin görev performansı için CS ve ABD'nin kendileri dışındaki zamanlama ipuçlarını kullanmalarını imkansız kılmaktadır.
CS veya ABD'yi atlayan denemeler dahil olmak üzere, eğitimli hayvanlarda bile CR ve UR kinematiğinin değerlendirilmesine izin verir. Kullanıcı, CS ve ABD'nin eşleştirildiği veya izole olarak sunulduğu denemelerin oranını tanımlayabilir. Burada sunulan verilerde, tüm oturumları% 10 CS denemelerinde, geri kalanını oluşturan ve yalnızca ABD'de olmayan denemeleri oluşturan eşleştirilmiş çalışmalarla çalıştırdık. Aşırı sayıda eşlenmemiş denemenin dahil edilmesinin eğitimi olumsuz yönde etkileyebileceğini unutmayın. Örneğin, denemelerin% 50'sinden fazlasının eşleştirilmemiş olduğu seanslar, eğitimli hayvanlarda CR'lerin neslinin tükenmesini sağlamak için yaygın olarak kullanılmaktadır19,26.
Kamera hazırlığı ve aydınlatma koşulları da yüksek kaliteli veriler elde etmek için kritik öneme sahiptir. Elde etme kare hızı, Picamera edinme yazılımında ayarlanabilir. Burada sunulan verilerde, DEC deneyleri için 120 Hz'lik bir kare hızı belirledik. Picamera modülünün kendisi ~ 200 Hz'e kadar kare hızlarına izin verir, ancak daha düşük hızların kare kaybını önlediğini ve göz kapağı izleme için yeterli zamansal çözünürlük sağladığını görüyoruz. Kızılötesi ışık, göz açıkken korneadan aşırı yansıma yaratmadan perioküler kürkü eşit şekilde aydınlatmak için yerleştirilmelidir. Şekil 3A , kabul edilebilir ışıklandırmaya sahip bir kayıt oturumundan örnek bir görüntü göstermektedir. Picamera edinme yazılımı (picameraStream.py), fotoğraf makinesi başlatıldığında aydınlatma koşullarına bağlı olarak kameranın beyaz dengesini ve kazancını ayarlayıp tutarak bir oturum boyunca tutarlı ayarlar sağlamak üzere tasarlanmıştır.
Davranışsal bir oturum başlatıldıktan sonra, kamera ve diğer platform donanım bileşenlerinden gelen veriler otomatik olarak günlüğe kaydedilir. Veri günlükleri, GUI'deki hayvan kimliği alanına tarih ve değer girişiyle adlandırılan bir dizinde oluşturulur. Her deneme için kamera çerçeveleri ve zaman damgaları, hayvan kimliği, deneme tarihi ve deneme numarası kullanılarak adlandırılan ayrı dosyalarda saklanır. Tekerlek hızı, deneme başlatmaları, deneme durdurmaları ve CS ve ABD zamanlaması dahil olmak üzere her oturum için platform olayları tek bir .txt dosyası olarak kaydedilir.
Ana makineye aktarılan veriler daha sonra protokolün 4. bölümünde açıklandığı gibi analiz edilebilir. analyzeData.py bir hedef dizinde çalıştırmak, kamera dosyalarının analizine dayanan bir dizideki tüm denemeler için zamana karşı göz kapağı pozisyonu için bir .npy kabı oluşturur. Bu kapsayıcı dosyası, çözümlenen dizinde oluşturulur. Tüm seanslar belirli bir hayvan için analiz edildikten sonra, tüm seanslar summarizeSessions.py kullanılarak hizalanabilir ve birleştirilebilir. 8 seans DEC için eğitilmiş bir hayvanın sonuçları Şekil 3B'de gösterilmiştir. Ayrıca, bireysel denemeler .mp4 yardımcı programı kullanılarak görüntülenebilir session2mp4s.py dosyaları olarak işlenebilir. Bu yardımcı program, CS ve ABD'nin ne zaman uygulandığını belirtmek için filmin sol üst köşesine bir kare yazdırır. Bu şekilde hazırlanan örnek DEC çalışmaları Ek Video 1 olarak yan yana sunulmuştur. Sol panel, hayvanın LED CS'ye yanıt olarak gözünü başarıyla kapattığı bir denemeyi göstermektedir. Sağ panelde, ABD başlayana kadar hayvan göz kırpmaz.
Bölüm 3'teki protokolleri izleyerek DEC'de eğitilen ve önceki hususlarla kaydedilen hayvanlar, birden fazla eğitim günü boyunca kademeli olarak edinilen iyi zamanlanmış CR'lerin açık kanıtlarını göstermelidir. Eğitimsiz bir hayvanda CR'si olmayan davranışsal izlerin örnekleri ve eğitimli bir hayvandan sağlam CR'ler içeren izler Şekil 3B'de sunulmuştur. Bu izlerin gösterdiği gibi, naif hayvanlar CS'ye değil, ABD'ye karşı sağlam bir tepki göstermelidir. CR'ler, günler boyunca gerçekleştirilen davranışsal oturumlarla hem boyut hem de sıklık olarak giderek artmalıdır (Şekil 3B-D). Buna karşılık, yetersiz aydınlatma koşulları, elde edilen verilerin kalitesini ciddi şekilde sınırlar. Göz ve çevresindeki kürk arasındaki kontrast düşük olduğunda (Şekil 3E), görüntüdeki küçük değişiklikler tek bir seansta UR'nin kaydedilen şeklini önemli ölçüde değiştirebilir ve göz kapağı pozisyonunu algılamak için sinyal-gürültü oranını azaltabilir (Şekil 3F-G).
Yüksek doğrulukta göz kapağı kayıtları sağlamak için optimum ışık kaynağı yerleşimi çok önemlidir. Aydınlatma LED'i doğrudan kaydedilen göz üzerinde eğitilmelidir. Yerleştirme kornea yüzeyinde aşırı parlamaya neden olursa, bu etkiyi azaltmak için LED dizisinin üzerine bir difüzör yerleştirilebilir.
DTSC deneyleri ve analizleri için iş akışı
Deneysel parametre seçimi için dikkate alınması gereken hususların çoğu, gecikme dokunsal irkilme koşullandırması (DTSC) ve DEC arasında benzerdir. Burada, farklı olanlara dikkat çekeceğiz. Örnek verilerde, DTSC CS süresi ABD süresi 50 ms olan 250 ms olarak ayarlanmıştır. Bu daha kısa uyarıcılar arası aralık, DTSC öğrenme20 için en uygun olarak tanımlanan daha kısa süre ile yakından uyumlu olacak şekilde seçilmiştir. GUI aracılığıyla ayarlanan diğer platform parametreleri, DEC için kullanılanlarla aynıydı.
Dokunsal uyaranın uygun şekilde yerleştirilmesi, DTSC'de öğrenme için kritik öneme sahiptir. Dokunsal uyaranı, köpük ucu, nötr konumdayken yaklaşık 1,5 cm'lik bir mesafede, hayvanın burnunun biraz üzerinde ortalanacak şekilde monte ederiz. Monte edildikten sonra, bir oturum çalışmadığında uyaran elle döndürülebilir. Seanslar sırasında, step motor bir ABD tetiklenene kadar uyaranı kesin bir yerde tutar. Konumlandırmanın doğru olduğundan emin olmak için, yaklaşık üç denemeden oluşan bir hazırlık oturumu düzenliyoruz. Döner kodlayıcıda günlüğe kaydedilen olaylar terminal ekranına yazdırılır ve bu çıktı, hayvan UR'lerinin genliğini gerçek zamanlı olarak izlemek için kullanılabilir. Maksimum genlik denemeden denemeye değişmekle birlikte, kısa oturum boyunca kodlayıcıda ortalama maksimum ~ 40 sayım olan hayvanlar DTSC görevinde iyi performans göstermelidir. Döner kodlayıcı kontrol ayarlarına bağlı olarak, bu değer 24 cm / s'ye karşılık gelir ve negatif bir değer hayvanın tekerlek üzerinde geriye doğru hareket ettiğini gösterir.
DTSC oturumları sırasında üretilen dosyaların organizasyonu ve adlandırılması, DEC'de üretilenlerle aynıdır. analyzeSession.py, .csv dosyasına kaydedilen verilerin analizinden bir dizideki tüm denemeler için zamana karşı tekerlek hızı için bir .npy kabı oluşturacaktır. Tüm seanslar belirli bir hayvan için analiz edildikten sonra, tüm seanslar summarizeSession.py kullanılarak hizalanabilir ve birleştirilebilir. 5 seans DEC için eğitilmiş bir hayvanın sonuçları Şekil 4A'da sunulmuştur. DEC'e gelince, DTSC'den kamera yakalamaları görüntülenebilir .mp4 dosyalarına dönüştürülebilir. Örnek DTSC denemeleri Ek Video 2'de yan yana gösterilmiştir. Sol panel, hayvanın LED CS'ye yanıt olarak tekerleği başarıyla desteklediği bir denemeyi göstermektedir. Sağ panelde, dokunsal uyaran US uygulanana kadar hayvan tekerleği hareket ettiremez.
DTSC paradigması üzerinde eğitilen hayvanlarda yanıtların UR'sine göre zaman seyri ve genliği, Aralık ayında eğitilenlerle nitel benzerlikler göstermektedir. naif hayvanlar CS'ye hiçbir yanıt göstermemeli ve tekerleği CS'ye yanıt olarak geriye doğru hareket ettirmeyi öğrenmelidir. Eğitim ilerledikçe CR'lerin sıklığı ve genliği artar (Şekil 4A,B). DTSC söz konusu olduğunda, eğitimin başlarında UR genliğinin öğrenmenin başarısının iyi bir göstergesi olduğunu bulduk. Düşük genlikli UR'ler (<20 cm / s) üreten bir ABD ile eğitilmiş bir hayvan kohortunda, hiçbir hayvan 4 günlük eğitimden sonra tutarlı bir şekilde CR üretmeyi öğrenmemiştir (Şekil 4C, D).
DEC ve DTSC eğitimi arasındaki farklar
DEC ve DTSC önemli şekillerde farklılık gösterir. İlk olarak, bu platformda DTSC öğrenimi daha hızlı gerçekleşir, çoğu hayvan eğitimin üçüncü gününe kadar yüksek derecede görev yeterliliğine ve beşinci güne kadar asimptotik performansa ulaşır. DEC öğrenimi çoğu hayvan için en az 3 gün daha yavaştır. İkincisi, DTSC sistemi, dokunsal uyaranın genliğini azaltmak için cihaza bir geri besleme sinyali görevi gören başarılı CR'lerin otomatik olarak algılanmasını içerir. Bu eğitim prosedürü, gelişmiş CR performansının engelleyici bir kornea hava pufundan kısmi koruma sağladığı göz kırpma koşullandırmasını taklit eder. Buna karşılık, DTSC paradigmasındaki kafaya sabitlenmiş hayvanlar, kendilerini yalnızca motor tepkileriyle dokunsal uyarandan koruyamazlar. ABD genliğini bir CR'nin varlığına dayandırarak, hayvanlar kendilerini engelleyici uyaranlardan koruma fırsatına sahiptir.
Şekil 1: Platform nitelikleri ve tasarımı . (A) Baş sabit koşullar altında hayvan davranışlarını kaydetmek için platform elemanları. Fare bir Biorender görüntüsünden uyarlandı. (B) DEC ve DTSC koşullandırması için zamanlama ve uyaranlar. Kullanıcı tanımlı bir uyarıcılar arası aralık (ISI), CS çağının yalnızca ne kadar süreceğini belirler. CS ve ABD dönemleri birlikte sona erecek şekilde tasarlanmıştır. (C) Anahtar platform elemanlarının yerleşimini gösteren resim. 1) DTSC ABD'nin kontrolü için step motor. 2) Hayvan için koşu tekerleği. 3) Tekerlek hareketini izlemek için döner kodlayıcı. 4) DTSC dokunsal uyaranı olarak hizmet veren akrilik bir kol üzerine bantlanmış köpük. 5) LED CS. 6) DEC US'yi sağlayan solenoid valf ve çıkış. 7) Hayvan davranışlarını kaydetmek için pikamera. 8) Sahne aydınlatması için kızılötesi LED. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Platform donanım elemanlarının kablolanması. (A) Tamamen monte edildiğinde platform donanımının Fritzing kablolama şeması. Teller turuncu = Kamera modülü ile modüller tarafından renklendirilir; sarı = DEC ABD modülü; mavi = LED CS modülü; mor = DTSC ABD modülü; yeşil = Döner kodlayıcı modülü. Picamera hariç tutulur, ancak Raspberry Pi'nin yüzeyinde bulunan kamera seri arayüzüne bağlanır. Piller, belirtilen voltajda doğru akım güç kaynaklarını gösterir. (B-F) İzole modüller için eşdeğer kablolama şeması. Teller yeniden renklendirildi, böylece kırmızı ve siyah her zaman sırasıyla pozitif besleme rayını ve toprağı gösterirken, diğer teller devrenin kolayca takip edilmesini sağlayacak şekilde renklendirildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: DEC eğitiminin temsili sonuçları . (A) Kabul edilebilir aydınlatma koşullarına sahip bir oturumdan örnek kamera çerçevesi. Göz ve perioküler kürk arasındaki yüksek kontrasta dikkat edin. (B) DEC paradigmasında günler boyunca gerçekleştirilen seanslar sırasında tek bir hayvanın performansı. Yatay çizgiler her denemede performansı gösterirken, sıcak renkler daha fazla göz kapağı kapanmasını gösterir. En soldaki kırmızı siyah dikey çizgi CS'nin başlangıcını gösterirken, noktalı çizgi ABD'nin başlangıcını gösterir. İkinci katı çizgi, CS ve ABD'nin durduğunu gösterir. CS sırasında başarılı yanıtlar alan denemelerin sayısının eğitim oturumları arasında arttığını unutmayın. (C) Her gün seans için deneme ortalamasından türetilen bireysel izlerle (B)'den hayvan performansı. Ton doygunluğu, sonraki oturumlar için daha yüksek doygunluğa sahip oturum sayısını gösterir. (D) DEC grubundaki tüm hayvanlar için performans (n = 7). İnce çizgiler, her hayvan için her seanstan tespit edilebilir bir CR ile yapılan denemelerin yüzdesini gösterir. Kalın çizgiler, seansın tüm hayvanlar arasındaki anlamına geldiğini gösterir. (E) Optimum olmayan aydınlatma koşullarına sahip bir oturumdan örnek kamera çerçevesi. (F) Zayıf aydınlatma ile kaydedilen tek denemelerin nicelleştirilmesi. UR algılanabilir, ancak optimum ışık koşullarına göre daha düşük kontrast ve daha yüksek değişkenlik ile. (G) (F)'de sunulan çalışmalardan alınan oturum ortalama izleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: DTSC eğitiminin temsili sonuçları. (A) DTSC paradigmasında günler boyunca gerçekleştirilen oturumlar sırasında tek bir hayvanın performansı. Yatay çizgiler her denemedeki performansı gösterirken, sıcak renkler geriye doğru tekerlek hareketini gösterir. En soldaki siyah dikey çizgi CS'nin başlangıcını gösterirken, noktalı çizgi ABD'nin başlangıcını gösterir. İkinci katı çizgi, CS ve ABD'nin durduğunu gösterir. (B) Her gün seans için deneme ortalamasından türetilen bireysel izlerle (A)'dan hayvan performansı. Ton doygunluğu, sonraki oturumlar için daha yüksek doygunluğa sahip oturum sayısını gösterir. (C) DTSC grubundaki tüm hayvanlar için performans (n = 6). İnce çizgiler, her hayvan için her seanstan tespit edilebilir bir CR ile yapılan denemelerin yüzdesini gösterir. Kalın çizgiler, seansın tüm hayvanlar arasındaki anlamına geldiğini gösterir. (D) ABD yoğunluğunun düşük genlikli UR'lere yol açtığı bir kohorttan (A) da olduğu gibi tek denemeler. (E) Zayıf ABD'ye maruz kalan hayvanlar için (B) de olduğu gibi sunulan oturum ortalama izleri. (F) DTSC'de zayıf ABD'li tüm hayvanlar için performans (n = 6). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Video 1: Örnek DEC isabeti ve eksik denemeler. DEC denemeleri video 1'de karşılaştırılmıştır. Her video, öznenin hedef CR'yi senkronize ettiği ve karşılaştırma için yan yana oynattığı (Sol) veya yapamadığı (Sağ) denemeleri gösterir. LED CS, her videonun sol üst köşesinde mavi kare göründüğünde yanar. ABD kontrol sinyali, beyaz bir kare mavi karenin yerini aldığında etkindir. CS ve ABD kontrol sinyalleri, kare kaybolduğunda birlikte sona erer. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Video 2: Örnek DTSC isabeti ve denemeleri kaçırmayın. Video 2, DTSC deneme sürümü karşılaştırmasını göstermektedir. Her video, öznenin hedef CR'yi senkronize ettiği ve karşılaştırma için yan yana oynattığı (Sol) veya yapamadığı (Sağ) denemeleri gösterir. LED CS, her videonun sol üst köşesinde mavi kare göründüğünde yanar. ABD kontrol sinyali, beyaz bir kare mavi karenin yerini aldığında etkindir. CS ve ABD kontrol sinyalleri, kare kaybolduğunda birlikte sona erer. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada özetlenen ilişkili protokollere sahip platform, iki duyusal ilişkisel öğrenme görevinde hayvan davranışını güvenilir bir şekilde izlemek için kullanılabilir. Her görev, tırmanan fiber yolu boyunca sağlam iletişime bağlıdır. Burada açıklanan tasarımda, serebellar yanıtın öğrenilmesini ve kaydedilmesini / pertürbasyonunu kolaylaştırmak için unsurları birleştiriyoruz. Bunlar, serbest hareket 11,18'in yanı sıra kafa sabitlemesine izin veren bir tekerleği içerir. Tekerlek, fare deneklerin serbestçe lokomotif yapmasına izin verir, bu da DEC edinimi18 için kritik olduğu gözlemlenmiştir. Farelerde kafa fiksasyonu, araştırmacıların diğer model türlerde veya serbestçe hareket eden koşullar altında kullanımı daha zor olan genetik, elektrofizyolojik, görüntüleme ve optogenetik yaklaşımlardan yararlanmalarını sağlar12. Bu uygulamaların her biri için tasarımımızı kullandık. Mikrodenetleyiciler üzerinde çalışan yazılım, her ikisi de milisaniyenin altında hassasiyetle çoklu foton alımı veya optogenetik stimülasyon ile senkronizasyon için zamanlama sinyallerini kontrol etmek üzere kolayca uyarlanabilir. Davranışsal deneylerle birleştirildiğinde optogenetik ve görüntüleme ekipmanlarının hayvan algısını en aza indirmek için özen gösterilmelidir. Örneğin, birçok çoklu foton sistemi, görüntüleme alımları başladığında galvanometrik tarayıcılarından veya kepenklerinden duyulabilir bir ses yayar. Satın almalar deneme başlangıçlarıyla tetiklenirse, bu tür sesler hayvan deneklere bir uyaranın yaklaşmakta olduğuna dair yanlışlıkla bir ipucu olarak hizmet edebilir.
Davranışsal aygıtın kontrolü, deneyi, kamerayı ve veri dışa aktarmayı yönetmek için grafiksel bir kullanıcı arabirimi oluşturmak için kullanılan bir SBC etrafında inşa edilmiştir. SBC ayrıca denemelerin zamanlamasını ele alan ve uyaran sunumu ve döner kodlayıcı gibi donanım bileşenlerini doğrudan kontrol eden iki mikrodenetleyiciye komutlar gönderir. Burada detaylandırılan protokoller, kontrol deneyi zamanlaması nedeniyle bir Arduino'ya bağlı bir Raspberry Pi 3B + veya 4B ve DTSC US'nin sunumunu kontrol etmek için bir Arduino Uno kullanılarak test edilmiştir. Diğer donanım tasarım uygulamaları mümkündür, ancak sağlanan yazılımla test edilmemiştir.
Birden fazla sondaj makinesinin paralel olarak kullanılmasını kolaylaştırmak için SBC'yi "başsız" modda çalıştırmanızı öneririz. Bu yapılandırmada, SBC ile etkileşim kurmak için bir ana bilgisayar kullanılır. Bir ethernet anahtarı, hem ana bilgisayara hem de SBC'ye eşzamanlı internet bağlantısı sağlar. Anahtar ayrıca hızlı veri aktarımı ile ana bilgisayar ve SBC arasında doğrudan iletişim sağlar. Sonuç olarak, anahtar kolay veri aktarımı ve SBC paket bakımı sağlar.
Birden fazla makineyi paralel olarak çalıştırmak için her sondaj makinesi kendi özel muhafazasına yerleştirilmelidir. Bu muhafazalar, birbirine yakın yerleştirilmişse ses yalıtımı içermelidir. Bitişik makineler arasındaki sesi bastırmak, komşu muhafazalarda üretilen uyaranlardan kaynaklanan kasıtsız işitsel ipuçlarından kaçınmaya yardımcı olabilir.
DEC ve DTSC için tek bir platformun kullanılması, araştırmacıların her paradigmanın güçlü ve zayıf yönlerinde esnek bir şekilde gezinmelerini sağlar. DEC, hangi beyin bölgelerinin ve spesifik serebellar devre elemanlarının görev öğrenme ve yürütmede yer aldığına dair onlarca yıllık araştırmalardan elde edilen içgörülere sahiptir 1,4,11,13,14,15,19. Bununla birlikte, farelerde, en sık göz kırpma koşullandırması11,12 ile ilişkili serebellar korteks bölgesi, birincil serebellar fissür içinde derin bir yerde bulunur (ancak yüzeysel lobül VI'nın DEC ile ilişkili bir bölgesini gösteren 15,17,27'ye bakınız). Öğrenme için derin bir lokus, optik deneylere, özellikle hücre aktivitesinin çoklu foton görüntülemesine ve optogenetik pertürbasyon deneylerine erişimi zorlaştırır. Buna karşılık, DTSC'nin serebellar substratları kısmen IV / V20 lobüllerinin yüzeysel yönüne yerleştirilmiştir. DTSC bu nedenle sistem sinirbilimi araştırmaları için popüler bir yer olan dorsal neokorteksinkiyle karşılaştırılabilir optik erişim sunar.
Tasarımımızda, hayvan davranışı tekerleğe bağlı bir döner kodlayıcı ve bir kamera kullanılarak izlenir. Düşük maliyet ve uygulama kolaylığı için bu yöntemleri seçtik. Bazı durumlarda, diğer izleme yöntemleri daha fazla uzamsal ve zamansal doğruluk sağlayabilir. Örneğin, DEC'deki göz kapağı pozisyonu, Hall etkisi sensörleri28,29 veya musculus orbicularis oculi30,31'in periorbital bölgesinin elektromiyogram kayıtları kullanılarak yaygın olarak izlenmiştir. Benzer şekilde, tekerlek hareketini algılayarak hareketin izlenmesi, SLEAP 32 veDeepLabCut 33 gibi görüntü tabanlı poz izleme algoritmalarından daha az ayrıntılı bir hayvan davranışı resmi verir. Kamera tabanlı kayıtlar bu tür yaklaşımların eklenmesine izin verir.
Burada, iki tırmanma lifine bağımlı ilişkisel öğrenme paradigması sırasında hayvan davranışını izlemek için bir platform sunduk. Platformumuz, bu yöntemlerin hem maliyet hem de uygulama kolaylığı açısından erişilebilirliğini artırmayı amaçlamaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma, Ulusal Ruh Sağlığı Enstitüleri NRSA F32 MH120887-03 (G.J.B.'ye) ve R01 NS045193 ve R01 MH115750'den (S.S-H.W.'ye) hibelerle desteklenmektedir. DEC kurulumunu optimize etmek için yararlı tartışmalar için Dr. Bas Koekkoek ve Henk-Jan Boele'ye ve DTSC kurulumunu optimize etmek için yararlı tartışmalar için Dr. Yue Wang ve Xiaoying Chen'e teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| "B" Quick Base For C&B METABOND - 10 mL bottle | Parkell | S398 | Dental cement solvent |
| "C" Universal TBB Catalyst - 0.7 mL | Parkell | S371 | Catalyst |
| #8 Washers | Thorlabs | W8S038 | Washers |
| 0.250" (1/4") x 8.00" Stainless Steel Precision Shafting | Servocity | 634172 | 1/4" shaft |
| 0.250” (0.770") Clamping Hub | Servocity | 545588 | Clamping hub |
| 1/4" to 6 mm Set Screw Shaft Coupler- 5 pack | Actobotics | 625106 | Shaft-coupling sleeve |
| 1/4"-20 Cap Screws, 3/4" Long | Thorlabs | SH25S075 | 1/4" bolt |
| 100 pcs 5 mm 395–400 nm UV Ultraviolet LED Light Emitting Diode Clear Round Lens 29 mm Long Lead (DC 3V) LEDs Lights +100 pcs Resistors | EDGELEC | ED_YT05_U_100Pcs | CS LEDs |
| 2 m Micro HDMI to DVI-D Cable - M/M - 2 m Micro HDMI to DVI Cable - 19 pin HDMI (D) Male to DVI-D Male - 1920 x 1200 Video | Star-tech | HDDDVIMM2M | Raspberry Pi4B to monitor cable |
| 256 GB Ultra Fit USB 3.1 Flash Drive | SanDisk | SDCZ430-256G-G46 | USB thumb drive |
| 3.3 V–5 V 4 Channels Logic Level Converter Bi-Directional Shifter Module | Amazon | B00ZC6B8VM | Logic level shifter |
| 32 GB 95 MB/s (U1) microSDHC EVO Select Memory Card | Samsung | MB-ME32GA/AM | microSD card |
| 4.50" Aluminum Channel | Servocity | 585444 | 4.5" aluminum channel |
| 48-LED CCTV Ir Infrared Night Vision Illuminator | Towallmark | SODIAL | Infrared light array |
| 4PCS Breadboards Kit Include 2PCS 830 Point 2PCS 400 Point Solderless Breadboards for Proto Shield Distribution Connecting Blocks | REXQualis | B07DL13RZH | Breadboard |
| 5 Port Gigabit Unmanaged Ethernet Network Switch | TP-Link | TL-SG105 | Ethernet switch |
| 5 V 2.5 A Raspberry Pi 3 B+ Power Supply/Adapter | Canakit | DCAR-RSP-2A5 | Power supply for Raspberry Pi 3B+ |
| 5-0 ETHILON BLACK 1 x 18" C-3 | Ethicon | 668G | Sutures |
| 6 mm Shaft Encoder 2000 PPR Pushpull Line Driver Universal Output Line Driver Output 5-26 V dc Supply | Calt | B01EWER68I | Rotary encoder |
| Ø1/2" Optical Post, SS, 8-32 Setscrew, 1/4"-20 Tap, L = 1", 5 Pack | Thorlabs | TR1-P5 | Optical posts |
| Ø1/2" Optical Post, SS, 8-32 Setscrew, 1/4"-20 Tap, L = 2", 5 Pack | Thorlabs | TR2-P5 | Optical posts |
| Ø1/2" Optical Post, SS, 8-32 Setscrew, 1/4"-20 Tap, L = 4", 5 Pack | Thorlabs | TR4-P5 | Optical posts |
| Ø1/2" Optical Post, SS, 8-32 Setscrew, 1/4"-20 Tap, L = 6", 5 Pack | Thorlabs | TR6-P5 | Optical posts |
| Ø1/2" Post Holder, Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrew, L = 2" | Thorlabs | PH2 | Optical post holder |
| Adapter-062-M X LUER LOCK-F | The Lee Co. | TMRA3201950Z | Solenoid valve luer adapter |
| Aeromat Foam Roller Size: 36" Length | Aeromat | B002H3CMUE | Foam roller |
| Aluminum Breadboard 10" x 12" x 1/2", 1/4"-20 Taps | Thorlabs | MB1012 | Aluminum breadboard |
| Amazon Basics HDMI to DVI Adapter Cable, Black, 6 Feet, 1-Pack | Amazon | HL-007347 | Raspberry Pi3B+ to monitor cable |
| Arduino Uno R3 | Arduino | A000066 | Arduino Uno (microcontroller board) |
| Arduino Due | Arduino | A000062 | Arduino Due (microcontroller board) |
| Bench Power Supply, Single, Adjustable, 3 Output, 0 V, 24 V, 0 A, 2 A | Tenma | 72-8335A | Power supply |
| Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet, 12" x 24" x 1/8" | McMaster Carr | 8560K257 | Acrylic sheet |
| CNC Stepper Motor Driver 1.0–4.2 A 20–50 V DC 1/128 Micro-Step Resolutions for Nema 17 and 23 Stepper Motor | Stepper Online | B06Y5VPSFN | Stepper motor driver |
| Compact Compressed Air Regulator, Inline Relieving, Brass Housing, 1/4 NPT | McMaster Carr | 6763K13 | Air source regulator |
| Cotton Swab | Puritan | 806-WC | Cotton swab |
| Dell 1908FP 19" Flat Panel Monitor - 1908FPC | Dell | 1908FPC | Computer monitor |
| Flex Cable for Raspberry Pi Camera | Adafruit | 2144 | camera serial interface cable |
| High Torque Nema 17 Bipolar Stepper Motor 92 oz·in/65 N·cm 2.1 A Extruder Motor | Stepper Online | 17HS24-2104S | Stepper motor |
| Isoflurane | Henry Schein | 66794001725 | Isoflurane |
| Krazy Maximum Bond Permanent Glue, 0.18 oz. | Krazy Glue | KG483 | Cyanoacrylate glue |
| Lidocaine HCl | VetOne | 510212 | Lidocaine |
| Low-Strength Steel Hex Nut, Grade 2, Zinc-Plated, 1/4"-20 Thread Size | McMaster Carr | 90473A029 | Nuts |
| M3 x 50 mm Partially Threaded Hex Key Socket Cap Head Screws 10 pcs | Uxcell | A16040100ux1380 | M3 bolt |
| NEMA 17 Stepper Motor Mount | ACTOBOTICS | 555152 | Stepper motor mount |
| Official Raspberry Pi Power Supply 5.1 V 3 A with USB C - 1.5 m long | Adafruit | 4298 | Power supply for Raspberry Pi 4B |
| Optixcare Dog & Cat Eye Lube Lubricating Gel, 0.70-oz tube | Optixcare | 142422 | Opthalimic ointment |
| Precision Stainless Steel Ball Bearing, Shielded, Trade No. R188-2Z, 13000 rpm Maximum Speed | McMaster-Carr | 3759T57 | Bearing |
| Premium Female/Female Jumper Wires - 40 x 6" | Adafruit | 266 | Wires |
| Premium Female/Male 'Extension' Jumper Wires - 40 x 6" (150 mm) | Adafruit | 826 | Wires |
| Premium Male/Male Jumper Wires - 40 x 6" | Adafruit | 758 | Wires |
| Radiopaque L-Powder for C&B METABOND - 5 g | Parkell | S396 | Dental cement powder |
| Raspberry Pi (3B+ or 4B) | Adafruit | 3775 or 4295 | Raspberry Pi |
| Raspberry Pi NoIR Camera Module V2 - 8MP 1080P30 | Raspberry Pi Foundation | RPI3-NOIR-V2 | Raspberry NoIR V2 camera |
| Right-Angle Bracket, 1/4" (M6) Counterbored Slot, 8-32 Taps | Thorlabs | AB90E | Right-angle bracket |
| Right-Angle Clamp for Ø1/2" Posts, 3/16" Hex | Thorlabs | RA90 | Right-angle optical post clamp |
| Right-Angle End Clamp for Ø1/2" Posts, 1/4"-20 Stud and 3/16" Hex | Thorlabs | RA180 | Right-angle end clamp |
| RJ45 Cat-6 Ethernet Patch Internet Cable | Amazon | CAT6-7FT-5P-BLUE | Ethernet cable |
| Rotating Clamp for Ø1/2" Posts, 360° Continuously Adjustable, 3/16" Hex | Thorlabs | SWC | Rotating optical post clamps |
| Spike & Hold Driver-0.1 TO 5 MS | The Lee Co. | IECX0501350A | Solenoid valve driver |
| Swivel Base Adapter | Thorlabs | UPHA | Post holder adapter |
| USB 2.0 A-Male to Micro B Cable, 6 feet | Amazon | 7T9MV4 | USB2 type A to USB2 micro cable |
| USB 2.0 Printer Cable - A-Male to B-Male, 6 Feet (1.8 m) | Amazon | B072L34SZS | USB2 type B to USB2 type A cable |
| VHS-M/SP-12 V | The Lee Co. | INKX0514900A | Solenoid valve |
| Zinc-Plated Steel 1/4" washer, OD 1.000" | McMaster Carr | 91090A108 | Washers |
References
- McCormick, D. A., Lavond, D. G., Clark, G. A., Kettner, R. E., Rising, C. E., Thompson, R. F. The engram found? Role of the cerebellum in classical conditioning of nictitating membrane and eyelid responses. Bulletin of the Psychonomic Society. 18 (3), 103-105 (1981).
- McCormick, D. A., Clark, G. A., Lavond, D. G., Thompson, R. F. Initial localization of the memory trace for a basic form of learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (8), 2731-2735 (1982).
- McCormick, D. A., Thompson, R. F. Cerebellum: essential involvement in the classically conditioned eyelid response. Science. 223 (4633), New York, N.Y. 296-299 (1984).
- Krupa, D. J., Thompson, J. K., Thompson, R. F. Localization of a memory trace in the mammalian brain. Science. 260 (5110), New York, N.Y. 989-991 (1993).
- Llinás, R., Sugimori, M. Electrophysiological properties of in vitro Purkinje cell dendrites in mammalian cerebellar slices. The Journal of Physiology. 305, 197-213 (1980).
- Mintz, M., Lavond, D. G., Zhang, A. A., Yun, Y., Thompson, R. F. Unilateral inferior olive NMDA lesion leads to unilateral deficit in acquisition and retention of eyelid classical conditioning. Behavioral and Neural Biology. 61 (3), 218-224 (1994).
- Welsh, J. P., Harvey, J. A. Cerebellar lesions and the nictitating membrane reflex: performance deficits of the conditioned and unconditioned response. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 9 (1), 299-311 (1989).
- Mauk, M. D., Steinmetz, J. E., Thompson, R. F. Classical conditioning using stimulation of the inferior olive as the unconditioned stimulus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (14), 5349-5353 (1986).
- Steinmetz, J. E., Lavond, D. G., Thompson, R. F. Classical conditioning in rabbits using pontine nucleus stimulation as a conditioned stimulus and inferior olive stimulation as an unconditioned stimulus. Synapse. 3 (3), New York, N.Y. 225-233 (1989).
- Chettih, S. N., McDougle, S. D., Ruffolo, L. I., Medina, J. F. Adaptive timing of motor output in the mouse: The role of movement oscillations in eyelid conditioning. Frontiers in Integrative Neuroscience. 5, 72 (2011).
- Heiney, S. A., Wohl, M. P., Chettih, S. N., Ruffolo, L. I., Medina, J. F. Cerebellar-dependent expression of motor learning during eyeblink conditioning in head-fixed mice. The Journal of Neuroscience. 34 (45), 14845-14853 (2014).
- Heiney, S. A., Kim, J., Augustine, G. J., Medina, J. F. Precise control of movement kinematics by optogenetic inhibition of purkinje cell activity. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2321-2330 (2014).
- Ten Brinke, M. M., et al. Evolving models of pavlovian conditioning: Cerebellar cortical dynamics in awake behaving mice. Cell Reports. 13 (9), 1977-1988 (2015).
- Gao, Z., et al. Excitatory cerebellar nucleocortical circuit provides internal amplification during associative conditioning. Neuron. 89 (3), 645-657 (2016).
- Giovannucci, A., et al. Cerebellar granule cells acquire a widespread predictive feedback signal during motor learning. Nature Neuroscience. 20 (5), 727-734 (2017).
- Ten Brinke, M. M., et al. Dynamic modulation of activity in cerebellar nuclei neurons during pavlovian eyeblink conditioning in mice. eLife. 6, 28132 (2017).
- Wang, X., Yu, S., Ren, Z., De Zeeuw, C. I., Gao, Z. A FN-MdV pathway and its role in cerebellar multimodular control of sensorimotor behavior. Nature Communications. 11 (1), 6050 (2020).
- Albergaria, C., Silva, N. T., Pritchett, D. L., Carey, M. R. Locomotor activity modulates associative learning in mouse cerebellum. Nature Neuroscience. 21 (5), 725-735 (2018).
- Kim, O. A., Ohmae, S., Medina, J. F. A cerebello-olivary signal for negative prediction error is sufficient to cause extinction of associative motor learning. Nature Neuroscience. 23 (12), 1550-1554 (2020).
- Yamada, T., et al. Sensory experience remodels genome architecture in neural circuit to drive motor learning. Nature. 569 (7758), 708-713 (2019).
- Horlington, M. Startle response circadian rhythm in rats: lack of correlation with motor activity. Physiology & Behavior. 5 (1), 49-53 (1970).
- Yeomans, J. S., Li, L., Scott, B. W., Frankland, P. W. Tactile, acoustic and vestibular systems sum to elicit the startle reflex. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 26 (1), 1-11 (2002).
- Raspberry Pi Operating system images. , Available from: https://www.raspberrypi.com/software/operationg-systems/ (2021).
- VNC Server. VNC® Connect. , Available from: https://www.realvnc.com/en/connect/download/vnc/ (2021).
- Anaconda: The world's most popular data science platform. , Available from: https://xddebuganaconda.xdlab.co/ (2021).
- De Zeeuw, C. I., Ten Brinke, M. M.
- Badura, A., et al. Normal cognitive and social development require posterior cerebellar activity. eLife. 7, 36401 (2018).
- Koekkoek, S. K. E., Den Ouden, W. L., Perry, G., Highstein, S. M., De Zeeuw, C. I. Monitoring kinetic and frequency-domain properties of eyelid responses in mice with magnetic distance measurement technique. Journal of Neurophysiology. 88 (4), 2124-2133 (2002).
- Kloth, A. D., et al. Cerebellar associative sensory learning defects in five mouse autism models. eLife. 4, 06085 (2015).
- Boele, H. -J., Koekkoek, S. K. E., De Zeeuw, C. I. Cerebellar and extracerebellar involvement in mouse eyeblink conditioning: the ACDC model. Frontiers in Cellular Neuroscience. 3, (2010).
- Lin, C., Disterhoft, J., Weiss, C. Whisker-signaled eyeblink classical conditioning in head-fixed Mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53310 (2016).
- Pereira, T. D., et al. Fast animal pose estimation using deep neural networks. Nature Methods. 16 (1), 117-125 (2019).
- Mathis, A., et al. DeepLabCut: markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning. Nature Neuroscience. 21 (9), 1281-1289 (2018).
